CN112961806B

CN112961806B - 高产乳酸的凝结芽孢杆菌、生物发酵饲料及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112961806B
Application number: CN202110313269.5A
Authority: CN
Inventors: 韩冰; 刘向阳; 肖进; 真诚; 贾红敏; 薛凌峰; 谭薇; 朱海源
Original assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Current assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date: 2021-03-24
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2041-03-24
Also published as: CN112961806A

Abstract

本发明提供高产乳酸的凝结芽孢杆菌、生物发酵饲料及其制备方法和应用，所述凝结芽孢杆菌保藏号为CGMCC No.21669。所述生物发酵饲料优选包括枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和所述凝结芽孢杆菌的发酵产物。本发明提供的生物发酵饲料含有丰富的小肽和酸性物质以及膳食纤维等多种有效成分，可着重改善动物肠道健康，提高畜禽和水产动物适口性和生产性能，减少动物腹泻，改善产品品质，杀死肠道致病菌，降低对环境的污染，具有安全无毒无残留的优点，可以在一定程度上替代抗生素，且制备方法简单易行。

Description

高产乳酸的凝结芽孢杆菌、生物发酵饲料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物及功能饲料技术领域，尤其涉及高产乳酸的凝结芽孢杆菌、生物发酵饲料及其制备方法和应用。

背景技术

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，是一种革兰氏阳性菌。产乳酸是凝结芽孢杆菌的一个重要特性。乳酸目前在饲料添加剂领域有着广泛的应用。但目前已报道的文献中提到的凝结芽孢杆菌产乳酸含量较低，例如G4菌株的产乳酸量仅为48.05mmol/L(4.32g/L)(陈秀秀等，一株凝结芽孢杆菌的分离鉴定及益生性分析[J]，2020，11：1-5)。

发酵饲料是以微生物、复合酶为生物饲料发酵剂菌种，将饲料原料转化为微生物菌体蛋白、生物活性小肽类氨基酸、微生物活性益生菌、复合酶制剂为一体生物发酵饲料。生物发酵饲料不但可以弥补常规饲料中容易缺乏的氨基酸，而且能使其它粗饲料原料营养成份迅速转化，达到增强消化吸收利用效果。

最常见的发酵饲料主要包括木薯渣、秸秆加工饲料、棉菜茶粽饼粕(如棕榈粕、豆粕、棉粕、菜籽粕、油茶籽饼、蓖麻饼等)、动物下脚料、潲水发酵饲料、菌糠加工饲料、粉渣醋渣酱渣发酵饲料、果渣、酒糟、青贮饲料、生物蛋白与肽、米糠统糠等方面。市场上用于饲料发酵的益生菌种类主要是乳酸菌、芽孢杆菌、酵母和霉菌。但是，目前市面上的发酵豆粕等发酵产品，其营养成分有限，品质或味道欠佳，也不能满足不同动物的营养需求。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一株高产乳酸的凝结芽孢杆菌、一种生物发酵饲料及其制备方法和应用。

本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一株高产乳酸的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年1月19日，保藏编号为CGMCC No.21669。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地，本发明所述凝结芽孢杆菌的16SrDNA核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

第二方面，本发明提供一种微生物菌剂，包含上述的凝结芽孢杆菌。

本发明所述微生物菌剂除了包含上述凝结芽孢杆菌，还可以包含乳酸菌、酵母、其它芽孢杆菌等菌种中的一种或多种。

在本发明的具体实施方式中，所述微生物菌剂可由以下方法获得：

将菌体与一定浓度的保护剂溶液混合制备成混悬液；然后将所述混悬液经过喷雾干燥工艺，进风温度为120～140℃，出风温度为60～70℃，制备成微生物菌剂。

其中保护剂选用乳清粉、脱脂奶粉、海藻糖、蔗糖、甘露寡糖等中的两种或两种以上，保护剂浓度为10～20％之间。

第三方面，本发明提供上述凝结芽孢杆菌或微生物菌剂在高产乳酸中的应用。所述乳酸主要指L-乳酸。

优选地，所述凝结芽孢杆菌的液体发酵培养基为：葡萄糖0.5～1％，酵母提取物0.5～2％，蛋白胨1～2％，硫酸锰0.001～0.01％，磷酸氢二钾0.1～0.5％，硫酸镁0.05～0.5％，pH5.5～7.0。

进一步地，将所述凝结芽孢杆菌接种至所述液体发酵培养基后，40～45℃，静止培养24～48h。培养结束后，将发酵液在6000rad/min，离心20min，收获菌体。

第四方面，本发明提供一种生物发酵饲料，包括枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和凝结芽孢杆菌的发酵产物，所述凝结芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.21669。

本发明的生物发酵饲料由特定的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和凝结芽孢杆菌发酵制得，该生物发酵饲料含有丰富的小肽和酸性物质以及膳食纤维等多种营养与免疫物质，可着重改善动物肠道健康，提高畜禽和水产动物适口性和生产性能，减少动物腹泻，改善产品品质，杀死肠道致病菌，降低对环境的污染，具有安全无毒无残留的优点。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和凝结芽孢杆菌的质量比为1～4:1～2:1～4。

本发明还提供上述生物发酵饲料的制备方法，包括将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和凝结芽孢杆菌与固体发酵培养基混合进行有氧发酵的步骤。

本发明的制备方法生产周期较短，增加饲料适口性，简单易行。

进一步地，所述固体发酵培养基包括质量百分含量为1～5％的植物原料和余量的固体基质，所述植物原料为桑叶、黄芪、陈皮、甘草、姜黄、蒲公英、黄连中的一种或多种。

在本发明的优选实施方式中，所述固体发酵培养基包括以下重量份的组分：玉米5～15份、豆粕10～20份、米糠5～15份、甘草1～5份、麸皮30～50份和石粉1～5份。

进一步地，混合前，经复壮、扩繁使枯草芽孢杆菌生物量为10¹⁰～10¹¹cfu/g，酿酒酵母生物量为10⁸～10⁹cfu/g，凝结芽孢杆菌生物量为10⁸～10⁹cfu/g。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和凝结芽孢杆菌的总接种量为10～20％，接种比例为1～4:1～2:1～4，与所述固体发酵培养基混合后的物料的水分含量控制在30～50％。

进一步地，所述有氧发酵的条件为：在温度30～45℃、相对湿度50％～70％下有氧发酵48～72小时。

本发明还提供上述生物发酵饲料在动物饲养中的应用。

具体地，所述动物为畜禽类动物，所述生物发酵饲料的添加量为0.1～10％。

所述动物为水产类动物，所述生物发酵饲料的添加量为0.1～5％。

本发明提供了一株高产乳酸的凝结芽孢杆菌，其相较于现有的凝结芽孢杆菌，产乳酸性能明显提升，可达到91.8g/L。本发明还提供了一种生物发酵饲料及其制备方法和应用，该生物发酵饲料含有丰富的小肽和酸性物质以及膳食纤维等多种有效成分，可着重改善动物肠道健康，提高畜禽和水产动物适口性和生产性能，减少动物腹泻，改善产品品质，杀死肠道致病菌，降低对环境的污染，具有安全无毒无残留的优点，可以在一定程度上替代抗生素，且制备方法简单易行。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1菌株C12的分离与鉴定

1.菌株C12的分离

采取某养殖场土壤样品10g，置于100mLNJ液体培养基(葡萄糖0.5～1％，酵母提取物0.5～2％，蛋白胨1～2％，硫酸锰0.001～0.01％，磷酸氢二钾0.1～0.5％，硫酸镁0.05～0.5％，pH5.5～7.0；下同)中，160℃，45℃富集培养24h。选取菌液80℃，10min，进行涂板，45℃培养24h。

2.菌株的纯化

挑取单个菌落染色、镜检、对革兰氏阳性、杆状的细菌划线分离，并保存。

3.菌株的筛选

将步骤2中所述的单菌落接种于NJ液体培养基中，45℃，静止培养48h。结果得到一株产酸较好的菌株C12，其特征为：镜检呈细杆状，菌落形态为圆形，淡黄色，表面较为光滑。

4.菌株的鉴定

将纯化得到的细菌，取对数生长期的新鲜菌液，送至擎科生物公司提取16S rDNA序列并进行序列测定，该菌株16S rDNA全长序列为1356bp，相似度为99％。

5.菌株的产酸特性

分离得到的凝结芽孢杆菌C12菌株在40℃静止培养，发酵24h，发酵液经HPLC测定其有机酸含量，结果见表1。

表1发酵液中各有机酸含量

有机酸种类	乳酸	乙酸	丙酸	丁酸
					浓度(mg/L)	91800	278	19	3.6

实施例2菌剂的制备

本发明所述的凝结芽孢杆菌，其液体发酵培养需要条件：葡萄糖0.5～1％，酵母提取物0.5～2％，蛋白胨1～2％，硫酸锰0.001～0.01％，磷酸氢二钾0.1～0.5％，硫酸镁0.05～0.5％，pH5.5～7.0；

将上述培养基接种后，40℃，静止培养2h；

将发酵液在6000rad/min，离心20min，收获菌体；

将菌体与浓度10％的保护剂溶液混合，制备成混悬液；保护剂选用乳清粉、脱脂奶粉、海藻糖、蔗糖、甘露寡糖等其中的两种或两种以上；

将上述混悬液经过喷雾干燥工艺，进风温度为120℃，出风温度为70℃，制备成微生物菌剂，生物量可达10¹⁰cfu/g。

实施例3生物发酵饲料的制备

本实施例提供一种生物发酵饲料，其制备方法如下：

(1)生产菌的复壮、扩繁

1)枯草芽孢杆菌的复壮和扩繁

挑取一环斜面菌株，接种于基础液体培养基中，250ml三角瓶培养基装量为50ml，30～45℃、160～220rad/min摇瓶培养20～24h，此为一级种子液，将此种子液以2％的接种量接入二级种子液培养基中，1000ml三角瓶装液量400ml，30～45℃、160～220r/min摇瓶培养20～24h；其中，基础液体培养基成分为：蛋白胨10～15g/L，酵母浸粉5～10g/L，氯化钠5g/L，调节pH至7.0～7.2；二级种子枯草芽孢杆菌培养液成分为：葡萄糖5～15g/L，蛋白胨10～15g/L，酵母浸粉10～20g/L，K₂HPO₄0.5～1g/L，Na₂HPO₄3～5g/L，调节至pH 6.5～7.5；

接着，将此种子培养液以1～3％的接种量分别接入50L的种子发酵罐进行扩繁，控制温度为30～45℃，有氧发酵20～24小时，其中，刚接入时调节转速为180-250r/min，制得发酵种子液，其中，种子罐枯草芽孢杆菌液体培养基为：葡萄糖:5～15g/L，蛋白胨：10～15g/L，酵母浸粉：10～20g/L，K₂HPO₄：0.5～1g/L，Na₂HPO₄:3～5g/L，调节pH至7.0～7.2；

下面，将上述种子培养液以6～10％的接种量接入50L的发酵罐，控制温度为37～40℃，有氧发酵20～24小时，其中50L发酵罐枯草芽孢杆菌发酵培养基组成为：葡萄糖：5～8g/L，蛋白胨：5～15g/L，酵母浸粉：5～10g/L，K₂HPO₄：0.5～1g/L，Na₂HPO₄:3～5g/L；其中，当液体发酵10h后开始补料，补料培养基组成：葡萄糖：5～20g/L，蛋白胨：5～10g/L，酵母浸粉：5～10g/L，共补料2～4次，每2～4小时一次。

2)酿酒酵母的复壮和扩繁

酿酒酵母种子液体培养基为：蛋白胨10～30g/L，酵母浸粉10～20g/L，葡萄糖1～5g/L；上述培养基均在121℃条件下高温灭菌30min。

酿酒酵母液体培养基组成：上述培养基均121℃高压30min。葡萄糖：5～20g/L，蛋白胨：5～10g/L，酵母浸粉：5～10g/L，共补料2～3次，每2～4小时一次。

酿酒酵母摇瓶种子液体培养基为：蛋白胨10～30g/L，酵母浸粉10～20g/L，葡萄糖1～5g/L。其中，液体发酵10h开始补料，葡萄糖：5～20g/L，蛋白胨：5～10g/L，酵母浸粉：5～10g/L，共补料2～3次，每2～4小时一次。

3)凝结芽孢杆菌(实施例1所得)的复壮和扩繁

凝结芽孢杆菌摇瓶种子液体培养基为：葡萄糖1～5g/L，蛋白胨10～15g/L，酵母浸粉10～15g/L，K₂HPO₄0.5～1g/L，NaH₂PO₄3～5g/L，调节至pH 6.5～7.0，121℃高压25min；

凝结芽孢杆菌液体培养基组成：葡萄糖：2～5g/L，蛋白胨：10～15g/L，酵母浸粉：10～15g/L，K₂HPO₄：0.5～1g/L，NaH₂PO₄:3～5g/L；

凝结芽孢杆菌中试液体培养基组成：葡萄糖：1～3g/L，蛋白胨：10～12g/L，酵母浸粉：10～12g/L，K₂HPO₄：0.5～1g/L，NaH₂PO₄:3～5g/L，调节至pH 6.5～7.5，121℃高压30min，当液体发酵10h后开始补料，葡萄糖：5～20g/L，蛋白胨：5～10g/L，酵母浸粉：5～10g/L，共补料2～3次，每2～4小时一次。

(2)固体培养基的制备

固体培养基组成为：玉米10份，麸皮35份，豆粕15份，米糠10份，甘草3份，石粉4份。将需要粉碎的组分提前粉碎，用孔径1.2mm筛子过滤，最后按比例混合。

(3)有氧发酵

把步骤1)得到的培养液(含菌量为100～150亿CFU/mL，枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母的比例为1:2:2)与步骤2)的固体培养基混匀，其水分控制在40％，在温度40℃、空气相对湿度为60％条件下有氧发酵72小时，得到发酵产物。

实施例4

本实施例提供一种生物发酵饲料，其与实施例3的区别在于，枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母菌株添加比例为2:2:1。

实施例5

本实施例提供一种生物发酵饲料，其与实施例3的区别在于，枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母菌株添加比例为1:1:1。

实施例6

本实施例提供一种生物发酵饲料，其与实施例3的区别在于，固体培养基为：玉米10份，麸皮38份，豆粕15份，米糠10份，石粉4份。

对比例1

本对比例提供一种生物发酵饲料，其与实施例3的区别在于，用等量(以活菌数计)的枯草芽孢杆菌替代凝结芽孢杆菌。

对比例2

本对比例提供一种生物发酵饲料，其与实施例3的区别在于，用等量(以活菌数计)的酿酒酵母替代枯草芽孢杆菌。

对比例3

本对比例提供一种生物发酵饲料，其与实施例3的区别在于，用等量(以活菌数计)的市面凝结芽孢杆菌替代本发明中的凝结芽孢杆菌。

实验例1

各实施例和对比例得到的生物发酵饲料的营养指标检测结果如表2所示。

表2不同生物发酵饲料发酵后的营养指标

实验例2

采用实施例6和对比例1得到的生物发酵饲料饲喂海兰褐蛋鸡，试验选取216只海兰褐蛋鸡，随机分成三组，试验分1个对照组、2个处理组，每组8个重复，每个重复9只鸡。自由采食，每天定点光照，统计生物发酵饲料对蛋鸡生产性能和蛋品质的影响。其中，蛋壳强度测试采用多功能蛋品分析仪(EMT-5200)。

结果如表3所示，在蛋鸡饲料中添加本发明实施例的生物发酵饲料后，能够提高产蛋率，提高蛋品质，并可以在一定程度上减少蛋白原料的使用。

表3生物发酵饲料对蛋鸡生产性能和蛋品质的影响

实验例3

采用生物发酵饲料饲喂肉鸡，试验选取180只肉仔鸡，随机分成三个处理组，分别为空白对照组，实施例3处理组和对比例3处理组，每个处理组6个重复，每个重复10只鸡，饲养周期42天，自由采食，发酵饲料添加剂量均为5％。统计生物发酵饲料对肉鸡采食量、料肉比以及粪便大肠杆菌的影响，结果如表4所示。

表4生物发酵饲料对肉鸡的影响

结果可见，本发明的生物发酵饲料可提高肉鸡采食量，改善料肉比，且可明显减少大肠杆菌的数量，改善肠道健康状况。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 高产乳酸的凝结芽孢杆菌、生物发酵饲料及其制备方法和应用

<130> KHP201119610.1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1356

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa 60

cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccggcttca tgcaggcggg 120

ttgcagcctg caatccgaac tgggaatggt tttctgggat tggcttaacc tcgcggtctc 180

gcagcccttt gtaccatcca ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg 240

atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa 300

ctgaatgctg gcaactaagg tcaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc 360

acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcactc tgtcccccga aggggaaggc 420

cctgtctcca gggaggtcag aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga 480

attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagcct 540

tgcggccgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta aagggcggaa 600

accctctaac acttagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 660

ttgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc agttacagac cagagagccg ccttcgccac 720

tggtgttcct ccacatctyt acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt 780

ctgcactcaa gcctcccagt ttccaatgac cgcttgcggt tgagccgcaa gatttcacat 840

cagacttaag aagccgcctg cgcgcgcttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca 900

cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctggc cgggtaccgt 960

caaggcgccg ccctgttcga acggcacttg ttcttccccg gcaacagagt tttacgaccc 1020

gaaggccttc ttcactcacg cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt 1080

ccctactgct gcctcccgta ggagtttggg ccgtgtctca gtcccaatgt ggccgatcac 1140

cctctcaggt cggctacgca tcgttgcctt ggtgagccgt taccccacca actagctaat 1200

gcgccgcggg cccatctgta agtgacagca aaagccgtct ttcctttttc ctccatgcgg 1260

aggaaaaaac tatccggtat tagccccggt ttcccggcgt tatcccgatc ttacaggcag 1320

gttgcccacg tgttactcac ccgtccgccg ctaacc 1356

Claims

1.一株高产乳酸的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)的保藏号为CGMCC No.21669。

2.根据权利要求1所述的高产乳酸的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌的16SrDNA核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

3.一种微生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌。

4.权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌或权利要求3所述的微生物菌剂在高产乳酸中的应用。

5.一种生物发酵饲料，其特征在于，包括枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌的发酵产物。

6.根据权利要求5所述的生物发酵饲料，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和凝结芽孢杆菌的质量比为1～4:1～2:1～4。

7.权利要求5或6所述的生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，包括将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和凝结芽孢杆菌与固体发酵培养基混合进行有氧发酵的步骤；

其中，所述固体发酵培养基包括质量百分含量为1～5％的植物原料和余量的固体基质，所述植物原料为桑叶、黄芪、陈皮、甘草、姜黄、蒲公英、黄连中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，混合前，枯草芽孢杆菌生物量为10¹⁰～10¹¹cfu/g，酿酒酵母生物量为10⁸～10⁹cfu/g，凝结芽孢杆菌生物量为10⁸～10⁹cfu/g。

9.根据权利要求7或8所述的生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，所述有氧发酵的条件为：在温度30～45℃、相对湿度50％～70％下有氧发酵48～72小时。

10.权利要求5或6所述的生物发酵饲料在动物饲养中的应用，其特征在于，所述动物为畜禽类动物，所述生物发酵饲料的添加量为0.1～10％；

和/或，所述动物为水产类动物，所述生物发酵饲料的添加量为0.1～5％。