CN101984046B - 一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SA001，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.3991。本发明还公开了利用上述高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌生产琥珀酸的方法。本发明方法与化学法相比，能耗低，污染小，使用非化石资源作为原料，无需使用贵重金属作为催化剂，成本低廉，过程易操控，产量高。本发明菌株与原始菌相比，发酵产物单一，副产物少，产量高。

Description

一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌。

背景技术

琥珀酸，又名丁二酸，是一种常见的天然有机酸，作为三羧酸循环还原端的终端产物，广泛存在于人体、动植物以及微生物中，在生物代谢中占有重要地位。琥珀酸不仅可以作为添加剂应用于食品、医药等行业，同时亦可以作为C4平台化合物用于合成1，4-丁二醇、四氢呋喃等大宗化学品以及PBS(聚丁二酸丁二醇酯)等生物可降解材料。

琥珀酸的制备方法主要包括化学合成法和生物法。相比化学法难以控制、产率不高、纯度低、催化剂昂贵等问题，生物法合成琥珀酸具有成本低廉，产率较高同时兼具固定CO₂的特点，因此生物法制备琥珀酸成为今年来的研究热点。目前生物法合成琥珀酸的主要菌种包括：Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Escherichia coli、Mannheimia succiniciproducens等。其中谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum因其生长迅速、培养条件简单、耐受性强、发酵条件成熟，同时由于其厌氧代谢途径中部分酶的缺失，使得其在厌氧条件下副产物较少，成为最具潜力的生产琥珀酸的工业菌种。但是野生谷氨酸棒杆菌在发酵生产琥珀酸的过程中，总是伴随着副产物L-乳酸和乙酸，影响了发酵产物的质量，增加了后续分离的负荷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌，其厌氧条件下不产生副产物L-乳酸。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

发明人通过低能离子束注入技术，对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032进行诱变，经筛选得到一株谷氨酸棒杆菌，其厌氧下可高产琥珀酸，同时不产生副产物乳酸。该菌株，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SA001，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，登记入册的编号是CGMCC No.3991，保藏日期是2010年7月2日。以此菌作为生产菌株。

CGMCC No.3991菌株具有下述性质：

1、菌落形态学特征：

在营养琼脂培养基上，30℃划线培养呈中度生长，菌苔线状，24h为白色，48h后稍呈淡黄色，随培养时间的延长颜色稍增深。表面湿润、光滑，有光泽，无黏性

2、生理与生化特性：

a.培养温度：28～39℃，最适温度为30℃；

b.在pH 5.0～8.5范围内生长；

c.色素产生情况：不产色素；

3、营养特征：

谷氨酸棒杆菌可在合成培养基上生长，培养基成分明确且价格低廉。该培养基碳源一般为葡萄糖或玉米糖化液，氮源可选用玉米浆干粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素以及(NH₄)₂SO₄等，培养基中还包括钾盐、钠盐、钙盐、镁盐、锌盐、铁盐、锰盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐等常用的无机盐类，根据不同的氮源而定，以硫酸铵或尿素为唯一氮源时需全添加，在以玉米浆干粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏时可以少量或不加入无机盐。

利用上述高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌生产琥珀酸的方法，将保藏号为CGMCCNo.3991的菌株活化后，在28～39℃下好氧发酵12～16h，再在28～39℃下厌氧发酵12～36h；

其中，好氧发酵培养基为完全培养基：碳源10～40g/L，氮源10～20g/L，无机盐0～3g/L，生长因子0～0.3mg/L，其余为水，pH 5.0～7.5；

其中，厌氧发酵过程中，向好氧发酵培养基中添加碳源30～60g/L。

其中，所述的碳源为葡萄糖或玉米糖化液。

其中，所述的氮源为尿素或玉米浆干粉、牛肉膏、蛋白胨或酵母膏。

其中，所述的无机盐为钾盐、锰盐、铁盐、镁盐、锌盐、铜盐、钙盐、硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐中的任意一种或几种的组合。

其中，所述的生长因子为生物素和维生素中的任意一种或两种的组合。

最优选的生产方式为：将保藏号为CGMCC No.3991的菌株活化后，在30℃下好氧发酵12h，好氧阶段通气1v/vm、搅拌500rpm，再在30℃下厌氧发酵36h，厌氧阶段搅拌200rpm；

其中，所述的好氧发酵培养基为：葡萄糖20g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，FeSO₄·7H₂O 20mg/L，MnSO₄·H₂O 20mg/L，尿素2.5g/L，生物素100μg/L，维生素B1200μg/L，其余为水，pH 7；

其中，厌氧发酵过程中，向好氧发酵培养基中添加碳源40g/L，分别于厌氧发酵开初始及厌氧发酵12h时各添加20g/L。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：

(1)与化学法相比，能耗低，污染小，使用非化石资源作为原料，无需使用贵重金属作为催化剂，成本低廉，过程易操控，产量高。

(2)与原始菌相比，发酵产物单一，副产物少，产量高。

附图说明

图1为本发明菌株CGMCC No.3991厌氧发酵终点的高效液相色谱有机酸检测图谱。其中，标号1的峰为琥珀酸的响应峰。

图2为本发明的出发菌株ATCC13032厌氧发酵终点的高效液相色谱有机酸检测图谱。其中，标号1的峰为乳酸的响应峰，2为琥珀酸的响应峰。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH7.0。

好氧发酵培养基：葡萄糖20g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.4g/L，FeSO₄·7H₂O 20mg/L，MnSO₄·H₂O 20mg/L，尿素2.5g/L，生物素100μg/L，维生素B1200μg/L，初始pH7.0。5L发酵罐装液量3L，115℃灭菌10分钟。

分别将保藏号为ATCC13032及CGMCC No.3991菌首先于30℃平板活化菌种，24h后接两环生长良好的菌体入30mL发酵培养基，30℃，200rpm培养12h，然后按照3％(v/v)接种量转接入3L发酵培养基，通空气1v/vm，转速500rpm，30℃，好氧发酵12h后，转入厌氧发酵，通CO₂0.2v/vm，转速200rpm，30℃培养。分别于厌氧发酵初始及发酵后12h各添加20g/L葡萄糖。发酵36h后CGMCC No.的发酵液中含有37.2g/L琥珀酸。厌氧阶段糖酸转化率达到93％，较ATCC13032相比，琥珀酸产量提高了325％，没有副产物乳酸(见图1和图2)。

实施例2：

平板培养基：同实施例1。

好氧发酵培养基：玉米糖化液400mL/L(玉米糖化液的含糖量约为50g/L)，K₂HPO₄·3H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，FeSO₄·7H₂O 20mg/L，MnSO₄·H₂O 20mg/L，尿素2.5g/L，生物素100μg/L，维生素B1200μg/L，初始pH7.0。5L发酵罐装液量3L，115℃灭菌10分钟。

分别将保藏号为ATCC13032及CGMCC No.3991菌首先于30℃平板活化菌种，24h后接两环生长良好的菌体入30mL发酵培养基，30℃，200rpm培养12h，然后按照3％(v/v)接种量转接入3L发酵培养基，通空气1v/vm，转速500rpm，30℃，好氧发酵14h后，转入厌氧发酵，通CO₂0.2v/vm，转速200rpm，30℃培养。分别于厌氧发酵初始及发酵后12h各添加20g/L葡萄糖。发酵36h后CGMCC No.的发酵液中含有36.2g/L琥珀酸。厌氧阶段糖酸转化率达到90.5％，较ATCC13032相比，琥珀酸产量提高了312％，没有副产物乳酸

实施例3：

平板培养基：同实施例1

好氧发酵培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨5g/L，FeSO₄·7H₂O 20mg/L，MnSO₄·H₂O20mg/L，初始pH7.0。5L发酵罐装液量3L，115℃灭菌10分钟。

分别将保藏号为ATCC13032及CGMCC No.3991菌首先于30℃平板活化菌种，24h后接两环生长良好的菌体入30mL发酵培养基，35℃，200rpm培养12h，然后按照3％(v/v)接种量转接入3L发酵培养基，通空气1v/vm，转速500rpm，30℃，好氧发酵16h后，转入厌氧发酵，通CO₂0.2v/vm，转速200rpm，35℃培养。分别于厌氧发酵初始及发酵后12h各添加20g/L葡萄糖。发酵36h后CGMCC No.的发酵液中含有35.1g/L琥珀酸。厌氧阶段糖酸转化率达到87.75％，较ATCC13032相比，琥珀酸产量提高了298％，没有副产物乳酸

实施例4：

平板培养基：同实施例1

好氧发酵培养基：葡萄糖20g/L，玉米浆干粉10g/L，初始pH7.0。5L发酵罐装液量3L，115℃灭菌10分钟。

分别将保藏号为ATCC13032及CGMCC No.3991菌首先于30℃平板活化菌种，24h后接两环生长良好的菌体入30mL发酵培养基，30℃，200rpm培养12h，然后按照3％(v/v)接种量转接入3L发酵培养基，通空气1v/vm，转速500rpm，30℃，好氧发酵16h后，转入厌氧发酵，通CO₂0.2v/vm，转速200rpm，33℃培养。分别于厌氧发酵初始及发酵后12h各添加20g/L葡萄糖。发酵36h后CGMCC No.的发酵液中含有35.8g/L琥珀酸。厌氧阶段糖酸转化率达到89.5％，较ATCC13032相比，琥珀酸产量提高了308％，没有副产物乳酸。

Claims (7)

1.一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)SA001，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.3991。

2.利用权利要求1所述的高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌生产琥珀酸的方法，其特征在于将保藏号为CGMCC No.3991的菌株活化后，在28～39℃下好氧发酵12～16h，再在28～39℃下厌氧发酵12～36h；

其中，好氧发酵培养基为完全培养基：碳源10～40g/L，氮源10～20g/L，无机盐0～3g/L，生长因子0～0.3mg/L，其余为水，pH 5.0～7.5；

其中，厌氧发酵过程中，向好氧发酵培养基中添加碳源30～60g/L。

3.根据权利要求2所述的高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌生产琥珀酸的方法，其特征在于所述的碳源为葡萄糖或玉米糖化液。

4.根据权利要求2所述的高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌生产琥珀酸的方法，其特征在于所述的氮源为尿素、硫酸铵、玉米浆干粉或酵母粉。

5.根据权利要求2所述的高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌生产琥珀酸的方法，其特征在于所述的无机盐为钾盐、锰盐、铁盐、镁盐、锌盐、铜盐、钙盐、硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐中的任意一种或几种的组合。

6.根据权利要求2所述的高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌生产琥珀酸的方法，其特征在于所述的生长因子为维生素。

7.利用权利要求1所述的高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌生产琥珀酸的方法，其特征在于将保藏号为CGMCC No.3991的菌株活化后，在30℃下好氧发酵12h，好氧阶段通气1v/vm、搅拌500rpm，再在30℃下厌氧发酵36h，厌氧阶段搅拌200rpm；

其中，所述的好氧发酵培养基为：葡萄糖20g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，FeSO₄·7H₂O 20mg/L，MnSO₄·H₂O 20mg/L，尿素2.5g/L，生物素100μg/L，维生素B1 200μg/L，其余为水，pH 7；

其中，厌氧发酵过程中，向好氧发酵培养基中添加碳源40g/L，分别于厌氧发酵开初始及厌氧发酵12h时各添加20g/L。

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