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CN116622795B - L-氨基酸连接酶的制备方法及其在二肽合成上的应用 - Google Patents

L-氨基酸连接酶的制备方法及其在二肽合成上的应用 Download PDF

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CN116622795B CN202310894436.9A CN202310894436A CN116622795B CN 116622795 B CN116622795 B CN 116622795B CN 202310894436 A CN202310894436 A CN 202310894436A CN 116622795 B CN116622795 B CN 116622795B
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Abstract

本发明提供了一种L‑氨基酸连接酶的制备方法及其在二肽合成上的应用。其中，二肽合成方法包括利用如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的L‑氨基酸连接酶进行二肽合成反应，得到二肽。利用本申请的L‑氨基酸连接酶，能够进行多种功能二肽的合成，底物谱较广，且合成效率较高，能够较好地用于工业放大，成本低，收率高，实现了真正的绿色化学。

Description

L-氨基酸连接酶的制备方法及其在二肽合成上的应用
技术领域
本发明涉及酶技术领域，具体而言，涉及一种L-氨基酸连接酶的制备方法及其在二肽合成上的应用。
背景技术
二肽是最简单的肽，由一分子氨基酸的α-羧基和另一分子氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键组成。尽管二肽的结构简单，但它具有广泛的生物活性，能够对生物体的生理代谢等生命活动起到调节作用。以抗生素、抗病毒、抗癌、激素及免疫调节作用为基础的肽需求量逐年增加，并广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品等领域。比如肌肽（Carnosine，β-alanyl-His）具有抗氧化、抗炎、抗糖化的作用；双甘氨肽（Gly-Gly）在医药上用作血液保存和蛋白质药物细胞色素C水针剂的稳定剂；丙谷二肽（Ala-Gln）作为手术病人的重要营养补充剂；阿斯巴甜（Asp-Phe methyl ester）是广泛使用的一种甜味剂；Ala-Phe，Ile-Phe，Pro-Gly二肽是咸味增强剂；Ile-Tyr，Lys-Trp，Val-Tyr，Ile-Trp是降压肽，Arg-Trp具有镇痛作用的，Lys-Glu具有抗肿瘤活性等等。
目前二肽合成主要是化学合成，该过程涉及到保护和去保护相关操作的过程，且产物会发生消旋，而且合成成本较高，甚至需要有毒试剂等问题。而采用生物法合成则具有很好的立体选择性，不产生消旋产物。L-氨基酸连接酶可以在ATP参与下将两个游离氨基酸连接合成二肽。现有的L-氨基酸连接酶（Lal）底物谱较窄，且在合成二肽的反应中底物浓度较低，底物浓度提高以后，酶的活性不足，这严重限制了Lal在合成多种功能二肽上的广泛应用。因而，开发具有广泛底物谱的L-氨基酸连接酶对二肽合成具有着非常重要的意义。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种L-氨基酸连接酶在二肽合成上的应用、及其制备方法，以解决现有技术中L-氨基酸连接酶底物谱较窄的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种制备二肽的方法，方法包括利用如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的L-氨基酸连接酶进行二肽合成反应，得到二肽。
进一步地，二肽合成反应的底物为氨基酸；优选地，氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸或酪氨酸中的一种或两种。
进一步地，二肽包括Gly-Gln、Gly-Tyr、Gly-Gly或Ala-Gln。
进一步地，二肽合成反应的反应体系包括：pH值为8.5-9.0的如下缓冲液：0.1-0.2M Tris-HCl、0.1-0.2M ATP及0.1-0.2M MgCl2。
进一步地，二肽合成反应的反应温度为20-25℃。
进一步地，二肽合成反应的反应时间为15-17h。
进一步地，进行二肽合成反应的L-氨基酸连接酶在反应体系中的质量浓度为0.05-1mg/mL。
进一步地，进行二肽合成反应的底物在反应体系中的浓度为10-200 mM。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种L-氨基酸连接酶的制备方法，其特征在于，将编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的L-氨基酸连接酶的基因克隆至表达载体中，得到重组载体；将重组载体导入大肠杆菌中，得到重组菌株；培养重组菌株，诱导L-氨基酸连接酶的表达，得到培养液；将培养液进行超声破碎后离心，得到L-氨基酸连接酶。
进一步地，表达载体包括pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b（+）、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19；优选地，宿主细胞包括包括原核细胞或真核细胞；优选地，原核细胞为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌；更优选地，大肠杆菌的菌种为BL21；优选地，真核细胞为酿酒酵母和毕赤酵母。
应用本发明的技术方案，利用本申请的L-氨基酸连接酶，能够进行多种功能二肽的合成，底物谱较广，且合成效率较高，能够较好地用于工业放大，成本低，收率高，实现了真正的绿色化学。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了实施例1中的重组L-氨基酸连接酶在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE结果图；
图2示出了实施例2中利用大肠杆菌纯化Blal蛋白的SDS-PAGE结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有技术中的L-氨基酸连接酶在二肽合成反应中底物谱普遍较窄。不同的L-氨基酸连接酶表现出不同的底物特异性，有些酶不能利用酸性或碱性氨基酸作为底物；有些能合成N 端氨基酸较大，而C 端氨基酸较小的二肽，有些则相反；还有一些酶表现出高度受限的底物特异性，如N端只接受L-蛋氨酸和 L-亮氨酸，C 端底物仅限于小残基等。
此外，现有技术中的L-氨基酸连接酶能够催化底物的浓度较低，通常只有几十mM的水平，且活力不足，不能用于多种功能二肽合成，这制约着L-氨基酸连接酶在合成多种二肽产品上的广泛应用。因此，开发具有广泛底物谱的L-氨基酸连接酶有着非常重要的意义。在本申请中发明人尝试通过筛选及密码子优化的方法对L-氨基酸连接酶进行改造，进而提高酶的各种性质，扩宽酶的底物谱，提高L-氨基酸连接酶的酶活力，使其可以广泛用于生产功能二肽的技术方案中，因而提出了本申请的一系列保护方案。
本发明的第一种典型的实施方式中，提供了一种制备二肽的方法，方法包括利用如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的L-氨基酸连接酶进行二肽合成反应，得到二肽。
上述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，是将来源于Bacillus sp. Root920的L-氨基酸连接酶Blal经密码子优化后的DNA序列经转录翻译得到的氨基酸序列。根据大肠杆菌中偏好，将来源于Bacillus sp. Root920的L-氨基酸连接酶Blal的DNA序列进行密码子优化。
已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem .32:1180-1187(1993) ；Kobayashi等人Protein Eng .12(10) :879-884(1999) ；和Burks等人Proc .NatlAcad .Set USA 94:412-417(1997))。
SEQ ID NO：1：
MSKKTVLVIADLGGCPPHMFYESVAASYHIVSYIPRPFAITKGHAELIEKYSIAVIKDRDYFETHPSFEHPDSIYWAHDDYLKSEEEVVDDLVRVASFFKADAITTNNELFIAPMAKAAERLGLRGAGVKAAEKARDKSQMRAAFNAAGVKAVKTQPVTTLADFQQAIEHIGTPLILKPTYLASSIGVTLFHDRAGSDDLFLNVQSYLQTIPVPNAVTYEAPFVAETYLEGAYKDWYQEDGYSDYVSVEGLVVEGEYIPFVIHDKTPQIGFTETAHITPSILDNEAQQIIIEAAKKANEGLGLENCATHTEIKLMKNRETGLIESAARFAGWNMIPNIKKVFGVDMAKLLIDVLVDGKKAELPKELLSGHTHYIADCHLYPQHFKESGHIPAEATHITIDHIHIPQDALVGDTVIVSKSVPSKGTFVDLSLFEAFNGIVSLELKGSSSQDVAVSIRNLQKQAAIHLMDELVKG。
SEQ ID NO：2：（经密码子优化后的源于Bacillus sp. Root920的L-氨基酸连接酶Blal的DNA序列）
ATGTCAAAAAAGACAGTTCTAGTAATAGCTGATTTGGGTGGCTGCCCACCGCACATGTTTTATGAAAGCGTTGCGGCATCCTACCATATTGTGAGCTACATACCGCGTCCGTTCGCAATCACTAAAGGCCACGCAGAGCTGATTGAAAAATACAGCATCGCGGTCATCAAGGACCGTGACTACTTCGAAACCCACCCGTCTTTTGAACATCCGGATAGCATTTACTGGGCACACGATGACTACCTGAAGAGCGAAGAAGAGGTGGTGGACGACCTGGTGCGCGTCGCCTCTTTTTTCAAAGCGGACGCAATCACCACCAATAACGAGCTGTTCATCGCCCCGATGGCGAAAGCGGCGGAACGTCTGGGCCTGCGTGGTGCGGGCGTGAAGGCTGCGGAAAAGGCTCGCGATAAGTCCCAAATGAGAGCTGCGTTTAACGCCGCAGGTGTTAAAGCTGTGAAGACCCAGCCGGTTACCACTCTGGCGGATTTCCAGCAAGCAATCGAGCACATCGGTACGCCGCTGATCCTGAAGCCGACCTACTTGGCTTCCTCTATCGGCGTGACCCTGTTTCATGACCGCGCCGGTTCCGACGATTTGTTCCTGAATGTTCAGAGCTACCTGCAAACCATTCCGGTGCCGAACGCGGTTACGTACGAGGCGCCTTTCGTGGCTGAAACGTACCTTGAGGGCGCTTATAAAGACTGGTATCAAGAAGATGGTTATAGCGATTATGTTAGCGTCGAGGGTCTCGTAGTTGAGGGCGAATATATTCCGTTCGTCATTCACGATAAAACCCCGCAGATCGGCTTTACTGAAACCGCGCATATTACCCCGAGCATCCTGGATAATGAGGCGCAGCAAATTATTATCGAAGCGGCGAAAAAGGCGAACGAGGGTCTGGGTTTGGAGAACTGCGCTACCCATACCGAAATCAAGCTGATGAAAAACCGTGAAACCGGTTTGATCGAGAGCGCAGCGCGTTTTGCAGGCTGGAATATGATTCCCAACATCAAGAAAGTTTTCGGTGTTGACATGGCCAAGCTGCTGATTGACGTGCTGGTTGACGGGAAAAAGGCGGAGCTTCCAAAAGAATTACTGAGCGGTCACACCCACTATATTGCGGACTGTCATCTATATCCGCAACATTTTAAAGAGTCTGGTCACATCCCTGCAGAGGCCACCCACATCACGATTGATCATATTCACATCCCGCAGGACGCGCTGGTGGGTGATACCGTTATCGTGTCGAAGAGCGTACCGAGCAAAGGCACGTTTGTTGACCTGAGTCTTTTCGAGGCCTTCAACGGTATTGTGAGCTTAGAGTTGAAGGGCTCATCGTCCCAGGACGTTGCTGTTTCGATCCGTAATCTGCAGAAACAGGCAGCCATCCACCTGATGGATGAATTGGTGAAGGGC。
本申请的L-氨基酸连接酶能够利用多种氨基酸作为底物进行二肽合成。因而，任何L-氨基酸连接酶能够作用的氨基酸均适用于本申请，在一种优选的实施例中，二肽合成反应的底物为氨基酸；在一种优选的实施例中，氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸或酪氨酸中的一种或两种。本申请的L-氨基酸连接酶能够利用上述20种氨基酸作为底物，在底物浓度提高后，仍能保持一定的活性进行二肽的合成。
任何能够利用L-氨基酸连接酶合成得到的二肽均适用于本申请，在一种优选的实施例中，二肽包括Gly-Gln、Gly-Tyr、Gly-Gly或Ala-Gln。特别是利用L-氨基酸连接酶合成得到一些重要的功能二肽。其中，二肽是由一分子氨基酸的α-羧基和另一分子氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键组成，广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品等领域。如甘氨酰谷氨酰胺（Gly-Gln）可替代谷氨酰胺作为细胞培养的营养物质，提高细胞的产量；甘酪二肽（Gly-Tyr）是一种降压肽；双甘氨肽（Gly-Gly）在医药上用作血液保存和蛋白质药物细胞色素C水针剂的稳定剂；丙谷二肽（Ala-Gln）作为手术病人的重要营养补充剂。
本申请的二肽合成反应于碱性环境下，消耗ATP将两个游离的氨基酸连接合成为二肽，任何能够利用L-氨基酸连接酶进行二肽合成反应的反应体系均适用于本申请，在一种优选的实施例中，二肽合成反应的反应体系包括：0.1-0.2M Tris-HCl、0.1-0.2M ATP及0.1-0.2M MgCl2；Tris-HCl的pH值为8.5-9.0。
任何能够完成二肽合成反应的反应条件均适用于本申请，从二肽的反应效率及消耗的能耗角度考虑，在一种优选的实施例中，二肽合成反应的反应温度为20-25℃；反应时间为15-17h。
任何利用L-氨基酸连接酶进行二肽合成反应的酶的质量及底物的浓度均适用于本申请，从提高二肽合成的反应效率的角度来看，在一种优选的实施例中，二肽合成反应的L-氨基酸连接酶在反应体系中的质量浓度为0.05-1mg/mL；二肽合成反应的底物在反应体系中的浓度为10-200 mM。
本发明的第二种典型的实施方式中，提供了一种L-氨基酸连接酶的制备方法，将上述L-氨基酸连接酶的基因克隆至表达载体中，得到重组载体；将重组载体导入大肠杆菌中，得到重组菌株；培养重组菌株，诱导L-氨基酸连接酶的表达，得到培养液；将培养液进行超声破碎后离心，得到L-氨基酸连接酶。通过常规的原核表达蛋白的方法完成对L-氨基酸连接酶的表达生产。
除非特别指明，本申请中所使用的分子生物学实验方法，基本上参照J .Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F .M .Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons ,Inc .，1995中的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本申请，且不意欲限制本申请所要求保护的范围。
任何能够正常表达L-氨基酸连接酶的重组载体均适用于本申请，在一种优选的实施例中，表达载体包括pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b（+）、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。
任何能够正常诱导表达L-氨基酸连接酶的宿主细胞均适用于本申请，在一种优选的实施例中，宿主细胞包括包括原核细胞或真核细胞；原核细胞为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌；更优选地，大肠杆菌的菌种为BL21；真核细胞为酿酒酵母和毕赤酵母。pET-28a(+)。大肠杆菌菌种包括BL21。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1 L-氨基酸连接酶Blal基因的筛选、表达
以报道的具有L-氨基酸连接酶活性的酶的序列为探针，在数据库中进行同源性搜索，初步得到的10条酶，属于ATP-grasp 超家族（ATP 依赖性羧酸-胺连接酶），经过判断是合成短寡肽的良好候选者。对这10个酶进行进一步的序列分析，选择来源于Bacillus sp.Root920的L-氨基酸连接酶Blal进行下一步表达和功能研究。
对来源于Bacillus sp. Root920的L-氨基酸连接酶Blal进行密码子优化，并在基因合成公司进行优化后基因片段的合成，在5’端引入内切酶位点NdeI和3’端引入内切酶位点XhoI，基因合成于pUC19，获得pUC19-Blal。将表达载体pET-28a(+)进行双酶切（NdeI+XhoI），同时L-氨基酸连接酶的基因pUC19-Blal双酶切（NdeI+XhoI），切出编码Blal基因片段与表达载体pET-28a(+)连接，获得含有L-氨基酸连接酶Blal的大肠杆菌重组质粒pET-28a(+)-Blal，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/ Blal。
取含有重组质粒的BL21(DE3)菌株4 ml，接种于含400 mL LB培养基2L三角瓶，37℃ 200 rpm振荡培养2-3h后，OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2 mM IPTG，25℃诱导20h，诱导结束，4℃离心收集菌体。通过超声破碎，离心，收集上清和沉淀，12%分离胶SDS-PAGE结果表明，重组L-氨基酸连接酶在大肠杆菌中得到了表达，如图1所示。其中，M为蛋白marker，泳道1为L-氨基酸连接酶大肠杆菌菌株表达细胞破碎液上清，泳道2为L-氨基酸连接酶大肠杆菌菌株表达细胞破碎液沉淀。该酶基因编码473个氨基酸，理论分子量为52kDa。
注：实施例中所用的试验材料和试剂描述如下：
1、菌株及载体：大肠杆菌表达载体pET-28a(+)及菌株BL21（DE3）
2、培养基：大肠杆菌培养基LB（10 g/L蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，pH7.0）。
实施例2 大肠杆菌表达Blal蛋白的纯化
表达的Blal菌泥以10%菌浓重悬，超声破碎（2 s超声，6 s间隔，25%功率），12000rpm离心30 min，重复离心两次后，过0.45 μm滤膜。采用亲和层析进行纯化，具体流程是：样品以2 ml/min流速上样，然后采用缓冲液A（20 mM Tris-Hcl，200 mM NaCl，pH 8.0）冲洗直至未结合蛋白完全洗脱，接着采用线性梯度咪唑洗脱杂蛋白5个柱体积（咪唑浓度由0 mM提高到30 mM），然后在200 mM洗脱目标蛋白。亲和纯化的蛋白进一步采用超滤管进行离心换液，除去除咪唑和盐，加入终浓度为20%的甘油，放-20℃备用。蛋白浓度采用Bradford方法测定，浓度为80 mg/mL。12%分离胶SDS-PAGE进行分析，结果如图2。其中M为蛋白marker，泳道1-3为洗脱的未结合蛋白，泳道4为30 mM 咪唑洗脱蛋白，泳道5为200 mM 咪唑洗脱目标蛋白。
实施例3 L-氨基酸连接酶Blal的底物谱测定
对Blal合成不同二肽的活性进行考察，反应体系如下（0.5 mL）：以10 mM两种相同或者不同氨基酸为底物， ATP 15 mM，MgCl2 10 mM， Blal纯酶50μg/mL，0.1M Tris-HCl（pH9.0）， 25℃反应16 h。反应结束后加入0.5 mL的甲醇，离心后进行LC-MS分析，反应结果统计如下（表1）：
表1
。
注：此表为Blal的反应结果，第一行和第一列为所示的底物氨基酸。*代表0≤摩尔转化率＜1%， **代表摩尔转化率大于等于1%且小于10%，***代表摩尔转化率大于10%。其中摩尔转化率为反应后体系中的二肽的摩尔浓度/（单一氨基酸摩尔浓度+二肽的摩尔浓度）×100%
从表1中可以说明本发明的L-氨基酸连接酶Blal具有广泛的底物谱，可以用于合成同型和异型功能二肽。
实施例4 L-氨基酸连接酶Blal用于Gly-Tyr合成
对Blal合成高浓度的 Gly-Tyr反应进行考察，反应体系如下（100 mL）：甘氨酸和酪氨酸各200 mM， ATP 200 mM，MgCl2 200 mM， Blal纯酶1 mg/mL，0.1M Tris-HCl（pH9.0）， 25℃反应16 h。反应结束后加入100 mL的甲醇，离心后进行HPLC分析，通过测定不同浓度Gly-Tyr标准品的紫外吸收面积，绘制外标曲线。产品Gly-Tyr浓度通过外标计算，最终测定反应后Gly-Tyr的浓度为130 Mm，摩尔转化率65%，产量约31 g/L。
实施例5 L-氨基酸连接酶Blal用于Gly-Gly合成
对Blal合成高浓度的Gly-Gly反应进行考察，反应体系如下（100 mL）：甘氨酸400mM， ATP 200 mM，MgCl2 200 mM， Blal纯酶1 mg/mL，0.1M Tris-HCl（pH 9.0）， 25℃反应16 h。反应结束后加入100 mL的甲醇，离心后进行HPLC分析，通过测定不同浓度Gly-Gly标准品的紫外吸收面积，绘制外标曲线。产品Gly-Gly浓度通过外标计算，最终测定反应后Gly-Gly的浓度为140 Mm，摩尔转化率70%，产量约18.5 g/L。
实施例6 L-氨基酸连接酶Blal用于Gly-Gln合成
对Blal合成高浓度的Gly-Gln反应进行考察，反应体系如下（100 mL）甘氨酸和谷氨酰胺各200 mM， ATP 200 mM，MgCl2 200 mM， Blal纯酶1 mg/mL，0.1M Tris-HCl（pH9.0）， 25℃反应16 h。反应结束后加入100 mL的甲醇，离心后进行HPLC分析，通过测定不同浓度Gly-Gln标准品的紫外吸收面积，绘制外标曲线。产品Gly-Gln浓度通过外标计算，最终测定反应后Gly-Gln的浓度为120 Mm，摩尔转化率60%，产量约24.4 g/L。
实施例7 L-氨基酸连接酶Blal用于Ala-Gln合成
对Blal合成高浓度的Ala-Gln反应进行考察，反应体系如下（100 mL）丙氨酸和谷氨酰胺各200 mM， ATP 200 mM，MgCl2 200 mM， Blal纯酶1 mg/mL，0.1M Tris-HCl（pH9.0）， 25℃反应16 h。反应结束后加入100 mL的甲醇，离心后进行HPLC分析，通过测定不同浓度Ala-Gln标准品的紫外吸收面积，绘制外标曲线。产品Ala-Gln浓度通过外标计算，最终测定反应后Ala-Gln的浓度为180 mM，摩尔转化率90%，产量约39.1 g/L。
对比例1 Blal与现有L-氨基酸连接酶对比
将本发明中的Blal与现有文献中报道的L-氨基酸连接酶进行对比，可以看出：（1）本发明中的Blal在相同底物浓度下的活性显著高于目前已报道的酶，且在高浓度的底物下，活性依然保持较高水平。（2）本发明中的酶可利用的底物范围更广，可合成的二肽数量更多。（3）本发明中的酶已经实现部分二肽g级制备，证明了相比于较文献报道的酶，更有工业应用潜力和价值。
表2：
。
*上表中的活性数据，以产品对底物的摩尔转化率表示。P. luminescens subsp.laumondii TT0的反应底物为Asn和Ala，除此之外，反应底物均为Ala和Gln。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：（1）本发明中的L-氨基酸连接酶Blal具有广泛的底物谱，可以用于合成同型和异型功能二肽。
（2）本发明中的L-氨基酸连接酶Blal活性高，在200 mM的底物反应中仍然可以达到较高的摩尔转化率，合成高浓度的Gly-Tyr、Gly-Gln、Gly-Gly和Ala-Gln。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种制备二肽的方法，其特征在于，所述方法包括利用如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的L-氨基酸连接酶进行二肽合成反应，得到所述二肽；
所述二肽合成反应的底物为氨基酸；
所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸或酪氨酸中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二肽选自Gly-Gln、Gly-Tyr、Gly-Gly或Ala-Gln。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二肽合成反应的反应体系包括：pH值为8.5-9.0的如下缓冲液：0.1-0.2M Tris-HCl、0.1-0.2M ATP及0.1-0.2M MgCl2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二肽合成反应的反应温度为20-25℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二肽合成反应的反应时间为15-17h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述二肽合成反应的所述L-氨基酸连接酶在反应体系中的质量浓度为0.05-1mg/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述二肽合成反应的底物在反应体系中的浓度为10-200 mM。
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