CN105131089B - 一种十三肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种十三肽及其应用，该合成多肽的氨基酸序列如下所示：Tyr‑Gly‑Phe‑Val‑Met‑Pro‑Arg‑Ser‑Gly‑Leu‑Trp‑Phe‑Arg，缩写为YGFVMPRSGLWFR，分子量1614.9，纯度96.3%。本发明的多肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成。本发明提供了一种具有体外抗肿瘤活性、对人正常肝细胞有一定的促进增殖作用的合成多肽，可应用于生物制药领域。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种合成多肽及其应用。
背景技术
生物活性肽是对机体的功能或状态具有积极作用并最终影响机体健康的特殊蛋白质片段。相较于蛋白质而言，小分子肽片段的优越性主要体现在：更易被人体吸收利用；活性高，在较小浓度下即可发挥其特有的生理作用；分子量小，易于修饰和改造，能够通过人工化学合成等。而相较于单一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸无可比拟的优越性。已有研究证实，人体小肠存在专门的低聚肽吸收通道，人体摄入的蛋白质经过多种消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸收。许多研究表明，各种来源的生物活性肽具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降压、降血糖等多种作用，成为生物医药和保健品开发的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有体外抗肿瘤活性的合成多肽即合成十三肽，可应用于生物制药领域。本发明选取五种肿瘤细胞MCF-7、HepG-2、SGC-7901、A549和HT-29以及一种正常肝细胞L-o2为研究对象，使用MTT法测定合成肽的体外抑制活性。
本发明所述的合成多肽缩写为YGFVMPRSGLWFR，分子量1614.9，序列为：Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg。其中，
Tyr表示英文名称为Tyrosine，中文名称为酪氨酸的氨基酸的相应残基；
Gly表示英文名称为Glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基；
Phe表示英文名称为phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Val表示英文名称为Valine，中文名称为缬氨酸的氨基酸的相应残基；
Met表示英文名称为Methionine ，中文名称为甲硫氨酸的氨基酸的相应残基；
Pro表示英文名称为proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基;
Arg表示英文名称为arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基;
Ser表示英文名称为serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基;
Gly表示英文名称为Glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基；
Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；
Trp表示英文名称为Tryptophan，中文名称为色氨酸的氨基酸的相应残基；
Phe表示英文名称为phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Arg表示英文名称为arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基。
本发明所述的氨基酸序列采用标准 Fmoc 方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的 C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N 端合成。
本发明将终浓度为30-500 µg/mL 的合成多肽与五种肿瘤细胞MCF-7、HepG-2、SGC-7901、A549和HT-29混匀，孵育48 h后，经MTT法检测，对肿瘤细胞抑制率达到46.68%~76.06%。用500 µg/mL的合成多肽处理正常肝细胞后，其L-o2增殖9%, 表明对正常肝细胞L-o2无杀伤作用，反而有一定的促进增殖的效果，安全性非常好,为其在生物医药领域的应用提供参考。
更具体的，将终浓度为30-500 µg/mL 的所述十三肽与肿瘤细胞HepG-2、SGC-7901、A549和HT-29混，孵育48 h后，对四种肿瘤细胞HepG-2、SGC-7901、A549和HT-29的抑制率分别为17.57%-71.79%、20.75%-51.55%、22.17%-76.06%和3.22%-57.27%。将浓度为500µg/mL的所述十三肽与五种肿瘤细胞MCF-7、HepG-2、SGC-7901、A549和HT-29混，孵育48 h后，对A549和HepG-2的体外增殖抑制作用最强，抑制率分别为76.06%和71.79%；其次为HT-29、SGC-7901和MCF-7，其抑制率分别为57.27%、51.55%和46.68%。所述十三肽对 A549、HepG-2、SGC-7901和HT-29的半数抑制浓度IC50值分别为104.05µg/mL、188.23µg/mL、247.32µg/mL和446.72µg/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
本发明首次合成了该肽，并且采用MTT方法检测了合成多肽的体外抗肿瘤活性，所述合成多肽具有很强的肿瘤细胞抑制能力，同时，合成多肽对正常肝细胞无杀伤作用。
附图说明
图1a为合成多肽Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg 的HPLC图。
图1b为合成多肽Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg 的ESI-MS图,其中横坐标为m/z (质荷比值)、纵坐标为relative abundance (相对强度)。
图2为合成肽Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg 对MCF-7、HepG-2、SGC-7901、A549、HT-29和L-02的体外抑制作用(500µg/mL)。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
多肽固相合成
选用高分子树脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg的特征，先将Arg的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Arg的氨基和Phe 的羧基缩水反应，处理后，再添加Trp，Phe的氨基和Trp的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Tyr氨基酸后，再切除树脂即得到目标多肽。采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为Phenomenex C18，尺寸 4.6*150mm，流动相A:含有0.1%三氟乙酸（TFA）的水；流动相B:含有0.09%TFA 的溶液 (80%乙腈+20%水)；20 min内B相由14.0%上升到24.0%，流速1.0 mL/min，检测波长220nm。液氮速冻，冷冻干燥，得到最后的产品，要求纯度达到96.3%以上，并经ESI-MS 鉴定结构。图1a为合成多肽Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe
-Arg 的HPLC图。图1b为合成多肽yr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp
-Phe-Arg 的ESI-MS图,其中横坐标为m/z (质荷比值)、纵坐标为relativeabundance (相对强度)。
合成多肽的体外抗肿瘤活性
通过 MTT 比色法分析各多肽组分对肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7、胃癌细胞SGC-7901、肺癌细胞A549和结肠癌细胞HT-29的生长抑制作用。具体操作步骤如下：
1）取对数生长期的细胞，经0.25%（体积）的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，血球平板计数后，调整细胞悬液的浓度至5×104个/mL，加至96孔板中，每孔100 µL, 于37 ℃恒温CO2培养箱中培养；
2）培养24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200 µL的含有不同浓度待测样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37 ℃恒温CO2培养箱中培养；
3）48 h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 µl和新鲜基础培养基180 µL；于37 ℃恒温CO2培养箱中继续培养；
4）4 h后，弃去含有MTT的培养液，加入150 µl DMSO后于微型振荡器上振荡15min， 490nm 波长处测定光密度值并计算抑制率:
癌细胞生长抑制率(%)=((对照组OD-空白组OD)-(给药组OD-空白组OD ))/((对照组OD-空白组OD ) )×100
应用实施例1
五种肿瘤细胞MCF-7、HepG-2、SGC-7901、A549和HT-29及人正常肝细胞L-02各100µL 细胞悬液(5×104个/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒温CO2培养箱中培养. 24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200 µL的500 µg/mL的多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37 ℃恒温CO2培养箱中培养. 48 h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 µl和新鲜基础培养基180 µL；于37 ℃恒温CO2培养箱中继续培养；4 h后，弃去含有MTT的培养液，加入150 µl DMSO后于微型振荡器上振荡15 min， 490nm波长处测定光密度值并计算抑制率，结果见图2。
应用实施例2
四种肿瘤细胞A549、HepG-2、HT-29和SGC-7901悬液(5×104个/mL)各100 µL, 加至96孔板中，于37 ℃恒温CO2培养箱中培养， 24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200 µL的31.25µg/mL的多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37 ℃恒温CO2培养箱中培养， 48 h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 µl和新鲜基础培养基180 µL；于37 ℃恒温CO2培养箱中继续培养；4 h后，弃去含有MTT的培养液，加入150 µl DMSO后于微型振荡器上振荡15 min， 490nm 波长处测定光密度值并计算抑制率。 由表1可知，31.25µg/mL的多肽对肿瘤细胞A549、HepG-2、HT-29和SGC-7901的抑制率分别是22.17%、17.57%、3.22%和20.75%。
表1
应用实施例3
四种肿瘤细胞A549、HepG-2、HT-29和SGC-7901悬液(5×104个/mL)各100 µL, 加至96孔板中，于37 ℃恒温CO2培养箱中培养. 24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200 µL的62.5µg/mL的多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37 ℃恒温CO2培养箱中培养. 48 h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 µl和新鲜基础培养基180 µL；于37 ℃恒温CO2培养箱中继续培养；4 h后，弃去含有MTT的培养液，加入150 µl DMSO后于微型振荡器上振荡15 min， 490nm 波长处测定光密度值并计算抑制率。由表1可知，62.5µg/mL的多肽对肿瘤细胞A549、HepG-2、HT-29和SGC-7901的抑制率分别是27.51%、21.11%、18.77%和23.42%。
应用实施例4
四种肿瘤细胞A549、HepG-2、HT-29和SGC-7901悬液(5×104个/mL)各100 µL, 加至96孔板中，于37 ℃恒温CO2培养箱中培养. 24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200 µL的125µg/mL的多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37 ℃恒温CO2培养箱中培养. 48 h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 µl和新鲜基础培养基180 µL；于37 ℃恒温CO2培养箱中继续培养；4 h后，弃去含有MTT的培养液，加入150 µl DMSO后于微型振荡器上振荡15 min， 490nm 波长处测定光密度值并计算抑制率。由表1可知，125µg/mL的多肽对肿瘤细胞A549、HepG-2、HT-29和SGC-7901的抑制率分别是59.42%、29.23%、29.23%和28.06%。
应用实施例5
四种肿瘤细胞A549、HepG-2、HT-29和SGC-7901悬液(5×104个/mL)各100 µL, 加至96孔板中，于37 ℃恒温CO2培养箱中培养. 24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200 µL的250 µg/mL的多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37 ℃恒温CO2培养箱中培养. 48 h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 µl和新鲜基础培养基180 µL；于37 ℃恒温CO2培养箱中继续培养；4 h后，弃去含有MTT的培养液，加入150 µl DMSO后于微型振荡器上振荡15 min， 490nm 波长处测定光密度值并计算抑制率。由表1可知，250µg/mL的多肽对肿瘤细胞A549、HepG-2、HT-29和SGC-7901的抑制率分别是65.07%、63.02%、52.43%和39.88%。
Claims (5)
1.一种十三肽，其特征是该十三肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg。
2.权利要求1 所述一种十三肽，其特征在于将终浓度为30-500 µg/mL 的所述十三肽与肿瘤细胞HepG-2、SGC-7901、A549和HT-29混，孵育48 h后，所述十三肽对四种肿瘤细胞HepG-2、SGC-7901、A549和HT-29的抑制率分别为17.57%-71.79%、20.75%-51.55%、22.17%-76.06%和3.22%-57.27%。
3. 根据权利要求1 所述一种十三肽，其特征在于将浓度为500µg/mL的所述十三肽与五种肿瘤细胞MCF-7、HepG-2、SGC-7901、A549和HT-29混，孵育48 h后，所述十三肽对A549和HepG-2的体外增殖抑制作用最强，抑制率分别为76.06%和71.79%；其次为HT-29、SGC-7901和MCF-7，其抑制率分别为57.27%、51.55%和46.68%。
4.根据权利要求3 所述的十三肽，其特征在于所述十三肽对 A549、HepG-2、SGC-7901和HT-29的半数抑制浓度IC50值分别为104.05µg/mL、188.23µg/mL、247.32µg/mL和446.72µg/mL。
5.根据权利要求3 所述的十三肽，其特征在于用浓度为500 µg/mL所述十三肽处理正常肝细胞L-O2后，肝细胞L-O2增殖9%。
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