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CN117659116B - 酪氨酸寡肽的制备方法 - Google Patents

酪氨酸寡肽的制备方法 Download PDF

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CN117659116B CN202311662840.XA CN202311662840A CN117659116B CN 117659116 B CN117659116 B CN 117659116B CN 202311662840 A CN202311662840 A CN 202311662840A CN 117659116 B CN117659116 B CN 117659116B
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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及酪氨酸寡肽的制备方法。受限于酪氨酸在水中的溶解度极低，一般情况下的反应浓度的上限只能是酪氨酸在水中的溶解度(常温常压中性pH下仅为1mM左右)。而本发明则可以在1～4小时的反应中，让酪氨酸二肽在水溶液中合成浓度达到90mM及以上，且反应工艺可靠，体系可进行等比例放大，不发生放大效应。

Description

酪氨酸寡肽的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及酪氨酸寡肽的制备方法。
背景技术
多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。多肽的合成途径包括化学合成和生物合成。多肽的化学合成主要是以氨基酸与氨基酸之间的缩合形式来进行的。多肽的生物合成主要包括发酵法、酶解法和基因工程法。目前，小分子的多肽常化学合成方法。按照反应介质的不同，多肽的化学合成分为液相合成和固相合成。近年来，多肽的液相合成法发展迅速。
酪氨酸(tyrosine；Tyr)的化学名称为2-氨基-3-对羟苯基丙酸，它是一种含有酚羟基的芳香族极性α-氨基酸。因酪氨酸含有疏水官能团苯环，在常温常压中性pH下，酪氨酸在水中溶解度极低(仅为0.5g/L)，也难溶于常见的有机试剂。因此，含有酪氨酸的多肽难以通过液相合成。当前最多的合成酪氨酸二肽的方法包括化学法中的提取制备与合成制备以及发酵法。
化学法多是在进行官能团保护的前提下进行的制备。如在缚酸剂的作用下首先进行缩合与氨化两步反应，然后再经过浓缩、除氨再结晶得到丙酪二肽。需要利用醚、苯、甲苯等多种有害溶剂，且反应步骤两步较为麻烦。提取例如利用美洲大蠊提取物作为底物，经过MCI gel CHP 20P柱11次洗脱分离、再通过凝胶色谱及半制备液相得到环(酪氨酸-苏氨酸)及其盐类。操作繁琐且产物不纯，无法区分旋光性与产物盐。
发酵法使用的是一种以大肠杆菌为基底细胞的改造菌株，使用发酵培养基直接发酵后去除细胞，并从发酵培养基中分离且γ-谷氨酰酪氨酸。但依旧存在两个问题，其一是其生产的二肽产物是γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe的混合物，并不能单独生产目标酪氨酸二肽；其二是发酵法的本身限制因素，即发酵过程至少需要24小时，常规情况需要48小时，造成了较高的能耗与时间成本。
酶法合成二肽是一个较新的二肽合成方法，目前仅有的文献中多数是通过合成一些二肽衍生物再进一步尝试去除修饰基团来实现二肽的生产。例如Takuya M.等(ProcessBiochemistry,(2021)102:186–189)利用铜绿假单胞菌中分离出的蛋白酶来进行羧苯甲氧基-甘氨酸-L-酪氨酸酰胺的合成，随后再尝试去除额外的基团来获得甘氨酰酪氨酸。若采用这种方法来进行二肽生产的合成思路是两步法导致额外的操作难度，从而提高成本；另一方面后续脱修饰基团的步骤也会在反应体系中带来其他的杂质，提高纯化难度与成本以及三废带来的环保压力。
而利用酶法直接合成酪氨酸二肽的仅有Cui X.W.等(Biochemistry andBiotechnology,(2023)195:4336–4346)报道过一种利用氨基酸连接酶在1mL的小体系下合成浓度低于45mM的丙酪二肽。这一方法尽管在实验室阶段成功，但仍存在一些显著的问题，最主要的就是其使用的酶必须是纯化酶，这会带来额外的操作难度与成本，降低了经济效益并且难以产业化。此外，本方法也没有突破酪氨酸难溶导致的反应体系底物浓度过低的问题，难以合成高浓度产物，暂不具备工业应用可能性。
可见，在酪氨酸寡肽的合成中，包括化学合成与发酵法在内的所有合成方法如果需要以液体作为溶剂那么都无可避免的需要面对酪氨酸本身疏水性带来的低溶解度问题。过低的溶解度限制了反应底物浓度，从而限制了反应速率以及产物的产量。化学法中也可以采用固相合成法，但这样合成会使得设备要求非常严格，同时产物无法区分手性，反应不具备扩大生产的客观条件。发酵法则受限于微生物生长代谢的客观条件无法快速累积产物，反应时长较长，带来较高的能耗与时间成本，产物同样无法区分手性。而现有的酶催化法尚不成熟，在实验室阶段时可以采用纯酶进行的直接合成来少量合成酪氨酸寡肽的，但这种方式存在成本高，难放大，合成产物浓度低的问题。若需相对大量的合成酪氨酸寡肽，目前已有的方案就是通过先合成酪氨酸寡肽衍生物，之后再进行脱修饰基团的相关操作，通过多步反应达成目标。而这样的方法会导致杂质多，后处理困难以及成本高经济效益低等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供简单、高效的酪氨酸寡肽的制备方法，使酪氨酸寡肽能够在液相中实现高浓度的合成。
本发明提供了氨基酸连接酶在制备酪氨酸寡肽中的应用。
本发明所述氨基酸连接酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或为与SEQ IDNO:1具有至少80％同一性的序列。
本发明中，所述具有至少80％同一性的序列为在原序列的基础上，经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。优选的，同一性为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。具体实施例中，所述复合酶中，氨基酸连接酶是从苏云金芽孢杆菌中获得的，Uniprot数据库编号为“Uniprot ID：A0A4R4B2K4”。
本发明中，所述酪氨酸寡肽是指含有酪氨酸残基的寡肽，所述寡肽中氨基酸残基的个数为≥2，所述寡肽中，酪氨酸残基的个数≥1。除酪氨酸残基外，所述寡肽中还包括如下氨基酸中至少一种的残基：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。
研究表明，本发明中使用的氨基酸连接酶的催化活性口袋则会专一识别氨基酸，特别是L-Tyr、L-Ser、L-Gly或L-Ala，并与之结合，使酪氨酸能够与这些氨基酸合成肽键，合成酪氨酸寡肽。特别的，本发明使用的氨基酸连接酶，将L-Tyr的N端与L-Ser、L-Gly或L-Ala的C端相连。在本发明实施例中，以二肽为例，验证如前所述氨基酸连接酶对含有酪氨酸的多肽的合成效果。进一步的，本发明还提供了制备酪氨酸寡肽的复合酶，其包括氨基酸连接酶和磷酸激酶。
其中，所述氨基酸连接酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或为与SEQ IDNO:1具有至少80％同一性的序列。
本发明中，所述具有至少80％同一性的序列为在原序列的基础上，经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。优选的，同一性为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％。具体实施例中，所述复合酶中，氨基酸连接酶是从苏云金芽孢杆菌中获得的，Uniprot数据库编号为“Uniprot ID：A0A4R4B2K4”。
本发明所述复合酶中，所述氨基酸连接酶与磷酸激酶的用量根据酶活进行选择，只要能够促进反应的进行，其比例皆在本申请的保护范围之内。具体实施例中，所述氨基酸连接酶和多聚磷酸酶为将发酵获得的固体菌体重悬后破碎获得，以粗酶液参与反应即可。所述氨基酸连接酶与多聚磷酸激酶的体积比为1：(0.8～3)。所述体积比以重悬液体积计算。一些实施例中，所述氨基酸连接酶与多聚磷酸激酶的体积比为1:0.8、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5或1:3。
本发明复合酶中，还包括多聚磷酸盐。所述多聚磷酸盐优选为偏六磷酸钠。
氨基酸在所述氨基酸连接酶作用下形成肽键的过程需要消耗ATP，生成ADP。磷酸激酶可以通过六偏磷酸钠提供磷酸根基团，不断地将生成的ADP再转化为ATP，从而实现了ATP的再被利用，大大减少了ATP的需求量。
本发明对所述磷酸激酶的来源不做限定，能够实现上述功能即可。例如，所述磷酸激酶的来源包括但不限于铜绿单胞菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、伯克霍尔德菌或棒状杆菌等微生物。本发明实施例中，以来自铜绿单胞菌的磷酸激酶为例，进行效果验证。其他磷酸激酶也可以实现降低ATP用量的效果，但铜绿单胞菌来源的磷酸激酶与如前所述苏云金芽孢杆菌来源的氨基酸连接酶能够很好的配合，不仅更好的降低ATP的用量，还能够提高目标产物的含量和反应速度。所述磷酸激酶具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的序列。具体实施例中，磷酸激酶是从假铜绿单胞菌中获得的，Uniprot数据库编号为“Uniprot ID：Q9HYF1”。一些实施例中，本发明所述复合酶中还包括多聚磷酸盐；本发明对多聚磷酸盐的种类不做限定，凡具备参与ATP循环能力的多聚磷酸盐皆可用于本发明的方案。一些具体实施例中，所述多聚磷酸盐包括但不限于三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、偏磷酸钾等。本发明实施例中，以六偏磷酸钠为例对效果进行验证。
进一步的，本发明还提供了如前所述的复合酶在制备酪氨酸寡肽中的应用。本发明对所述酪氨酸寡肽中，氨基酸残基的个数不做限定，优选的，所述酪氨酸寡肽的氨基酸残基个数为2～10。所述酪氨酸寡肽中，与酪氨酸相连的氨基酸残基为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸中任一种，优选为Ala、Ser或Gly。
本发明利用上述复合酶突破了产物浓度问题，利用可控流加补料的方式在不提高底物在反应体系中的实时浓度的前提下大幅提高了产物浓度。并且，本发明通过试验寻找到了产物合成反应和分解反应的强度变化临界点。仅需在分解反应强度超过合成反应之前对反应体系进行淬灭即可防止杂酶分解产物，故本方法可以直接利用粗酶液进行反应。并且，本发明利用磷酸激酶，实现了供能物ATP的循环利用，只需要非常少的能源物质即可满足反应需求。同时得益于酶反应的高效性，反应时间被大大缩短至数小时内，这也大幅减少了能源开支与时间成本。而酶反应的特异性也能够对反应底物进行特异性的选择反应，产品纯度可以达到相关标准。更重要的是，经过反复尝试获得的工艺十分可靠，可以直接的进行等比例放大，且在放大过程中不会出现显著的放大效应，易于工业化批量生产。
本发明提供的酪氨酸寡肽的制备方法，包括：
将反应物A与反应物B在酶作用下反应，合成酪氨酸寡肽；
所述酶为氨基酸连接酶或为如前所述的复合酶。
所述氨基酸连接酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的序列。
所述反应物A为Tyr，或为N端为Tyr的寡肽；
所述反应物B为X，或C端为X的寡肽，其中，X为Ala、Ser或Gly。
本发明对所述寡肽中氨基酸的个数为不做限定，所述寡肽中的氨基酸残基选自为酪氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸中的任意任意两种或两种以上。
本发明所述制备方法中，所述反应的溶剂为水。并且，在生产全程不需有毒有害的有机溶剂，也不产生对环境存在显著危害的副产物或三废。
一些实施例中，仅利用氨基酸连接酶进行制备：
所述反应包括：
将部分反应物A溶于水，制得反应物A溶液，
将余量反应物A溶于水，制得补料液；
在反应物A溶液中加入反应物B、ATP和氯化镁，制得反应液；
在反应液中加入氨基酸连接酶和补料液，反应25～35min后，补加氯化镁溶液，继续反应制得含有所述酪氨酸寡肽的产物。优选的，反应30min后，补加氯化镁溶液。
在这些实施例中，
所述反应物A溶液中，反应物A的浓度为5～20mM，pH值为12.0～13.5。作为优选，以NaOH溶液调节pH值，所述反应物A溶液的pH值为12.0、12.5、13.0或13.5。所述反应物A的浓度为5mM、10mM、15mM或20mM。
所述补料液中，反应物A的浓度为350～550mM，pH值为12.0～13.5。作为优选，补料液以氢氧化钠水溶液配制，氢氧化钠水溶液的pH值为13.5～14.0。制得补料液的pH值为12.0、12.5、13.0或13.5。
所述反应物A与反应物B的摩尔比为1：(1.2～2.0)。作为优选，反应物A与反应物B的摩尔比为1：1.2、1：1.5、1：1.7、1：1.9或1：2.0。
所述反应液中ATP的初始浓度为1～3mM，氯化镁的初始浓度为20～50mM。作为优选，ATP的初始浓度为1mM、2mM或3mM，氯化镁的初始浓度为20mM、30mM、40mM或50mM。
所述反应液中，加入氨基酸连接酶至氨基酸连接酶的浓度为2～10U/mL。作为优选，氨基酸连接酶的浓度为5～8U/mL，更优选的，氨基酸连接酶的浓度为2U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、8U/mL或10U/mL。
所述氯化镁溶液中氯化镁的浓度为1～5.9M，补加至反应体系中镁离子浓度为50～200mM。作为优选，氯化镁溶液中氯化镁的浓度为1M、2M、4M或5.9M。补加至反应体系中镁离子浓度为50mM、60mM、80mM、100mM、120mM、140mM、160mM、180mM或200mM。
在这些实施例中，所述反应物A为L-Tyr，所述反应物B为L-Ser、L-Ala或L-Gly。产物为L-Ala-L-Tyr、L-Ser-L-Tyr或L-Gly-L-Tyr。
另一些实施例中，利用氨基酸连接酶、磷酸激酶和多聚磷酸盐进行制备：
所述反应包括：
将部分反应物A溶于水，制得酪氨酸溶液，
将余量反应物A溶于水，制得补料液；
在反应物A溶液中加入反应物B、ATP、多聚磷酸盐和氯化镁，制得反应液；
在反应液中加入氨基酸连接酶、多聚磷酸激酶和补料液，反应10～50min后，补加氯化镁溶液，继续反应制得含有所述酪氨酸寡肽的产物。优选的，反应30min后，补加氯化镁溶液。
在这些实施例中，
所述反应物A溶液中，反应物A的浓度为5～20mM，pH值为12.0～13.5。作为优选，以NaOH溶液调节pH值，所述反应物A溶液的pH值为12.0、12.5、13.0或13.5。所述反应物A的浓度为5mM、10mM、15mM或20mM。
所述补料液中，反应物A的浓度为350～550mM，pH值为12.0～13.5。作为优选，补料液以氢氧化钠水溶液配制，氢氧化钠水溶液的pH值为13.5～14.0。制得补料液的pH值为12.0、12.5、13.0或13.5。
所述反应物A与反应物B的摩尔比为1：(1.2～2.0)；作为优选，反应物A与反应物B的摩尔比为1：1.2、1：1.5、1：1.7、1：1.9或1：2.0。
所述反应液中ATP的初始浓度为1～3mM，多聚磷酸盐的初始浓度为5～100mM，氯化镁的初始浓度为20～50mM；作为优选，ATP的初始浓度为1mM、2mM或3mM，氯化镁的初始浓度为20mM、30mM、40mM或50mM。
所述反应液中，加入氨基酸连接酶至其浓度为2～10U/mL。作为优选，氨基酸连接酶的浓度为5～8U/mL，更优选的，氨基酸连接酶的浓度为2U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、8U/mL或10U/mL。加入多聚磷酸激酶至其浓度为1～10U/mL，作为优选，多聚磷酸激酶的浓度为4～6U/mL，更优选的，多聚磷酸激酶的浓度为4U/mL、5U/mL或6U/mL.
所述氯化镁溶液中氯化镁的浓度为4M，补加至反应体系中镁离子浓度为50～200mM。作为优选，氯化镁溶液中氯化镁的浓度为1～5.9，例如为：1M、2M、4M、。补加至反应体系中镁离子浓度为50mM、60mM、80mM、100mM、120mM、140mM、160mM、180mM或200mM。
在这些实施例中，所述反应物A为L-Tyr，所述反应物B为L-Ser、L-Ala或L-Gly。产物为L-Ala-L-Tyr、L-Ser-L-Tyr或L-Gly-L-Tyr。
如前所述方法中，
所述反应的温度为25℃～50℃，总反应时长为1～4h。
作为优选，38℃反应1h、40℃反应1h、25℃反应4h、30℃反应3h或50℃反应1h。
反应体系初始pH值为6.5～9.5，反应过程控制反应体系pH值为7.0～9.0。
作为优选，初始pH值为9.0，反应过程控制pH值为8.7；或初始pH值为8.0，反应过程控制pH值为9.0；或初始pH值为9.5，反应过程控制pH值为8.5；或初始pH值为8.0，反应过程控制pH值为7.5；或初始pH值为6.5，反应过程控制pH值为7.0。
反应开始即补加补料液，补料液补加时长为10～50min，补料体积为初始体积的20％～50％。
作为优选，补料液补加时长为40min，补加体积为初始体积的40％；或者补料液补加时长为30min，补加体积为初始体积的30％；或者补料液补加时长为25min，补加体积为初始体积的25％；或者补料液补加时长为50min，补加体积为初始体积的50％；或者补料液补加时长为10min，补加体积为初始体积的20％。
从反应开始后的第30min开始补加氯化镁溶液，补加氯化镁溶液的时长为10～60min，补加氯化镁溶液的体积为初始体积的1.25～5％。
作为优选，补加氯化镁溶液的时长为30min，补加氯化镁溶液的体积为初始体积的2.5％。或者补加氯化镁溶液的时长为20min，补加氯化镁溶液的体积为初始体积的1.8％。补加氯化镁溶液的时长为40min，补加氯化镁溶液的体积为初始体积的3.5％。补加氯化镁溶液的时长为50min，补加氯化镁溶液的体积为初始体积的4.2％。补加氯化镁溶液的时长为60min，补加氯化镁溶液的体积为初始体积的5％。
受限于酪氨酸在水中的溶解度极低，一般情况下的反应浓度的上限只能是酪氨酸在水中的溶解度(常温常压中性pH下仅为1mM左右)。而本发明则可以在1～4小时的反应中，让酪氨酸二肽在水溶液中合成浓度达到90mM及以上，且反应工艺可靠，体系可进行等比例放大，不发生放大效应。
附图说明
图1示实施例1中丙酪二肽反应后样品液相谱图，产物浓度为22g/L；
图2示实施例1中丙酪二肽反应后样品液相谱图，产物浓度21g/L；
图3示实施例3中甘酪二肽反应后样品液相谱图，产物浓度21g/L；
图4示实施例4中丝酪二肽反应后样品液相谱图，产物浓度21.5g/L；
图5示实施例5中甘酪二肽反应后样品液相谱图，产物浓度21g/L。
具体实施方式
本发明提供了酪氨酸寡肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
涉及的缩写及英文含义包括：ATP：5’-三磷酸腺苷二钠盐；L-Ala：左旋丙氨酸；L-Tyr：左旋酪氨酸；L-Ala-L-Tyr：L-丙氨酰酪氨酸；Gly：甘氨酸。
本发明实施例中所述氨基酸连接酶是从苏云金芽孢杆菌中获得的，Uniprot数据库编号为“Uniprot ID：A0A4R4B2K4”；氨基酸序列为：
MKRLNVLVIADLGGCPPHMFYESVARKYNIISYIPRPFAITENHAKLIENYSVAVIKDADFLNDISDFKHPESIYWAQKKYEKPEEVVVEDIIKVAKMFNVSAITTNNELFVVPMAKACEKLGLRGAGVQAAEKARDKNLMREAFNTSGVKSIKSKRVGTLEDFRKALEYIKLPAILKPTYLASSIGVTFIHNMENAEELFLQVENLLTGIDVPKSVKYEAPFILEEYLIGEYHDWYTEEGYSDYISIEGIMVNKEYHPLVIHDKTPQIGFVETSHITSSILDEDAKKKIIEAAKKANEGLGLENCATHTEIKLMKNRELGIIESAARFAGWDMIPNIKKVYGVDAAEILVDVLCHGFSENLPNQLLDNPKKYVADFHLYPTDFMKTGEIDENQEVIIFNKITIPEGILVGDTEINSFSTVESGTKINLKLFEAFNSLANLHLSSSNSKDLVKSIKNIQNNASLLLIGDYSLV(SEQ ID NO:1)
本文实施例种提到的多聚磷酸激酶是从假铜绿单胞菌中获得的，Uniprot数据库编号为“Uniprot ID：Q9HYF1”。氨基酸序列为：
MFESAEVGHSIDKDTYEKAVIELREALLEAQFELKQQARFPVIILINGIEGAGKGETVKLLNEWMDPRLIEVQSFLRPSDEELERPPQWRFWRRLPPKGRTGIFFGNWYSQMLYARVEGHIKEAKLDQAIDAAERFERMLCDEGALLFKFWFHLSKKQLKERLKALEKDPQHSWKLSPLDWKQSEVYDRFVHYGERVLRRTSRDYAPWYVVEGADERYRALTVGRILLEGLQAALATKERAKRQPHAAPLVSSLDNRGLLDSLDLGQYLDKDAYKEQLAAEQARLAGLIRDKRFRQHSLVAVFEGNDAAGKGGAIRRVTDALDPRQYHIVPIAAPTEEERAQPYLWRFWRHIPARRQFTIFDRSWYGRVLVERIEGFCAPADWLRAYGEINDFEEQLSEYGIIVVKFWLAIDKQTQMERFKEREKTPYKRYKITEEDWRNRDKWDQYVDAVGDMVDRTSTEIAPWTLVEANDKRFARVKVLRTINDAIEAAYKKDK(SEQ ID NO:2)
由于磷酸激酶具备一定的通用特点，本文不对磷酸激酶的种类和来源做出限制。应当认为所有能够满足反应体系中ATP循环所需的磷酸激酶均可以用于本工艺生产。
本发明实施例中，涉及氨基酸连接酶和磷酸激酶可以于市场购得，也可根据其氨基酸序列自行制得，本发明对此不做限定。其制备的方法可采用基因工程方法，也可采用其他方法，本发明对此亦不做限定。具体实施例中，分别制备氨基酸连接酶和磷酸激酶。制备方法为：构建基因工程菌株，进行发酵，将发酵获得的固体菌体与20mM的PBS缓冲液按照1：5的重量比进行重悬，在充分重悬后放置于高压均质机中进行菌体细胞破碎，破碎均质压力为500～900bar，均质次数为3次。均质后得到细胞破碎粗酶液，可以直接用于后续反应。
作为优选，一些实施例中通过氨基酸连接酶催化合成产物。利用磷酸激酶催化进行的ATP再生循环体系以提供能量。具体的，包括以下步骤：
步骤1：以水为溶剂，将10mM的酪氨酸原料投入到反应初始体积60％的水中，加入4M的氢氧化钠作为pH调整剂调整pH到12.0以上。此时酪氨酸全部溶解；
步骤2：加入另一种用于合成的氨基酸、ATP、多聚磷酸盐、氯化镁等辅料，加入充分溶解，在加热条件下加入氨基酸连接酶与多聚磷酸激酶催化底物反应，生成产物；
步骤3：将剩余反应用酪氨酸原料溶入到水中，加入4M的氢氧化钠pH调整至12.0～13.5，并定容到反应初始体积的33％(反应初始体积指的是步骤1中的酪氨酸溶液加上pH调整所用的氢氧化钠溶液、盐酸溶液、酶液、氯化镁加入后的溶胀体积。最终以上全部之和为100％的初始反应体积。此处酪氨酸补料液是指在100％的初始体积之外额外再加入的体积为33％反应初始体积的部分。)。在加入反应用酶时便开始进行补料，补料过程约耗时20～40min。
步骤4：在反应结束后及时加入大量的氢氧化钠以淬灭反应体系中的酶，淬灭后的反应体系稳定且不会出现产物降解现象。
本发明采用一步合成高浓度酪氨酸二肽的酶合成法——这将大大减少现有合成方法带来的污染与高昂成本。此外，不同于传统酶法合成工艺动辄6～10小时的反应时间，本发明反应时长在4小时乃至更短，这大幅节省了反应所需的时间成本与维持反应温度的能耗。另一方面，通过高浓度的补料料液流加合成也有两项明显的优点，首先就是突破了目标产物受限于底物在水相中的低溶解度导致的低产量问题，通过一定速率的底物流加能够使得反应体系中的底物浓度始终维持在其溶解度范围之内，而合成后的产物则可以正常累积，使得反应产物产量的主要限制条件从底物溶解度变更为了产物溶解度。其次则是酶法合成在反应过程中多需要ATP作为供能物，ATP水解时会按照如下方程式进行
ATP+H2O→能量+ADP+Pi+H+
由于ATP水解时会产生磷酸根与氢离子，反应合成过程中会出现明显的pH降低，此时需要使用碱液进行pH控制，这很容易导致反应液局部pH过高从而杀死反应用酶，通过适合pH的补料液流加可以在维持底物浓度的同时顺便控制pH的方式可以保持反应体系内的pH不易出现过高的情况，一举两得。
本发明实施例中所述转化率，全称为“归一法转化率”是根据HPLC检测中的添加量较少的底物(本反应为Tyr)和产物的相对峰面积进行计算的。由于反应溶液中Tyr的存在方式只有游离酪氨酸与酪氨酸二肽这两种，且理论上二者可以100％相互转化。故将二者的相对峰面积之和认为100％，看产物的相对峰面积能够占到这100％中的值。计算公式为：
转化率＝(产物浓度/产物相对分子量)/(产物浓度/产物相对分子量)+(底物浓度/底物相对分子量)
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1:
向500mL三口瓶中，加入100mL水和0.45gL-Tyr(10mM)，然后加入的4M氢氧化钠，使pH到达12.0，再加入5.94gL-Ala(200mM)，0.36gATP(2mM)，6.09g六偏磷酸钠(60mM)、1.69gMgCl2(25mM)加水至总体积达到210mL。另外制备补料液：向烧杯中加入5.58g L-Tyr(补料液浓度370mM)溶解在pH为14.0的水-氢氧化钠溶液中，溶解后pH 13.0，体积为80mL。加入氨基酸连接酶14mL和多聚磷酸激酶25mL，此混合体系在38℃温度条件下反应1h，反应体系初始pH9.0，反应过程pH8.7，反应一开始就进行补料，补料时间40min，补料结束后继续使用4M的氢氧化钠控制pH。反应30min时开始补加4M的氯化镁溶液，补加时间为30min，补加量为8.3mL(100mM)。反应1h后L-Ala-L-Tyr转化率达98％，反应结束后，体系中L-Ala-L-Tyr浓度为22g/L。
实施例2：
向5L三口瓶中，加入1000mL水和5.44gL-Tyr(10mM)，然后加入的4M氢氧化钠，使pH到达13.0，再加入49.89gL-Ala(140mM)，4.4gATP(2mM)，195.77g六偏磷酸钠(80mM)、24.39gMgCl2(30mM)加水至总体积达到2.8L。另外制备补料液：向烧杯中加入72.48g L-Tyr(补料液浓度400mM)溶解在pH为13.5的水-氢氧化钠溶液中，溶解后pH 12.5，体积为1.2L。加入氨基酸连接酶225mL和多聚磷酸激酶600mL，此混合体系在40℃温度条件下反应1h，反应体系初始pH9.5，反应过程pH8.5，反应一开始就进行补料，补料时间30min，补料结束后继续使用4M的氢氧化钠控制pH。反应30min时开始补加4M的氯化镁溶液，补加时间为20min，补加量为150mL(150mM)。反应1h后L-Ala-L-Tyr转化率达95％，反应结束后，体系中L-Ala-L-Tyr浓度为22g/L。
实施例3：
向500mL三口瓶中，加入100mL水和0.45gL-Tyr(10mM)、然后加入的4M氢氧化钠，使pH到达12.5，再加入3.75g L-Gly(150mM)，0.36g ATP(2mM)，20.37g六偏磷酸钠(100mM)、1.35g MgCl2(20mM)加水至总体积达到200mL。另外制备补料液：向烧杯中加入4.76g L-Tyr(补料液浓度350mM)溶解在pH为14.0的水-氢氧化钠溶液中，溶解后pH 13.5，体积为75mL。加入氨基酸连接酶18mL和多聚磷酸激酶30mL，此混合体系在25℃温度条件下反应4h，反应体系初始pH8.0，反应过程pH9.0，反应一开始就进行补料，补料时间25min，补料结束后继续使用4M的氢氧化钠控制pH。反应30min时开始补加4M的氯化镁溶液，补加时间为40min，补加量为13.54mL(200mM)。反应4h后L-Gly-L-Tyr转化率达95％。反应结束后，体系中L-Gly-L-Tyr浓度为22g/L。
实施例4：
向500mL三口瓶中，加入100mL水和0.45gL-Tyr(10mM)、然后加入的4M氢氧化钠，使pH到达12.0，再加入4.19g L-Ser(120mM)，0.36g ATP(2mM)，16.29g六偏磷酸钠(80mM)、3.38g MgCl2(50mM)加水至总体积达到210mL。另外制备补料液：向烧杯中加入8.27g L-Tyr(补料液浓度550mM)溶解在pH为13.5的水-氢氧化钠溶液中，溶解后pH 12.5，体积为85mL。加入氨基酸连接酶15mL和多聚磷酸激酶28mL，此混合体系在30℃温度条件下反应3h，反应体系初始pH8.0，反应过程pH7.5，反应一开始就进行补料，补料时间50min，补料结束后继续使用4M的氢氧化钠控制pH。反应10min时开始补加4M的氯化镁溶液，补加时间为50min，补加量为4.16mL(50mM)。反应3h后L-Ser-L-Tyr转化率达96％。反应结束后，体系中L-Ser-L-Tyr浓度为21.5g/L。
实施例5：
向5L三口瓶中，加入1000mL水和5.44gL-Tyr(10mM)、然后加入的4M氢氧化钠，使pH到达13.5，再加入45.04g L-Gly(150mM)，4.4gATP(2mM)，244.71g六偏磷酸钠(100mM)、8.2gMgCl2(10mM)加水至总体积达到2.2L。另外制备补料液：向烧杯中加入76.09g L-Tyr(补料液浓度350mM)溶解在pH为13.5的水-氢氧化钠溶液中，溶解后pH 12.0，体积为1.2L。加入氨基酸连接酶200mL和多聚磷酸激酶600mL，此混合体系在50℃温度条件下反应1h，反应体系初始pH6.5，反应过程pH7.0，反应一开始就进行补料，补料时间10min，补料结束后继续使用4M的氢氧化钠控制pH。反应30min时开始补加4M的氯化镁溶液，补加时间为60min，补加量为162.64mL(200mM)。反应4h后L-Gly-L-Tyr转化率达95％反应结束后，体系中L-Gly-L-Tyr浓度为21g/L。
实施例6：
向100mL三口瓶中，加入20mL水和0.09g L-Tyr(10mM)、然后加入的4M氢氧化钠，使pH到达13.5，再加入0.89g L-Ala(200mM)，2.76g ATP(100mM)，1.5mL 4M的MgCl2母液(120mM)加水至总体积达到41mL。另外制备补料液：向烧杯中加入0.54g L-Tyr(补料液浓度300mM)溶解在pH为13.5的水-氢氧化钠溶液中，溶解后pH 12.3，体积为10mL。加入氨基酸连接酶1.5mL，此混合体系在50℃温度条件下反应4h，反应体系初始pH7.0，反应过程pH8.0，反应一开始就进行补料，补料时间10min，补料结束后继续使用4M的氢氧化钠控制pH。反应4h后L-Ala-L-Tyr转化率达92％，反应结束后，体系中L-Ala-L-Tyr浓度为21.2g/L。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.氨基酸连接酶在制备酪氨酸寡肽中的应用；
所述氨基酸连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述酪氨酸寡肽为Tyr-Ala、Tyr-Ser或Tyr-Gly。
2.复合酶在制备酪氨酸寡肽中的应用，
所述酪氨酸寡肽为Tyr-Ala、Tyr-Ser或Tyr-Gly；
所述的复合酶中包括氨基酸连接酶、磷酸激酶和多聚磷酸盐；
所述氨基酸连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述多聚磷酸盐为三聚磷酸钠、六偏磷酸钠或偏磷酸钾。
3.酪氨酸寡肽的制备方法，其特征在于，包括：
将部分反应物A溶于水，制得反应物A溶液，
将余量反应物A溶于水，制得补料液；
在反应物A溶液中加入反应物B、ATP和氯化镁，制得反应液；
在反应液中加入氨基酸连接酶和补料液，进行反应制得含有所述酪氨酸寡肽的产物；
所述酪氨酸寡肽为Tyr-Ala、Tyr-Ser或Tyr-Gly；
所述反应物A为Tyr；
所述反应物B为X，X为Ala、Ser或Gly；
所述氨基酸连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述反应的溶剂为水，所述反应的温度为25℃~50℃，总反应时长为1~4h，反应体系初始pH值为6.5~9.5，反应过程控制反应体系pH值为7.0~9.0；
所述补料液中反应物A的浓度为350~550mM，pH值为12.0~13.5；所述反应开始即补加补料液，补料液补加时长为10~50min，补料体积为初始体积的20%~50%；
从反应开始后的第25~35min开始补加氯化镁溶液，补加氯化镁溶液的时长为10~60min，补加氯化镁溶液的体积为初始体积的1.25%~5%。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
所述反应物A的溶液中，反应物A的浓度为10 mM，pH值为12.0~13.5；
所述反应物A的与反应物B的摩尔比为1：（1.2~2.0）；
所述反应液中ATP的初始浓度为2mM，氯化镁的初始浓度为20~50mM；
所述反应液中，加入氨基酸连接酶至氨基酸连接酶的浓度为8U/mL；
所述氯化镁溶液中氯化镁的浓度为4M，补加至反应体系中镁离子浓度为50~200mM。
5.酪氨酸寡肽的制备方法，其特征在于，包括：
将部分反应物A溶于水，制得反应物A溶液，
将余量反应物A溶于水，制得补料液；
在反应物A溶液中加入反应物B、ATP、多聚磷酸盐和氯化镁，制得反应液；
在反应液中加入氨基酸连接酶、多聚磷酸激酶和补料液，进行反应制得含有所述酪氨酸寡肽的产物；
所述酪氨酸寡肽为Tyr-Ala、Tyr-Ser或Tyr-Gly；
所述反应物A为Tyr；
所述反应物B为X， X为Ala、Ser或Gly
所述氨基酸连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述多聚磷酸盐为三聚磷酸钠、六偏磷酸钠或偏磷酸钾；
所述反应的溶剂为水，所述反应的温度为25℃~50℃，总反应时长为1~4h，反应体系初始pH值为6.5~9.5，反应过程控制反应体系pH值为7.0~9.0；
所述补料液中反应物A的浓度为350~550mM，pH值为12.0~13.5；所述反应开始即补加补料液，补料液补加时长为10~50min，补料体积为初始体积的20%~50%；
从反应开始后的第25~30min开始补加氯化镁溶液，补加氯化镁溶液的时长为10~60min，补加氯化镁溶液的体积为初始体积的1.25%~5%。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
所述反应物A溶液中反应物A的浓度为10 mM，pH值为12.0~13.5；
所述反应物A与反应物的摩尔比为1：（1.2~2.0）；
所述反应液中ATP的初始浓度为2mM，多聚磷酸盐的初始浓度为5~100mM，氯化镁的初始浓度为20~50mM；
所述反应液中，加入氨基酸连接酶至其浓度为10U/mL，加入多聚磷酸激酶至其浓度为5U/mL，
所述氯化镁溶液中氯化镁的浓度为4M，补加至反应体系中镁离子浓度为50~200mM。
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