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TW202024332A - 吡咯賴氨酰-tRNA合成酶 - Google Patents

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TW202024332A
TW202024332A TW108131369A TW108131369A TW202024332A TW 202024332 A TW202024332 A TW 202024332A TW 108131369 A TW108131369 A TW 108131369A TW 108131369 A TW108131369 A TW 108131369A TW 202024332 A TW202024332 A TW 202024332A
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pylrs
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TW108131369A
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坂本健作
山口純
木村史枝
横山茂之
柳澤達男
關英子
倉谷光央
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國立研究開發法人理化學研究所
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Abstract

提供有效的含非天然氨基酸的多肽的製作方法、向多肽引入非天然氨基酸的方法、結合了非天然氨基酸的tRNA的製作方法、非天然氨基酸引入系統、或使用於此類的材料。 一種含非天然氨基酸的多肽的製作方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸接觸的工序，且包括選自以下工序（a）和工序（b）的引入工序，工序（a）： 與利用使用了馬氏甲烷八疊球菌的PylRS(MmPylRS)的無細胞蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸;工序（b）： 與利用使用了具有受glmS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況，以及，使用了具有受glnS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。

Description

吡咯賴氨酰-tRNA合成酶
本發明涉及一種使用了吡咯賴氨酰（pyrrolysyl）-tRNA合成酶的含非天然氨基酸的多肽的製作方法。
氨基酰tRNA合成酶(aaRS)是參與蛋白質合成的酶。具體而言，已知可使氨基酸與tRNA形成酯鍵從而具有合成氨基酰tRNA的活性。氨基酰tRNA是一種分子參與在核醣體構成蛋白質的肽鏈的伸長。
使用吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(PylRS)，一種氨基酰tRNA合成酶進行將非天然氨基酸引入蛋白質的研究。例如，專利文獻1公開了通過使用馬氏甲烷八疊球菌(M. mazei)的PylRS(MmPylRS)，將賴氨酸衍生物的α-羥酸衍生物引入蛋白質。專利文獻2公開了通過使用MmPylRS的變異體，將賴氨酸衍生物引入蛋白質。專利文獻3公開了通過使用MmPylRS的變異體，將抗體引入ZLys衍生物。並且在該文獻還公開了利用點擊化學製作了ZLys衍生物引入抗體的化學修飾體。
非專利文獻1公開了PylRS的N末端結構域是in vivo活性所必須的。非專利文獻2公開了PylRS的N末端結構域與tRNA的結合。非專利文獻3公開了PylRS的N末端結構域和tRNA的相互作用。
非專利文獻4公開了MmPylRS具有N末端結構域，相反，Methanomethylophilus alvus(M. alvus)的PylRS(MaPylRS)不具有N末端結構域。且公開了通過使用了MaPylRS的大腸桿菌蛋白質合成系統將非天然氨基酸引入蛋白質。 [現有技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] 國際公開2009/066761 [專利文獻2] 國際公開2009/038195 [專利文獻3] 國際公開2017/030156 [非專利文獻]
[非專利文獻1] "The amino-terminal domain of pyrrolysyl-tRNA synthetase is dispensable in vitro but required for in vivo activity." Herring et al.， FEBS Lett. 2007 Jul 10;581(17):3197-203. [非專利文獻2] "PylSn and the Homologous N-terminal Domain of Pyrrolysyl-tRNA Synthetase Bind the tRNA That Is Essential for the Genetic Encoding of Pyrrolysine" Jiang et al.， J Biol Chem. 2012 Sep 21; 287(39): 32738-32746. [非專利文獻3] "Crystal structures reveal an elusive functional domain of pyrrolysyl-tRNA synthetase." Suzuki et al.， Nat Chem Biol. 2017 Dec;13(12):1261-1266. [非專利文獻4] "Mutually orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs." Willis et al.， Nat Chem. 2018 May 28. doi: 10.1038/s41557-018-0052-5. [Epub ahead of print]
[發明要解決的課題]
上述非專利文獻4公開了即使使用不具有N末端結構域的MaPylRS時也可引入非天然氨基酸，但非專利文獻4的大腸桿菌蛋白質合成系統中，非天然氨基酸的引入效率的高度並不充分。
上述非專利文獻4公開了有無引入非天然氨基酸的正交性實驗、非天然氨基酸的選擇性實驗、引入1個多肽不同的非天然氨基酸的實驗。相反，與MmPylRS相比較，並沒有公開能顯著提高引入效率的方法。應予說明，作為表達MmPylRS的啟動子使用了glmS啟動子(非高表達啟動子)。
另一方面，本發明人嘗試了使用MmPylRS通過無細胞蛋白質合成系統將非天然氨基酸引入蛋白質。然而得知，為了使用於無細胞蛋白質合成系統而提取了MmPylRS的結果，其濃縮極限為4mg/mL以下，無法使用比此更高濃度使用MmPylRS(實驗例1、實施例2、3)。其結果為，無法提高非天然氨基酸的引入效率。
本發明人還嘗試了使用MmPylRS通過大腸桿菌蛋白質合成系統將非天然氨基酸引入蛋白質。此時，使用高表達啟動子使MmPylRS實現了高表達。然而得知，非天然氨基酸的引入效率低(實施例9)。還得知大腸桿菌的增值惡化。由此可知，在使用MmPylRS的大腸桿菌蛋白質合成系統中，不適合使PylRS高表達。
本發明鑑於這種情況，以提供有效的含非天然氨基酸的多肽的製作方法、向多肽引入非天然氨基酸的方法、結合了非天然氨基酸的tRNA的製作方法、非天然氨基酸引入系統、或使用於此類的材料為目的。 [解決課題的手段]
如後述的實施例，本發明人首次提取純化了MaPylRS。進一步，濃縮了MaPylRS溶液時，MaPylRS的濃縮極限顯著得高，從而得知可製備高濃度的MaPylRS溶液(實施例1、3)。此MaPylRS的濃縮極限為MmPylRS的濃縮極限的5倍以上，超出了預期。
還嘗試使用高濃度的MaPylRS溶液，通過無細胞蛋白質合成系統將非天然氨基酸引入蛋白質(實施例3、6)。其結果為，非天然氨基酸的引入效率顯著高於MmPylRS而超出了預期。
還嘗試以點擊化學使引入至Fab抗體的TCO*-Lys和熒光基板進行反應(實施例8)。其結果為，出人意料的是，結合反應僅在10分鐘內幾乎完成。由於蛋白質具有不穩定的性質，在短時間內完成反應的能力是一個劃時代的結果。
還嘗試通過使用具有受控於強啟動子的MaPylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統，將非天然氨基酸引入於蛋白質(實施例9~12)。其結果為，非天然氨基酸的引入效率顯著高於MmPylRS而超出了預期。
即，根據本發明的一個實施方式，可提供一種製作方法，其為包括了使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸接觸的工序的含非天然氨基酸的多肽的製作方法，且包括選自以下工序（a）和工序（b）的引入工序:工序（a）：與利用使用了MmPylRS的無細胞蛋白質合成系統的情況相比，，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸;工序（b）：與利用使用了具有受glmS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況，以及，使用了具有受glnS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。使用該製作方法可有效製作含非天然氨基酸的多肽。應予說明，glmS啟動子以及glnS啟動子(Plumbridge and Soll ， Biochimie. 1987 May;69(5):539-41.)為不適用於高表達啟動子的啟動子(非高表達啟動子)。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種引入方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸接觸的工序，向多肽引入非天然氨基酸，且包括選自以下工序（a）和工序（b）的引入工序:工序（a）：與利用使用了MmPylRS的無細胞蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸;工序（b）：與利用使用了具有受glmS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況，以及，使用了具有受glnS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。使用該引入方法可向多肽有效引入非天然氨基酸。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種非天然氨基酸引入系統，其含有高濃度的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。使用該非天然氨基酸引入系統，可有效製作含非天然氨基酸的多肽。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種無細胞蛋白質合成系統的反應溶液，其含有Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。使用該反應溶液，可有效製作含非天然氨基酸的多肽。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種含非天然氨基酸的多肽的製作方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸在細胞外接觸的工序。使用該製作方法，可有效生產含非天然氨基酸的多肽。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種向多肽引入非天然氨基酸的方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸在細胞外接觸的工序。使用該引入方法，可向多肽有效引入非天然氨基酸。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種結合了非天然氨基酸的tRNA的製作方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸、tRNA在細胞外接觸的工序。使用該製作方法，可有效製作結合了非天然氨基酸的tRNA。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種純化的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。使用該PylRS，可有效製作含非天然氨基酸的多肽。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種溶液，其含有5mg/mL以上的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。使用該溶液，可有效製作含非天然氨基酸的多肽。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種多核苷酸，其編碼Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和高表達啟動子。使用該多核苷酸，可有效製作含非天然氨基酸的多肽。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種含非天然氨基酸的多肽的製作方法，其包括由活細胞高表達Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的工序。使用該製作方法，可有效製作含非天然氨基酸的多肽。
以下，詳細描述本發明的實施方式。應予說明，為了避免關於相同內容的重複，適當地省略了說明。
本發明的一個實施方式是新穎的含非天然氨基酸的多肽的製作方法。該製作方法包括一種工序，例如，使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(PylRS)和非天然氨基酸接觸的工序。且優選包括選自以下工序（a）和工序（b）的引入工序:工序（a）：與利用使用了馬氏甲烷八疊球菌（Methanosarcina mazei）的PylRS(MmPylRS)的無細胞蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸;工序（b）：與利用使用了具有受glmS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況，以及，使用了具有受glnS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。此時，使用該製作方法可有效製作含非天然氨基酸的多肽。應予說明，glmS啟動子以及glnS啟動子為不適用於高表啟動子的啟動子(非高表達啟動子)。而且，相比於作為PylRS使用了MmPylRS的情況，本發明的一個實施方式中的引入工序包括高效率地向多肽引入非天然氨基酸的工序。相比於比較對象，本發明的一個實施方式中“高效率”的程度例如為1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、或40.0倍，大於其中之一，或也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種引入方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸接觸的工序，向多肽引入非天然氨基酸，且包括選自以下工序（a）和工序（b）的引入工序:工序（a）：與利用使用了MmPylRS的無細胞蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸;工序（b）：與利用使用了具有受glmS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況，以及，使用了具有受glnS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。使用該引入方法可向多肽有效引入非天然氨基酸。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種非天然氨基酸引入系統，其含有Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。該非天然氨基酸引入系統從可向蛋白質有效引入非天然氨基酸的觀點出發，優選含有高濃度的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種無細胞蛋白質合成系統的反應溶液，其含有Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。使用該反應溶液，可含有高濃度的PylRS，從而可有效製作含非天然氨基酸的多肽。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種含非天然氨基酸的多肽的製作方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸在細胞外接觸的工序。使用該製作方法，可通過使用無細胞蛋白質合成系統的反應溶液進行，該反應溶液可含有高濃度的PylRS，從而可有效生產含非天然氨基酸的多肽。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種向多肽引入非天然氨基酸的方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸在細胞外接觸的工序。使用該引入方法，可通過使用無細胞蛋白質合成系統的反應溶液進行，該反應溶液可含有高濃度的PylRS，從而可向多肽有效引入非天然氨基酸。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種結合了非天然氨基酸的tRNA的製作方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸、tRNA在細胞外接觸的工序。使用該製作方法，可通過使用無細胞蛋白質合成系統的反應溶液進行，從而可有效製作結合了非天然氨基酸的tRNA。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種純化的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。過濃縮含有該PylRS的溶液，可調節含有高濃度PylRS的溶液。將該溶液利用於無細胞蛋白質合成系統に，從而可有效製作含非天然氨基酸的多肽。
根據本發明的一個實施方式，可提供一種溶液，其含有5mg/mL以上的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。該溶液優選含有5mg/mL以上的PylRS。此時，通過混合該溶液和含有非天然氨基酸或tRNA等的溶液，可製作無細胞蛋白質合成系統的反應溶液。通過將該溶液利用於無細胞蛋白質合成系統，可有效製作含非天然氨基酸的多肽。本發明的一個實施方式中的溶液可含有例如，緩衝液、NaCl、或還原劑。
本發明的一個實施方式，可提供一種向多肽引入非天然氨基酸的引入劑，其包括上述反應溶液或溶液。通過將該引入劑利用於無細胞蛋白質合成系統，可向多肽有效引入非天然氨基酸。
本發明的一個實施方式，可提供一種多核苷酸，其編碼Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。該多核苷酸優選編碼高表達啟動子。此時，通過將該多核苷酸利用於活細胞蛋白質合成系統，可有效製作含非天然氨基酸的多肽。多核苷酸含有載體。高表達啟動子可位於PylRS的上游。高表達啟動子連結為在多核苷酸內可控制PylRS的表達。
本發明的一個實施方式，是一種含非天然氨基酸的多肽的製作方法，其包括將上述多核苷酸引入於細胞的工序或從上述多核苷酸表達PylRS的工序。通過將該製作方法利用於活細胞蛋白質合成系統，可有效製作含非天然氨基酸的多肽。該製作方法可包括，例如，將多核苷酸連結於載體的工序、將編碼tRNA的多核苷酸引入於細胞的工序、培養上述細胞的工序、評價PylRS的表達的工序、評價含非天然氨基酸的多肽的表達的工序、或純化或提取含非天然氨基酸的多肽的工序。載體可以是例如，表達載體、環狀載體、或質粒。
本發明的一個實施方式，是一種含有多核苷酸的細胞，該多核苷酸編碼Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和高表達啟動子。通過將該細胞利用於活細胞蛋白質合成系統，可有效製作含非天然氨基酸的多肽。
本發明的一個實施方式，是一種向多肽引入非天然氨基酸的方法，其包括，向細胞引入上述多核苷酸的工序，或從上述多核苷酸表達PylRS的工序。通過將該製作方法利用於活細胞蛋白質合成系統，可向多肽有效引入非天然氨基酸。該引入方法可包括，例如，和上述製作方法包括的工序相同的工序。
本發明的一個實施方式，是一種向多肽引入非天然氨基酸的引入劑，其包括上述多核苷酸。通過將該引入劑利用於活細胞蛋白質合成系統，可向多肽有效引入非天然氨基酸。
本發明的一個實施方式，是一種結合了非天然氨基酸的tRNA的製作方法，其包括，向細胞引入請上述多核苷酸的工序，或從上述多核苷酸表達PylRS的工序。通過將該製作方法利用於活細胞蛋白質合成系統，可有效製作結合了非天然氨基酸的tRNA。該製作方法可包括，例如，將編碼PylRS的多核苷酸引入於細胞的工序、培養上述細胞的工序、評價PylRS的表達的工序、評價tRNA的表達的工序、評價含非天然氨基酸的多肽的表達的工序、或純化或提取含非天然氨基酸的多肽的工序。
本發明的一個實施方式，是一種含非天然氨基酸的多肽的製作方法，其包括由活細胞高表達Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的工序。若將該製作方法利用於活細胞蛋白質合成系統，則可有效製作含非天然氨基酸的多肽。高表達工序可包括例如，通過高表達啟動子使PylRS高表達的工序。
本發明的一個實施方式的製作方法或引入方法可以在含有PylRS的非天然氨基酸引入系統中實施。
本發明的一個實施方式的非天然氨基酸引入系統也可以是無細胞蛋白質合成系統的反應溶液。本發明的一個實施方式的反應溶液中的PylRS濃度例如為15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、或120μM、大於其中之一、或也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。從向蛋白質更有效引入非天然氨基酸的觀點考慮，優選25μM以上、更優選50μM以上、最優選75μM以上。反應溶液可以是，編碼與天然型的不同位點具有終止密碼子的基因的多核苷酸、tRNA、或非天然氨基酸。編碼與天然型在不同位點具有終止密碼子的基因的多核苷酸的濃度可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、 1.8、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、或10.0mg/mL、大於其中之一、或也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。與天然型的不同位點包括對應於向多肽引入天然氨基酸的引入位點的位置。與天然型的不同位點可以是對應於抗體的固定區域內的位置。tRNA的濃度可以是，1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、或20.0μM、大於其中之一、或也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。非天然氨基酸的濃度可以是，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、或10.0mM、大於其中之一、或也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。反應溶液可包括LMCPY 混合物-PEG-DTT、tRNA、醋酸鎂、氨基酸混合物、肌酸激酶、RNA聚合酶、伴侶增強S30 提取物、緩衝液、模板DNA、GSSG 、DsbC、pH調節劑或水。這些的組分濃度可以是記載於後述表2的濃度±40、±30、±20、±10、或±5%以內。模板DNA可以是編碼引入了氨基酸的目標蛋白質的鹼基序列中包括無義密碼子的核酸。發明的一個實施方式中的無細胞蛋白質合成系統可利用，來源於大腸桿菌的無細胞蛋白質合成系統、來源於哺乳動物細胞的無細胞蛋白質合成系統、來源於昆蟲細胞的無細胞蛋白質合成系統、來源於小麥胚芽的無細胞蛋白質合成系統、重構型無細胞蛋白質合成系統等。
本發明的一個實施方式的非天然氨基酸引入系統可以是活細胞蛋白質合成系統的細胞。本發明的一個實施方式的細胞可以含有編碼PylRS和高表達啟動子的多核苷酸。本發明的一個實施方式的高表達啟動子包括高表達多肽(例如PylRS)的啟動子。高表達啟動子包括表達能力高於glmS啟動子以及glmS啟動子的啟動子。控制PylRS的高表達啟動子包括，T3、T5、T7、SP6等來源於噬菌體的高表達用啟動子tac、trc、lac、lacUV5、araBAD、rhaBAD、SV40、CMV、CAG、SV40、EF-1α、TEF1、PGK1、HXT7、TPI1、TDH3、PYK1、ADH1、GAL1、GAL10、多角體、p10、金屬硫蛋白（metallothionein）或Actin 5C等高表達用啟動子。高表達啟動子，在大腸桿菌培養系中優選T3、T5、T7、SP6、tac、trc、 lac、lacUV5、araBAD或rhaBAD，哺乳類細胞培養系中優選SV40、CMV、CAG、SV40或EF-1α，發芽酵母(S. cerevisiae)培養系中優選TEF1、PGK1、HXT7、TPI1、TDH3、PYK1、ADH1、GAL1或GAL10，裂變酵母(Schizosaccharomyces pombe)培養系中優選CMV，昆蟲細胞(例如，感染了桿狀病毒的蛾的細胞)培養系中優選多角體或p10，昆蟲細胞(例如，果蠅Drosophila S2細胞)培養系中優選金屬硫蛋白或Actin 5C。控制tRNA高表達的啟動子包括U6、H1、7SK、tRNA(Val)、tRNA(Arg)、tRNA(Tyr)、lpp或T5 。該啟動子，在哺乳類細胞培養系或昆蟲細胞培養系中優選U6、H1、7SK、tRNA(Val)、tRNA(Arg)或tRNA(Tyr)，在大腸桿菌培養系中優選pp或T5。本發明的一個實施方式的活細胞蛋白質合成系統可利用大腸桿菌等細菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母等。
本發明的一個實施方式的非天然氨基酸引入系統可適用於含有多個正交系的非天然氨基酸引入系統。
本發明的一個實施方式的反應溶液中PylRS濃度為高濃度是包括15μM以上的濃度。該濃度可以是15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、或120μM、大於其中之一、或也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。從向蛋白質更有效引入於非天然氨基酸的觀點考慮，優選25μM以上、更優選50μM以上、最優選75μM以上。
本發明的一個實施方式的製作方法可以包括一種工序，該工序是通過混合含有5mg/mL以上的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的溶液和非天然氨基酸從而製備混合溶液。該混合溶液可含有高濃度的PylRS。通過將含有高濃度PylRS的混合溶液利用於無細胞蛋白質合成系統，可有效製作含非天然氨基酸的多肽。
本發明的一個實施方式的溶液中PylRS濃度為5mg/mL以上可以是5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、26、27、28、29、或30mg/mL、大於其中之一、或也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。上述5mg/mL以上在12.6mg/mL以上時，在高效率的無細胞蛋白質合成系統中的製備特別容易。從這個觀點出發，優選12.6mg/mL以上、更優選15mg/mL以上、最優選20mg/mL以上。
本發明的一個實施方式中無細胞蛋白質合成系統包括:在含有為合成無細胞蛋白質而製備的大腸桿菌等細胞提取液的反應液，以高濃度添加表達了PylRS的細胞提取液、粗純化的PylRS或純化的PylRS的合成系統;由高濃度表達PylRS(為合成無細胞蛋白質而製作的)的大腸桿菌等製備的細胞提取液作為反應液使用的合成系統。
本發明的一個實施方式的含天然型氨基酸多肽包括與藥物相結合的多肽。藥物包括抗癌劑。
本發明的一個實施方式的PylRS包括具有將氨基酸結合於tRNA的活性的蛋白質。氨基酸包括吡咯賴氨酸或非天然氨基酸。本發明的一個實施方式的非天然氨基酸包括賴氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、苯丙氨酸衍生物、色氨酸衍生物、精氨酸衍生物、蛋氨酸衍生物、亮氨酸衍生物、組氨酸衍生物、脯氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、蘇氨酸衍生物、絲氨酸衍生物、丙氨酸衍生物、異亮氨酸衍生物、纈氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、谷氨酸衍生物、天冬酰胺衍生物、天冬氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、硒代半胱氨酸衍生物、吡咯烷衍生物、犬尿氨酸衍生物、鳥氨酸衍生物、瓜氨酸衍生物、刀豆氨酸衍生物、二氨基庚二酸、或其中之一的α-羥酸衍生物。PylRS沒有特別指定時，包括天然型PylRS、變異型PylRS兩者。
Methanomassiliicoccales目以及Thermoplasmatales目生物形成一個整體，且與M. mazei和M. barkeri等Methanosarcina屬生物為遠親。序列比對Methanomassiliicoccales目以及Thermoplasmatales目生物的PylRS的氨基酸序列和M. barkeri或M. mazei的PylRS的氨基酸序列時，可具有N末端側缺失氨基酸序列的結構。
本發明的一個實施方式的Methanomassiliicoccales目生物包括Methanomethylophilus屬、Methanomassiliicoccus屬、Methanoplasma屬生物。而且Methanomassiliicoccales目生物可包括未分類屬的生物。Methanomethylophilus屬生物包括Methanomethylophilus alvus(M. alvus)(WP_015505008)或Methanomethylophilus sp. 1R26(WP_058747239)。Methanomassiliicoccus屬生物包括Methanomassiliicoccus luminyensis(WP_019176308)或Methanomassiliicoccus intestinalis(WP_020448777)。Methanoplasma屬生物包括Methanoplasma termitum(WP_048111907)。未分類屬的生物包括Methanomassiliicoccales archaeon RumEn M1(KQM11560)、Methanogenic archaeon ISO4-H5(WP_066075773)或Methanogenic archaeon ISO4-G1(AMK13702)。應予說明，生物名稱後的括號內表示PylRS的NCBI登錄號。
本發明的一個實施方式的Thermoplasmatales目生物包括未分類的屬的生物。作為未分類的屬的生物，包括Thermoplasmatales archaeon BRNA1(WP_015492598)。
圖1表示包括Methanomethylophilus屬或Methanomassiliicoccus屬生物的PylRS的系統發育樹的一個例子。從向蛋白質更有效引入非天然氨基酸的觀點考慮，生物優選M. alvus或Methanogenic archaeon ISO4-G1。Methanomethylophilus alvus通常標記為Candidatus Methanomethylophilus alvus。因此，本說明書中Methanomethylophilus alvus包括Candidatus Methanomethylophilus alvus。而且，關於其他生物(包括屬、種)，含有Candidatus的名稱所對應的生物包括在未含有Candidatus的名稱表示的生物。即，由Candidatus X表示的生物包括在由X表示的生物。
本發明的一個實施方式的MaPylRS，包括具有由序列號5表示的氨基酸序列的蛋白質。本發明的一個實施方式的G1PylRS，包括具有由序列號10表示的氨基酸序列的蛋白質。比對M. barkeri或M. mazei的古細菌具有的PylRS氨基酸序列時，MaPylRS以及G1PylRS具有N終端區域缺失的氨基酸序列。圖2表示使用Clustal Omega進行序列比對的結果。封閉部分是推測為吡咯賴氨酸結合口袋的部分。本發明的一個實施方式的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的氨基酸序列可以是與MaPylRS的氨基酸序列相同性70%以上。該數值為70、75、80、85、90、95、97、98、99或100%、或也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。
本發明的一個實施方式的PylRS與M. barkeri或M. mazei的PylRS進行序列比對時，包括具有N末端側至少缺失50個氨基酸的氨基酸序列的PylRS。該值為50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或185、或也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。從向蛋白質有效引入非天然氨基酸的觀點考慮，優選至少110氨基酸、更優選至少130氨基酸。序列比對可通過Clustal Omega或NCBI的BLAST實施。
本發明的一個實施方式的PylRS包括在氨基酸結合口袋中與非天然氨基酸結合的PylRS。與MaPylRS進行序列比對時，氨基酸結合口袋的氨基酸含有96、120、121、122、125、126、129、164、166、168、170、203、204、205、206、207、221、223、227、228、233、235、239、241或243位的氨基酸。與ISO4-G1 PylRS進行序列比對時，氨基酸結合口袋的氨基酸可以含有95、119、120、121、124、125、128、163、165、167、169、201、202、203、204、205、219、221、225、226、231、233、237、239或241位的氨基酸。本發明的一個實施方式的PylRS包括與氨基酸結合口袋的非天然氨基酸(例如，賴氨酸衍生物)結合的PylRS。
本發明的一個實施方式的純化的PylRS包括提取的PylRS。PylRS包括，用無細胞蛋白質合成系統合成的PylRS、在活細胞表達的重組PylRS。本發明的一個實施方式的細胞包括，大腸桿菌或哺乳類細胞。本發明的一個實施方式的哺乳類包括，人、實驗鼠、老鼠、兔、牛、猴。純化的PylRS包括，通過HisTrap純化、或凝膠過濾層析等純化法純化的PylRS。
相比於天然型PylRS的氨基酸序列，本發明的一個實施方式的變異型PylRS包括，具有70%以上相同性的氨基酸序列、具有吡咯賴氨酰-tRNA合成酶活性的變異型PylRS。相同性可以是70、75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9%以上、或也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。相同性可以是小於100%。相同性可以根據該技術領域眾所周知的方法進行計算2個或多個氨基酸序列的相同氨基酸數的比率。計算比率之前，使進行比較的氨基酸序列組的氨基酸序列對齊，需要使相同氨基酸的比率成為最大時，在氨基酸序列的部分引入間隙。實現對齊的方法、比率的計算方法、比較方法以及與這些相關的計算機程序是本領域眾所周知的(例如，BLAST、GENETYX等)。相同性可由NCBI的BLAST測定的值表示。氨基酸序列的比較可默認設置使用。應予說明，本說明書的變異型PylRS和PylRS變異體相同。
本發明的一個實施方式的吡咯賴氨酰-tRNA合成酶活性包括，使非天然氨基酸和tRNA結合的活性。活性包括，使非天然氨基酸和阻抑tRNA結合的活性。活性包括，向蛋白質引入非天然氨基酸的活性。
本發明的一個實施方式的變異型PylRS包括變異型PylRS，該變異型PylRS是在由互補於編碼天然型PylRS的氨基酸序列的鹼基序列的鹼基序列構成的多核苷酸上，具有在嚴格條件特異性雜交的多核苷酸所編碼的氨基酸序列，其具有吡咯賴氨酰-tRNA合成酶活性。嚴格條件可採用以下條件。(1)清洗中使用低離子強度以及高溫度(例如，在50℃、0.015M的氯化鈉/0.0015M的檸檬酸鈉/0.1%的十二烷基硫酸鈉)、或(2)雜交中使用甲酰胺等變性劑(例如，在42℃、50%(v/v)甲酰胺和0.1%牛血清白蛋白/0.1%菲科爾/0.1%の聚乙烯吡咯烷酮/50mM且pH6.5的磷酸鈉緩衝液、以及750mM的氯化鈉、75mM檸檬酸鈉)。應予說明，清洗時的溫度可以是50、55、60或65℃、也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。清洗時間可以是5、15、30、60或120分或也可以是這些以上的。影響雜交反應嚴謹性的要素可考慮溫度、鹽濃度等，細內容可參照Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology， Wiley Interscience Publishers， (1995)。
本發明的一個實施方式的變異型PylRS包括變異型PylRS，該變異型PylRS相對於天然型PylRS具有1個或幾個氨基酸殘基的缺失、添加、插入或取代的，具有吡咯賴氨酰-tRNA合成酶活性。幾個為2、3、4、5、6、7、8、9、或10個、或也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。已知，接受了1個或幾個氨基酸殘基的缺失、添加、插入或取代的多肽可維持其生物活性(Mark et al.， Proc Natl Acad Sci US A.1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zoller et al.， Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al.， Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-1433.)。發生缺失等的多肽可通過例如定點誘變法或隨機誘變法製作。作為定點誘變法可使用例如PrimeSTAR mutagenesis kit (Takara Bio Inc.)。
本發明的一個實施方式的氨基酸包括具有氨基和羧基的有機化合物。本發明的實施方式所涉及的多肽包括特定氨基酸序列時，該氨基酸序列中任意氨基酸可形成鹽或溶劑化物。而且，該氨基酸序列中任意氨基酸可以是L型或D型。即使在這些情況下，本發明的實施方式所涉及的多肽可以說含有特定的氨基酸序列。
本發明的一個實施方式的變異型PylRS包括在氨基酸結合口袋具有變異的PylRS。本發明的一個實施方式的變異型PylRS包括與氨基酸結合口袋的非天然氨基酸(例如，賴氨酸衍生物)結合的PylRS。
本發明的一個實施方式的變異型PylRS包括，與天然型PylRS進行序列比對時，在96、120、121、122、125、126、128、129、164、166、168、170、203、204、205、206、207、221、223、227、228、233、235、239、241或243位點具有變異的PylRS。從變異引入實驗或晶體結構分析結果考慮，這些位點可認為是可變異的位點。該變異可以是對於A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V的變異。該變異優選對於A、L、V、C或F的變異。變異前的126、129、168、206位點可以依次為Y、M、V、Y。
本發明的一個實施方式的變異型PylRS包括變異型PylRS，該變異型PylRS相比於天然型PylRS具有非天然氨基酸對於蛋白質的高引入效率。本發明的一個實施方式的變異型PylRS包括變異型PylRS，該變異型PylRS具有對於蛋白質的TCO*Lys引入活性、pEtZLys引入活性、或pAzZLys引入活性。
本發明的一個實施方式是包括Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的非天然氨基酸和tRNA的結合用組合物。該結合用組合物優選含有5mg/mL以上的PylRS。此時，通過混合該結合用組合物和含有非天然氨基酸或tRNA等的溶液，從而有效結合非天然氨基酸和tRNA。將該結合用組合物使用於含非天然氨基酸的多肽的合成，可有效製作含非天然氨基酸的多肽。本發明的一個實施方式是使用Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS從而製作非天然氨基酸和tRNA的結合用組合物。本發明的一個實施方式是使用Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的非天然氨基酸和tRNA的結合方法。
本發明的一個實施方式的向多肽引入非天然氨基酸的引入方法、含非天然氨基酸的多肽的製作方法、非天然氨基酸和tRNA的結合方法、或結合了非天然氨基酸的tRNA的製作方法可包括以下工序。(1)使PylRS和非天然氨基酸接觸的工序、(2)使PylRS和tRNA接觸的工序、(3)編碼PylRS、PylRS的核酸、或將非天然氨基酸投入於溶液中的工序、(4)將編碼tRNA或tRNA的核酸投入於溶液中的工序、(5)使編碼與天然型在不同位點具有終止密碼子的基因的多核苷酸和tRNA接觸的工序、或(6)在非天然氨基酸存在下，使PylRS、tRNA或編碼與天然型在不同位點具有終止密碼子的基因的多核苷酸在活細胞或非細胞蛋白質合成系統中表達的工序。而且，也可包括濃縮含PylRS的溶液的工序、或混合已濃縮的PylRS溶液和非天然氨基酸的工序。tRNA包括例如，阻抑tRNA。阻抑tRNA包括例如，琥珀阻抑tRNA。tRNA包括例，Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的tRNA。tRNA若無特別限定，可包括天然型tRNA、變異型tRNA兩者。溶液可包括例如，緩衝液、tRNA、編碼與天然型在不同位點具有終止密碼子的基因的多核苷酸、氨基酸混合物、模板DNA或RNA聚合酶。向多肽引入非天然氨基酸的引入方法或含非天然氨基酸的多肽的製作方法可採用無細胞蛋白質合成法或細胞蛋白質合成法。
本發明的一個實施方式的蛋白質包括例如，功能蛋白質或結構蛋白質。功能蛋白質可包括例如，抗體或酶。蛋白質可含有天然型氨基酸或非天然型氨基酸。引入非天然氨基酸的位點可以是例如，抗體的固定區域內。
本發明的一個實施方式中，多肽包括例如，蛋白質。多肽包括多個氨基酸結合而構成的。多肽中的氨基酸的數量可以是例如，10、20、30、50、70、100、200、400、500、700、1000或1500、大於其中之一、或也可以是此處例示的任意2個數值之間的範圍。
本發明的一個實施方式的賴氨酸衍生物包括例如，圖3的化合物。非天然氨基酸包括例如，WO/2017/030156所記載的非天然氨基酸。非天然氨基酸包括例如，氨基酸衍生物。苯丙氨酸衍生物包括例如，3-iodo-L-苯丙氨酸。酪氨酸衍生物包括例如，o-propargyl-LO-炔丙基-L-酪氨酸。
本發明的一個實施方式是組合物。該組合物包括例如，含有Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的組合物。組合物包括例如，用於向多肽引入非天然氨基酸的、或用於製作含非天然氨基酸的多肽的組合物。組合物可含有例如，非天然氨基酸。組合物可含有例如，緩衝液、tRNA、模板DNA、氨基酸混合物或RNA聚合酶。
本發明的一個實施方式是具有非天然氨基酸的多肽。該多肽可通過點擊化學進行化學修飾。點擊化學可利用例如，Hou J et al.， Expert Opin Drug Discov. 2012 Jun;7(6):489 -501.、Bonnet Det al.， Bioconjug Chem. 2006 Nov-Dec;17(6):1618-23.等技術。本發明的一個實施方式是具有非天然氨基酸的多肽的化學修飾體。本發明的一個實施方式是包括具有非天然氨基酸的多肽或其化學修飾體的組合物。組合物包括一種醫藥組合物，該醫藥組合物包括一種以上藥理學可接受的擔體。
本發明的一個實施方式是製作變異型PylRS的模型組合物，其包括Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS、或編碼該PylRS的核酸。本發明的一個實施方式是變異型PylRS的製作方法，其包括向Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS引入變異的工序。引入了變異的PylRS具有的吡咯賴氨酰-tRNA合成酶活性可通過如後述實施例記載，由無細胞蛋白質合成法或活細胞蛋白質合成法評價。本發明的一個實施方式是多肽的製作方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和氨基酸接觸的工序，以及選自以下工序（a）和工序（b）的引入工序:工序（a）： 與利用使用了MmPylRS的無細胞蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸;工序（b）： 與利用使用了具有受glmS啟動子控制的上述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況，以及，使用了具有受glnS啟動子控制的上述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。本發明的一個實施方式是含有高濃度的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的氨基酸引入系統。氨基酸引入系統可以是例如，無細胞蛋白質合成系統的反應溶液、或活細胞蛋白質合成系統的細胞。本發明的一個實施方式是多肽的製作方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和氨基酸在細胞外接觸的工序。本發明的一個實施方式是多肽的製作方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS高表達於活細胞的工序。
本說明書引用的所有出版物，公報類(專利或專利申請)均通過引用將其全文併入。
本說明書的“或”使用於可採用在本章列出的項目中“至少1個以上”時。“或者”也相同。明確記載為本說明書的“在兩個值的範圍內”時，其範圍包括2個值自身。本說明書的“A~B”表示A以上B以下。
以上，對本發明的實施方式進行了說明，但這些是本發明的例示，也可以採用上述以外的各種結構。此外，也可以採用上述實施方式中描述的構成的組合。 [實施例]
以下，通過實施例進一步進行說明，但本發明不限於此。
>實驗例1> (1) M. mazei PylRS的表達、純化 將His6-SUMO-M. mazei PylRS結構基因克隆於pET24後，轉化於大腸桿菌BL21-Gold(DE3)，在1L的LB培養基以37℃培養，OD600=0.7時加入1mM IPTG，以20℃進行過夜培養(His6-SUMO-M.mazei PylRS的氨基酸序列為序列號1)。回收菌體、HisTrap純化、SUMO蛋白酶處理後、進行HiTrap SP、Superdex 200 HiLoad16/60純化，從1L培養基回收了4.4mg的M. mazei PylRS(2.82mg/ml×1.56ml)。濃縮了含有該MmPylRS的溶液，結果濃縮極限為2.82mg/mL。
>實施例1> 1.1 M. alvus PylRS的表達、純化 將Methanomethylophilus alvus的PylRS(MaPylRS)結構基因(序列號2)克隆於pET28後，轉化於大腸桿菌BL21-Gold(DE3)，在1L的LB培養基以37℃培養，OD600=0.6時加入1mM IPTG，以20℃進行過夜培養。進行回收菌體、HisTrap純化、Thrombin處理、HiTrapQ、Hitrap Heparin、Superdex 200純化，從1L培養基回收了約100mg的MaPylRS。該回收量高於現有古細菌的PylRS。將Methanosarcina屬PylRS表達於大腸桿菌時，由於PylRS易沉澱難以純化而導致回收量少。濃縮了含有該MaPylRS的溶液，結果濃縮極限為20mg/mL以上。
>實施例2> 2.1 無細胞蛋白質合成法中使用了MaPylRS以及MmPylRS的非天然氨基酸引入蛋白質合成量的比較。 反應液以及透析外液的組成符合表1。 [表1]
Figure 02_image001
tRNAPyl 各使用了來源於M. mazei的tRNAPyl 以及來源於M. alvus的tRNAPyl (鹼基序列為序列號3)。PylRS各使用了來源於M. mazei以及來源於M. alvus的天然型(MmPylRS的氨基酸序列為序列號4、MaPylRS的氨基酸序列為序列號5)。非天然氨基酸使用了Nε -（叔丁氧羰基）-L-賴氨酸(BOCLys)(Bachem公司)以及Nε -炔丙氧基羰基-L-賴氨酸(PocLys) (SciChem公司)。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、對照組合成用使用了pN11GFPS1sh。合成反應中，相對於透析外液1mL，將反應液30μL以25℃進行了過夜透析。將1μL當量的合成後的反應液稀釋約200倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量，以相對於對照組的一般合成的比率示出。
其結果為，如圖4所示確認到使用了PylRS的非天然氨基酸的引入。BOCLys引入中，通過MaPylRS的蛋白質合成量成為了MmPylRS的2倍以上，合成到了與對照組的一般合成(WT)同等的蛋白質。PocLys引入中通過MaPylRS的蛋白質合成量非常多，合成到了與對照組幾乎同等量。由此可知，通過使用MaPylRS可有效製備非天然型蛋白質。
>實施例3> 3.1 無細胞蛋白質合成法中天然型PylRS濃度依賴性 評價了在TCO*Lys引入中使用天然型PylRS時的濃度依賴性。反應液以及透析外液的組成符合表1。tRNAPyl 使用了來源於M. alvus的tRNAPyl 。PylRS使用了來源於M. alvus的天然型PylRS。
反應液中可添加的PylRS量的上限為，與水(Milli-Q 超純水)的液體量所對應的量。由於MaPylRS的濃縮極限為20mg/mL以上，作為最終濃度可添加80μM以上。本實驗中使用了從10μM到75μM的範圍。應予說明，MmPylRS時，由於濃縮極限為4mg/mL以下，可添加的濃度最大為約10μM。
非天然氨基酸使用了TCO*Lys。模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb。合成反應是相對於透析外液(External solution)1mL，將反應液(Reaction solution)30μL以25℃進行了過夜透析。1μL當量的合成後的反應液稀釋約200倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量。
其結果為，如圖5所示確認到在超過10μM的濃度蛋白質合成量增加，在75μM PylRS上升為10μM PylRS的約2.3倍以上。
>實施例4> 4.1 MaPylRS的晶體結構分析 對實施例1中回收的MaPylRS進行晶體篩選時，在使用PEG作為沈淀劑的條件下產生晶體。用台灣光束線(TPS05A)得到了分辨率為2.2Å(空間組C2)的衍射數據，並用MmPylRS結構取代了分子，從而進行了結構精密化(Rf/Rw=28.8/22.8)。催化結構域在結構上與M. mazei相似，但是兩個α-螺旋在N-末端的傾斜度與M. mazei不同。由於Tyr206(Phe384)未能進入口袋中而在Tyr206周圍的幾個殘基處彎曲朝向內側，因此活性位點口袋是敞開的。MaPylRS在活性位點口袋的形狀上與MmPylRS略有不同，口袋的內部稍微狹窄。根據結構，進行了PylRS變異體的製作並進行了非天然氨基酸引入實驗。
圖6的左側示出了MmPylRS催化結構域/吡咯烷基矽AMP複合物(MmPylRSc/Pyl-AMP，灰色)的單體和MaPylRS(載脂蛋白類型，綠色和藍色)的二聚體重疊的結構。圖6的右側示出了MmPylRSc和MaPylRS(載脂蛋白類型)重疊結構的活性位點的放大圖。另外，顯示了引入變異的氨基酸殘基和M.mazei中相應的氨基酸殘基、識別吡咯賴氨酸的羰基所必需的Asn346/Asn166，這對於識別吡咯賴氨酸的羰基是必需的。
>實施例5> 5.1 基於結構分析結果引入的MaPylRS變異體的評價 基於結構分析結果使用已決定變異引入位點的PylRS評價了非天然氨基酸的引入。反應液以及透析外液的組成符合表1。tRNAPyl 使用了10μM的來源於M. alvus的tRNAPyl 。MaPylRS使用了在現有的PylRS(Y126A/M129A)變異體或PylRS(Y126A/M129L)變異體新增從結構分析結果得出的新變異(H227I/Y228P)的PylRS(Y126A/M129A/H227I/Y228P)和PylRS((Y126A/M129L/H227I/Y228P)。PylRS使用了10μM。非天然氨基酸使用了ZLys、mAzZLys、pEtZLys以及TCO*Lys。模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb。合成反應中，相對於透析外液1mL，將反應液30μL以25℃進行了過夜透析。將1μL當量的合成後的反應液稀釋約200倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基準定量合成的GFPS1蛋白質量。
其結果為，如圖7所示通過向PylRS(Y126A/M129A)變異體引入(H227I/Y228P)變異，從而導致了所有非天然氨基酸的蛋白質合成量的大幅增加。特別是，達到了與ZLys、 mAzZLys以及TCO*Lys中WT的合成同等的合成量。通過引入(H227I/Y228P)變異，確認到了ZLys約3倍、mAzZLys約1.5倍、pEtZLys約1.6倍、TCO*Lys約9倍的增加。
接下來，(H227I/Y228P)變異也被引入了由TCO*Lys引入獲效的PylRS(Y126A/M129L)變異體。達到了與PylRS(Y126A/M129A)變異體相同，達到了與WT的合成同等合成量，增加了約4倍。由此表明了(H227I/Y228P)變異對各種變異體有效的可能性。
>實施例6> 6.1 無細胞蛋白質合成法中使用了PylRS變異體的非天然氨基酸引入的PylRS濃度依賴性 反應液以及透析外液的組成符合上述表1。此時，PylRS使用了PylRS變異體。在5μM到75μM之間確認了PylRS變異體的最終濃度。水(Milli-Q超純水)根據伴隨PylRS變異體濃度改變而產生的液量變化來變更。
tRNAPyl 各使用了來源於M. mazei的tRNAPyl 以及來源於M. alvus的tRNAPyl 。PylRS變異體各使用了MmPylRS(Y306A/Y384F/R61K)以及MaPylRS(Y126A/M129L)。相對於在MaPylRS變異體中如ZLys衍生物等大的賴氨酸衍生物，MmPylRS(Y306A/Y384F/R61K)為活性高的變異體(Yanagisawa et al.， Chem Biol. 2008 Nov 24;15(11):1187-97.)。非天然氨基酸使用了Nε -(((（E）-環辛-2-烯-1-基）氧基）羰基)-L-賴氨酸(TCO*-Lys) (SciChem公司)、Nε -（對乙炔基芐氧基羰基）-L-賴氨酸(pEtZLys) (Sundia/Namiki公司)、Nε -（對疊氮基芐氧基羰基）-L-賴氨酸(pAzZLys) (Sundia/Namiki公司)。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、對照組用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。合成反應中，相對於透析外液1mL，將反應液30μL以25℃進行了過夜透析。將1μL當量的合成後的反應液稀釋約200倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量。
反應液中可添加的PylRS變異體量的上限為，與水(Milli-Q 超純水)的液體量所對應的量。由於MmPylRS變異體的濃縮極限為4mg/mL以下，最多可添加約10μM 。由於MaPylRS變異體的濃縮極限為20mg/mL以上，可添加80μM以上。
以上結果，如圖8、9所示確認到通過使用高濃度的MaPylRS變異體提高了蛋白質合成量。將對於點擊化學反應有希望的非天然氨基酸TCO*-Lys引入的結果示於圖8。以PylRS變異體濃度10μM合成了M. mazei約為0.25mg/mL、M. alvus約為0.83mg/mL的GFPS1蛋白質。另一方面，以PylRS變異體濃度75μM可合成M. alvus，以50μM合成了與對照組的一般合成(WT)同等以上的3mg/mL的蛋白質。這是使用MmPylRS變異體合成的10倍以上。由此可知，通過使用高濃度的MaPylRS變異體，可有效製備引入了TCO*-Lys的蛋白質。
使用引入效率低於TCO*-Lys的pEtZLys和pAzZLys時的結果示於圖9。PylRS濃度為10μM時，M. mazei和M. alvus的蛋白質合成量均低。另一方面，在MaPylRS變異體中，蛋白質合成量的增加依賴於濃度，若增加PylRS變異體濃度至75μM，則相比於添加10μM時，pEtZLys引入的蛋白質合成量增加至約2.5倍的約0.5mg/mL。pAzZLys引入中增加至約4.6倍的約2mg/mL而接近一般合成的WT合成量。由此可知，通過以高濃度使用MaPylRS變異體，可增加低引入效率的pEtZLys、pAzZLys的蛋白質合成量。
>實施例7> 7.1 無細胞蛋白質合成法中使用MaPylRS變異體的ZLys非天然氨基酸引入 反應液以及透析外液的組成符合上述表1。此時，PylRS使用了PylRS變異體。tRNAPyl 使用了來源於M. alvus的tRNAPyl 。PylRS變異體使用了來源於M. alvus的圖10的變異體。非天然氨基酸使用了Nε -芐氧羰基-L-賴氨酸(ZLys) (Bachem公司)。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb，對照組用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。合成反應中，相對於透析外液1mL，將反應液30μL以25℃進行了過夜透析。將1μL當量的合成後的反應液稀釋約200倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量，以相對於對照組的一般合成的比率示出。
ZLys引入蛋白質合成量的調查結果示於圖10。表示了在MaPylRS的氨基酸口袋內的126位、129位、168位、206位引入變異的結果中，相對於對照組合成量為40%以上的。特別是Y126A/M129A和Y126A/V168C表示了高合成量。由以上結果可知，可製作適合ZLys引入的變異體。
7.2 無細胞蛋白質合成法中使用MaPylRS變異體的mAzZLys非天然氨基酸引入 反應液以及透析外液的組成符合上述表1。此時，PylRS使用了PylRS變異體。tRNAPyl 使用了來源於M. alvus的tRNAPyl 。PylRS變異體使用了來源於M. alvus的圖11的變異體。非天然氨基酸使用了Nε -（間疊氮基芐氧基羰基）-L-賴氨酸(mAzZLys) (Sundia/Namiki公司)。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、對照組用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。合成反應中，相對於透析外液1mL，將反應液30μL以25℃進行了過夜透析。將1μL當量的合成後的反應液稀釋約200倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量，以相對於對照組的一般合成的比率示出。
mAzZLys引入蛋白質的調查結果示於圖11。表示了在MaPylRS的氨基酸口袋內的126位、129位、168位引入變異的結果中，至少相對於對照組合成量至少為65%以上的。由以上結果可知，可製作適合mAzZLys引入的變異體。
>實施例8> 8.1 使用了MaPylRS變異體的TCO*-Lys非天然氨基酸引入Fab抗體的製備 按照以下表2的反應液以及透析外液的組成，合成了引入非天然氨基酸TCO*-Lys的無細胞蛋白質，非天然氨基酸TCO*-Lys在Herceptin Fab抗體的L鏈有可能進行點擊化學反應。 [表2]
Figure 02_image003
tRNAPyl 各使用了來源於M. mazei的tRNAPyl 以及來源於M. alvus的tRNAPyl 。PylRS變異體各使用了MmPylRS(Y306A/Y384F/R61K)變異體以及MaPylRS(Y126A/M129L)變異體。由於此系中可添加的tRNAPyl 和PylRS的最大液體量為460μL，各自的添加量是，M. mazei的tRNAPyl 和PylRS變異體為6.5μM分、來源於M. alvus的tRNAPyl 為10μM分、PylRS變異體為50μM分。模型DNA使用了在Herceptin Fab H鏈用的pN11TVGS_Her-H、Herceptin Fab L鏈用的氨基酸序號203位點具有非天然氨基酸引入位點用密碼子的pN11TVGS_Her-L-S203Amb。合成反應中，相對於透析外液50mL，將反應液5 mL以25℃進行了過夜透析。標籤切割和純化處理了合成後的反應液。與10倍量的TAMRA-四嗪混合以25℃反應10分鐘以及30分鐘進行了點擊化學反應。
其結果為，如圖12所示每1mL無細胞蛋白質合成反應液的TCO*-Lys引入Herceptin Fab二聚體的合成量在使用M. alvus時為1.7mg。這是使用M. mazei時的20倍量。
以點擊化學將熒光基板TAMRA結合於被引入的TCO*-Lys的結果示於圖13、14。TCO*-Lys的反應性高，結合反應幾乎在10分鐘內結束。使用了M. alvus的合成中，點擊化學後的L鏈的電泳圖像向高分子側移動顯示了強的熒光強度。另一方面，使用了M. mazei的合成中向高分子側移動的比率為M. alvus的1/2量，熒光強度為約1/3。由各電泳圖像蛋白質量的熒光強度中M. alvus高出1.5倍並結合圖12可知，通過使用M. alvus的合成，可製備引入了30倍量TCO* -Lys的Fab抗體。
也就是說，通過使用高濃度的MaPylRS變異體可比以往更有效製備引入了TCO*-Lys的Fab抗體。而且，通過引入TCO*-Lys，可進行反應性高的點擊化學。
>實施例9> 9.1 大腸桿菌表達系統中通過M.mazei、M.alvus、D.hafniense PylRS進行的非天然氨基酸的引入效率的比較 非天然氨基酸(ncAA)使用了BocLys、AlocLys(Bachem)。PylRS基因(野生型)使用了MaPylS(M.alvus PylRS基因)、MmPylS(M.mazei PylRS基因)、DhPylS(D.hafniense PylRSc基因)。tRNAPyl 基因使用了MaPylT(M.alvus tRNAPyl )、MmPylT(M.mazei tRNAPyl )、DhPylT(D.hafniense tRNAPyl )。此時，PylRS基因和tRNAPyl 基因組合使用了來源於同一個菌的基因。大腸桿菌はBL21-Gold(DE3)使用了。質粒使用了pBT5系列(T5/lacO-PylRS、T5/lacO-tRNAPyl )。蛋白質表達用質粒使用了pACYC-GST-GFP(amber3)(T7/lacO-3amb-His6-GST-GFP、將N末端第3個Ser變異為琥珀密碼子)。
將pBT5系列、pACYC-GST-GFP(amber3)轉化於大腸桿菌BL21-Gold(DE3)後，在含有1mM非天然氨基酸(BocLys、AlocLys)的2x YT 自誘導培養基（autoinduction medium）2ml或0.2ml以25℃培養了24小時。此時，由pBT5系列的T5啟動子(序列號6)實現了PylRS的高表達。在96孔微孔板上0.19 ml的PBS接入大腸桿菌培養液10μl進行稀釋，用SpectraMAX i3 plate reader (molecular devices)以485/510nm蛍光測定，通過600nm的吸光進行換算比較了熒光值。
結果示於圖15。圖中，-ncAA意味著沒有非天然氨基酸的條件。使用DhPylS時，沒有檢測到熒光。使用MmPylS時檢測到了熒光，其引入效率在BocLys中為9%。另一方面，使用MaPylS時示出了最高熒光值，BocLys、AlocLys的引入效率各為57%、64%。PylRS的高表達系統中，使用M.alvus的PylRS時的BocLys的引入效率是M.mazei的6倍、AlocLys的引入效率是M.mazei的14倍。應予說明，觀察到使MmPylRS高表達的大腸桿菌的增殖惡化，而沒有觀察到使MaPylRS高表達的大腸桿菌的增殖惡化。
>實施例10> 10.1 野生型GST-GFP融合蛋白質(3Ser)和琥珀變異GST-GFP融合蛋白質的分析 在1mM BocLys環境下以5ml培養基表達了野生型GST-GFP或GST-GFP(amber3)。回收菌體後用Bugbuster Master Mix reagent(Merck Millipore)粉碎，用GST SpinTrap(GE Healthcare)純化了蛋白質，用SDS-PAGE、Simplyblue safe stain進行染色。切出凝膠片用Trypsin/Lys-C Mix， Mass Spec grade(Promega)以37℃消化一晝夜後，用His SpinTrap TALON純化、用含有0.1%TFA的4 %乙腈洗脫後，進行了MALDI-TOF MS分析。
結果示於圖16。使用MaPylRS得到的GST-GFP生成物為59mg(野生型GST-GFP為106mg)時與熒光值成正比。通過胰蛋白酶消化後的MALDI-TOF分析，確認到1-12肽(MNXSSHHHHHHR)的第3殘基引入了BocLys(2的峰)、野生型引入了Ser(1的峰)。(3的峰是由酸處理(TFA)進行的BocLys→Lys分解、*為開始Met脫離的來源於生成物的峰)。
>實施例11> 11.1 大腸桿菌表達系統中使用MaPylRS的向非天然氨基酸的蛋白質的位點特異性引入 非天然氨基酸(ncAA)使用了BocLys、AlocLys、DBocLys(Bachem)、PocLys(SynChem)。PylRS使用了MaPylRS、MmPylRS(R61K/G131E/Y384F)(BocLysRS2)。tRNAPyl 各使用了來源於M. alvus、M. mazei的基因。此時，PylRS和tRNAPyl 組合使用了來源於同一個菌的基因。大腸桿菌使用了BL21-Gold(DE3)。質粒使用了pBT5系列(T5/lacO-PylRS、T5/lacO-tRNAPyl )。蛋白質表達用質粒使用了pACYC-GST-GFP(amber3)(T7/lacO-3amb-His6-GST-GFP、將N末端第3個Ser變異為琥珀密碼子)。
將pBT5系列(作為對照組使用pBR322)、pACYC-GST-GFP(amber3)轉化於大腸桿菌BL21-Gold(DE3)後，在含有1mM非天然氨基酸的2x YT 自誘導培養基2ml或0.2ml以25 ℃培養了24小時。此時，由pBT5系列的T5啟動子實現了PylRS的高表達。在96孔微孔板上0.19 ml的PBS接入大腸桿菌培養液10μl進行稀釋，用SpectraMAX i3 plate reader以485/510nm蛍光測定，通過600nm的吸光進行換算比較了熒光值。
結果示於圖17。圖中，-ncAA意味著沒有非天然氨基酸的條件。在PylRS的高表達系統中，相比於使用BocLys、DBocLys、AlocLys、PocLys和MmPylRS(R61K/G131E/Y384F)時，使用MaPylRS時實現了更有效引入。應予說明，觀察到使MmPylRS高表達的大腸桿菌的增殖惡化，而沒有觀察到使MaPylRS高表達的大腸桿菌的增殖惡化。
>實施例12> 12.1 大腸桿菌表達系統中使用MaPylRS變異體的向ZLys系非天然氨基酸的蛋白質的位點特異性引入 非天然氨基酸使用了ZLys(渡邊化學)、oClZLys、pNO2ZLys(Bachem)、pTmdZLys、oAzZLys、mAzZLys、oEtZLys、AmAzZLys、AzNO2 ZLys(新城化學)。MaPylRS變異體使用了Y126A/M129L、Y126A/M129L/Y206F。MmPylRS變異體使用了Y306A/Y384F。tRNAPyl 各使用了來源於M. alvus、M. mazei的基因。此時，PylRS和tRNAPyl 組合使用了來源於同一個菌的基因。大腸桿菌使用了BL21-Gold(DE3)。質粒使用了pBT5系列(T5/lacO-PylRS、T5/lacO-tRNAPyl )。蛋白質表達用質粒使用了pACYC-GST-GFP(amber3)(T7/lacO-3amb-His6-GST-GFP、將N末端第3個Ser變異為琥珀密碼子)。
將pBT5系列(作為對照組使用pBR322)、pACYC-GST-GFP(amber3)轉化於大腸桿菌BL21-Gold(DE3)後，在含有1mM非天然氨基酸的2x YT 自誘導培養基2ml或0.2ml以25 ℃培養了24小時。此時，由pBT5系列的T5啟動子實現了PylRS的高表達。在96孔微孔板上0.19 ml的PBS加入大腸桿菌培養液10μl進行稀釋，用SpectraMAX i3 plate reader以485/510nm蛍光測定，通過600nm的吸光進行換算後，將野生型GST-GFPwt的熒光作為1比較了熒光值。
結果示於圖18。圖中，-ncAA意味著沒有非天然氨基酸的條件。在PylRS的高表達系統中，引入成功了所有ZLys衍生物。MaPylRS(Y126A/M129L)的引入效率最高。特別是， MaPylRS(Y126A/M129L)的引入效率高於MmPylRS(Y306A/Y384F)(3~18倍)。應予說明，觀察到使MmPylRS變異體高表達的大腸桿菌的增殖惡化，而沒有觀察到使MaPylRS高表達的大腸桿菌的增殖惡化。
>實施例13> 13.1 小麥胚芽係無細胞蛋白質合成法中PylRS濃度依賴性確認 為了確認真核生物蛋白質合成系統中M. alvus PylRS高濃度化的有效性，使用了小麥胚芽係無細胞蛋白質合成法的Premium PLUS Expression Kit (Cellfree science公司)進行了TCO*Lys的引入試驗。
tRNAPyl 使用了來源於M. mazei的tRNAPyl 以及來源於M. alvus的tRNAPyl 。PylRS變異體使用了來源於M. mazei的PylRS(Y306A/Y384F/R61K)以及來源於M. alvus的PylRS(Y126A/M129L)，以10μM到50μM的範圍添加於反應液。非天然氨基酸以最終濃度1mM使用了TCO*Lys。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pEU-E01-GFPS1sh-A17Amb。將底物溶液206μL以重層於翻譯反應液約20μL的方式以15℃進行了20小時合成反應。將合成後的混合液20μL稀釋為約10倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量。
其結果為，如圖19所示，確認到在濃度超過10μM的PylRS中蛋白質合成量增加，在50μM PylRS中上升至約7.2倍。由此，確認到真核生物蛋白質合成系統中M. alvus PylRS的高濃度化的有效性。
14.1 人類係無細胞蛋白質合成法中PylRS濃度依賴性確認 為了確認真核生物中特別有用的來源於人類細胞的蛋白質合成系統中M. alvus PylRS的有效性，使用了人類細胞係無細胞蛋白質合成法的Human Cell-Free Protein Expression Maxi System (TAKARA)進行了TCO*Lys的引入試驗。
tRNAPyl 使用了來源於M. alvus的tRNAPyl 。PylRS變異體使用了來源於M. alvus的PylRS(Y126A/M129L)，以10μM到50μM的範圍添加於反應液。非天然氨基酸以最終濃度1mM使用了TCO *Lys。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb。將反應溶液30μL透析於反應外液350μL的方法以32℃進行了20小時合成反應。將合成後的混合液20μL稀釋為約10倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量。
其結果為，如圖20所示確認到，伴隨PylRS濃度的上升蛋白質合成量增加，在50μM PylRS中上升至約1.8倍。由此確認到人細胞無細胞蛋白質合成系統中M. alvus PylRS的高濃度化的有效性。並且，通過無細胞蛋白質合成法示出的有效性，確認到使用相同轉錄翻譯系的人細胞表達系統的有效性。
>實施例15> 15.1 AcLys引入確認試驗 使用M. alvus PylRS確認了非天然氨基酸Nε -乙酰-L-賴氨酸 (AcLys)的引入。
反應液以及透析外液的組成符合上述表1。此時，tRNAPyl 使用了來源於M. alvus的tRNAPyl 、PylRS變異體使用了來源於M. alvus的PylRS:AcLysRS3(121V/125I/126F/129A/ 168F)以及AcLysRS3-IP(121V/125I/126F/129A/168F/227I/228P)，添加10μM於反應液，AcLys以最終濃度1mM使用。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh- A17Amb、對照組用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。相對於反應液30μL使用透析外液1mL以25℃過夜透析進行合成反應。將合成後的反應液1μL稀釋為約200倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量。
其結果為，如圖21所示確認到使用M. alvus PylRS變異體可引入AcLys。
>實施例16> 16.1 Phe衍生物的引入確認試驗 使用M. alvus PylRS確認了作為苯丙氨酸(Phe)衍生物的3-iodo-L-苯丙氨酸 (IPhe)的引入。
反應液以及透析外液的組成符合上述表1。此時，tRNAPyl 使用了來源於M. alvus的tRNAPyl 、PylRS變異體使用了來源於M. alvus的PylRS(166A/168A)以及PylRS(166A/168A /227I/228P)，添加10μM於反應液，IPhe以最終濃度1mM使用。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、對照組用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。並且，由於Phe衍生物用變異體有引入苯丙氨酸自身的報告例，確認到未添加IPhe時的合成。相對於反應液30μL使用透析外液1mL以25℃過夜透析進行合成反應。將合成後的反應液1μL稀釋為約200倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量。
其結果為，如圖22所示確認到使用M. alvus PylRS變異體可引入IPhe。由此確認到M. alvus PylRS變異體有效於Phe衍生物。
>實施例17> 17.1 Tyr衍生物的引入確認試驗 使用M. alvus PylRS確認了作為酪氨酸(Tyr)衍生物的O-炔丙基-L-酪氨酸(oPgTyr)的引入。
反應液以及透析外液的組成符合上述表1。此時，tRNAPyl 使用了來源於M. alvus的tRNAPyl 、PylRS變異體使用了來源於M. alvus的PylRS(166A/168A)，添加10μM於反應液，oPgTyr以最終濃度1mM使用。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、對照組用模型DNA使用了pN11GFPS1shを用い。相對於反應液30μL使用透析外液1mL以25℃過夜透析進行合成反應。將合成後的反應液1μL稀釋為約200倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量。
其結果為，如圖23所示確認到使用M. alvus PylRS變異體可引入oPgTyr。由此確認到M. alvus PylRS變異體有效於Tyr衍生物。
>實施例18> 18.1 來源於Methanogenic archaeon ISO4-G1的PylRS的確認試驗 進行了作為產甲烷古細菌的Methanogenic archaeon ISO4-G1的PylRS(G1PylRS)評價。用於合成的DNA序列是，ISO4-G1的PylRS為 ATGGTAGTCAAATTCACTGACAGCCAAATCCAACATCTGATGGAGTATGGTGATAATGATTGGAGCGAGGCAGAATTTGAGGACGCTGCTGCTCGTGATAAAGAGTTTTCAAGCCAATTCTCCAAGTTGAAGAGTGCGAACGACAAAGGATTGAAAGACGTCATTGCGAACCCGCGTAATGACCTGACCGACCTTGAAAATAAGATTCGTGAGAAACTTGCTGCACGCGGTTTCATCGAAGTGCATACGCCTATTTTTGTATCTAAGAGTGCATTAGCCAAGATGACAATCACCGAGGATCATCCTTTATTCAAGCAGGTCTTCTGGATCGACGACAAACGTGCCTTGCGTCCAATGCATGCGATGAATCTTTATAAGGTAATGCGCGAGTTGCGCGATCACACAAAGGGACCAGTCAAGATCTTCGAGATTGGCTCGTGCTTCCGCAAGGAAAGCAAGTCATCGACGCATTTGGAAGAATTCACTATGCTGAACTTAGTTGAGATGGGACCCGATGGCGACCCTATGGAGCACCTTAAGATGTATATTGGAGACATCATGGACGCGGTTGGTGTAGAATACACCACCTCACGTGAGGAGTCTGATGTGTACGTAGAGACACTTGACGTGGAGATCAATGGAACTGAAGTTGCGTCAGGAGCAGTAGGTCCTCATAAGCTTGACCCTGCCCACGATGTGCATGAACCCTGGGCAGGAATCGGATTCGGACTGGAGCGTCTGTTGATGCTTAAGAACGGTAAATCGAATGCTCGTAAGACAGGCAAAAGTATCACCTATTTGAATGGTTACAAATTGGAT(序列號7)、tRNAPyl 為GGAGGGCGCTCCGGCGAGC AAACGGGTCTCTAAAACCTGTAAGCGGGGTTCGACCCCCCGGCCTTTCGCCA(序列號8)。ISO4-G1的tRNAPyl 的RNA序列為GGAGGGCGCUCCGGCGAGCAAACGGGUCUCUAAAACCUGUAAGCGGGGUUCGACCCCCCGGCCUUUCGCCA(序列號9)。
將ISO4-G1的tRNAPyl 以及PylRS各10μM、1mM的BocLys或PocLys添加於大腸桿菌無細胞蛋白質合成系統的反應溶液。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、對照組用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。相對於反應液30μL使用透析外液1mL以25℃過夜透析進行合成反應。將合成後的反應液1μL稀釋為約200倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量。
其結果為，如圖24所示確認到使用ISO4-G1的PylRS可通過引入效率良好的非天然氨基酸合成蛋白質。並且，相對於對照組的合成量與M. mazei以及M. alvus的PylRS的比較結果示於圖25。由此結果確認到ISO4-G1 PylRS有效。G1PylRS在無細胞蛋白質合成系統中顯示如此良好的引入效率是驚人的結果。
>實施例19> 19.1 Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS變異體的確認試驗 作為Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS的變異體使用了PylRS(Y125A/M128A)以及PylRS(Y125A/M128L)，進行了非天然氨基酸引入確認。非天然氨基酸確認了ZLys、TCO*Lys、BCNLys、pETZLys、pAzZLys。將ISO4-G1的tRNAPyl 以及PylRS變異體各10μM、1mM的非天然氨基酸添加於大腸桿菌無細胞蛋白質合成系統的反應溶液。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、對照組用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。相對於反應液30μL使用透析外液1mL以25℃過夜透析進行合成反應。將合成後的反應液1μL稀釋為約200倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量。
其結果為，如圖26所示確認到使用ISO4-G1的PylRS變異體可通過引入效率良好的非天然氨基酸合成蛋白質。並且，相對於對照組的合成量與M. mazei的PylRS變異體的比較結果示於圖27。由此結果確認到ISO4-G1 PylRS變異體有效。
>實施例20> 20.1 無細胞蛋白質合成法中Methanogenic archaeon ISO4-G1濃度依賴性確認試驗 Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS以及PylRS變異體與M. alvus PylRS同樣濃縮極限高，可以高濃度使用。在此，圖27確認到了對照組合成量未達到100%的pEtZLys中，使用Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS變異體的PylRS(Y125A/M128L)時的濃度依賴性。 反應液以及透析外液的組成符合表1。
Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS(Y125A/M128L)使用了10μM至75μM的範圍。添加了10μM 的ISO4-G1的tRNAPyl 、10μM的非天然氨基酸pEtZLys。模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb。相對於反應液(Reaction solution)30μL使用透析外液(External solution)1mL以25℃過夜透析進行合成反應。將合成後的反應液1μL稀釋為約200倍，以激發波長485nm、發射波長535nm測定了熒光值。以1mg/mL的標準GFPS1的熒光值為基准定量合成的GFPS1蛋白質量。
其結果為，如圖28所示確認到濃度超過10μM時蛋白質合成量增加，75μM PylRS中上升約6.8倍。由此結果確認到ISO4-G1 PylRS變異體以高濃度使用更有效。
>實施例21> 21.1 動物細胞中mAzZLys向蛋白質的引入 為了在動物細胞(HEK293c18細胞)高表達M. alvus PylRS變異體(Y126A/M129L/H227I/Y228P)和M. alvus tRNAPyl ，或Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS變異體(Y125A/M128L)和ISO4-G1 tRNAPyl ，使用了揭示於非專利文獻(Mukai， et al.， Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 371， pp. 818-822(2008))的系統。關於蛋白質使用了其基因的編碼區域引入了琥珀･密碼子(T137或N157)的變異基因以及其表達系統。
結果示於圖29。不管在那種情況，都確認到了非天然氨基酸引入於蛋白質。本實驗中儘管各tRNA基因以1份而非9份進行，仍然合成了非天然氨基酸引入的蛋白質。以上實驗表示，相比於向動物細胞內的期待位點的mAzZLys的特異性引入，M. alvus PylRS變異體(Y126A/M129L/H227I/Y228P)或Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS變異體(Y125A/M128L)的高表達系統有效。
以上，基於實施例對本發明進行了說明。本領域技術人員需理解，該實施例僅是示例，並且各種修改是可能的，並且這種修改在本發明的範圍內。
圖1是例示Methanomethylophilus屬或Methanomassiliicoccus屬生物的系統發育樹的圖。 圖2是表示使用Clustal Omega對M. alvus、M. barkeri、M. mazei的PylRS的氨基酸序列進行序列比對的結果的圖。 圖3是例示可引入於蛋白質的賴氨酸衍生物的圖。 圖4是表示在細胞蛋白質合成法中使用MaPylRS以及MmPylRS的非天然氨基酸引入蛋白質合成量的比較試驗結果結果的圖。 圖5是表示在無細胞蛋白質合成法中MaPylRS的濃度依賴性的調查結果的圖。 圖6是表示晶體結構分析結果的圖。 圖7是表示MaPylRS變異體的活性的調查結果的圖。 圖8是表示引入了TCO*-Lys的PylRS濃度依賴性的調查結果的圖。 圖9是表示引入了pEtZLys或pAzZLys的PylRS濃度依賴性的調查結果的圖。 圖10是表示引入了ZLys的蛋白質的合成量的調查結果的圖。 圖11是表示引入了mAzZLys的蛋白質的合成量的調查結果的圖。 圖12是表示引入了TCO*-Lys的Fab抗體的合成量的圖。 圖13是表示通過點擊化學使熒光基板結合於引入於Fab抗體的TCO*-Lys的結果的圖。 圖14是表示結合於TCO*-Lys的熒光基板的熒光強度的圖。 圖15是表示大腸桿菌表達系統中通過M.mazei、M.alvus、D.hafniense PylRS進行的非天然氨基酸的引入效率的比較試驗結果的圖。 圖16是表示野生型GST-GFP融合蛋白質(3Ser)和琥珀變異GST-GFP融合蛋白質的分析結果的圖。a:SDS-PAGE後進行CBB染色。b:胰蛋白酶消化生成物後進行MALDI-TOF MS分析。實測值和理論值所示於Table。 圖17是表示大腸桿菌表達系統中使用MaPylRS將非天然氨基酸引入於蛋白質的特異位點的實驗結果的圖。 圖18是表示大腸桿菌表達系統中使用MaPylRS變異體將ZLys系非天然氨基酸引入於蛋白質的特異位點的實驗結果的圖。 圖19是表示小麥胚芽係無細胞蛋白質合成法中PylRS濃度依賴性的調查結果的圖。 圖20是表示人類係無細胞蛋白質合成法中PylRS濃度依賴性的圖。 圖21是表示AcLys的引入的調查結果的圖。 圖22是表示Phe衍生物的引入的調查結果的圖。 圖23是表示Tyr衍生物的引入的調查結果的圖。 圖24是表示無細胞蛋白質合成法中G1PylRS的活性的調查結果的圖。 圖25是表示使用G1PylRS、MaPylRS以及MaPylRS時蛋白質合成量的比較結果的圖。 圖26是表示無細胞蛋白質合成法中G1PylRS變異體的活性的調查結果的圖。 圖27是表示使用G1PylRS以及MaPylRS的變異體時蛋白質合成量的比較結果的圖。 圖28是表示無細胞蛋白質合成法中G1PylRS濃度依賴性的圖。 圖29是表示動物細胞中將mAzZLys引入於蛋白質的結果的圖。
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Claims (48)

  1. 一種含非天然氨基酸的多肽的製作方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(PylRS)和非天然氨基酸接觸的工序，且包括選自以下工序（a）和工序（b）的引入工序， 工序(a)：與利用使用了馬氏甲烷八疊球菌的PylRS(MmPylRS)的無細胞蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸; 工序(b)：與利用使用了具有受glmS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況、以及利用使用了具有受glnS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。
  2. 根據請求項1所述的製作方法，其中，所述引入工序是與使用MmPylRS作為PylRS的情況相比以1.5倍以上的效率向多肽引入非天然氨基酸的工序。
  3. 根據請求項1或2所述的製作方法，其中，所述接觸是在含有高濃度的所述PylRS的非天然氨基酸引入系統中進行的。
  4. 根據請求項3所述的製作方法，其中，所述非天然氨基酸引入系統為無細胞蛋白質合成系統的反應溶液，所述引入工序為所述工序(a)。
  5. 根據請求項4所述的製作方法，其中，所述反應溶液含有15μM以上的PylRS。
  6. 根據請求項4或5所述的製作方法，其中，所述反應溶液含有多核苷酸，所述多核苷酸編碼與天然型在不同位點具有終止密碼子的基因。
  7. 根據請求項1~6中任一項所述的製作方法，其包括混合含有5mg/mL以上的所述PylRS的溶液和非天然氨基酸從而製備混合溶液的工序，所述引入工序為所述工序（a）。
  8. 根據請求項3所述的製作方法，其中，所述非天然氨基酸引入系統為活細胞蛋白質合成系統的細胞，所述引入工序為所述工序(b)。
  9. 根據請求項8所述的製作方法，其中，所述細胞含有編碼MaPylRS和高表達啟動子的多核苷酸。
  10. 根據請求項1~9中任一項所述的製作方法，其中，所述PylRS為Methanomethylophilus屬、Methanomassiliicoccus屬或Methanoplasma屬生物、或者Methanomassiliicoccales archaeon RumEn M1、Methanogenic archaeon ISO4-H5、Methanogenic archaeon ISO4-G1或Thermoplasmatales archaeon BRNA1的PylRS。
  11. 根據請求項1~9中任一項所述的製作方法，其中，所述PylRS為Methanomethylophilus屬生物的PylRS。
  12. 根據請求項1~11中任一項所述的製作方法，其中，所述PylRS與馬氏甲烷八疊球菌的PylRS進行序列比對時，所述PylRS具有N末端側的至少50個氨基酸缺失的氨基酸序列。
  13. 根據請求項1~11中任一項所述的製作方法，其中，所述PylRS為Methanomethylophilus alvus的PylRS(MaPylRS)。
  14. 根據請求項1~10中任一項所述的製作方法，其中，所述PylRS為Methanogenic archaeon ISO4-G1的PylRS(G1PylRS)。
  15. 根據請求項1~14中任一項所述的製作方法，其中，所述非天然氨基酸為賴氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、苯丙氨酸衍生物、色氨酸衍生物、精氨酸衍生物、蛋氨酸衍生物、亮氨酸衍生物、組氨酸衍生物、脯氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、蘇氨酸衍生物、絲氨酸衍生物、丙氨酸衍生物、異亮氨酸衍生物、纈氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、谷氨酸衍生物、天冬酰胺衍生物、天冬氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、硒代半胱氨酸衍生物、吡咯烷衍生物、犬尿氨酸衍生物、鳥氨酸衍生物、瓜氨酸衍生物、刀豆氨酸衍生物、二氨基庚二酸、或其中之一的α-羥酸衍生物。
  16. 根據請求項1~15中任一項所述的製作方法，其中，所述PylRS為天然型或變異型PylRS。
  17. 根據請求項1~16中任一項所述的製作方法，其中，所述含非天然氨基酸的多肽與藥物結合。
  18. 一種向多肽引入非天然氨基酸的引入方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸接觸的工序，且包括選自以下工序（a）和工序（b）的引入工序， 工序(a)：與利用使用了MmPylRS的無細胞蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率地向多肽引入非天然氨基酸； 工序(b)：與利用使用了具有受glmS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況、以及利用使用了具有受glnS啟動子控制的所述PylRS基因的載體的大腸桿菌蛋白質合成系統的情況相比，以更高的效率地向多肽引入非天然氨基酸。
  19. 一種非天然氨基酸引入系統，其含有高濃度的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。
  20. 根據請求項19所述的非天然氨基酸引入系統，其為無細胞蛋白質合成系統的反應溶液。
  21. 根據請求項20所述的非天然氨基酸引入系統，其中，所述反應溶液含有15μM以上的PylRS。
  22. 根據請求項20或21所述的非天然氨基酸引入系統，其中，所述反應溶液含有多核苷酸，所述多核苷酸編碼與天然型在不同位點具有終止密碼子的基因。
  23. 根據請求項19所述的非天然氨基酸引入系統，其為活細胞蛋白質合成系統的細胞。
  24. 根據請求項23所述的非天然氨基酸引入系統，其中，所述細胞含有編碼MaPylRS和高表達啟動子的多核苷酸。
  25. 根據請求項19~24中任一項所述的非天然氨基酸引入系統，其中，所述PylRS為天然型或變異型PylRS。
  26. 一種無細胞蛋白質合成系統的反應溶液，其含有Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。
  27. 根據請求項26所述的反應溶液，其含有多核苷酸，所述多核苷酸編碼與天然型在不同位點具有終止密碼子的基因。
  28. 一種含非天然氨基酸的多肽的製作方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸在細胞外接觸的工序。
  29. 根據請求項28所述的製作方法，其與利用使用了MmPylRS的無細胞蛋白質合成系統的情況，非天然氨基酸引入效率更高。
  30. 根據請求項28或29所述的製作方法，其中，所述PylRS為天然型或變異型PylRS。
  31. 一種向多肽引入非天然氨基酸的方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸在細胞外接觸的工序。
  32. 一種結合有非天然氨基酸的tRNA的製作方法，其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS、非天然氨基酸與tRNA在細胞外接觸的工序。
  33. 一種純化的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。
  34. 一種溶液，其含有5mg/mL以上的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。
  35. 根據請求項34所述的溶液，其中，所述PylRS為天然型或變異型PylRS。
  36. 一種含非天然氨基酸的多肽的製作方法，其通過混合請求項34或35所述的溶液和非天然氨基酸來製備混合溶液。
  37. 根據請求項36所述的含非天然氨基酸的多肽的製作方法，其中，所述混合溶液為無細胞蛋白質合成系統的反應溶液。
  38. 一種向多肽引入非天然氨基酸的方法，其包括向無細胞蛋白質合成系統的反應溶液添加請求項34或35所述的溶液的工序。
  39. 一種向多肽引入非天然氨基酸的引入劑，其包括請求項34或35所述的溶液。
  40. 一種結合了非天然氨基酸的tRNA的製作方法，其包括向無細胞蛋白質合成系統的反應溶液添加請求項34或35所述的溶液的工序。
  41. 一種多核苷酸，其編碼Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和高表達啟動子。
  42. 根據請求項41所述的多核苷酸，其中，所述PylRS為天然型或變異型PylRS。
  43. 一種細胞，其含有請求項41或42所述的多核苷酸。
  44. 一種含非天然氨基酸的多肽的製作方法，其包括，向細胞引入請求項41或42所述的多核苷酸的工序，或從請求項40或41所述的多核苷酸表達PylRS的工序。
  45. 一種向多肽引入非天然氨基酸的方法，其包括，向細胞引入請求項41或42所述的多核苷酸的工序，或從請求項40或41所述的多核苷酸表達PylRS的工序。
  46. 一種向多肽引入非天然氨基酸的引入劑，其包括請求項41或42所述的多核苷酸。
  47. 一種結合了非天然氨基酸的tRNA的製作方法，其包括，向細胞引入請求項41或42所述的多核苷酸的工序，或從請求項40或41所述的多核苷酸表達PylRS的工序。
  48. 一種含非天然氨基酸的多肽的製作方法，其包括由活細胞高表達Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的工序。
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