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CN116042526A - P16基因特异性甲基化的正常人永生化结肠成纤维细胞 - Google Patents

P16基因特异性甲基化的正常人永生化结肠成纤维细胞 Download PDF

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CN116042526A
CN116042526A CN202210846132.0A CN202210846132A CN116042526A CN 116042526 A CN116042526 A CN 116042526A CN 202210846132 A CN202210846132 A CN 202210846132A CN 116042526 A CN116042526 A CN 116042526A
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Abstract

本发明公开了P16基因特异性甲基化的正常人永生化结肠成纤维细胞株CGMCC 45195。申请人在国际上首次建立P16基因特异性甲基化的正常人永生化结肠成纤维细胞株，成为体外研究表观遗传学修饰在细胞增殖、分化、凋亡、衰老等过程中起何等作用的理想模型；同时将为研究者体外研究P16基因甲基化在对肿瘤发生发展的影响提供重要的模型。

Description

P16基因特异性甲基化的正常人永生化结肠成纤维细胞
技术领域
本发明涉及细胞学基因工程的技术领域，具体地涉及P16基因特异性甲基化的正常人永生化结肠成纤维细胞。
背景技术
正常组织来源的细胞在体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这种现象称之为“海弗利克极限”。细胞永生化是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有增殖能力的过程。对细胞的永生化处理可使得传代困难、增殖慢、易衰老的正常细胞获得无限增殖能力，更易培养，这可以使研究者获得更多的细胞资源，也节省了分离细胞的周期，降低反复分离原代细胞的成本。永生化细胞稳定均一、性状一致，可建立稳定细胞库，遗传上相同的种群，有助于提供一致且可重复的实验结果，是体外研究细胞增殖、分化、凋亡、衰老等的理想模型。同时，永生化是细胞发生恶性转化的关键步骤之一，永生化细胞和肿瘤细胞关系密切，可为研究肿瘤发生机制提供重要的模型。
正常细胞因其有限的增殖能力使其在基础研究、临床应用和生物工程领域的作用受到局限。在许多实际应用中，理想的是获得具有持续增殖能力的细胞。永生化细胞恰好具有无限增殖的能力，这为基础研究、临床研究提供了很好的模型。然而，细胞自发性永生化的几率非常低，啮齿类动物细胞为10-5～10-6，而人类细胞则更罕见，小于10-12。因此，为了满足实验需求，学者们常通过基因转染等技术将外源性永生化基因导入目的细胞内，如病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等，以增加永生化的发生率，进而建立永生化细胞株来达到使体外培养的细胞具有无限增殖能力，实现细胞间无差异的目的。
CDKN2A基因位于染色体9p21，是肿瘤组织中缺失频率最高的位点之一，编码P14ARF和P16INK4A两个基因。其中，P16基因编码细胞周期调控蛋白，是一个细胞衰老控制基因，在胚胎干细胞、诱导性多能干细胞和组织干细胞中均不表达。一般认为P16基因过表达将使细胞周期停滞，启动细胞衰老过程。目前，有很多研究表明：敲除CDKN2A基因联合hTERT基因的过表达可使得正常细胞永生化。例如：Xavier
Figure BDA0003728570680000021
等人通过CRISPR的技术敲除CDKN2A的第二外显子联合端粒酶过表达构建了永生化的正常人前列腺上皮细胞株。JiLuo等人通过敲降CDKN2A基因联合端粒酶过表达建立了永生化的正常人呼吸道上皮细胞株。这为研究细胞增殖、分化、凋亡、衰老以及肿瘤发生机制提供了重要的模型。
同时，表观遗传学修饰在肿瘤发生、发展过程中具有重要作用，已得到研究者的共识，然而，表观遗传改变是否起到驱动作用，尚存在争议。P16基因(CDKN2A)是肿瘤基因组中失活频率最高的位点，DNA甲基化是其失活的主要途径。近两年的研究表明P16基因缺失和甲基化都能够明显促进肿瘤的生长和转移。虽然P16基因甲基化等表观遗传变异可能是肿瘤发生驱动因素的假说早已提出，但至今仍缺乏直接实验证据的支持。建立P16基因甲基化的永生化细胞模型也将为研究者体外研究P16基因甲基化对肿瘤发生发展的影响提供重要的模型。
尽管P16基因座位CDKN2A是人肿瘤组织中缺失频率最高的位点(10％)，但是在众多散发性肿瘤中DNA甲基化却是其失活的主要方式(30％-40％)。表观遗传学修饰在肿瘤发生、发展过程中具有重要作用，已得到研究者的共识，但是至今仍缺乏表观遗传学修饰的人永生化细胞株模型。
发明内容
本发明的目的在于利用表观遗传学修饰，构建稳定均一、性状一致、遗传背景相同的正常人永生化结肠成纤维细胞株，为体外研究表观遗传学修饰在细胞增殖、分化、凋亡、衰老等过程中起何等作用提供理想的细胞模型。
为此目的，申请人前期构建了能够与人P16启动子DNA特异性结合的人工锌指蛋白，将之与DNA甲基化转移酶Dnmt3a的酶促催化域融合，获得了P16特异性DNA甲基化转移酶(P16-dnmt3a),首次证明从头诱发该基因CpG岛甲基化可以直接导致该基因转录失活，显著延长细胞寿命。
随后，发明人利用P16特异性DNA甲基化转移酶(P16-dnmt3a)联合人端粒逆转录酶(hTERT)的慢病毒构建了正常人永生化结肠成纤维细胞株(iCCD-DT)，这为深入研究基因特异性甲基化在启动正常细胞永生化和恶性转化过程中的作用提供了良好的细胞模型，并为其分子调控机制研究提供了线索。
首先，我们利用慢病毒稳定转染的技术将外源性的P16-dnmt3a和hTERT基因导入目的细胞CCD-18Co内，从而建立了稳定转染的细胞株(iCCD-DT)。利用甲基化特异性的PCR法(methylation-specific PCR，MSP)对iCCD-DT细胞的P16基因是否发生了特异性甲基化进行检测，证实了iCCD-DT细胞的P16基因确实发生了甲基化。我们成功构建了P16基因特异性甲基化并且端粒逆转录酶过表达的正常人永生化结肠成纤维细胞株(iCCD-DT)。并且对该细胞株进行了保藏。
申请人在国际上首次建立P16基因特异性甲基化的正常人永生化结肠成纤维细胞株，成为体外研究表观遗传学修饰在细胞增殖、分化、凋亡、衰老等过程中起何等作用的理想模型；同时将为研究者体外研究P16基因甲基化在对肿瘤发生发展的影响提供重要的模型。
细胞保藏信息
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
保藏编号：CGMCC45195,保藏日期:2022年6月23日；
细胞名称:正常人永生化结肠成纤维细胞(iCCD-DT)；
种属来源:人；
组织来源:结肠；
细胞形态:成纤维细胞样；
生长特性:贴壁生长；
培养体系:MEM培养基+10％FBS+1％P/S；
培养条件:气相：空气，95％；二氧化碳，5％；温度：37℃；
传代消化:胰酶消化2-3min；1：5至1：8传代，每周2次；
冻存条件:90％FBS+10％DMSO，或使用无蛋白细胞冻存液(货号：UC000-N011)，液氮储存。
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实验材料包括缓冲液、培养基、试剂、寡核苷酸引物和模板等没有特别说明，为基因工程中常规的实验材料，均可以商购或者按照上述《分子克隆实验指南》由发明人自行配制得到。
附图说明
图1是本发明构建的pTRIPZ-p16-6I-dnmt3a慢病毒质粒图谱。
图2是MSP法对iCCD-DT细胞株P16基因甲基化进行鉴定的结果。
RKO:阳性对照、BGC803:阴性对照、CCD-18Co:未进行处理的正常人结肠成纤维细胞、iCCD-DT:永生化的正常人结肠成纤维细胞；M:甲基化；U:非甲基化。
图3是iCCD-DT细胞株P16、TERT蛋白的表达量的测定(蛋白质免疫印迹，WesternBlot)的结果。
图4是iCCD-DT细胞株老化情况测定的结果。
图5是iCCD-DT细胞株的细胞增殖能力检测的结果。
图6是iCCD-DT细胞株的STR鉴定的结果。
图7是iCCD-DT细胞株长时程动态时间观察的结果。
图8是iCCD-DT细胞株小鼠皮下成瘤结果。
具体实施方式
1.实验材料
1.1细胞
正常人结肠成纤维细胞CCD-18Co购于美国ATCC(American Type CultureCollection)细胞库；人胃癌细胞株MGC803、人结肠癌细胞株RKO、人胚肾细胞株HEK293FT系商购得到。
1.2质粒
人端粒逆转录酶慢病毒表达质粒(pLV-hTERT-IRES-hygro)购自addgene(Addgeneplasmid#85140；http://n2t.net/addgene:85140)现保存于本实验室-20℃冰箱。实验中所用到的其它质粒框架也商购自该公司。
1.3病毒包装及浓缩相关试剂
BioGeekTM慢病毒包装试剂盒购于北京合生基因科技有限公司，于本实验室-20℃冰箱中保存。
1.4 PCR相关试剂
四种脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP Mix)：Promega(美国)；
DNA聚合酶：HotStart Taq DNA聚合酶体系，Qiagen(德国)；Taq DNA聚合酶。
1.5 LB固体培养基
称取35g LB LennoxAgar(生工生物工程股份有限公司)，溶于1000mL LB液体培养基中，高压灭菌后置于室温，待温度降至30～40℃时加入50mg/mL氨苄霉素或卡那霉素1000μL，混匀倒于平皿中，约20mL/平皿，静置凝固后4℃保存。
1.6 LB液体培养基
称取25g LB肉汤培养基(生工生物工程股份有限公司)，溶于800mL水中，调pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。
1.7氨苄霉素(Ampicillin)和卡那霉素(Kanamycin)：Sigma(美国)，储存液浓度为50mg/mL，置于-20℃保存，工作液浓度为50μg/mL。
1.8细胞培养
CCD-18Co、iCCD-DT细胞用MEM+15％FBS细胞培养液培养；MGC803、RKO、HEK293FT用RPMI1640+10％FBS细胞培养液培养。MEM非必需氨基酸(MEM Non-Essential Amino AcidsSolution(100X)，NEAA)；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)：Gibco(美国)。
1.9 LigaFastTM DNA快速连接系统：Promega(美国)，内有T4 DNA连接酶(T4DNA连接酶)、2×Rapid Ligation Buffer(2×快速连接缓冲液)。
实施例1：pcDNA3.1-p16-6Idnmt3a质粒载体的构建方法
1.以小鼠Dnmt3a cDNA全长作为模版，利用PCR的方法，使用引物SEQ ID NO.1(F)和SEQ ID NO.:2(R)扩增Dnmt3a的催化域第608位氨基酸至908位氨基酸，在引物5’端引入酶切位点KpnI，3’端引入酶切位点XhoI；
2.利用KpnI和XhoI双酶切步骤1得到的PCR产物及载体pcDNA3.1/myc-his A(Addgene，商购可得)，酶切产物纯化后连接，得到的载体命名为pcDNA3.1-Dnmt3a；
3.人工合成七锌指蛋白6I寡核苷酸序列，其碱基序列如SEQ ID NO.8所示；利用PCR扩增6I序列，在引物5’端引入酶切位点EcoRI，3’端引入酶切位点KpnI；
4.利用EcoRI和XhoI双酶切步骤3得到的PCR产物及载体pcDNA3.1-Dnmt3a，酶切产物纯化后连接，得到的载体命名为pcDNA3.1-p16-6I-dnmt3a。
PCR反应体系：
模板 3ul
10X缓冲液 5uL
dNTP(10mM/每种) 1ul
引物(10uM) 1ul
Hotstart Tag DNA聚合酶 0.5ul
<![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> 39.5ul
PCR反应条件：
步骤 温度 时间 循环数
预变性 95℃ 15分钟 1
变性 95℃ 30秒
退火 57℃ 30秒 40
延伸 72℃ 30秒
最终延伸 72℃ 10分钟 1
实施例2：pTRIPZ-p16-6I-dnmt3a慢病毒质粒载体的构建方法
1.以实施例1的pcDNA3.1-p16-6I-dnmt3a为模板，用T7引物和BGHrev-MluI PCR扩增6I-dnmt3a-myc/His片段；
2.PCR产物先用EcoRI酶切，载体pTRIPZ(Addgene，商购可得)先用AgeI酶切，然后加Pfu聚合酶和dNTP各1uL/50uL体系，72℃水浴孵育15分钟；
3.对上述酶切产物进行纯化；
4.纯化后产物用MluI酶切，切胶纯化；
5.纯化后的载体和6I-dnmt3a-myc-His片段4℃连接过夜；
6.细菌转化后，挑取单克隆细菌至含有抗生素的LB培养液中，37℃，200rpm振荡培养16小时；
7.PCR方法鉴定，选择连接成功的阳性克隆；
8.取阳性克隆的质粒送测序鉴定，所制备得到的pTRIPZ-p16-6I-dnmt3a慢病毒质粒载体图谱如图1所示，其DAN的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例3：pTRIPZ-p16-6I-dnmt3a质粒的慢病毒包装
该实验操作按照BioGeekTM慢病毒包装试剂盒说明书进行。
1.转染前一天，用不含抗生素的培养液，将3-5×106个HEK293FT细胞接种到10cm细胞培养皿中，放置于37℃，5％CO2培养箱培养16～24小时；
2.取一支1.5mL EP管(标记为A管),分别加入300μL Opti-MEM培养基及40μLEpFectTM转染试剂进行稀释，混匀，室温静止5分钟；
3.另外取一支1.5mL EP管(标记为B管)，接着加入下列试剂并且混匀：实施例2所制备的慢病毒质粒载体(1.0μg/μL)2.5μL，慢病毒包装质粒混合物(1.0μg/μL)7.5μL,Opti-MEM培养基300μL；
4.将A管内的液体转入到B管内,混合均匀，然后室温静止15-30分钟；
5.将上述混合物逐滴均匀地加入到10cm皿中的HEK293FT细胞上，轻轻地混匀，然后放置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养；
6.转染6小时之后，弃去含有转染复合物的旧培养基，更换为预热的37℃新鲜的培养基；
7.转染48小时后，收集病毒上清液，再加入10mL新鲜的完全培养基至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱继续培养；
8.转染72小时之后，可以进行第二次的病毒上清液的收集，与48小时收集的上清液进行混合后利用0.45μm滤器过滤，可以直接感染目的细胞。
实施例4：pLV-hTERT-IRES-hygro质粒的慢病毒包装
该实验操作按照BioGeekTM慢病毒包装试剂盒说明书进行。
1.转染前一天，用不含抗生素的培养液，将3-5×106个HEK293FT细胞接种到10cm细胞培养皿中，放置于37℃，5％CO2培养箱培养16～24小时；
2.取一支1.5mL EP管(标记为A管),分别加入300μL Opti-MEM培养基及40μLEpFectTM转染试剂进行稀释，混匀，室温静止5分钟；
3.另外取一支1.5mL EP管(标记为B管)，接着加入下列试剂并且混匀：pLV-hTERT-IRES-hygro质粒载体(1.0μg/μL)2.5μL，慢病毒包装质粒混合物(1.0μg/μL)7.5μL,Opti-MEM培养基300μL；
4.将A管内的液体转入到B管内,混合均匀，然后室温静止15-30分钟；
5.将上述混合物逐滴均匀地加入到10cm皿中的HEK293FT细胞上，轻轻地混匀，然后放置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养；
6.转染6小时之后，弃去含有转染复合物的旧培养基，更换为预热的37℃新鲜的培养基；
7.转染48小时后，收集病毒上清液，再加入10mL新鲜的完全培养基至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱继续培养；
8.转染72小时之后，可以进行第二次的病毒上清液的收集，与48小时收集的上清液进行混合后利用0.45μm滤器过滤，可以直接感染目的细胞。
实施例5：慢病毒转染细胞及构建稳转细胞株
1.当正常人结肠成纤维细胞CCD-18Co(ATCC,CRL-1459)，传代到第6代，分裂旺盛时，在感染前一天，将待感染的细胞CCD-18Co细胞株铺于6孔板中；
2.待细胞贴壁且密度达到40％-50％，取实施例3所制备的1mL病毒上清加至铺好的细胞中，再加1mL细胞培养液，之后37℃、5％CO2培养箱内培养，为提高效率可以次日用新取得的病毒上清再感染一次；
3. 48小时后，将感染后的细胞加合适浓度的嘌呤霉素进行筛选，其中CCD-18Co细胞转染pTRIPZ-P16-6I-dnmt的用1μg/mL嘌呤霉素筛选3-4天，当无死细胞出现时，停止筛选。
4.随后取步骤3制备的细胞，重新对目的细胞进行铺板，待细胞贴壁且密度达到40％-50％，取实施例4所制备的1mL病毒上清加至铺好的细胞中，再加1mL细胞培养液，之后37℃、5％CO2培养箱内培养，为提高效率可以次日用新取得的病毒上清再感染一次；
5. 72小时后，使用潮霉素的终浓度为12.5ug/ml的完全培养基进行筛选，为期一周，最终选出稳定转染细胞株。
实验结果以及结果分析
实验1：甲基化特异性PCR(MSP)检测
该实验以MGC803作为P16基因甲基化阴性对照，以RKO作为P16基因甲基化阳性对照，以无菌双蒸水代替模板作为空白对照。
1.1 MGC803、RKO和实施例5制备的细胞的DNA提取
该实验操作按照康为世纪通用型柱式基因组提取试剂盒说明书，按照下列步骤，分别地提取MGC803、RKO和实施例5制备的细胞的DNA。
1.分别地贴壁培养上述3种细胞，然后将细胞先处理为细胞悬液，2,000rpm离心5分钟，弃尽上清，加200μl GTL，振荡至样品彻底悬浮；
2.加入20μl蛋白酶K；
3.加入200μl缓冲液GL，涡旋震荡充分混匀，56℃水浴10分钟；
4.短暂离心以去除管盖内壁的水珠。加入200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀；
5.上一个步骤中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns DM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm(～13,400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
5.向吸附柱中加入500μl缓冲液GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
6.向吸附柱中加入500μl缓冲液GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
7. 2,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；
8.将吸附柱置于一个新的1.5mL EP管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入预热的50uL缓冲液GE，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
1.2 MGC803、RKO和实施例5制备的细胞的DNA甲基化修饰
该实验操作按照Zymo EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒说明书进行。
1.CT转化试剂溶液配置(现用现配)：
Figure BDA0003728570680000091
Figure BDA0003728570680000101
2.分别取上述1.1所制备的MGC803、RKO和实施例5制备的细胞的DNA各20μL(1.0μg)至0.2mL Ep管中，加入130μL步骤1中的CT转化试剂溶液，充分混匀并离心；
3.放入PCR仪中反应：98℃,10分钟；64℃,2.5小时；4℃,20小时；
4.将Zymo-Spin IC吸附柱置于收集管中，向柱中加入600μL M-结合缓冲液；
5.将步骤3的PCR反应液加入吸附柱中，颠倒混匀，离心机12000rpm离心30秒，弃收集管中流出液；
6.加入100μL M-冲洗缓冲液于吸附柱中，离心机12000rpm离心30秒；
7.向Zymo-Spin IC吸附柱中加入200μL M-Desulphonation缓冲液，室温孵育30分钟，离心机12000rpm离心30秒；
8.继续向吸附柱中加入200μL M-Wash缓冲液，离心机12000rpm离心30秒，重复一次该步骤；
9.将吸附柱放置于新的1.5mL Ep管中，向吸附柱中吸附膜中间部位悬空加入30μLM-洗脱缓冲液，离心机12000rpm离心1分钟以洗脱DNA，收集Ep管中的DNA溶液。
1.3甲基化特异性PCR(MSP)检测
DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit)，购于ZYMO(美国)，按照该试剂盒进行DNA亚硫酸氢盐修饰。
1.MSP反应体系：
Figure BDA0003728570680000102
Figure BDA0003728570680000111
2.PCR反应条件：
Figure BDA0003728570680000112
引物序列：本实验中的寡核苷酸引物由人工合成获得
Figure BDA0003728570680000113
3.电泳检测：取5μL PCR产物混合1μL 6Xloading缓冲液，2.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
实验结果：和对照组细胞CCD-18Co相比，iCCD-DT细胞确实发生了甲基化修饰(图2)。
实验2：蛋白质免疫印迹(Western Blot)：iCCD-DT细胞株P16、TERT蛋白的表达量 的测定
1.根据目的蛋白分子量大小配制适宜浓度的SDS-PAGE分离胶和5％浓缩胶，以GAPDH蛋白为例，应配制10％分离胶；
2.蛋白样品准备：将收集好的对照组细胞CCD-18Co和实施例5制备的iCCD-DT细胞的蛋白样品溶液置于沸水中煮沸变性10分钟，离心置于冰上备用；
3.上样：取蛋白样品10μL(可根据前面测定的蛋白浓度调整上样量)及蛋白分子量Marker 5μL/2.5μL加入SDS-PAGE胶的上样孔中；
4.电泳：80V,40分钟；120V,60分钟；
5.电转：按照从阴极到阳极：海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序将转膜板固定到电转槽之中，槽之中需装满电转液,2000mA恒流约1.5小时将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上；
6.封闭：将PVDF膜置于含5％脱脂奶粉的1X PBST中室温缓慢振荡1小时；
7.一抗孵育:根据蛋白大小剪膜,分别加入含1％脱脂奶粉的1XPBST稀释的一抗，GAPDH小鼠抗人单克隆抗体(1:15000)，室温孵育1小时；
8. 1XPBST洗PVDF膜三次，每次10分钟；
9.二抗孵育：含GAPDH蛋白的条带加入含1％脱脂奶粉的1XPBST稀释的辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(1:15000)室温缓慢振荡1小时；
10. 1XPBST液洗PVDF膜六次，每次10分钟；
11.将膜从洗膜液中取出，加入提前配制好的化学发光试剂，进行曝光并且照相。
实验结果显示：P16基因甲基化之后，iCCD-DT细胞的P16蛋白表达量明显下调；且稳定转染hTERT过表达质粒后，iCCD-DT细胞的TERT蛋白表达量大幅度升高(图3)。
实验4：β-半乳糖苷酶染色
为了检测iCCD-DT细胞是否可以从衰老危机中逃离，我们分别选择了早代和晚代细胞(P20,P200)进行细胞的衰老进行了检测。
该实验操作按照通用型组织/细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒说明书进行，以24孔板为例，具体如下：
1.配置GENMED染色工作液：从-20℃冰箱中取出GENMED染色原液(试剂E)于冰上融化，在15mL离心管中加入3.8mL GENMED稀释液(试剂D)及200μL GENMED染色液(试剂E)。混匀后，置于37℃水浴预热，标记为GENMED染色工作液；
2.将对数生长期的待检测细胞均匀铺在24孔板中，待细胞贴壁后吸弃培养孔中的培养基，在每孔中加入500μL GENMED清理液(试剂A)，清洗细胞表面后吸弃清理液；
3.每孔加入500μL GENMED固定液(试剂B)，需要覆盖整个细胞表面；室温孵育5分钟，弃去固定液；
4.每孔加入500μL GENMED酸性液(试剂C)清洗，吸弃；
5.重复步骤4；
6.每孔加入500μL 37℃预热的GENMED染色工作液，需要覆盖培养皿中的细胞表面；
7.将培养皿置于37℃细胞培养箱中孵育3小时至16小时待细胞呈现蓝色；
8.光学显微镜下观察细胞形态、颜色并计数：其中呈现蓝色即表达β-半乳糖苷酶的细胞为衰老细胞；
9.统计分析：实验细胞和对照细胞分别计数6个视野，每个视野细胞总数100个以上，计算呈现蓝色的衰老细胞比率。
实验结果显示：β-半乳糖苷酶检测结果显示：未进行处理的CCD-18Co细胞在体外传代20次(体外培养100多天)的时候就已经发生了严重的衰老；而iCCD-DT细胞在第20代时，并未出现明显的衰老，甚至在连续培养到200代(体外存活700余天)的时候，细胞的衰老比例仍未上升。这意味着：在连续培养的过程中，iCCD-DT细胞越过了衰老危机，细胞不再随着培养时间的延长而发生衰老。(图4)。
实验5：细胞平板克隆形成实验
同时，为了检测iCCD-DT细胞在培养的过程中，是否能一直保持旺盛的分裂能力，我们分别选择了实施例5制备的早代和晚代细胞(P20,P200)进行了平板克隆实验。
1.胰酶消化收集单细胞悬液,细胞计数后将细胞悬液稀释成浓度为300个/200μl；
2.实验设置3个复孔，将上述细胞悬液接种于提前加入2ml完全培养基的6孔板内，200μl/孔，水平左右晃动6孔板，使细胞均匀分布，将6孔板放入37℃细胞培养箱内；
3.定期观察细胞集落形成情况，每3天对细胞进行补液，200ul/孔。7-14天后取出6孔板；
4.弃掉培养基，轻轻加入1XPBS洗去多余培养基，向孔内加入1mL细胞固定液，室温固定30min，结晶紫染色30min，再用自来水轻柔洗掉板内残余结晶紫；
5.拍照，并按照1个细胞集落大于或等于50个细胞进行计数。
实验结果显示：未进行处理的CCD-18Co细胞在体外传代20次(体外培养100多天)的时候细胞的增殖能力已经很弱，基本上无法形成平板克隆；而iCCD-DT细胞不论是在早代(P20)，还是晚代(P200),都可以形成大量平板克隆，二者之间并无明显差异(图5)。这说明：iCCD-DT细胞的增殖能力并不会随着培养时间的延长而发生衰退，而是一直保持着旺盛的增殖能力。
实验6：短串联重复序列STR鉴定
同时，为了验证在连续传代过程中iCCD-DT细胞是否被污染，我们委托北京天一辉远生物科技有限公司利用短串联重复序列(Short tandem repeat，STR)对该细胞的身份进行了鉴定，STR鉴定结果显示：iCCD-DT细胞株与初始的CCD-18Co细胞具有相同的特征图谱(图6)，说明细胞并未发生污染，iCCD-DT细胞的初始来源仍为CCD-18Co。
STR鉴定结果显示：iCCD-DT细胞株与初始的CCD-18Co细胞具有相同的特征图谱(图6)，说明细胞并未发生污染，iCCD-DT细胞的初始来源仍为CCD-18Co。
实验7：、iCCD-DT细胞株长时程动态活细胞成像
1.胰酶消化细胞培养皿中处于对数生长期的细胞，吸取细胞培养基悬浮细胞，制成细胞悬液，传代至6cm细胞培养皿；
2.待细胞处于对数生长期时将6cm细胞培养皿置于IncuCyte Zoom系统自带培养箱中选定的连续监测模块中，对培养过程种的细胞进行拍照并记录.
实验结果显示：正常细胞的分裂次数是有限的，并不能无限制的分裂下去，体外培养的细胞分裂50-60次后就会停止，这被称为“海弗利克极限”。而iCCD-DT细胞到目前为止已经体外分裂200余次，培养时间长达800余天，incucyte长时程动态拍照结果显示：到目前位置，iCCD-DT细胞状态依旧完好，无衰老特征出现且保持着旺盛的分裂能力(图7)，这意味着iCCD-DT已经越过了海弗利克极限，实现了永生化。
实验8：小鼠皮下成瘤实验
为了检验：iCCD-DT细胞是否只发生了永生化而未发生恶性转化，我们进行了小鼠皮下成瘤实验。
1. 4-6周龄的NOD-SCID雌性小鼠饲养一周后标记；
2.将处于对数生长期的iCCD-DT细胞以及阳性对照AGS细胞进行胰酶消化并计数，用无血清的细胞培养液悬浮并调整细胞浓度为2×107个/mL，然后与基质胶等体积混合以包裹细胞；
3.取200μL iCCD-DT组分别接种于小鼠两侧的四肢根部皮下，iCCD-DT组5只小鼠；取100μL AGS细胞同样接种1只小鼠；
4.定期观察小鼠的皮下接种处形成肿瘤的情况；
实验结果显示：该细胞株不具有成瘤能力，确实只发生了永生化而未发生恶性转化(图8)。

Claims (2)

1.一种P16基因特异性甲基化的正常人永生化结肠成纤维细胞株CGMCC 45195。
2.一种质粒载体，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
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