CN106635980B - 一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系及其建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物细胞系，具体公开了一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系及其建立方法。具体为，采集成年健康绵羊的外周血，利用人外周血淋巴细胞分离液分离细胞后，进行细胞的培养与传代，传代过程中，通过对消化步骤的优化以及对培养基的优化，获得一种均一性高的自发永生化的绵羊外周血来源细胞系，该细胞系可表达绵羊的多种先天免疫受体，可用于细胞生物学、病原与宿主相互作用的体外研究。为促进绵羊健康养殖及疫病防控提供了很好的细胞学工具，为体外研究病原与绵羊的相互作用、评估药物或生物制品对绵羊的影响，更好的服务绵羊的健康养殖。

Description

一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系及其建立方法

技术领域

本发明涉及生物细胞系，具体地说，涉及一种绵羊外周血来源细胞系。

背景技术

绵羊是全球重要的肉制品和皮毛制品来源动物，在畜牧生产、餐饮、公众健康等领域有重要作用。当前，绵羊的多种重大疫病、如口蹄疫、小反刍兽疫、布鲁氏杆菌病、捻转血矛线虫病等越来越受到重视，其中布鲁氏杆菌病不仅严重危害绵羊本身，也极大地威胁人类的健康安全。然而，当前的研究中，研究这些疫病的科学工具和技术严重缺乏，制约了相关领域的技术发展。

绵羊来源的细胞系是研究病原体与绵羊相互作用、绵羊免疫应答等的可靠细胞学工具。然而，目前已知的可用于研究的绵羊细胞系(如卵巢细胞系、成纤维细胞系)较少，严重制约了这种研究的开展。因此，获得更多的具有不同特性的绵羊细胞系将促进绵羊重大疫病防控的研究。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系及其建立方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系的建立方法，包括如下步骤：

(1)细胞分离：利用真空采血管(含有肝素锂)从成年健康绵羊颈静脉采血5mL，在细胞超净台进行后续的细胞分离及培养工作。取新鲜抗凝全血5mL，用等体积PBS稀释全血后，先在离心管中加入5mL的常温淋巴细胞分离液(达人外周血淋巴细胞分离液)，然后将稀释后的血缓缓加到分离液液面上方。在室温下，选择水平转子700～800g(2000～2500rpm)离心20～30min。离心结束后，用移液器小心吸取血浆层与分离液层之间是一层薄且较致密的白膜，即：单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)层到另一离心管中。将细胞用PBS稀释重悬后再室温下用水平转子250g(1000rpm)，离心10min并重复洗涤1次。

此步骤中使用的人外周血淋巴细胞分离液效果优于小鼠淋巴细胞分离液及Percoll等分离试剂，外周血淋巴细胞的得率明显高。

(2)细胞培养：将细胞沉淀用培养基(RPMI 1640高糖培养基(GIBICO)，添加10％FBS(GIBICO)，5％绵羊血清(Invitrogen)，链霉素及青霉素含200IU/mL，环丙沙星10μg/mL)，重悬后计数，按照10⁶密度铺至10cm直径的细胞培养皿，置于含5％CO₂的37℃细胞培养箱中培养。

此步骤中添加绵羊血清是为绵羊外周血淋巴细胞生长提供更接近于天然状态的生长微环境；链霉素及青霉素是为了抑制可能的细菌污染，环丙沙星是为抑制可能的支原体污染。

(3)细胞的消化与传代：细胞在2h后用PBS洗涤去除未贴壁细胞，重新加入新鲜的上述培养基培养。48h后，细胞培养用PBS洗涤去除培养基后，加入含EDTA的0.25％胰酶消化液0.5mL，于含5％CO₂的37℃细胞培养箱中孵育5min，然后用吸管吹打使细胞脱落，重悬为单个细胞，加入培养基终止消化后，将细胞转移至新的培养皿中继续培养。

在显微镜下观察细胞生长至50％铺满状态时进行细胞传代。在培养的第3代，将细胞培养基中的RPMI 1640高糖培养基减少50％，同时添加等体积的DMEM高糖培养基，再次培养和传代3次。

该步骤中须使用含EDTA的0.25％胰酶，在后期传代培养时对比发现，不含EDTA的0.25％胰酶不能对细胞进行消化(加入0.25％胰酶消化液0.5mL，于含5％CO₂的37℃细胞培养箱中孵育10min，显微镜下观察细胞仍然处于50％状态，细胞形态也未发生改变，用吸管吹打也未有大量细胞悬浮)。在细胞处于50％铺满状态进行传代是为了使分裂能力强的细胞能更好的被传至下一代次。

(4)细胞亚克隆：在连续培养的第4代，从培养皿中发现密集生长的单个细胞克隆总计8个，每个细胞克隆大直径为4-5mm(见图1左)，肉眼明显可见。用记号笔在培养皿底部标记肉眼可见的细胞克隆后，用细胞克隆环(直径5mm)将细胞克隆罩住，在环内加入含EDTA的0.25％胰酶消化液10μL，于含5％CO₂的37℃细胞培养箱中孵育5min，用移液器吸头吹打细胞，将获得的细胞悬液转移至6孔细胞板进行继续培养。

该步骤使用了细胞克隆环，可以确保获得的细胞来源为单一克隆，为建立细胞系奠定了基础。

(5)细胞的继续传代培养：在6孔细胞板继续培养的细胞按照上述细胞传代的要求，在处于100％铺满状态进行传代。在第6代后，将培养液中的RPMI 1640高糖培养基全部更换为DMEM高糖培养基。待细胞生长铺满至呈现成纤维状细胞形态(见图1右上)时进行下一代的传代。每隔20代对传代细胞做一次冻存备份，细胞继续传代至50代。

该步骤中更换培养基是为以后进行连续传代提供稳定的培养基，根据对比实验，含有RPMI 1640高糖培养基的培养液效果差于DMEM高糖培养基的培养液。另外，在继续传代过程中待细胞生长至铺满且呈现成纤维状细胞形态后再传代，可以确保细胞的均一性。

第二方面，本发明提供了经前述方法建立的自发永生化的绵羊外周血来源细胞系。

该细胞系可表达MHC-I类分子及先天免疫相关的TLR分子，并可连续传代培养超过50代。

所述细胞系适用于体外进行绵羊的细胞生物学、免疫学研究。可用于病原体如病毒、细菌和寄生虫与宿主相互作用的研究。例如，可用于刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)的体外培养，可用于捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)等寄生虫的体外培养研究。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种绵羊来源的细胞系，该细胞系可表达绵羊的多种先天免疫受体，可用于细胞生物学、病原与宿主相互作用的体外研究。该细胞系为促进绵羊健康养殖及疫病防控提供了很好的细胞学工具，为体外研究病原与绵羊的相互作用、评估药物或生物制品对绵羊的影响，更好的服务绵羊的健康养殖。可显著改善目前绵羊先天免疫应答等研究所缺乏的细胞学工具，解决了目前绵羊生产中重大动物疫病防控的难题。

附图说明

图1为本发明所获得的自发性永生化的绵羊外周血来源细胞系。在将外周血单个核细胞(PBMC)连续在体外培养后，大部分细胞衰老死亡，剩余的自发永生化细胞形成细胞克隆。将此细胞克隆转移至细胞板上培养，可见其在铺满细胞板后呈现成纤维状细胞的特征。而单个生长细胞或未铺满的细胞则呈现多形性。

图2为本发明获得的自发性永生化的绵羊外周血来源细胞系进行MHC-I免疫荧光染色，图中可见细胞膜有大量MHC-I分子，而细胞核着染DAPI后呈现亮蓝色。

图3为本发明获得的自发性永生化的绵羊外周血来源细胞系进行实时定量PCR测定TOLL样受体分子TLR1-TLR10表达情况。使用来自细胞系提取的总RNA作为材料进行反转录获取cDNA样品，扩增结果可见部分TLR分子在正常生长(C)时不表达，而在加LPS(L)刺激后则发生明显的表达，“+”和“-”分别为阳性和阴性模板对照。

图4为本发明获得的自发性永生化的绵羊外周血来源细胞系进行刚第弓形虫的体外培养实验。所使用的刚第弓形虫为表达黄色荧光蛋白(YFP)基因的转基因RH虫株。弓形虫速殖子在细胞内形成了假包囊，其中含有数十个甚至数百个速殖子。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1自发性永生化的绵羊外周血来源细胞系的建立

(1)细胞分离

利用真空采血管(含有肝素锂)从成年健康绵羊颈静脉采血5mL，在细胞超净台进行后续的细胞分离及培养工作。取新鲜抗凝全血5mL，用等体积PBS稀释全血后，先在离心管中加入5mL的常温淋巴细胞分离液(达人外周血淋巴细胞分离液)，然后将稀释后的血缓缓加到分离液液面上方。在室温下，选择水平转子700～800g(2000～2500rpm)离心20～30min。离心结束后，用移液器小心吸取血浆层与分离液层之间是一层薄且较致密的白膜，即：单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)层到另一离心管中。将细胞用PBS稀释重悬后再室温下用水平转子250g(1000rpm)，离心10min并重复洗涤1次。

(2)细胞培养

将细胞沉淀用培养基(RPMI 1640高糖培养基(GIBICO)，添加10％FBS(GIBICO)，5％绵羊血清(Invitrogen)，链霉素及青霉素含200IU/mL，环丙沙星10μg/mL)，重悬后计数，按照10⁶密度铺至10cm直径的细胞培养皿，置于含5％CO₂的37℃细胞培养箱中培养。

(3)细胞的消化与传代

细胞在2h后用PBS洗涤去除未贴壁细胞，重新加入新鲜的上述培养基培养。48h后，细胞培养用PBS洗涤去除培养基后，加入含EDTA的0.25％胰酶消化液0.5mL，于含5％CO₂的37℃细胞培养箱中孵育5min，然后用吸管吹打使细胞脱落，重悬为单个细胞，加入培养基终止消化后，将细胞转移至新的培养皿中继续培养。

在显微镜下观察细胞生长至50％铺满状态时进行细胞传代。在培养的第3代，将细胞培养基中的RPMI 1640高糖培养基减少50％，同时添加等体积的DMEM高糖培养基，再次培养和传代3次。

(4)细胞亚克隆

在连续培养的第4代，从培养皿中发现密集生长的单个细胞克隆总计8个，每个细胞克隆大直径为4-5mm(见图1左)，肉眼明显可见。用记号笔在培养皿底部标记肉眼可见的细胞克隆后，用细胞克隆环(直径5mm)将细胞克隆罩住，在环内加入含EDTA的0.25％胰酶消化液10μL，于含5％CO₂的37℃细胞培养箱中孵育5min，用移液器吸头吹打细胞，将获得的细胞悬液转移至6孔细胞板进行继续培养。

(5)细胞的继续传代培养

在6孔细胞板继续培养的细胞按照上述细胞传代的要求，在处于100％铺满状态进行传代。在第6代后，将培养液中的RPMI 1640高糖培养基全部更换为DMEM高糖培养基。待细胞生长铺满至呈现成纤维状细胞形态(见图1右上)时进行下一代的传代。每隔20代对传代细胞做一次冻存备份，细胞继续传代至50代。

(6)细胞系的鉴定(转录组测试分析)

待培养至45代的绵羊来源细胞系生长至100％铺满时，加入含EDTA的0.25％胰酶消化液0.5mL，于含5％CO₂的37℃细胞培养箱中孵育5min，然后用吸管吹打使细胞脱落，加入培养基终止消化后，800g离心5分钟收集细胞，加入1mL TRIzol试剂(Invitrogen)。用试剂厂商提供的标准方法提取样品总RNA。即用移液器轻轻吹起细胞，将细胞悬液转移至无RNAase的1.5mL EP管中。按0.2mL/1mL TRIzol比例加入氯仿，盖紧EP管盖，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟。2-8℃离心15分钟，转速不超过12000g。把上层溶液小心转移至新的EP管中。向其中加入等体积异丙醇，充分混匀。-20℃静置10min后，2-8℃离心15分钟，转速不超过12000g，弃上清。将EP管再次瞬时离心，用移液器吸弃残留的乙醇。打开EP管盖，室温放置5min，使残留的乙醇挥发干净。根据RNA的量加入25-100μL无RNase的水溶解RNA。

用分光光度计测定所提取的RNA的浓度及纯度。然后根据1％琼脂糖凝胶电泳(总RNA上样量约为1μg)结果，对提取的总RNA进行RNA完整性以及是否有基因组DNA污染的评价。

使用试剂盒ribo-zero消化核糖体RNA后；加入打断试剂将RNA打断成短片段，以打断后的RNA为模板，用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，在cDNA二链合成时以dUTP代替dTTP，然后连接不同接头，再利用UNG酶法将含有dUTP的一条链进行消化，只保留连接链不同接头的cDNA一链；使用试剂盒纯化cDNA一链；纯化的cDNA一链再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；构建好的文库用Agilent 2100Bioanalyzer质检合格后，使用Illumina HiSeq^TM 2500或其他测序仪进行测序。

经测序平台测序所得的数据称经过滤得到clean reads，用tophat/bowtie2将clean reads比对到绵羊基因组的参考序列。然后比对基因的转录情况。

结果显示，该细胞系的转录本与绵羊参考基因组的总匹配(total mapped)比例为84.96％，表明该细胞为绵羊来源，无其他真核细胞或者细菌及支原体等污染。

实施例2 MHC-I染色

在6孔细胞培养板中置入直径为10mm的无菌盖玻片，然后将单个的细胞悬液加入细胞孔，并加入上述培养基进行培养。待细胞长至80％铺满状态时，按照标准的间接免疫荧光染色方法进行MHC-I染色。

首先用PBS洗涤细胞孔，吸净残余液体后每孔加入1mL预冷的无水甲醇溶液，将细胞板置于-20℃10min，然后用PBS洗涤3次。用PBS配制的一抗溶液(鼠抗绵羊MHC-I单克隆抗体，克隆号41.17，美国abdserotec公司生产，每毫升PBS加入抗体溶液5μL)加入细胞孔，每孔1mL，于室温反应30min，然后弃去一抗溶液，PBS洗涤3次后加入FITC标记二抗(稀释比率为1:1000)，PBS洗涤3次后加入加入DAPI复染。将盖玻片用眼科镊夹起后转移至载玻片上，用指甲油封片后观察。

实施例3弓形虫培养

将传代至51代的绵羊来源细胞系消化后转移至新的细胞培养瓶，待细胞生长至80％铺满时进行弓形虫接种。

将表达黄色荧光蛋白(YFP)的弓形虫速殖子1×10⁶个接种至上述培养的细胞。24h后更换培养基，连续培养72h，其间每天观察弓形虫在细胞内的发育状况。

在96h时，利用倒置荧光显微镜(IX71，Olympus)进行观察并记录图像。

实施例4 TOLL样受体分子TLR1-TLR10表达情况

将连续传代至55代的自发性永生化的绵羊外周血来源细胞系消化后铺至6孔细胞培养板中，每孔1×10⁶个细胞。以LPS(1μg/mL，Sigma)刺激或不刺激细胞。6h后，吸弃培养基，PBS洗涤2次。每孔加1mL TRIzol试剂(Invitrogen)，然后参照实施例3中的总RNA提取及测定方法获得总RNA。

将总RNA溶液稀释至200ng/μL。使用EasyFirst-Strand cDNASynthesisSuperMix(Transgen)进行逆转录反应。反应体系如表1所示：

表1逆转录反应体系

轻柔混匀后，42℃孵育30min，85℃加热5s失活EasyRT/RI。反应结束后，将cDNA溶液保存于-20℃。

以所获得的cDNA为模板，利用表2中的引物进行PCR反应，检测该细胞系中绵羊TOLL样受体分子的表达。

表2用于鉴定绵羊TLRs分子表达水平的引物序列(*)

*：这些引物序列来源于Chang，J.-S.，et al.，2009.127(1):p.94-105.

PCR反应体系如表3所示：

表3 RCR反应体系(25μL体系)

PCR反应条件如下：94℃ 10min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃10min，4℃保存。

反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳。

对比例1

将继续传代培养至第10代的细胞分别用培养液1(RPMI 1640高糖培养基(GIBICO)，添加10％FBS(GIBICO)，5％绵羊血清(Invitrogen)，链霉素及青霉素含200IU/mL，环丙沙星10μg/mL)、培养液2(RPMI 1640高糖培养基与DMEM高糖培养基比例为1:1，添加10％FBS，5％绵羊血清，链霉素及青霉素含200IU/mL，环丙沙星10μg/mL)和培养液3(DMEM高糖培养基，添加10％FBS，5％绵羊血清，链霉素及青霉素含200IU/mL，环丙沙星10μg/mL)进行培养和连续传代，培养液3能使细胞连续生长10代以上，而培养液1和培养液2培养的细胞在10代以内出现了细胞空泡和老化，未成功进行连续传代。表明绵羊外周血来源的细胞起初用培养液1进行培养、更换培养液2后进行细胞传代及细胞克隆、在后期的连续传代中使用培养液3是保证细胞系建立的关键。

对比例2

在培养液中加入环丙沙星溶液保证了细胞不受支原体污染。在培养过程中，上述培养液1和培养液2所培养的细胞在传代后如果培养液中不添加环丙沙星，则细胞在传代5-8代后发现明显的支原体污染，表明采集的绵羊血在分离前已经有潜在的支原体存在。

因此环丙沙星的加入可以有效清除潜在的支原体污染。而在后期的转录组测序分析中未发现支原体的转录本，表明该细胞系无支原体污染。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）细胞分离：从成年健康绵羊颈静脉采血，用等体积PBS稀释全血后，先在离心管中加入常温人外周血淋巴细胞分离液，然后将稀释后的血缓缓加到分离液液面上方，在室温下，选择水平转子700~800 g（2000~2500 rpm）离心20~30min，吸取血浆层与分离液层之间的细胞沉淀；

（2）细胞培养：将细胞沉淀用添加10% FBS，5%绵羊血清，200 IU/mL链霉素和青霉素与10 μg/mL环丙沙星的RPMI 1640高糖培养基进行细胞重悬，按照10⁶密度铺至10cm直径的细胞培养皿，置于含5% CO₂的37℃细胞培养箱中培养；

（3）细胞的消化与传代：细胞在培养2h后用PBS洗涤去除未贴壁细胞，重新加入新鲜的上述培养基培养，48h后，用PBS洗涤去除培养基后，加入含EDTA的0.25%胰酶消化液0.5mL，置于含5%CO₂的37℃细胞培养箱中孵育5min，然后用吸管吹打使细胞脱落，重悬为单个细胞，加入培养基终止消化后，将细胞转移至新的培养皿中继续培养；

观察细胞生长至50%铺满状态时进行细胞传代，在培养的第3代，将细胞培养基中的RPMI 1640高糖培养基减少50%，同时添加等体积的DMEM高糖培养基，再次培养和传代3次；

（4）细胞亚克隆：待培养得到肉眼可见的细胞克隆后，使用细胞克隆环将细胞克隆罩住，对单一细胞克隆进行消化、重悬后，转移至6孔细胞板进行继续传代培养；

（5）细胞的继续传代培养：待细胞生长至铺满且呈现成纤维状细胞形态后再传代，在第6代后，将培养液中的RPMI 1640高糖培养基全部更换为添加10% FBS，5%绵羊血清，200 IU/mL链霉素和青霉素与10 μg/mL环丙沙星的DMEM高糖培养基进行传代培养，每隔20代对传代细胞做一次冻存备份，细胞继续传代至50代。

2.一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系，其特征在于，利用权利要求1所述的方法建立得到。