CN103031270A - 胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种兔肝内的胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，属于生物医药技术领域。包括如下步骤：（1）上皮细胞分离，纯化，培养；（2）细胞生长线测定；（3）鉴定。本发明胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法通过多步分离方法获得纯度较高的胆管上皮细胞，并建立了胆管上皮细胞的长时间增殖培养体系，并首次发现Rho激酶抑制剂Y-27632可显著性地促进肝内胆管上皮细胞的增殖，具有操作较为简单，适合推广与应用等优点，并可为研究胆道闭锁和原发性胆汁肝硬化等在内的多种疾病机理提供平台。
Description
技术领域
本发明涉及一种兔肝内胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
胆管上皮细胞异常病理可引发包括胆道闭锁和原发性胆汁肝硬化等在内的多种疾病，研究这些疾病发病机制的其中一个理想方法是建立体外的胆管上皮细胞可扩增培养体系。采用不同的分离纯化方法，研究人员已先后从人和啮齿类动物胆管组织中分离培养出胆管上皮细胞，迄今尚未见到兔胆管上皮细胞分离培养的研究报道。兔子是常用的实验动物，取材经济方便，兔子肝脏的多方面生理及生化指标与人类有许多相似的特点，因此是人类肝脏疾病动物模型重要的补充。
目前，国内外报道成功的正常肝内胆管上皮细胞的培养方法主要组织块培养法，密度梯度离心法和细胞分选法等，但这些方法存在细胞纯度不高，体外培养的原代胆管上皮细胞增殖能力弱，无法进行长时间的可扩增培养，以及研究材料往往需要涉及整肝组织，肝组织消耗较大等缺陷，如：细胞分选法是获得高纯度胆管上皮细胞的有效方法，但细胞分选需要有专门的分选设备如流式细胞仪，分选获得的单个细胞也并十分适合胆管上皮细胞的生长，且目前缺乏胆管上皮细胞的特异性表面标志物，这些因素制约着细胞分选技术的开展应用；密度梯度离心法可以在一定程度上纯化胆管上皮细胞，但也不可避免地混合其他种类的细胞如肝星型细胞和成纤维样细胞，因而细胞纯度不高；组织块培养法优点是最大程度地保留了体内胆管上皮细胞的生物学特性，因而也具有较好的生长活性，但这一方法同样可以促进成纤维样细胞、肝细胞与胆管上皮细胞的混合生长，纯度较低；国内外可供应用的正常肝内胆管上皮细胞株很少，性状不稳定，容易发生恶性转化；尽管已有一些胆管上皮细胞分离培养的研究报道，但研究结果显示已有的大部分培养体系无法长时间地维持细胞的增殖，即使在添加EGF和HGF等细胞因子的情况下，也只能适当延长细胞的存活时间，效果并不十分显著。
有基于此，做出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法。
实现本发明目的所采取的技术方案如下：
肝胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，包括如下步骤：
（1）上皮细胞分离，纯化，培养；
（2）细胞生长线测定；
（3）鉴定。
其中：
（1）上皮细胞分离，纯化，培养：取5－20克的肝脏组织，剪成约1mm3的小块，在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)中浸泡洗涤3次后，在37℃的摇床中，用含5mg/ml的IV型胶原酶的DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）高糖培养基消化组织块30-60分钟，收集细胞1200r/min离心5min，重复3遍去除胶原酶；纯化肝胆管上皮细胞，将纯化后的肝胆管上皮细胞分别以克隆状密度（50细胞/cm2）接种于事先配置好的培养基(DMEM+10%FBS（fetal bovine serum, 胎牛血清）+ITS（Insulin-Transferrin-Selenium)中，于37℃、5%（体积体积比）的CO2中培养6-10天后，无菌条件下用玻璃分针切割胆管上皮细胞集落为小细胞团（20个-50个细胞团块），并转移至新的培养皿或培养板中进一步传代培养。
（2）细胞生长线的测定：将细胞以每孔5×103个细胞接种于有matrigel包被的4孔板中，每孔体积为500μl，置于37℃的5%（体积比）CO2中培养，分别于培养的第5-7天消化收集并测定细胞浓度。
（3）培养细胞的鉴定包括免疫细胞化学染色和胆管样结构形成，a．免疫细胞化学染色：用4%（体积比）多聚甲醛在室温下固定步骤（1）培养的胆管上皮细胞20 min（加入多聚甲醛前吸掉培养基，并用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)清洗2-3遍），加入0.4%（体积比）Triton X-100透膜15 min，用PBS冲洗3遍后；加入5%（体积比）的羊血清，室温下封闭0.5 h，加入一抗，37℃孵育40 min或4℃过夜，去掉一抗后，PBS冲洗3次后，进行DAB（辣根过氧化酶检测试剂盒）显色，倒置显微镜下检测，每次实验检测的细胞数大约为1 000个；
b. 胆管样结构形成：将Matrigle 用DMEM以1:1稀释, 包被在培养皿或培养板上形成5mm厚的三维Matrigle培养体系，1h后将5代内的胆管上皮细胞以1×105/cm2细胞密度接种在三维Matrigel上培养5－7天，其中，培养液为：DMED/F12 中加入10%FBS（Hyclone公司）, 20ng/ml HGF(hepatocytes growth factor, HGF, 肝细胞生长因子), 1×ITS和2mM 谷氨酸。
本发明技术方案的进一步设置如下：
步骤（1）中，所述的纯化是指：向分离的细胞中加入适当体积（细胞裂解液与细胞体积比为5:1）的红细胞裂解液，充分混匀，红细胞充分裂解后，配平，以1200r/min的速度离心5分钟重复三遍，裂解红细胞；收集细胞，将细胞悬浮于DMEM高糖培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）中，50g/min, 离心1min，重复三遍，收集上清液中的非实质性肝细胞。
步骤（1）中，所述的胆管上皮细胞培养基成分为：α-MEM(alpha Minimum Essential Medium)/DMEM（质量比为1:1）+ FBS + ITS + 10nmol/L Y-27632 + 100μg/ml 青链霉素。
步骤（1）中，培养用到的培养皿或者培养板均预先用250 μg/ml matrigel于37℃包被1h。
在本发明技术方案的分离纯化方法中，首先采用红细胞裂解液裂解数量丛多的红细胞，然后用密度梯度离心法去除成熟肝细胞获得非实质性肝脏细胞，由于成熟肝细胞密度和体积均比较大，在50g/min, 离心1min情况下可以沉淀至离心管底部，而肝内其他细胞仍保留在上清液中。在培养的非实质性肝细胞中，本技术方案获得了胆管上皮细胞和其它类型的细胞，由于是克隆状密度生长，胆管上皮细胞得以生成大的细胞集落，在此基础上我们通过显微镜下用玻璃针剥离胆管上皮细胞集落，即可获得了高纯度的胆管上皮细胞。
其中，matrigel 富含层粘链蛋白、胶原等细胞外基质，这一成分与胆管上皮细胞的体内微环境极为相似；Y-27632是Rho信号通路的抑制剂，可促进多种上皮型干细胞的增殖与存活，同样对胆管上皮细胞的增殖具有积极的作用，细胞外基质Matrigel进行包被预处理，促进胆管上皮细胞的生长和增殖，实现胆管上皮细胞的长时间扩增培养，并可促使细胞体外连续传代。
本技术方案首次采用二维的matrigel作为细胞外基质，在Y-27632存在的情况下，可显著性地提高胆管上皮细胞的体外扩增效率，这一结果表明Y-27632对上皮细胞的增殖作用可能具有普遍意义。
综上所述，本研究通过多步分离方法获得纯度较高的胆管上皮细胞，并建立了胆管上皮细胞的长时间增殖培养体系，并首次发现Rho激酶抑制剂Y-27632可显著性地促进肝内胆管上皮细胞的增殖。这一培养体系操作较为简单，适合推广与应用，并可为研究胆道闭锁和原发性胆汁肝硬化等在内的多种疾病机理提供平台。
附图说明
图1为原代和传代培养的胆管上皮细胞及Y-27632对细胞的增殖作用（(A)原代培养的非实质性肝细胞，白色虚线所围为胆管样上皮细胞；(B)机械纯度后传代培养上皮细胞；(C)Y-27632（Y）可显著促进上皮细胞的增殖（P<0.05）。(A), (B)放大100倍）；
图2 胆管样上皮细胞免疫组化鉴定（(A) 细胞表达CK18；(B) 细胞表达CK19；(C) 细胞表达GGT; (D) 细胞表达vimentin。(A), (B), (C), (D) 放大100倍）；
图3 胆管样上皮细胞胆管样结构形成能力（(A) 3维matrigel体系中培养细胞形成胆管样结构；(B) 细胞免疫化学显示胆管样结构中的细胞表达CK7，(A) 放大100倍, (B) 放大200倍）。
具体实施方式
材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 10只12周大的新西兰大白兔，雌雄不限，购自绍兴文理学院实验动物中心，观察一周正常后用于实验。
1.1.2 试剂 DMEM、α-MEM、ITS、Trypsin-EDTA、IV型胶原酶、青链霉素和1×D-PBS均购自于美国Invitrogen生命技术公司，hepatocyte growth factor (HGF) 购自Peprotech公司（联科生物技术有限公司），培养板培养皿购自NUNC公司或Corning公司，红细胞裂解液购自Tiangen公司，胎牛血清（FBS）分别购于杭州四季青、Hyclone 公司，Y-27632购自Sigma公司，倒置显微镜购自Nikon公司。
1.1.3 胆管上皮细胞培养基：α-MEM/DMEM（1:1）+ FBS + ITS + 10nmol/L Y-27632 + 100μg/ml 青链霉素。
方法
1.2.1 胆管上皮细胞的分离、纯化与培养 每只兔子取大约5－20克的肝脏组织，剪成小块（约1mm3），在PBS中浸泡洗涤3次后，在37℃的摇床中，用含5mg/ml的IV型胶原酶的DMEM消化组织块30-60分钟，收集细胞1200r/min离心5min，重复3遍去除胶原酶，分离上皮细胞；向分离的上皮细胞中加入适当体积（细胞裂解液与细胞体积比为5:1）的红细胞裂解液，充分混匀，待红细胞充分裂解后放入离心机，配平后以1200r/min的速度离心5分钟，重复三遍，收集细胞，将细胞悬浮于DMEM溶液中，50g/min, 离心1min，重复三遍，收集上清液中的非实质性肝细胞；分别将非实质性肝细胞以克隆状密度（50细胞/cm2）接种于事先配置好的培养基(DMEM+10%FBS（fetal bovine serum, 胎牛血清）+ITS（Insulin-Transferrin-Selenium)中，培养皿或者培养板预先用250 μg/ml matrigel于37℃包被1h后，在37℃的 5%（体积体积比）CO2中培养6-10天，待出现大的胆管上皮细胞样集落（形态相同细胞形成的聚集在一起的一片细胞）后，倒置显微镜下，无菌条件下用玻璃分针切割胆管上皮细胞集落为小细胞团（20个-50个细胞团块），并转移至新的培养皿/培养板中进一步传代培养。
1.2.2 细胞生长曲线测定：将细胞以每孔5×103个细胞接种于有matrigel包被的4孔板中，每孔体积为500μl，置于37℃的5%（体积体积比）CO2中培养；分别于培养的第5-7天消化收集细胞，红细胞计数器测定细胞浓度。
培养细胞的鉴定
1.3.1 免疫细胞化学染色
用4%多聚甲醛在室温下固定细胞20 min，0.4% （体积比）Triton X-100透膜15 min，用PBS冲洗3遍后；加入5%（体积比）的羊血清室温下封闭0.5 h，加入一抗，于37℃孵育40 min或4℃过夜，去掉一抗后，PBS冲洗3次，按Dako公司的操作试剂盒进行DAB显色，倒置显微镜下检测，每次实验检测的细胞数大约为1 000个。以不添加一抗，而添加DAB操作试剂盒中二抗的细胞作为阴性对照组，检测二抗的非特异性结合情况。一抗来源见表1。
表1：本研究中使用的抗体
1.3.2 胆管样结构形成实验 将Matrigle用DMEM以1:1稀释, 包被在培养皿/培养板上形成5mm厚的三维Matrigle培养体系，1h后将5代内的胆管上皮细胞以1×105/cm2细胞密度接种在三维Matrigel培养体系上培养5－7天，其中，培养液为：DMED/F12 中加入10%FBS（Hyclone公司）, 20ng/ml HGF, 1×ITS和2mM 谷氨酸。
统计分析
统计数据（3次重复）以平均值±标准误(SE)进行表示，统计分析采用SPSS10.0软件进行LSD（least-significant difference，最小显著差数法）分析。P<0.05为差异显著。
结果
2.1 原代培养细胞形态
将离心获得的非实质性肝脏细胞以克隆状密度接种至包被有matrigel的培养板中，24h后观察细胞基本已贴壁，换液清洗未贴壁的细胞及少量的红细胞；培养5-7天后，倒置显微镜下观察发现原代培养的非实质性肝脏细胞出现两种不同的细胞形态：一种细胞形态呈立方形或扁平的多角形，呈“铺路石状”贴壁生长，细胞直径在10-15μm之间（图1A，白色虚线所围细胞），形态上与胆管上皮细胞具有很高的相似度；另一种为细胞形态不规则，有些呈成纤维样（图1A）。
细胞纯化、传代及长时程培养
在倒置显微镜下，用手拉的玻璃针将胆管样上皮细胞集落切割成小团块后，转移至新的包被有matrigel的培养皿或培养板中继续培养，传代细胞表现出均一性的多角形上皮细胞形态（图1B），并未见成其他类型细胞的生长。在含有Y-27632 的培养体系中，上皮样细胞集落可连续传10代以上，总存活时间超过3个月；而未添加Y-27632组上皮样细胞只能少量增殖（图1C），两者差异极显著。
上皮样细胞的鉴定
2.3.1 细胞免疫化学染色
为鉴定纯化培养的上皮样细胞集落是否是胆管上皮细胞，采用多种胆管上皮细胞的特异性标志物对其进行细胞免疫化学鉴定。结果显示：100%上皮样集落细胞特异性地表达CK18（图2A），CK19（图2B），GGT（图2C）, Vimentin（图2D）等胆管上皮细胞的特异性标志物；但不表达肝细胞的标志物AFP, ALB以及肝星型细胞的标志物Desmin和αSMA。这一研究结果表明：分离培养的上皮样细胞为胆管上皮细胞。
2.3.2 胆管样结构形成实验
为进一步证实分离培养的上皮样细胞为胆管上皮细胞，我们进行了胆管样结构形成实验。将长满80-90%的细胞用0.05%Trypsin-EDTA消化后，按1×105/cm2细胞密度接种于三维的matrigel培养系统中，培养5-7天后，扁平的多角胆管上皮细胞形成胆管样结构组织（图3A），并表达CK7（图3B）。
肝内胆管由肝憩室头支发育而成，在人胚胎发育的第四周，肝憩室头支上皮细胞迅速增殖，形成肝细胞板，在胚胎发育的第二个月，肝细胞之间形成胆小管，内胚层上皮细胞相继形成肝内胆管上皮细胞。肝内胆管上皮细胞为典型的扁平立方上皮细胞形态，细胞直径为10-15μm，为分化成熟细胞，细胞标志物为GGT, CK7, CK18, CK19等，其中CK19是胆管上皮细胞特异性标志物之一。本研究分离培养的细胞具有胆管上皮细胞典型的细胞特征，表达胆管上皮细胞的特异蛋白，GGT, CK7, CK18, CK19等，在三维的matrigel分化体系中容易形成胆管样结构，这些生物学特性均符合了体内外肝内胆管上皮细胞的生物学特性，证实分离培养的细胞为胆管上皮细胞。
本发明分离纯化方法中首先采用红细胞裂解液裂解数量丛多的红细胞，然后用密度梯度离心法去除成熟肝细胞获得非实质性肝脏细胞，由于成熟肝细胞密度和体积均比较大，在50g/min, 离心1min情况下可以沉淀至离心管底部，而肝内其他细胞仍保留在上清液中。在培养的非实质性肝细胞中，本研究获得了胆管上皮细胞和其它类型的细胞，由于是克隆状密度生长，胆管上皮细胞得以生成大的细胞集落，在此基础上我们采用显微镜下用玻璃针剥离胆管上皮细胞集落，获得了高纯度的胆管上皮细胞；机械剥离刚开始需要一定操作技巧，但经2-3次练习后可熟练掌握。
matrigel 富含层粘链蛋白，胶原等细胞外基质，这一成分与胆管上皮细胞的体内微环境极为相似；Y-27632是Rho信号通路的抑制剂，最近几年的研究发现Y-27632可促进多种上皮型干细胞的增殖与存活，我们推测Y-27632同样对胆管上皮细胞的增殖具有积极的作用。本研究结果首次发现以二维的matrigel作为细胞外基质，在Y-27632存在的情况下可显著性地提高胆管上皮细胞的体外扩增效率（见结果2.2），这一研究结果提示Y-27632对上皮细胞的增殖作用可能具有普遍意义。此外本研究还发现血清的质量也影响胆管上皮细胞的扩增效率，在所有我们已检测的血清中，Hyclone公司某一特定批号的效果最好（结果未显示）。
综上所述，本技术方案通过多步分离方法获得纯度较高的胆管上皮细胞，并建立了胆管上皮细胞的长时间增殖培养体系，并首次发现Rho激酶抑制剂Y-27632可显著性地促进肝内胆管上皮细胞的增殖。这一培养体系操作较为简单，适合推广与应用，并可为研究胆道闭锁和原发性胆汁肝硬化等在内的多种疾病机理提供平台。
Claims (5)
1.胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）上皮细胞分离，纯化，培养；
（2）细胞生长线测定；
（3）鉴定。
2.根据权利要求1所述的胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）上皮细胞分离，纯化，培养：取5－20克的肝脏组织，剪成面积为1mm3的组织块，在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)中浸泡洗涤3次后，在37℃温度下，用含5mg/ml IV型胶原酶的DMEM高糖培养基消化组织块30-60分钟，收集细胞并于1200r/min下离心5min，重复3遍后，去除胶原酶，得分离的肝胆管上皮细胞，并进行纯化；将纯化后的肝胆管上皮细胞分别以50个细胞/cm2接种于事先配置好的培养基中，于37℃、5%的CO2中培养6-10天后，无菌条件下将胆管上皮细胞集落切割，每20 -50个细胞团块作为一个，并转移至新的培养皿或者培养板中进一步传代培养；
（2）细胞生长线测定：将细胞以每孔5×103个细胞接种于有matrigel包被的4孔板中，置于37℃ 、5%的CO2培养，分别于培养的第5-7天测定细胞浓度，其中，四孔板每孔加入培养液的体积500μl；
（3）培养细胞的鉴定包括免疫细胞化学染色和胆管样结构形成，
a．免疫细胞化学染色：用4%多聚甲醛在室温下固定培养的胆管上皮细胞，20 min 分钟后，吸掉4%多聚甲醛，加入0.4%Triton X-100透膜15 min，用PBS冲洗3遍后；加入5%的羊血清，室温下封闭0.5 h；加入一抗，37℃孵育40 min或4℃过夜，去掉一抗，PBS冲洗3次后，进行显色并检测，其中，每次检测的细胞数为1 000个；
b. 胆管样结构形成：将Matrigle 用DMEM以1:1稀释, 包被在培养皿/培养板上形成5mm厚的三维Matrigle培养体系，1h后将5代内的胆管上皮细胞以1×105/cm2细胞密度接种在三维Matrigel培养体系上培养5－7天，其中，培养液为：DMED/F12 中加入10%FBS, 20ng/ml HGF, 1×ITS和2mM 谷氨酸。
3.根据权利要求2所述的胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于，所述的纯化方式为：按细胞裂解液：细胞体积比为5:1，向分离的肝胆管上皮细胞中加入红细胞裂解液，充分混匀，红细胞充分裂解后，配平，以1200r/min的速度离心5分钟重复三遍，裂解红细胞；收集细胞，将细胞悬浮于DMEM溶液中，50g/min离心1min，重复三遍，收集上清液中的非实质性肝细胞。
4.根据权利要求2所述的胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于：步骤（1）中，培养所用的培养皿或培养板均预先用250 μg/ml matrigel于37℃包被1h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于，所述的胆管上皮细胞培养基成分为：α-MEM/DMEM+ FBS + ITS + 10nmol/L Y-27632 + 100μg/ml 青链霉素，其中，α-MEM与DMEM的质量比为1:1。
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