CN115960757B

CN115960757B - 一株可以耐受低pH生产L-乳酸的乳酸菌及其应用

Info

Publication number: CN115960757B
Application number: CN202211239580.0A
Authority: CN
Inventors: 虞龙; 秦倩
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2022-10-11
Filing date: 2022-10-11
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2042-10-11
Also published as: CN115960757A

Abstract

本发明公开了一株可以耐受低pH生产L‑乳酸的乳酸菌及其应用，所述耐低pH乳酸菌株的分类命名为保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)QSE‑1993，已于2019年2月18日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO:M 2019095。在正常培养条件下酸性培养条件下，不需要再加入氧化钙进行中和，在pH低至2‑3的条件下也能够正常生长，降低成本，减少废弃物硫酸钙对环境的污染，能够投入大批量工业化生产。

Description

一株可以耐受低pH生产L-乳酸的乳酸菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株能够耐受低pH生产L-乳酸的乳酸菌，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸而不能分解蛋白质的细菌的统称，通常是不运动、不产芽孢的革兰氏阳性菌，可在厌氧、兼性厌氧条件下生长。乳酸菌在自然界的分布广泛，不仅存在于人和动物的消化道内，在工业、农业等领域也有很高的应用价值。在多数为同型乳酸发酵类型的乳酸菌细胞内，乳酸是糖酵解途径的最终产物，乳酸菌能够利用这一代谢途径获得需要的能量。

聚乳酸（polylactic acid，PLA）是一种由乳酸单体缩聚而成的可生物降解的高分子聚合物，主要是以微生物的发酵产物乳酸作为单体通过聚合反应而获得。作为聚乳酸，主要包括聚L-乳酸（PLLA）、聚D-乳酸（PDLA）和聚DL-乳酸（PDLLA）三种，其中使用规模最广泛的是PLLA。更具体来说，以光学纯度大于98%的L-乳酸为原料聚合而成的聚乳酸材料在食品、医药、农药、化工等方面都有广泛应用。

目前，L-乳酸可以通过化学合成法和微生物发酵方法获得。化学合成法具有污染坏境、成本昂贵、技术复杂、光学纯度较低等棘手问题，不能满足实际应用需要。相比之下，微生物发酵法的生产成本低，条件温和和产物光学纯度高等优点，因此绝大部分都是通过微生物发酵法进行L-乳酸的工业生产的。目前L-乳酸发酵菌不能耐受低pH，对培养环境胁迫的抵抗能力低，发酵生产过程需要加入氧化钙中和至pH6.0才能让发酵顺利进行，但随后会产生大量的硫酸钙废弃物，给环境带来了巨大的污染。

就此而言，在乳酸发酵工业中，显著提高菌株耐低pH的能力，生产并积累更多的L-乳酸，使其更适合应用于工业生产，具有积极的研究意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株能够耐低pH生产L-乳酸的乳酸菌菌株，该菌株能够显著提高原有菌株对于低pH坏境的耐性，生产的L-乳酸光学纯度大，且生产过程对环境污染小。

一株耐低pH乳酸菌株，其分类命名为保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus) QSE-1993，已于2019年2月18日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号： CCTCC NO:M 2019095。

本发明所述菌株保加利亚乳酸杆菌QSE-1993是将从四川采集到的原始菌株QSE-1经过诱变得到，将菌株QSE-1使用平板划线的方式接入MRS培养基中活化二代，37℃条件下培养至OD=1，使用无菌水稀释到OD=0.6后，涂布于菌后的平板上，在无菌条件下吹干显微观察无细胞重叠后进行离子束注入，选择氮离子束，注入条件为10-30KeV，注入剂量为15x10¹³～35x10¹³ ions/cm³，处理时间为120s。注入结束后，取出平板使用无菌水洗脱。涂布于MRS平板，在厌氧环境内培养活化。培养一段时间后，将菌种接入调节过pH的MRS固体培养基中培养72h，多次重复这一过程，观察并筛选出生长状况良好的菌株。将上一步筛选得到的菌株制成细胞悬液，将浓度调整为10^-6/ml。取0.1ml细胞悬液涂布于灭菌后的平板上，吹干后进行氮离子束注入，条件为20～30KeV，注入剂量为15x10¹⁴～35x10¹⁴ions/cm³，注入时间120s。注入完毕后，用无菌水洗脱平皿，洗脱后的菌液涂布到固体MRS培养基上，37℃ 条件下倒置培养24h。

将诱变得到的菌种接种至种子培养基中，37 ℃培养10～16h，摇瓶装液量为10%～30%（v/v）。将种子培养基中的菌液接种至MRS液体培养基，与厌氧袋一起装入厌氧罐内培养48h。将菌种接种至调节过pH的固体培养基中，挑选生长情况良好的菌株。重复复筛步骤，直到筛选出目标菌株。

筛选得到的具有耐低pH能力的乳酸菌命名为保加利亚乳酸杆菌QSE-1993，在MRS琼脂培养基中生长良好，观察到的菌株形态为圆形或稍不规则形状，菌落形态为灰白色、不透明，表面光滑，稍微隆起，边缘粗糙明显；为革兰氏阳性杆菌，无孢子生成。

本发明中能够耐低pH的乳酸菌为兼性厌氧菌，适宜生长温度为35-45℃，更适宜的生长温度范围为30-37℃。能够在低pH条件下正常生长，可耐pH值最低可以达到2-3，有效提升乳酸菌抵抗外界不良环境的能力。

所述保加利亚乳酸杆菌QSE-1993的培养方法为：

1）平板培养：将保加利亚乳酸杆菌QSE-1993接种至平板培养基上培养，培养温度为35~45℃，培养时间为36~48h；

2）斜面培养：将步骤1）平板培养基培养的乳酸菌接种至斜面培养基培养，培养温度为35~45℃，培养时间为36~48h；

3）种子培养：将步骤2）中乳酸菌的斜面培养物接种至种子培养基培养，培养温度为35~45℃，培养时间10~20h；

4）发酵培养：将步骤3)中种子培养的乳酸菌接种至发酵培养基培养，接种量5%~15%（V/V)，发酵温度35~37℃，发酵时间24-120h。

所述平板培养基包含如下质量的组分：蛋白胨 10g/L、酵母提取物 10g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾 2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、柠檬酸二铵 2 g/L、玉米浆 20 g/L、硫酸铵 5g/L、硫酸锰 0.25 g/L、吐温80 1mL/L。

所述发酵温度为35-37 ℃，发酵时间为36-70小时。

所述斜面培养基: 琼脂2%、蛋白胨 10g/L、酵母提取物 10g/L、乙酸钠 5g/L、磷酸氢二钾 2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、柠檬酸二铵 2 g/L、玉米浆 20 g/L、硫酸铵 5 g/L、硫酸锰 0.25 g/L、吐温80 1mL/L。

所述发酵温度为35-37 ℃，发酵时间为36-48小时。

所述种子培养基: 蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠0.5g/L、柠檬酸二铵0.2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、玉米浆50g/L。

所述发酵温度为35-45℃，发酵时间10-20h。

所述发酵培养基: 蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠0.5g/L、柠檬酸二铵0.2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、玉米浆120g/L。

所述发酵温度为35-37℃，发酵时间24-36h。

所述耐低pH乳酸菌株在发酵生产L-乳酸中的应用。

在营养培养基中培养保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus) QSE-1993，发酵生产L-乳酸。

所述营养培养基为MRS液体培养基，包括如下组分：蛋白胨 10g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠 5g/L、磷酸氢二钾 2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、柠檬酸二铵 2 g/L、玉米浆 20g/L、硫酸铵 5 g/L、硫酸锰 0.25 g/L、吐温80 1mL/L。

所述发酵温度为30-37 ℃，发酵时间为24-36小时。

所述保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus) QSE-1993以5-20%v/v的比例接种到营养培养基中, 发酵过程中，不需要再加入氧化钙进行中和。

本发明菌株具有耐低pH环境的能力，遗传稳定性好且产L-乳酸能力也有所提升，且产物的光学纯度也得到了显著提高，生产周期24-36小时，产量180-200g/L，光学纯度达到99.8%。诱变后的乳酸菌，在酸性培养条件下，不需要再加入氧化钙进行中和，在pH低至2-3的条件下也能够正常生长。

有益效果：相比于野生菌株，本发明通过离子束工程技术筛选得到的乳酸菌QSE-1993，有效提升了菌株耐低pH环境的能力，遗传稳定性好且产L-乳酸能力也有所提升，且产物的光学纯度也得到了显著提高，生产周期24-36小时，产量180-200g/L，光学纯度达到99.8%。乳酸菌诱变后，在正常培养条件下酸性培养条件下，不需要再加入氧化钙进行中和，在pH低至2-3的条件下也能够正常生长，降低成本，减少废弃物硫酸钙对环境的污染，能够投入大批量工业化生产，具有重大的研究意义和经济价值。

具体实施方式

实施例1 菌株的诱变和低pH筛选

出发菌株筛选：

将菌株QSE-1使用平板划线的方式接入MRS培养基中活化二代，37℃条件下培养至OD=1，使用无菌水稀释到OD=0.6后，涂布于菌后的平板上，在无菌条件下吹干显微观察无细胞重叠后进行离子束注入，选择氮离子束，注入条件为10-30KeV，注入剂量为15x10¹³～35x10¹³ ions/cm³，处理时间为120s。注入结束后，取出平板使用无菌水洗脱。涂布于MRS平板，在厌氧环境内培养活化。培养一段时间后，将菌种接入调节过的PH=3.2的MRS固体培养基中培养72h，多次重复这一过程，观察并筛选出生长状况良好的菌株。

复筛：

将上一步筛选得到的菌株制成细胞悬液，将浓度调整为10^-6/ml。取0.1ml细胞悬液涂布于灭菌后的平板上，吹干后进行氮离子束注入，条件为20～30KeV，注入剂量为15x10¹⁴～35x10¹⁴ions/cm³，注入时间120s。注入完毕后，用无菌水洗脱平皿，洗脱后的菌液涂布到固体MRS培养基上，37℃ 条件下倒置培养24h。

将诱变得到的菌种接种至种子培养基中，37 ℃培养10～16h，摇瓶装液量为10%～30%（v/v）。将种子培养基中的菌液接种至MRS液体培养基，与厌氧袋一起装入厌氧罐内培养48h。将菌种接种至调节过pH的固体培养基中，挑选生长情况良好的菌株。重复复筛步骤，直到筛选出目标菌株QSE-1993。

MRS培养基的配方为（1000ml中各组分及含量）：蛋白胨 10g、酵母提取物 4 g、乙酸钠 5g、磷酸氢二钾 2 g、硫酸镁0.58 g、柠檬酸二铵 2 g、玉米浆 20 g、硫酸铵 5 g、硫酸锰 0.25 g、吐温80 1mL；琼脂（若为液体培养基则不加）18g。

种子培养基的配方（1000ml中各组分及含量）：磷酸氢二钾 2 g、柠檬酸三铵2 g、无水乙酸钠 5 g、七水硫酸锰 0.25 g、七水硫酸镁 0.58 g、蛋白胨 10 g、酵母提取物 5g、玉米浆20 g、硫酸铵5 g、吐温801ml、琼脂20g。

筛选获得的菌株，革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶试验为阴性，菌落形态为白色，表面光滑，稍微隆起，边缘粗糙明显，菌株形态多为圆形，少数呈现不规则形态。

筛选菌株耐低pH能力的测定：

在30℃ 环境下，筛选的突变菌株QSE-1993与原始菌株QSE-1都分别放在pH2、3、4的MRS培养基中进行培养，36h 后观察生长状况，发现在每一组pH条件下，筛选菌株的存活率均高于原始菌株，达到90%以上，且存活菌株的生长状态好于原始菌株。

实施例2

本实施例说明菌株的鉴定以及遗传稳定性

菌株的鉴定：MRS固体培养基上，菌落为灰白色，圆形或稍不规则形状，表面隆起，中间光滑，边缘有明显粗糙，菌体的适宜生长温度范围为30-37 ℃。

传代培养实验：将筛选得到的乳酸菌，接种于MRS固体培养基中，在37℃，厌氧条件下培养36h，将其接种至pH调节至2、3、4的固体培养基中培养36h，记录不同代的菌株存活率。

不同代菌株存活率如表所示：

代数	存活率
		1	97.56%
2	96.87%
		3	97.12%
4	98.25%
		5	96.95%
6	97.26%
		7	97.42%

由实验结果可知，经过连续五次传代，突变株QSE-1993有较好的传代稳定性，能够作为进一步研究和开发的菌株。

实施例3：保加利亚乳酸杆菌QSE-1993的培养方法

本实施例说明保加利亚乳酸杆菌QSE-1993的培养方法，包括如下步骤：

1）平板培养：将保加利亚乳酸杆菌QSE-1993接种至平板培养基上培养，培养温度为37℃，培养时间为36h；

2）斜面培养：将步骤1）平板培养基培养的乳酸菌接种至斜面培养基培养，培养温度为37℃，培养时间为36h；

3）种子培养：将步骤2）中乳酸菌的斜面培养物接种至种子培养基培养，培养温度为37℃，培养时间10h；

4）发酵培养：将步骤3)中种子培养的乳酸菌接种至发酵培养基培养，接种量10%（V/V)，发酵温度37℃，发酵时间24-120h。

所述斜面培养基: 琼脂2%、蛋白胨 10g/L、酵母提取物 410g/L、乙酸钠 5g/L、磷酸氢二钾 2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、柠檬酸二铵 2 g/L、玉米浆 20 g/L、硫酸铵 5 g/L、硫酸锰 0.25 g/L、吐温80 1mL/L。

实施例4：菌株发酵生产L-乳酸

将L-乳酸生产菌株QSE-1993接种至MRS液体培养基中，37℃，150rpm过夜培养获得种子液。在200mL产酸发酵培养基中按照10%(v/v)的比例接种种子液，在150rpm条件下摇床发酵菌株36h，发酵结束后通过高效液相色谱测定乳酸含量和光学纯度。

产酸发酵培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠0.5g/L、柠檬酸二铵0.2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、玉米浆120g/L。

所述发酵温度为35℃。

测定的结果是，在放大培养规模的情况下，原始菌株70h可发酵生产乳酸121.5g/L，糖酸转化率在95%以上，所得产物L-乳酸光学纯度为97.2%，诱变后的菌株 70h发酵生产的乳酸为203.2g/L(增长67%)，糖酸转化率95%以上，所得产物L-乳酸光学纯度99.8%以上。

实施例4：低pH条件下发酵生产乳酸

将L-乳酸生产菌株QSE-1993和原始菌株QSE-1分别于未用碳酸钙中和条件下，pH为3.8的摇瓶发酵培养基（YE培养基）中培养48小时，比较其乳酸产量。

YE培养基配方为：酵母粉15g/L、葡萄糖100g/L、蒸馏水1L。

结果表明，突变菌株在pH 3.8 条件下发酵培养48h，其菌体生长与乳酸产量比原始菌株明显提高，原始菌株菌体密度为1.69，乳酸产量仅为1.59g/L,而突变菌株产酸量达到了4.995g/L,是原始菌株的3.14倍。

高效液相色谱法检测发酵液中的乳酸：

色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity II；

检出器：RID；

分离柱：Aminex HPX-87H Column 300×7 .8mm；

流动相：0.005M硫酸；

流量：0.5mL/min；

进样量：20μL。乳酸保留时间为14min左右。

高效液相色谱检测乳酸的光学纯度

色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity；

检出器：波长254nm，灵敏度0.32AUFS；

分离柱：MCI GEL-CRS10 W(3u)4.6ID×50nm；

流动相：0.002M硫酸铜

流量：0.5mL/min；

进样量：20μL。

将样品稀释至总乳酸浓度为0.5-1g/L再进行检测。D-乳酸保留时间为11min左右，L-乳酸保留时间为13min左右，根据其峰面积计算L-乳酸的光学纯度。

以上研究表明，本发明的菌株在L-乳酸生产速度和产物光学纯度方面都显著优于未经诱变的原始菌株(生产速度提高了67%，光学纯度提高到99%)。本发明提供了一种发酵成本低，L-乳酸生产速度快且产物光学纯度高的新型菌株，此菌株能够有效耐受低pH环境，减少生产发酵过程中使用氧化钙中和的步骤，从而减少产生的硫酸钙废弃物，达到减少环境污染的目的，为L-乳酸的工业化微生物发酵生产提供了更优的潜在选择。

Claims

1. 一株耐低pH乳酸菌株，其分类命名为保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus) QSE-1993，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号： CCTCC NO:M2019095。

2. 根据权利要求1所述的耐低pH乳酸菌株，其特征在于，所述菌株能够在低pH条件下正常生长，其中低pH条件为pH 2-3。

3.权利要求1所述耐低pH乳酸菌株在发酵生产L-乳酸中的应用。

4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在营养培养基中培养保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus) QSE-1993，发酵生产L-乳酸。

5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述营养培养基为MRS液体培养基，包括如下组分：蛋白胨 10g/L、酵母提取物 410g/L、乙酸钠 5g/L、磷酸氢二钾 2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、柠檬酸二铵 2 g/L、玉米浆 20 g/L、硫酸铵 5 g/L、硫酸锰 0.25 g/L、吐温801mL/L。

6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵温度为30-37 ℃，发酵时间为24-36小时。

7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus) QSE-1993以5-20%v/v的比例接种到营养培养基中。