CN103215199A - 一株具有延缓后酸化作用保加利亚乳杆菌菌株及其应用 - Google Patents
一株具有延缓后酸化作用保加利亚乳杆菌菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌及其筛选方法和应用，所述的保加利亚乳杆菌分类命名为Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2，保藏登记号为CGMCC No.7134，可以作为弱后酸化发酵剂使用。本发明利用含有硫酸新霉的MRS平板筛选，得到一株具有弱H+-ATPase活性的菌株，该菌株在脱脂乳中乳酸、乳糖和半乳糖的代谢能力明显低于出发菌株，可以作为弱后酸化的酸奶发酵剂在工业生产中使用。
Description
【技术领域】
本发明涉及一株利用硫酸新霉素诱变、筛选得到的具有延缓后酸化作用的保加利亚乳杆菌菌株，以及该菌株的筛选方法及其在发酵工业中的应用，属于生物发酵技术领域。
【背景技术】
乳酸菌在发酵乳糖过程中能产生多种代谢产物，这些乳酸菌及其生产的代谢产物不仅具有平衡肠道菌群、降低胆固醇、抗肿瘤、免疫以及延缓衰老等生理功能，还赋予产品良好的口感和风味。我国使用的酸奶发酵剂主要有嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。一般认为，保加利亚乳杆菌在低pH环境下能继续发酵乳糖，是引起酸奶后酸化现象的主要菌株。目前，控制酸奶后酸化的方法主要有：调整酸奶发酵剂保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例；在发酵乳中添加nisin等细菌素控制保加利亚乳杆菌的生长和代谢能力；改变细胞膜的通透性，抑制保加利亚乳杆菌的代谢等。其中，降低保加利亚乳杆菌的生长和能量代谢是控制后酸化现象的有效方法。
H+-ATPase酶是控制乳酸菌能量代谢的一个关键酶。H+-ATPase位于乳酸菌细胞膜上，既能催化ATP的合成与水解也能调节跨膜的质子梯度，其活性随pH的降低而增强，其数量也随着pH值的下降而增多。当外界环境中pH降低时，H+-ATPase能通过水解ATP释放出自由能，推动细胞内的质子泵出胞外，形成膜pH梯度差，从而使细胞内pH维持在中性附近，使细胞内酶的活力不受影响。很多乳酸菌含有H+-ATPase，如短乳杆菌、乳酸乳球菌、乳酸链球菌和嗜热链球菌等。
硫酸新霉素（neomycin）是一种能抑制细菌生长的抗生素，利用硫酸新霉素能筛选出具有低H+-ATPase活力的菌株。其原理在于硫酸新霉素进入细胞是一个耗能的过程，需要H+-ATPase的协助，因此只有低H+-ATPase活力的菌株才能在含有硫酸新霉素的筛选培养基上生长。目前，已有一些关于利用硫酸新霉素筛选具有低H+-ATPase活力菌株的报道，包括乳酸乳球菌、瑞士乳杆菌、酒类酒球菌等，这些诱变菌株对低pH环境敏感，具有改变的细胞膜通透性以及降低生长和能量代谢能力。
本发明针对“酸奶后酸化”这一乳品加工业的关键技术问题，以从我国青海的传统发酵乳制品中分离筛选出来的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06为出发菌株，利用硫酸新霉 素诱变、筛选出一株具有弱H+-ATPase活性的菌株，并进一步研究了其在脱脂乳培养基中的产酸能力，可从根本上解决产品后酸化问题。
【发明内容】
为了解决保加利亚乳杆菌在酸奶储存期间引起的后酸化现象，本发明使用硫酸新霉素诱变、筛选出一株H+-ATPase缺陷型保加利亚乳杆菌，该菌株在脱脂乳培养基中具有弱的产酸能力，作为弱后酸化酸奶发酵剂使用。
本发明所述的具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌菌株是利用硫酸新霉素诱变德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06（L.delbrueckii subsp.bulgaricus ND06）后筛选获得的，其中原始的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06）该菌株已于2013年1月15日保存在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心,保藏号为CGMCCNo.7133，筛选获得的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种的分类命名为Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2，德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2)已于2013年1月15日保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNo.7134。
本发明还涉及所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用，所述菌株在42℃培养72h后，发酵乳pH值从6.44降至4，发酵乳pH值的下降幅度明显低于出发菌株pH值的下降幅度，具有弱后酸化作用。所述菌株在42℃发酵后，在室温25℃储藏21d期间，pH值的变化范围在4.57～4.07的范围内。所述菌株在42℃发酵后，在室温储藏21d期间，pH值下降了0.5pH单位。
本发明还涉及所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株菌作为酸奶发酵剂的用途。
另一方面，本发明还涉及包含权利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株菌的发酵乳、发酵食品，所述发酵食品可以是酸奶。
本发明提供了一种控制酸奶后酸化的方法，该方法是利用硫酸新霉素诱变出具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种。本发明通过改变野生菌株的H+-ATPase活性来改变菌种生理特性，降低菌株的生长、代谢和产酸能力，同时避免了基因工程改良菌种带来的外缘DNA问题，具有一定的安全性，能缓解酸奶的后酸化现象，提高产品的稳定性。
根据本发明的实施方案，利用硫酸新霉素诱变具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌的方法是向MRS培养基中添加硫酸新霉素，硫酸新霉素在MRS培养基中的添加浓度为50-500μg/mL。硫酸新霉素的浓度对于控制酸奶后酸化起着非常重要作用，当MRS 培养基中硫酸新霉素的浓度过低时，对控制平板上的耐硫酸新霉素菌落的数量不明显，当硫酸新霉素浓度过高时，会抑制耐硫酸新霉素菌落的生长。
利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2，其在MRS培养基中培养18h后，H+-ATPase活性为0.44μmol/mg·min，和出发菌株相比H+-ATPase活力降低了44%，具有弱的H+-ATPase活性。
利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2作为发酵剂使用时，42℃培养0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后，发酵乳的pH值高于出发菌株ND06发酵乳的pH值。
利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2作为发酵剂使用时，42℃培养0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后，发酵乳的乳酸、乳糖和和半乳糖的代谢能力均低于出发菌株ND06。
利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌作为发酵剂使用时，42℃发酵后，在室温（25℃）储藏期间，发酵乳的pH值高于出发菌株ND06发酵乳的pH值。
利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌作为发酵剂使用时，42℃发酵后，在室温（25℃）储藏期间，发酵乳的乳酸含量明显低于出发菌株发酵乳的乳酸含量。
一种具有弱H+-ATPase活力的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2的制备方法：
①菌种活化
将-70℃保存的ND06菌株接种于脱脂乳培养基中，37℃培养24h后，在MRS培养基中传代2～3次。
②硫酸新霉素溶液的配制
硫酸新霉素溶液配制浓度为0.1g/mL，经0.22μm膜过滤灭菌后，-20℃储存。
③硫酸新霉素诱变
将活化后的ND06菌株接种于MRS培养基中，37℃培养8h，使用PBS缓冲液（pH7.2）稀释后，取100μL涂布于含有硫酸新霉素的MRS平板上，其中，硫酸新霉素的浓度为50、100、150、200、250、300、350、400、450和500μg/mL。37℃培养72h后，选取菌落数在30～300之间的平板，挑选单个菌落接种于MRS液体培养基，继续培养24h，检测OD660和pH值，挑选OD660<1和pH＞4.8的菌株。
④硫酸新霉素诱变菌株的纯化
将挑选出的诱变菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，适当稀释后，涂布于MRS平板上，继续培养48h，挑选单个菌落，-80℃保存。
⑤ND06-2菌株的低温冷冻真空保存
将步骤④筛选出的具有弱H+-ATPase活性的ND06-2菌株接种到MRS培养基中培养18h后，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗2遍后，加入冻干保护剂低温冻干保存。
另一方面，本发明提供了一种酸奶的制备方法，该方法的具体操作步骤如下：
①均质：以牛奶为主要原料，将牛奶升温至60℃，20MPa条件下均质;
②杀菌：95℃条件下灭菌10min;
③接种，发酵：杀菌后的原料降温至42℃，发酵剂的接种量为1.0×107cfu/mL，发酵时间为4～5h，待发酵乳的pH值降至4.5时，终止发酵，将发酵乳降温灌装，然后在常温储藏。
综上所述，本发明利用含有硫酸新霉素的MRS培养基筛选得到的可以作为弱后酸化发酵剂使用的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2，分类命名为Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricusND06-2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏登记号为CGMCCNo.7134。该菌株的H+-ATPase活力只有出发菌株的44%，在脱脂乳培养基中乳酸、乳糖和半乳糖的代谢能力明显低于出发菌株，可以作为弱后酸化的酸奶发酵剂使用。在我国的许多地区，酸奶在运输、存储和销售过程中的冷链系统并不完备，因此在市场终端常出现后酸化等质量问题。使用具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌作为酸奶发酵剂，可以使酸奶的后酸化程度弱化，延长产品的货架期。
附图说明
图1磷标准曲线。参考实施例2
图2蛋白标准曲线。参考实施例2
图3ND06及其诱变菌株ND06-2的H+-ATPase活性。参考实施例2
图4ND06及其诱变菌株ND06-2在42℃条件下发酵乳中半乳糖含量的变化。参考实施例5
图5ND06及其诱变菌株ND06-2在42℃条件下发酵乳中乳酸含量变化。参考实施例5
图6ND06及其诱变菌株ND06-2在42℃条件下发酵乳中乳糖含量变化。参考实施例5
图7ND06及其诱变菌株ND06-2在室温（25℃）储藏期间乳酸含量的变化。参考 实施例6
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：一种具有弱H+-ATPase活力的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2的筛选方法
所述具有弱H+-ATPase活力的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2菌株是利用硫酸新霉素诱变保加利亚乳杆菌ND06（L.delbrueckiisubsp.bulgaricusND06）后筛选获得的，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7134，筛选获得该菌株的方法如下：
1.菌种活化
将-70℃保存的保加利亚ND06菌株接种于脱脂乳培养基中，37℃培养24h后，在MRS培养基中传代2～3次。
2.硫酸新霉素溶液的配制
硫酸新霉素溶液配制浓度为0.1g/mL，经0.22μm膜过滤灭菌后，-20℃储存。
3.硫酸新霉素诱变
将活化后的ND06菌株接种于MRS培养基中，37℃培养8h，使用PBS缓冲液（pH7.2）稀释后，取100μL涂布于含有硫酸新霉素的MRS平板上，其中，硫酸新霉素的浓度为50、100、150、200、250、300、350、400、450和500μg/mL。37℃培养72h后，选取菌落数在30～300之间的平板，挑选单个菌落接种于MRS液体培养基，继续培养24h，检测OD660和pH值，挑选OD660<1和pH＞4.8的菌株。
4.硫酸新霉素诱变菌株的纯化
将挑选出的诱变菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，适当稀释后，涂布于MRS平板上，继续培养48h，挑选单个菌落，-80℃保存。
5.ND06-2菌株的低温冷冻真空保存
将步骤4筛选出的具有弱H+-ATPase活性的ND06-2菌株接种到MRS培养基中培养18h后，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗2遍后，加入冻干保护剂在低温冻干保存，所述的冻干保护剂的配方为：脱脂乳10%，谷氨酸钠0.1%，无菌水90%。
实施例2：具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2的H+-ATPase活性检测
测定本申请说明书实施例1所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2的H+-ATPase活性，具体检测方法及检测结果如下：
1.建立磷含量标准曲线
参考Ongol等报道的方法建立了磷含量标准曲线。使用KH2PO4分别配制成PO4 3-浓度为0mol/mL、0.2mol/mL、0.4mol/mL、0.6mol/mL、0.8mol/mL、1.0mol/mL、1.2μmol/mL的标准溶液系列。从上述标准溶液中分别量取350μL溶液，加入815μL染料，混合后在18℃培养15min，测定OD660值，建立磷含量标准曲线（图1）。其中，染料由5N硫酸、25g/L钼酸铵、10g/L甲氨基苯酚硫酸盐、30g/L亚硫酸钠以及蒸馏水（1：1：1：1：4）混合而成。
2.H+-ATPase酶粗提
将出发菌株ND06及其诱变菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h，离心收集菌体（3500×g，10min，4℃），加入250μL浓度为75mMTris-HCl缓冲液（10mMMgSO4，pH7.0），混匀后加入25μL甲苯，37℃水浴5min。细胞的冻融是在-80℃的乙醇和37℃水浴锅中进行的，冻融循环反复进行2次后，12,000×g离心10min，弃去上清液，加入上述含有MgSO4的Tris-HCl缓冲液200μL后，震荡混匀，用液氮迅速冻结，-80℃保存。
3.H+-ATPase活性测定
从上述细胞粗提取物中取出25μL，添加到1mL浓度为50mMTris-maleate缓冲液（10mMMgSO4，pH6.0）中。该混合液在37℃水浴锅中水浴5min后，添加50μLATP（TaKaRa，0.1M），在水浴锅中继续反应15min，然后加入600μL的0.1NHCl终止反应，反应物置冰上迅速冷却后，离心（5000×g，10min，4℃），收集上清液。吸取350μL上清液中加入815μL染料中，18℃反应15min后，测定反应物的OD660值，根据磷含量标准曲线计算反应物中无机磷酸盐的含量。
采用Bradford方法测定蛋白质的含量。吸取270μLTris-maleate缓冲液与酶粗提物的混合液，加入15μL10%SDS和15μL10NNaOH，煮沸10min，在冰上迅速冷却后，测定反应溶液中蛋白质的含量。H+-ATPase的活性用μmol/mg·min来表示，其中每个活力单位定义为1mgH+-ATPase的粗提取物在1min内分解ATP形成1μmol的无机磷酸盐。
4.H+-ATPase活性的测定结果
在pH6的条件下测定的ND06及其诱变菌株ND06-2的H+-ATPase酶活，结果如图3 （p<0.05）所示。ND06及其诱变菌株ND06-2的H+-ATPase活力分别为0.99和0.44μmol/mg·min，诱变菌株ND06-2的H+-ATPase活力和出发菌株相比降低了44%，和出发菌株相比，诱变菌株ND06-2具有明显较弱的H+-ATPase活性。
实施例3-6说明实施例1所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2菌株在乳品加工业中的应用，尤其是其在脱脂乳培养基中的弱后酸化作用。
实施例3：ND06及其诱变菌株ND06-2在42℃培养时发酵乳pH值的变化
将ND06及其诱变菌株ND06-2在42℃培养0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后，对比发酵乳pH值的变化。具体步骤如下：
1.主要操作步骤：
将ND06和诱变菌株ND06-2以1.0×107cfu/mL分别接种于12%的脱脂乳培养基中，42℃培养0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后发酵后，检测发酵乳pH值的变化。
2.发酵乳pH值的测定
ND06及其诱变菌株ND06-2在42℃培养0-72h时发酵乳pH值的变化如表1所示。ND06-2及其出发菌株ND06在42℃发酵16h时，pH值均降到4.5左右，在发酵20、24、36、48和72h时，ND06-2发酵乳的pH值分别为4.4、4.13、4.1、4.08和4，和出发菌株ND06发酵乳的pH值相比，分别高出0.1、0.12、0.3、0.43和0.49，诱变菌株发酵乳pH值的下降幅度明显低于出发菌株发酵乳pH值的下降幅度，可见诱变菌株ND06-2在发酵乳中的产酸能力要低于出发菌株。
表1ND06及其诱变菌株ND06-2在42℃培养0-72h时发酵乳的pH值
实施例4：ND06及其诱变菌株ND06-2在室温（25℃）储藏期间发酵乳pH值的变化
ND06及其诱变菌株ND06-2在脱脂乳中发酵后，在室温（25℃）储藏期间发酵乳pH值的变化。
1.主要操作步骤：
将ND06和诱变菌株ND06-2以1.0×107cfu/mL分别接种于12%的脱脂乳培养基中，42℃发酵后，在室温储藏21d，检测发酵乳pH值的变化。
2.发酵乳pH值的测定
ND06及其诱变菌株ND06-2在42℃发酵后，在室温储藏期间发酵乳pH值的变化如表2所示。ND06-2及其出发菌株ND06在42℃发酵16h时，pH值均降到4.5左右，随后在室温条件下储藏21d期间，发酵乳的pH值均呈下降趋势，在储藏开始时，ND06-2及其出发菌株ND06发酵乳的pH值分别为4.57和4.51，在储藏1、3、7、14和21d时，ND06-2发酵乳的pH值分别为4.4、4.13、4.1、4.08和4.07，和出发菌株ND06发酵乳的pH值相比，分别高出0.06、0.1、0.12、0.29、0.42和0.55，诱变菌株发酵乳pH值的下降幅度明显低于出发菌株发酵乳pH值的下降幅度，可见在室温储藏期间，诱变菌株ND06-2的产酸能力要低于出发菌株。
表2ND06及其诱变菌株ND06-2发酵后，在室温储藏期间发酵乳pH值的变化
实施例5：ND06及其诱变菌株ND06-2在42℃培养0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后，发酵乳的乳酸、乳糖、葡萄糖和半乳糖含量的变化
高效液相色谱法(highpressureliquidchromatography，HPLC)可快速、准确、可靠的测定样品中的糖类物质和有机酸。目前，已有很多关于利用高效液相色谱法检测发酵乳中的乳酸、乳糖和半乳糖的报道。Mulling等利用高效液相色谱法测定了干酪中乳糖含量；Laye等利用高效液相色谱法检测了发酵乳中乳糖的含量；Samona等利用高效液相色谱法对酸奶在储藏期间半乳糖的含量进行了检测。为检测ND06及其诱变菌株ND06-2发酵乳中乳酸、乳糖、葡萄糖和半乳糖含量的变化，本发明分别采用C18-Aq(4.6mm×150mm)和CHO-620CA色谱柱对处理后的样品进行分离，检测样品中乳酸、乳糖、葡萄糖和半乳糖的含量。
1.主要操作步骤：
将ND06和诱变菌株ND06-2以1.0×107cfu/mL接种于12%的脱脂乳培养基中，42℃培养0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后发酵后，检测发酵乳中乳酸、乳糖、葡萄糖和半乳糖的含量。
1.1乳酸含量测定
1.1.1样品处理
准确称取0.4g样品于50mL聚丙烯离心管中，加入1.2mL浓度为1mol/L的HCl，混匀后离心（2000×g，10min，4℃），取上清液经0.45μm膜过滤，待测。
1.1.2色谱条件
色谱分离柱：C18-Aq色谱柱(4.6mm×150mm)；流动相：甲醇/磷酸=3/97混合溶液；柱温：30℃；进样量：5μL；检测器：紫外检测器；检测波长：228nm；流速：0.5mL/min。
1.2乳糖、葡萄糖和半乳糖含量测定
1.2.1样品处理
称取0.4g样品于50mL聚丙烯离心管中，加入1.2mL三蒸水，超声波处理3min，105℃高压处理15min，待冷却后，离心（2000×g，10min，4℃），取上清液经0.45μm膜过滤，待测。
1.2.2色谱条件
色谱分离柱：CHO-620CAColumn色谱柱；流动相：三蒸水；柱温：90℃；进样量：0.3μL；检测器：示差检测器；流速：0.5mL/min。
2.测定样品中乳酸、乳糖、葡萄糖和半乳糖的含量
2.1半乳糖含量变化
应用高效液相色谱法分析ND06及其诱变菌株ND06-2在42℃条件下发酵乳中半乳糖含量的变化，结果如图4所示。发酵前20h时，ND06-2和ND06样品中半乳糖含量均为2.06g/L；发酵20h后，出发菌株ND06-2的半乳糖积累量明显低于ND06的半乳糖积累量，发酵24、36、48和72h时，ND06-2样品中半乳糖含量分别为2.1、2.28、2.44和2.7g/L，比ND06样品中半乳糖含量分别低0.36、0.6、0.89和1.77g/L；说明在发酵乳中ND06-2代谢乳糖生成半乳糖的能力要低于出发菌株ND06。
2.2乳酸和葡萄糖含量的变化
ND06及其诱变菌株ND06-2在发酵乳中乳酸含量的变化如图5所示。ND06-2和ND06样品中乳酸的发酵曲线和半乳糖的发酵曲线类似，呈上升趋势。发酵前20h时，ND06-2和ND06的乳酸含量基本一致，分别为2.14和2.17；发酵20h后，ND06-2的乳 酸积累量明显低于出发菌株ND06的乳酸积累量，发酵24、36、48和72h时，ND06-2样品中乳酸含量分别为2.29、2.49、2.63和2.67g/L，比ND06样品中乳酸含量分别低0.34、0.84、1.3和1.61g/L，说明在发酵乳中ND06-2菌株代谢葡萄糖生成乳酸的能力要低于出发菌株ND06。在这项实验中从ND06-2和ND06发酵乳样品中没有检测出葡萄糖的存在，这是因为在乳糖代谢过程中产生的葡萄糖迅速被EMP代谢途径转化为乳酸。类似的报道在其他研究中也有发现，Toba和Goodenough等利用气相色谱和纸层析法检测出发酵乳中葡萄糖的含量为痕量；Richmond等的研究表明发酵乳贮藏至50d时才检测出微量的葡萄糖。
2.3乳糖含量变化
ND06及其诱变菌株ND06-2在脱脂乳中乳糖含量的变化如图6所示。和半乳糖、乳酸发酵曲线的上升趋势不同，ND06-2和ND06样品乳糖的含量均呈下降的趋势。发酵24h时，样品中乳糖含量基本一致，分别为13.88和13.89g/L；发酵24h后，ND06-2样品的乳糖含量明显高于出发菌株ND06样品的乳糖含量，发酵36、48和72h时，ND06-2样品中乳糖含量分别为13.18、13.18、和13g/L，比ND06样品中乳糖含量分别高1.82、2.55和3.71g/L，说明和出发菌株ND06相比，诱变菌株ND06-2在发酵乳中乳糖代谢能力低于出发菌株ND06的乳糖代谢能力。
实施例6：ND06及其诱变菌株ND06-2在脱脂乳中发酵后，在室温（25℃）储藏期间乳酸含量的变化。
将ND06和诱变菌株ND06-2以1.0×107cfu/mL接种于12%的脱脂乳培养基中，42℃发酵后，利用高效液相色谱法测定发酵乳在室温（25℃）储藏期间发酵乳中乳酸含量的变化。
1.主要操作步骤：
1.1样品处理
准确称取0.4g样品于50mL聚丙烯离心管中，加入1.2mL浓度为1mol/L的HCl，混匀后离心（2000×g，10min，4℃），取上清液经0.45μm膜过滤，待测。
1.2色谱条件
色谱分离柱：C18-Aq色谱柱(4.6mm×150mm)；流动相：甲醇/磷酸=3/97混合溶液；柱温：30℃；进样量：5μL；检测器：紫外检测器；检测波长：228nm；流速：0.5mL/min。
2.测定样品中乳酸的含量
ND06及其诱变菌株ND06-2发酵乳在室温储藏期间发酵乳中乳酸含量的变化如图7所示。ND06-2和ND06样品中乳酸含量均呈上升趋势。在室温储藏3d时，样品中乳酸含量基本一致，分别为3.04和3.07g/L，随后ND06发酵乳的乳酸含量呈上升趋势，在室温储藏21d后，乳酸含量上升到5.36g/L，而ND06-2发酵乳的乳酸含量在储藏期间没有明显变化，在室温储藏21d后，发酵乳中乳酸含量为3.1g/L，说明ND06-2可作为弱后酸化酸奶发酵剂使用。
Claims (10)
1.一种具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种，其特征在于所述具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌菌株是利用硫酸新霉素诱变德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusND06）后筛选获得的，德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06，于2013年01月15日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7133。
2.一种具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，其特征在于所述具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的分类命名为(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusND06-2)，该菌株已于2013年01月15日保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7134。
3.权利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用。
4.权利要求3所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用，其特征在于：所述菌株在42℃培养72h后，发酵乳pH值从6.44降至4，发酵乳pH值的下降幅度明显低于出发菌株pH值的下降幅度，具有弱后酸化作用。
5.权利要求3所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用，其特征在于：所述菌株在42℃发酵后，在室温25℃储藏21d期间，pH值的变化范围在4.57～4.07的范围内。
6.权利要求3所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用，其特征在于：所述菌株在42℃发酵后，在室温储藏21d期间，pH值下降了0.5pH单位。
7.权利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株菌作为酸奶发酵剂的用途。
8.包含权利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株菌的发酵乳、发酵食品。
9.权利要求6所述的包含权利要求1所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株菌的发酵乳、发酵食品，其特征在于所述发酵食品是酸奶。
10.利用权利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株ND006-2制备酸奶的方法，该方法的具体操作步骤如下：
①均质：以牛奶为主要原料，将牛奶升温至60℃，20MPa条件下均质;
②杀菌：95℃条件下灭菌10min;
③接种，发酵：杀菌后的原料降温至42℃，发酵剂的接种量为1.0×107cfu/mL，发酵时间为4～5h，待发酵乳的pH值降至4.5时，终止发酵。
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