CN109628339B - 一种l-乳酸生产菌株及利用该菌株生产l-乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种L‑乳酸生产菌株以及利用该L‑乳酸生产菌株生产L‑乳酸的方法。利用本发明的L‑乳酸生产菌株Lr‑ALTHT在较高温度下发酵生产L‑乳酸时，产酸速度和产物光学纯度都得到显著提高，即，本发明的L‑乳酸生产菌株Lr‑ALTHT具有显著提高的生产L‑乳酸的产酸性能。相应地，通过使用本发明的L‑乳酸生产菌株Lr‑ALTHT来发酵生产L‑乳酸，可以大大改善L‑乳酸的生产。同时，该L‑乳酸生产菌株Lr‑ALTHT还具有发酵成本低、可缩短生产周期、减少发酵生产中控温所需的能耗、节约冷却用水、减少杂菌污染以及环境友好的优势。

Description

一种L-乳酸生产菌株及利用该菌株生产L-乳酸的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域和微生物发酵领域。具体而言，本发明涉及一种能够在较高温度下快速生产高光学纯度L-乳酸的L-乳酸生产菌株以及利用该L-乳酸生产菌株生产L-乳酸的方法。

背景技术

聚乳酸(Polylactic acid，PLA)是一种由乳酸单体缩聚而成的可生物降解的高分子聚合物，主要是以微生物的发酵产物乳酸作为单体通过聚合反应而获得。PLA因其原料为可再生的生物资源，被产业界一致认定为新世纪最有发展前途的新型“生物基材料”。此外，由PLA制成的产品光泽度、透明性、手感和耐热性好，还具有一定的耐菌性、阻燃性和抗紫外性，并具有较高的光泽度和加工性能；PLA还具有无毒、无刺激性和良好的生物相容性等特点。因此，PLA具有广阔的市场前景，用途十分广泛，目前主要用于服装、建筑、农业、林业、造纸和医疗卫生等多个领域中。作为聚乳酸，主要包括聚L-乳酸(PLLA)、聚D-乳酸(PDLA)和聚DL-乳酸(PDLLA)三种，其中使用规模最广泛的是PLLA。更具体而言，以光学纯度大于98％的L-乳酸为原料聚合而成的聚乳酸材料在食品、医药、农药、化工等方面都具有广泛应用。

迄今为止，L-乳酸主要可通过化学合成法和微生物发酵法获得。化学合成法存在环境污染、成本昂贵、技术复杂、光学纯度较低等棘手问题，难以满足实际应用要求。相比之下，微生物发酵法利用葡萄糖等可再生资源为原料生产L-乳酸，具有生产成本低、产物光学纯度和安全性高、生产条件温和、污染小等优点，因此，目前全世界的L-乳酸工业生产绝大部分都是通过微生物发酵法进行的。然而，大多数乳酸菌只能同时生产L-乳酸和D-乳酸，L-乳酸的产率和光学纯度难以满足实际需求。

此外，在通过微生物发酵法大规模工业生产L-乳酸时，可选择的菌株仍然十分有限，需要进一步选育高产菌株，不断发掘新菌种，以期实现产量增加、纯度提高、成本降低、效益提高等目标。对于乳酸发酵菌株的筛选和改造，主要聚焦于如下三个方面：高产菌株的获得；耐环境胁迫菌株的选育；以及转基因工程菌株的构建。

其中，增强乳酸发酵菌株对环境胁迫的抵抗能力是提高乳酸发酵能力的重要手段之一。已有研究表明，通过提高乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的耐高糖浓度和耐高乳酸钙浓度的能力，可以提高其乳酸产量和产物光学纯度；通过提高鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的耐酸和耐糖能力，可以提高其乳酸产量和生物量。就此而言，在乳酸发酵工业中，耐高温菌株可以带来极大的优势，例如，利用耐高温菌株可以达到缩短生产周期、减少发酵生产中控温所需的能耗、节约冷却用水以及减少杂菌污染的可能性等有益效果。然而，对于能够以高产率和高光学纯度生产L-乳酸的耐高温L-乳酸生产菌株而言，目前还存在改善空间。

发明内容

本发明的主要目的在于克服上述现有技术中的不足，提供一种能够在较高温度下快速生产高光学纯度L-乳酸的L-乳酸生产菌株以及利用该L-乳酸生产菌株生产L-乳酸的方法。具体而言，鼠李糖乳杆菌是从健康人肠道分离出的乳杆菌，是人类研究最广泛的益生菌之一，近年来也被用于生产L-乳酸，最适温度通常为30℃～40℃，一般超过42℃时，其发酵产乳酸能力就会大幅下降；而发酵温度较低时则容易污染杂菌造成发酵产物不纯。对于利用耐高温鼠李糖乳杆菌来以高产率生产高光学纯度的L-乳酸这一课题，本领域还罕有报道。对此，本发明通过对分离自新疆牧区酸奶样品的鼠李糖乳杆菌进行常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)诱变，筛选得到了可在较高温度下进行发酵(在48℃下仍具备较高发酵能力)、L-乳酸生产速度快且产物L-乳酸光学纯度高(可达99％)的菌株，从而完成了本发明。

因此，根据第一个方面，本发明提供了L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT，所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT的分类名称为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，于2018年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16834。

根据第二个方面，本发明提供了利用所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT生产L-乳酸的方法，所述方法包括：在35℃～40℃(优选37℃)的发酵温度下在培养基中培养所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT，从而使所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT生长；在42℃～48℃(优选45℃～48℃、更优选46℃～48℃、特别优选48℃)的发酵温度下在培养基中培养所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT，从而在所述培养基中产生和积累L-乳酸；以及从所述培养基中收集L-乳酸。

有益效果

相比野生型鼠李糖乳杆菌，利用本发明的L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT在较高温度下发酵生产L-乳酸时，产酸速度和产物光学纯度都得到显著提高，即，本发明的L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT具有显著提高的生产L-乳酸的产酸性能。相应地，通过使用本发明的L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT来发酵生产L-乳酸，可以大大改善L-乳酸的生产。同时，该L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT还具有发酵成本低、可缩短生产周期、减少发酵生产中控温所需的能耗、节约冷却用水、减少杂菌污染以及环境友好的优势。

本发明的其它特征和优势将通过以下具体实施方式进行详细说明。

附图说明

图1为示出了利用本发明的L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT生产L-乳酸时发酵产物L-乳酸的光学纯度(99％)的色谱图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本文使用的术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”通常都意味着统计学显著量的增加。然而，为避免疑义，术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”表示相比参比水平(例如野生型鼠李糖乳杆菌菌株中的水平)增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括增加100％、或相比参比水平增加在10％到100％之间的任意量；或相比参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或在2倍和10倍之间的任意量的增加、或是更大量的增加。

为了在属于鼠李糖乳杆菌的微生物中筛选出能够快速生产高光学纯度L-乳酸的L-乳酸生产菌株，可以通过常规诱变技术和低能离子注入诱变技术或遗传工程技术等在野生型鼠李糖乳杆菌菌株中引入突变或变异。诱变技术的实例包括例如利用低能离子注入诱变的方法，离子束作为一种新型诱变源在诱变育种方面因其独特的诱变机理和生物效应而发展极为迅速。与传统诱变源相比，离子注入除了具有能量沉积效应外，还具有动能传递、质量沉积及电荷的中和与交换效应等。它将物理诱变和化学诱变特性集于一身，能够在低剂量注入、细胞损伤较轻的情况下，诱发遗传物质的基本单位碱基的改变或诱发染色体结构的变异。诱变技术的实例还包括例如利用X-射线或紫外光辐射的方法，或者利用诱变试剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍和诸如此类处理的方法。

在本发明的优选实施方式中，利用常压室温等离子体(atmospheric and roomtemperature plasma，ARTP)诱变对鼠李糖乳杆菌进行改造，从而筛选出能够快速生产高光学纯度L-乳酸的L-乳酸生产菌株。ARTP是近几年发展起来的一种等离子体源，能够在大气压下产生温度在25-40℃之间的具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流。等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。

在本发明一些优选实施方式中，可以在利用ARTP诱变对鼠李糖乳杆菌进行改造(第一轮ARTP诱变)之后，在42℃～46℃的温度下进行平板培养以选择生长较快的单克隆(第一轮高温筛选)；然后，可以在再次利用ARTP诱变对鼠李糖乳杆菌进行改造(第二轮ARTP诱变)之后，在48℃～50℃的温度下进行平板培养以选择生长较快的单克隆并进行液体培养以选择L-乳酸产量较高的菌株(第二轮高温筛选)。

在本发明的发酵生产L-乳酸的方法中，对本发明的L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT进行发酵培养可以获得L-乳酸。其中，除了在较高温度下(例如42℃～48℃，优选45℃～48℃，更优选46℃～48℃，特别优选48℃)进行发酵之外，发酵培养的方法可以为本领域常规用于L-乳酸生产的发酵方法。除了在较高温度下(例如42℃～48℃，优选45℃～48℃，更优选46℃～48℃，特别优选48℃)进行发酵之外，可利用鼠李糖乳杆菌的标准培养方法制备本发明L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT的种子液和发酵液。例如，发酵培养的方法可包括以下步骤：将新鲜制备的L-乳酸生产菌株或低温冻存的L-乳酸生产菌株(例如在甘油冻存管中冻存于例如-80℃冰箱中的L-乳酸生产菌株)接种于鼠李糖乳杆菌液体培养基中进行活化并过夜培养制得种子液；将上述种子液接种至L-乳酸产酸发酵培养基中(例如装有L-乳酸产酸发酵培养基的摇瓶或发酵罐中)扩大培养制得发酵液。

例如，所述种子液可通过如下过程制备：从平板上挑取鼠李糖乳杆菌单菌落接种于种子液培养基中，以转速100-180rpm(优选120-150rpm)在35-40℃(优选37℃)下培养12～24h，即得种子液。在本发明一个优选实施方式中，所述种子液培养基为MRS液体培养基。

例如，所述发酵液可通过如下过程制备：以5％-10％体积(优选10％体积)的接种量将种子液接种至置于例如摇瓶或发酵罐中的产酸发酵培养基中，以转速100-180rpm(优选120-150rpm)在35-40℃(优选37℃)下发酵4-6h(优选5-6h)，然后再以转速100-180rpm(优选120-150rpm)在42-48℃(优选45-48℃，更优选46-48℃，特别优选48℃)下连续发酵60-72h(优选65-70h)，即得发酵液。其中，所述产酸发酵培养基包含葡萄糖、有机氮源(例如酵母提取物)、乙酸钠、磷酸盐、微量元素和中和剂。在本发明一个优选实施方式中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：葡萄糖160-200g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5-1g/L、MnSO₄ 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及合适的中和剂。在本发明一个更为优选的实施方式中，所述中和剂为CaCO₃，并且中和剂CaCO₃的浓度为糖浓度的一半，但本发明并不限于此。在本发明一个特别优选的实施方式中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：葡萄糖180-200g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5-1g/L、MnSO₄ 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及CaCO₃ 90-100g/L。

在完成发酵培养后，可以通过已知方法收集产酸发酵培养基中积累的L-乳酸。例如，可以通过包括在除去细胞后浓缩产酸发酵培养基以使产物结晶、离子交换层析和诸如此类的方法来分离L-乳酸。

同时，在完成发酵培养后，还可以通过已知方法对产酸发酵培养基中积累的L-乳酸或所分离的L-乳酸进行检测。例如，可以通过高效液相色谱法和诸如此类的方法来对L-乳酸的产量和光学纯度进行检测。

实施例

接下来，通过以下实施例对本发明进行更详细的说明，但这些实施例仅用于说明本发明而不用来限制本发明的范围。下述实施例中，除非特别说明，所用试剂、培养基均为市售商品，所用方法均为常规方法。

1.培养基

MRS+CaCO₃平板：MRS固体培养基+10g/L CaCO₃；

高糖MRS+CaCO₃平板：MRS固体培养基+10g/L CaCO₃+180g/L葡萄糖；

筛选培养基：MRS液体培养基+10g/L CaCO₃；

产酸发酵培养基：葡萄糖160-200g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄ 0.2g/L、吐温80 1ml/L、CaCO₃ 80-100g/L。

2.高效液相色谱法检测发酵液中的乳酸

色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity II；

检出器：RID；

分离柱：Aminex HPX-87H Column 300×7.8mm；

流动相：0.005M硫酸；

流量：0.5mL/min；

进样量：20μL。

乳酸保留时间为14min左右。

3.生物传感器检测发酵液中的葡萄糖和L-乳酸

仪器：SBA-40E型生物传感器；

酶膜：D-葡萄糖酶膜和L-乳酸酶膜；

进样量：25μl。

4.高效液相色谱法检测乳酸的光学纯度

色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity；

检出器：波长254nm，灵敏度0.32AUFS；

分离柱：MCI GEL-CRS10 W(3u)4.6ID×50mm；

流动相：0.002M硫酸铜；

流量：0.5mL/min；

进样量：20μL。

将样品稀释至总乳酸浓度为0.5-1g/L再进行检测。D-乳酸保留时间为11min左右，L-乳酸保留时间为13min左右，根据其峰面积计算L-乳酸的光学纯度。

实施例1：菌株分离和鉴定

菌株分离：将新疆牧区的酸驼乳样品用无菌生理盐水稀释1倍，充分混匀30min；取上述稀释液10倍梯度稀释后涂布于含1％(w/v)CaCO₃(中和剂)的MRS固体培养基上，37℃培养24小时，挑取透明圈较大的单菌落接种筛选培养基，37℃培养24小时，用生物传感器检测L-乳酸产量和葡萄糖残留，挑选L-乳酸产量高并且基本与葡萄糖消耗相等的菌株，即发酵产物中L-乳酸含量高的乳酸菌，液相检测其L-乳酸光学纯度。

菌株鉴定：挑选的菌株具有菌落乳白色、边缘整齐光滑、革兰氏染色呈阳性等特征，基本符合鼠李糖乳杆菌的各项特征。进而，采用16S rDNA测序鉴定方法确认了该菌株与鼠李糖乳杆菌最接近，从而将其鉴定为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌Lr-ALT。

具体而言，通过上述菌株分离方法从酸驼乳样品中分离得到大量乳酸生产菌株，但其中大部分的产物L-乳酸产率低(可能是产物L-乳酸光学纯度不高或糖酸转化率低)。进而，在产物L-乳酸光学纯度为90％以上的一系列菌株中，包括4株鼠李糖乳杆菌，其中3株鼠李糖乳杆菌的产物L-乳酸光学纯度为90-95％左右，而鼠李糖乳杆菌Lr-ALT的产物L-乳酸光学纯度达到97％以上，这也是筛选得到的所有菌株中产物L-乳酸光学纯度最高的。

实施例2：菌株诱变和高温筛选

通过平板划线的方式将实施例1中得到的鼠李糖乳杆菌Lr-ALT菌株活化后转接MRS培养基，37℃150rpm培养至OD＝1，取菌液用生理盐水稀释至OD＝0.6，进行常压室温等离子体(ARTP)诱变。以氦气作为等离子体的工作气体，功率100W，气体流量10slpm，处理时间120s、150s、180s，加入MRS培养基37℃150rpm复苏1小时，以无菌生理盐水对菌液进行梯度稀释并涂布于高糖MRS+CaCO₃固体平板上，将平板放置于45℃培养箱中培养，待形成单菌落并观察其溶钙圈。

挑选平板中菌落生长较快并且溶钙圈较大的单菌落再次转接MRS培养基，37℃150rpm培养至OD＝1，取菌液用生理盐水稀释至OD＝0.6，再次进行常压室温等离子体(ARTP)诱变。以氦气作为等离子体的工作气体，功率100W，气体流量10slpm，处理时间120s、150s、180s，加入MRS培养基37℃150rpm复苏1小时，以无菌生理盐水对菌液进行梯度稀释并涂布于高糖MRS+CaCO₃固体平板上，将平板放置于48℃培养箱中培养，待形成单菌落并观察其溶钙圈。

再次挑选平板中菌落生长较快并且溶钙圈较大的单菌落用MRS培养基37℃150rpm培养过夜，10％(v/v)比例接种筛选培养基37℃150rpm培养4h让菌体生长，再升温至50℃150rpm继续培养20h，培养结束后用生物传感器检测筛选葡萄糖消耗速度快并且基本转化为L-乳酸的菌株，即发酵产物中L-乳酸含量高的乳酸菌，并使用液相色谱对其L-乳酸光学纯度进行准确检测。对筛选出的备选菌株进行发酵摇瓶实验。

具体而言，将备选菌株接种MRS培养基，37℃150rpm过夜培养获得种子液，在30mL产酸发酵培养基中按照10％(v/v)的比例接种上述种子液，37℃150rpm摇床培养5小时让菌株生长，然后升温到42℃或48℃，继续以150rpm摇床培养60小时获得发酵液(总发酵时长65小时)。

发酵结束后通过高效液相色谱检测发酵产物中的乳酸，筛选出与鼠李糖乳杆菌Lr-ALT相比乳酸生产速度较快并且L-乳酸光学纯度较高的菌株。其结果是，在30mL摇瓶水平下，野生型鼠李糖乳杆菌菌株Lr-ALT42℃条件下65h可发酵生产乳酸165.9g/L，而48℃条件下仅可发酵生产乳酸93.6g/L，糖酸转化率均为95％以上，但48℃条件下的葡萄糖残留较多，所得产物L-乳酸光学纯度为97.4％；所筛选出的诱变后的鼠李糖乳杆菌菌株48℃条件下65h可发酵生产乳酸163.8g/L，与42℃条件下发酵生产乳酸的产量165.3g/L基本一致，糖酸转化率同样均达到95％以上，所得产物L-乳酸光学纯度为约99％。

将该筛选出的诱变后的鼠李糖乳杆菌菌株命名为鼠李糖乳杆菌Lr-ALTHT(也称为L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT)。该L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT于2018年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16834。

实施例3：菌株发酵生产L-乳酸

将实施例2中得到的L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT接种MRS培养基，37℃150rpm过夜培养获得种子液。然后，在200mL产酸发酵培养基中按照10％(v/v)的比例接种上述种子液，37℃150rpm摇床培养6小时让菌株生长，然后升温到48℃，继续以150rpm摇床培养70小时获得发酵液(总发酵时长76小时)。发酵结束后通过高效液相色谱测定乳酸产量和光学纯度。

其结果是，在放大培养规模的情况下，野生型鼠李糖乳杆菌菌株Lr-ALT 76h可发酵生产乳酸123.2g/L，糖酸转化率为95％以上，所得产物L-乳酸光学纯度为97.5％；所筛选出的诱变后的鼠李糖乳杆菌菌株Lr-ALTHT 76h可发酵生产乳酸205.3g/L(增长67％)，糖酸转化率为95％以上，所得产物L-乳酸光学纯度为99％(增长约2％)。

考虑到L-乳酸工业生产通常要求产物光学纯度达到98％以上，该诱变后的L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT提供了可满足工业需求的又一选择。

工业实用性

以上研究表明，本发明的L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT在L-乳酸生产速度和产物光学纯度方面显著优于未经改造的鼠李糖乳杆菌Lr-ALT(生产速度提高67％；光学纯度提高到99％)。因此，本发明提供了一种发酵成本低、环境友好、L-乳酸生产速度快并且产物光学纯度高的新型生产菌株，为L-乳酸的工业化微生物发酵生产提供了更优的潜在选择。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变型，这些变型均属于本发明的保护范围。

Claims (16)

1.利用L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT生产L-乳酸的方法，所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT的分类名称为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，于2018年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16834，

所述方法包括：

在35℃～40℃的发酵温度下在培养基中培养所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT，从而使所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT生长；

在45℃～48℃的发酵温度下在培养基中培养所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT，从而在所述培养基中产生和积累L-乳酸；以及

从所述培养基中收集L-乳酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中，在37℃的发酵温度下在培养基中培养所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT，从而使所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT生长。

3.如权利要求1所述的方法，其中，在46℃～48℃的发酵温度下在培养基中培养所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT，从而在所述培养基中产生和积累L-乳酸。

4.如权利要求1所述的方法，其中，在48℃的发酵温度下在培养基中培养所述L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT，从而在所述培养基中产生和积累L-乳酸。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

将新鲜制备的L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT或低温冻存的L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT接种于鼠李糖乳杆菌液体培养基中进行活化；

过夜培养制得种子液；以及

将所述种子液接种至L-乳酸产酸发酵培养基中扩大培养制得发酵液。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述种子液通过如下过程制备：

从平板上挑取L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT单菌落接种于种子液培养基中，以转速100-180rpm在35-40℃下培养12～24h，即得种子液。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述种子液通过如下过程制备：

从平板上挑取L-乳酸生产菌株Lr-ALTHT单菌落接种于种子液培养基中，以转速120-150rpm在37℃下培养12～24h，即得种子液。

8.如权利要求6或7所述的方法，其中，所述种子液培养基为MRS液体培养基。

9.如权利要求5所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：

以5％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速100-180rpm在35-40℃下发酵4-6h，然后再以转速100-180rpm在45-48℃下连续发酵60-72h，即得发酵液。

10.如权利要求5所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：

以5％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速100-180rpm在35-40℃下发酵4-6h，然后再以转速100-180rpm在46-48℃下连续发酵60-72h，即得发酵液。

11.如权利要求5所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：

以5％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速100-180rpm在35-40℃下发酵4-6h，然后再以转速100-180rpm在48℃下连续发酵60-72h，即得发酵液。

12.如权利要求5所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：

以10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速120-150rpm在37℃下发酵5-6h，然后再以转速120-150rpm在48℃下连续发酵65-70h，即得发酵液。

13.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基包含葡萄糖、有机氮源、乙酸钠、磷酸盐、微量元素和中和剂。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述有机氮源为酵母提取物。

15.如权利要求13所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：葡萄糖160-200g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5-1g/L、MnSO₄ 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及CaCO₃ 80-100g/L。

16.如权利要求13所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：葡萄糖180-200g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5-1g/L、MnSO₄ 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及CaCO₃ 90-100g/L。

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