CN115873754A - 一株肠源凝结魏茨曼氏菌rs804及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株肠源凝结魏茨曼氏菌RS804及其应用。本发明提供了一种能够高效利用甜菜蔗糖的肠源凝结魏茨曼氏菌RS804，所述菌株具备一定的耐温耐酸性能，有较好的纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶等多糖水解酶酶活，能进行边糖化边发酵产L‑乳酸。另外，所述肠源凝结魏茨曼氏菌RS804还能够代谢产生一定含量的细菌素，能够有效抑制巨大普里斯特氏菌、枯草芽孢杆菌等具备一定竞争性的菌株，有助于防治发酵染菌。本发明公开的肠源凝结魏茨曼氏菌RS804对降低L‑乳酸发酵的生产成本，提高L‑乳酸产率具有重要的意义。

Description

一株肠源凝结魏茨曼氏菌RS804及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及涉及一株肠道来源的凝结芽孢杆菌RS804及其应用；具体涉及一株可利用甜菜蔗糖发酵生产L-乳酸的凝结芽孢杆菌RS804及其应用。

背景技术

乳酸(lactic acid)，亦名α-羟基丙酸，分子式为CH₃CHOHCOOH，相对分子质量为900.8，是一种结构简单且较常见的有机酸，广泛存在于人体、动植物和微生物中。由于乳酸分子中存在一个不对称的碳原子，故其存在旋光性，分别为L-乳酸(右旋型)，D-乳酸(左旋型)，DL-乳酸(消旋型)。作为一种重要的日用化学品，是目前世界公认的三大有机酸之一，广泛应用于医药、食品、化工、纺织、化妆品及环保等各个工业领域。特别是以高光学纯度L-乳酸为原料制备的聚乳酸(polylactic acid，PLA)，是一种具有生物降解性和生物相容性的新型非石油材料，被认为是一种很有前途的可循环再生聚合物。

目前，L-乳酸的生产方法主要为发酵法，其中使用最多的是乳杆菌属(Lactobacillus)和魏茨曼氏菌属(Weizmannia)的微生物，其中凝结魏茨曼氏菌(旧称凝结芽孢杆菌，Bacillus coagulans)因为能形成孢子，具有抗逆性强、淀粉酶系发达、生长速度快、产物光学纯度高等优点，被公认为是L-乳酸生物发酵的最优良菌种之一。乳酸主要是微生物通过利用葡萄糖、淀粉或蔗糖等为碳源代谢发酵产生，如何降低乳酸的生产成本已经成为近来的一个研究热点。因为其碳源原料占L-乳酸生产成本的很大比例，若用精制糖类生产L-乳酸，虽会一定程度上降低产品后处理的成本，但精制糖类的价格普遍较高，不仅会拉高总体成本，并且以传统粮食作物来源的精制糖类为底物进行乳酸的生物炼制还会造成“与人争粮”的局面，所以此法亦是不经济的。甜菜作为可再生的能源作物，是取之不尽的可再生资源。而以甜菜制糖(主要为蔗糖)为乳酸发酵底物，既可以解决原料来源受限制和原料成本高的问题，同时可以充分利用甜菜制糖副产物——甜菜糖蜜，提高L-乳酸发酵产率和地源性原料的利用率。基于这些优势，利用甜菜制糖发酵产L-乳酸是工业化生产乳酸的一个很好的发展方向。

凝结魏茨曼氏菌作为主流的L-乳酸发酵菌株，虽然产量很高，但仍存在发酵周期长、容易染其它芽孢杂菌、生产效率不高、光学纯度低等缺点。如何选育具备高效利用甜菜制糖产物，并能够耐受高浓度的底物和终产物渗透压，维持细胞生长和酶活性，获得高生产率的菌株正成为L-乳酸菌株育种研究的关键。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供能够高效利用甜菜蔗糖发酵产L-乳酸的凝结魏茨曼氏菌(Weizmannia coagulans)及其发酵产生L-乳酸的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一株肠源凝结魏茨曼氏菌(Weizmannia coagulans)RS804，其特征在于，所述肠源凝结魏茨曼氏菌RS804于2022年8月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:62692，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明提供的凝结魏茨曼氏菌RS804是通过在健康哺乳母猪粪便中分离得到的出发菌株W103经原生质体的ARTP诱变选育得到。其生长迅速，遗传性状稳定，具有一定淀粉酶、木聚糖酶和纤维素酶合成能力，且同时能够高效利用甜菜糖为碳源发酵生产L-乳酸。

进一步地，本发明还要求保护所述的肠源凝结魏茨曼氏菌RS804在发酵中的应用。

由于本发明提供的肠源凝结魏茨曼氏菌RS804具有具有一定淀粉酶、木聚糖酶和纤维素酶合成能力，因此可利用其特性多种相应的发酵生产中。

作为本发明的优选实施方式，所述肠源凝结魏茨曼氏菌用于发酵生产L-乳酸。

作为本发明的优选实施方式，所述肠源凝结魏茨曼氏菌在发酵产L-乳酸的过程包括如下步骤：将所述肠源凝结魏茨曼氏菌接种于以甜菜蔗糖为主要碳源的发酵培养基中，通过发酵生产L-乳酸。

特异性的以甜菜糖为碳源，筛选能够耐高温和具备产抑菌性能物质的优良菌株，可以有效减少发酵过程染菌风险，并且高温的发酵条件，有利于减少发酵能耗，节约成本发酵高产乳酸。且在本发明条件下，所述肠源凝结魏茨曼氏菌RS804具有良好的L-乳酸发酵生产能力，可达194.8g/L。相对于出发菌产量量提高约21.3％。

作为本发明的优选实施方式，所述以甜菜蔗糖为主要碳源的发酵培养基包括以下质量体积百分含量的成分：酵母膏0.25％、甜菜糖蜜5％、磷酸氢二钾0.05％、磷酸二氢钾0.025％、磷酸二氢铵0.18％、硫酸铵0.5％、硫酸锌0.01％、叶酸0.02％、生物素0.02％和碳酸钙10.0％，以及以下体积百分含量的成分：甜菜液糖75％；去离子水补足余量。

作为本发明的优选实施方式，所述发酵生产L-乳酸的过程为：50-55℃静置培养40-48h。

所述发酵条件简单，对设备要求低，由于不需要搅拌，进一步节省生产成本。

进一步地，所述发酵过程还包括菌株活化、摇瓶种子培养以及种子扩大培养的过程。

作为本发明的优选实施方式，所述菌株活化的过程为：将所述肠源凝结魏茨曼氏菌接种至改良的MRS琼脂培养基斜面，50-55℃培养48h；再用无菌生理盐水洗下斜面菌株，制备菌悬液，转接于含有改良MRS培养基的培养基中，50-55℃培养24h。

所述摇瓶种子培养的过程为：将活化培养得到的菌种加入无菌水洗脱制备菌悬液，转接于装有改良的MRS培养基的摇瓶中，100-150r/min，50-55℃振荡培养12-18h，然后再50-55℃静置培养12-18h。

所述种子扩大培养的过程为：种子摇瓶按接种量20％移接含有种子培养基的种子罐，在罐压为0.06Mpa的条件下，50-55℃，100-150r/min搅拌培养6-10h，然后停止搅拌，保持罐体正压，继续50-55℃静置培养12-18h，移种标准为菌落数＞10⁹CFU/mL；

所述改良的MRS培养基含有以下质量体积百分含量的组分：1％蛋白胨，1％牛肉膏、0.5％酵母膏、0.2％柠檬酸氢二铵、0.5％乙酸钠、0.2％磷酸氢二钾、0.06％硫酸镁、0.025％硫酸锰、0.6％碳酸钙，以及以下体积百分含量的组分：75％甜菜液糖和0.1％的吐温-80；调节pH值至6.5左右；去离子水补足余量；

所述改良的MRS琼脂培养基为在所述改良的MRS培养基基础上加入以下质量体积百分含量的组分：2％的琼脂粉；去离子水补足余量；

所述种子培养基含有以下质量体积百分含量的组分：1.5％酵母膏、0.2％磷酸二氢铵、0.5％硫酸铵、1.0％轻质碳酸钙、0.02％硫酸镁、0.01％硫酸锌，以及以下体积百分含量的组分：75％甜菜液糖；调节pH值为6.0-6.5，去离子水补足余量。

通过菌株活化、摇瓶种子培养以及种子扩大培养可提高所述肠源凝结魏茨曼氏菌RS804的酶活和菌群数量，为后续接种于发酵罐中进行大规模发酵提供有利的支持。

作为本发明的优选实施方式，所述发酵条件为：将移种量为20-50％种子培养液移种至装有发酵培养基的发酵罐，控制发酵罐通气量为150-200mL/min，初始总糖的浓度控制在100-160g/L，pH值为5.5-6.0，50-55℃静置培养；维持发酵罐中的总糖含量在16-20g/L，发酵罐内正压，发酵48h。

在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为150-200mL/min，不开搅拌控制一定量的溶氧主要是为了前期菌体的繁殖。发酵结束后，发酵结束时发酵液中的残糖含量小于5g/L。

更优选地，发酵过程中调节pH的方法为通过控制流加25％的石灰乳控制。

本发明提供了一种能够高效利用甜菜蔗糖发酵产L-乳酸的肠源凝结魏茨曼氏菌RS804，所述菌株具备一定的耐温耐酸性能，有较好的纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶等多糖水解酶酶活，能进行边糖化边发酵产L-乳酸。另外，所述肠源凝结魏茨曼氏菌RS804还能够代谢产生一定含量的细菌素，能够有效抑制巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等具备一定竞争性的菌株，有助于防治发酵染菌。本发明公开的肠源凝结魏茨曼氏菌RS804对降低L-乳酸发酵的生产成本，提高L-乳酸产率具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明所述肠源凝结魏茨曼氏菌RS804的产酶特性检测结果。

图2为本发明所述肠源凝结魏茨曼氏菌RS804菌株基于16s rDNA序列的系统进化树。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1产L-乳酸出发菌株W103的筛选

1、健康哺乳母猪粪便样品的预处理及菌株分离

预处理：在无菌操作台中，取不同时间段的健康哺乳母猪粪便10g，加入含有50mL无菌生理盐水三角瓶中(pH值为2.5，pH通过加入3mol/L的盐酸调节)，充分涡旋振荡，纱布过滤，取滤液至新的灭菌三角瓶，并用灭菌的20％氢氧化钠回调pH值至5.5-6.0。为了能够特异性筛选能够耐受一定温度的菌株，将含有内容物的三角瓶继续在80℃水浴中100rpm振荡10min。

预处理结束后，将水浴液采用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10^-5，取稀释液涂布于含有1.5％的碳酸钙和1.5％的乳酸钙的分离培养基平板(即在分离培养基中添加1.5％(w/w)碳酸钙和1.5％的乳酸钙)，55℃培养48h以上，至有单菌落长出。

其中，所述分离培养基组成包括以下质量-体积浓度的组分：胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉10g/L、牛肉浸膏10g/L、K₂HPO₄ 2g/L、MgSO₄0.2 g/L、MnSO₄ 0.1g/L、NaCl 0.03g/L、FeSO₄ 0.01g/L和琼脂粉20g/L，以及以下体积百分含量的组分：甜菜液糖75％(v/v)，0.1％吐温-80，pH6.5±0.2，去离子水补足余量。121℃灭菌15min备用。

上述的甜菜液糖，指的是根据“郭成宇.现代甜菜制糖工艺学[M].中国轻工业出版社,2015.”文献方法，制备成总糖含量约20％，其中蔗糖含量约18.0％，单糖约2.0％的浓缩液。

2、菌株的特异性筛选

(1)选择性初筛

在分离培养基平板上挑取菌落生长较快、菌落较大、呈乳白色、表面有凸起、有明显溶钙圈，且革兰氏染色为阳性的菌株共10株，并重复划线于分离培养基平板，50-55℃培养，进行菌株纯化，保存。同时，挑取纯化菌株分别点殖于含有不同底物的产酶筛选培养基，50-55℃培养24-36h，再分别加入0.1％的刚果红或碘溶液，以测定纤维素酶(CMC)、木聚糖酶(XYL)、淀粉酶(AMY)活性，记录菌株酶解圈直径(H)和菌落直径(C)的比值(H/C)。

其中，产酶筛选培养基是在改良的MRS琼脂培养基的基础上，分别添加以下质量体积百分含量的组分：0.5％羧甲基纤维素钠(纤维素酶筛选)或0.5％木聚糖(木聚糖酶筛选)或1.0％的可溶性淀粉(淀粉酶筛选)进行选择性筛选。

所述改良的MRS琼脂培养基含有以下质量百分含量的组分：2％的琼脂粉、1％蛋白胨，1％牛肉膏、0.5％酵母膏、0.2％柠檬酸氢二铵、0.5％乙酸钠、0.2％磷酸氢二钾、0.06％硫酸镁、0.025％硫酸锰、0.6％碳酸钙，以及以下体积百分含量的组分：75％甜菜液糖和0.1％的吐温-80；去离子水补足余量，pH值6.5左右。

根据不同的菌株产酶能力的差异，挑取能够对多种底物形成明显酶解圈的菌，并对它们形成酶解圈直径与菌落直径的比值做产酶能力的初步排序，比值越大，酶活性越强。产酶筛选的结果如表1。

表1不同菌株的产酶能力比较

菌株编号	CMC H/C	XYL H/C	AMY H/C
				W01	1.0	1.0	1.0
W12	1.0	1.21	1.0
				W23	1.20	1.0	1.0
W29	1.16	1.12	1.0
				W58	1.22	1.0	1.0
W77	1.0	1.0	1.21
				W103	1.45	1.30	1.25
W109	1.11	1.0	1.10
				W116	1.15	1.0	1.10
W121	1.20	1.0	1.0

由表1的产酶发酵初筛结果显示：初筛获得的菌株的多糖水解能力都不强。但相较其它菌株来说，W103菌株同时具备纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶的酶活，体现了其具有较好的多糖水解与利用能力。

(2)摇瓶发酵复筛

采用摇瓶发酵的方式对上述具备不同产酶能力的菌株进行L-乳酸合成能力的比较以及发酵液抑菌性能测定：

将上述获得具备不同底物水解能力的菌株转接至试管斜面(含有改良的琼脂MRS培养基，18×180mm试管)，50-55℃培养24h，然后加入5mL无菌生理盐水洗脱，制备菌悬液(菌落数为1×10⁸CFU/mL)，最后将菌悬液转接至摇瓶，进行发酵培养，其中摇瓶发酵条件为：250mL三角瓶中装量100mL摇瓶发酵培养基，55℃静置培养48h。

上述的摇瓶发酵培养基包括质量体积百分含量如下的组分：0.25％酵母膏、5％甜菜糖蜜、0.05％磷酸氢二钾、0.025％磷酸二氢钾、0.18％磷酸二氢铵、0.5％硫酸铵、0.01％硫酸锌、0.02％叶酸、0.02％生物素和10.0％碳酸钙，以及体积百分含量如下的组分：75％甜菜液糖；去离子水补足余量。121℃高压灭菌15min备用。

上述甜菜糖蜜，含蔗糖45％(w/v)，氮0.5％(w/v)，甜菜碱2.6％，购自于新疆奎屯糖厂(新疆奎屯市阿克苏东路169号)。

发酵结束后，10000r/min离心2min收集发酵上清液，采用SBA-40D型生物传感分析仪(购自济南研科实验仪器有限公司)利用酶促反应来进行定量分析发酵培养基中的L-乳酸的含量。

另外，采用琼脂扩散法检测摇瓶发酵上清液的抑菌性能：将离心收集的发酵上清液，用10％氢氧化钠溶液调上清液pH至5.5-6.0，排除酸对后续测定的干扰，以巨大普里斯特氏菌作为指示菌，制备抑菌平板，测量抑菌圈直径，通过抑菌圈的大小测定上清液对指示菌的抑制作用强弱。上述抑菌平板，指的是将灭菌的LB固体培养基加热后放置室温冷却至45-55℃，加入适量巨大普里斯特氏菌或枯草芽孢杆菌菌悬液(指示菌终浓度为1×10⁵CFU/mL)，混匀后倒平板，用直径6.0mm无菌打孔器在平板上打孔，移去琼脂块，取50μL发酵液加入点样孔中，4℃静置约1h，后于37℃培养箱中培养24h，取出平板，测量抑菌圈直径。

抑菌圈直径＝抑菌圈外径-孔径(6.0mm)。摇瓶发酵复筛的结果如表2。

表2摇瓶发酵复筛结果

菌株编号	L-乳酸(％)	抑菌圈直径(mm)
			W01	21.0	2.5mm
W12	11.9	2.2mm
			W23	32.6	2.3mm
W29	11.6	1.8mm
			W58	22.2	1.6mm
W77	21.0	1.5mm
			W103	44.5	2.6mm
W109	11.1	1.1mm
			W116	11.5	2.0mm
W121	22.0	1.4mm

由表2可得，W103菌株的摇瓶发酵产L-乳酸的能力最强，而且还能够代谢产生一定的抑菌活性物质，具备一定的抑制活性，有效减少同样能够产生芽孢、对发酵原料有竞争性利用的芽孢杆菌类染菌风险。将编号W103菌株进行斜面保存及甘油保种，此即为分离获得的高产L-乳酸的出发菌株W103。

实施例2优良突变菌株凝结魏茨曼氏菌RS804的选育

1、原生质体制备

(1)菌株的活化

取上述分离获得的W103菌株作为出发菌株，取其甘油菌接种于改良的MRS琼脂培养基的斜面，50-55℃培养48h，培养结束后，从中取一环菌株划线至另一支新鲜的改良的MRS斜面培养基中，50-55℃培养24h，进一步强化菌株活力，复壮菌株，达到菌株活化的目的。

(2)菌株悬液的制备

用无菌生理盐水将上述斜面活化的菌株洗下制备斜面菌株悬液，充分涡旋振荡混匀。8000r/min，4℃离心5min收集菌体细胞，并用无菌生理盐水清洗两次，接着用高渗溶液SMM洗涤两次，离心去上清，最终菌体重悬于SMM溶液中，获得菌体悬液，并调整菌落数约为2.0×10⁶CFU/mL(SMM高渗溶液组成包括：蔗糖0.5mol/L，MgCl₂·6H₂O 0.02mol/L，顺丁烯二酸0.02mol/L蒸馏水配制，pH7.0，121℃，灭菌22min，4℃保存备用)。

(3)原生质体的制备

所述的制备原生质体，指的是先进行菌株的斜面活化，然后制备菌体悬液，最后在一定条件下进行酶解破壁，制备原生质体。

采用组合酶的形式进行细胞的酶解。具体为：采用溶菌酶和溶壁酶的进行组合消化，取上述菌体悬液分别加入一定量的过滤除菌后的酶母液(SMM溶液配制)，制备含有酶的菌体悬液，置于摇床，80r/min反应，每隔5min镜检一次，观察原生质体形成情况，当90％左右的细胞转化为原生质体时，2000rpm离心收集细胞，用SMM洗涤离心两次，用适量的SMM重悬。其中，溶菌酶(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司)的使用浓度为0.05％-0.5％，最佳浓度为0.05％-0.15％；，溶壁酶(购自于广东省微生物研究所)使用浓度为0.01％-0.1％，最佳浓度为0.01％-0.05％；酶解温度范围为24-35℃，最佳酶解温度为26-30℃；酶解时间为10-90min，最佳酶解时间为10-30min。优化条件下，最终原生质体浓度达到1.9×10⁶个/mL，原生质体形成率达到95.0％，而且原生质体的再生率也最好，达到20.5％。

2、原生质体的ARTP诱变

(1)ARTP诱变参数的确定

ARTP诱变选育，指的是通过常压室温等离子体(Atmospheric and RoomTemperature Plasma，ARTP)诱变育种机(无锡源清天木生物科技有限公司)来实现的，该育种机是通过能够在大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流，作用于微生物，能够使微生物壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。

采用上述诱变育种机对原生质体诱变育种的最佳条件为：取10-20μL的原生质体悬液，均匀涂布在金属载片的上表面，干燥后用镊子将原生质体悬液载片转移至载物台。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体，设置电源功率80W，照射距离4mm，等离子体的温度26-30℃，气流量10L/min，处理菌物载片，设置不同的处理组，各组的处理时间分别为0(对照)、10、20、30、40、50、60s，每组设置三次重复。处理后将载片转移到含有SMM溶液的EP管中，震荡洗脱形成新的原生质体悬液，涂布再生平板后置于50-55℃培养箱内培养至有单菌落长出，计数。计算致死率，致死率计算方法如下：

致死率％＝(未经诱变处理菌落数-经诱变处理菌落数)/未经诱变菌落数×100％

通过统计各处理组的致死率，选择致死率约90％的照射处理时间进行正式实验，即保证一定的突变丰富度，又提供一定的存活率供后续筛选。

结果显示：以未经ARTP处理的(处理时间0s)的菌株为对照，W103的菌悬液经ARTP诱变后，致死率分别为54.1％(处理时间10s)、79.8％(处理时间20s)；89.8％(处理时间30s)，且处理40s以上，致死率达到99.9％以上，细胞存活率基本为0。所以，在保证诱变损伤的同时又有一定的细胞存活率进行后续筛选，选择致死率约为90％的条件进行ARTP处理，即采用W103菌株的ARTP的最有处理时间确定为30s。

(3)诱变菌株的筛选

96孔板初筛：将ARTP诱变后的原生质体悬液涂布于含有1％溴甲酚绿-甲基红的再生平板中，根据平板中菌落色圈大小，挑取呈淡蓝色至淡红色圈较大的菌落245株，转接至含有微孔板筛选培养基的96微孔板中，50-55℃静置培养48h，并在24h之后每隔2h观察培养基颜色变化，选择培养液颜色变化快且红色较深的10株菌进行进一步的保存，备用。

其中，上述溴甲酚绿-甲基红的是按照如下方法进行配制的：准确称取0.1g溴甲酚绿、0.06g甲基红，溶于95％乙醇，并用95％乙醇定容至100mL。

上述的再生平板培养基的制备方法为：称取葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、柠檬酸氢二铵2g、NaCl 1g、K₂HPO₄ 2g、MgSO₄ 0.6g、MnSO₄ 0.25g、蔗糖171g、CaCl₂2.5g、MgCl₂6H₂O 4.066g、顺丁烯二酸2.32g，并量取吐温-80 1ml、溴甲酚绿-甲基红溶液2mL，去离子水定容至1L，121℃高压灭菌20min备用。

上述的微孔板筛选培养基的制备方法如下：称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、柠檬酸氢二铵2g、NaCl 5g、K₂HPO₄ 2g、MgSO₄ 0.6g、MnSO₄ 0.25g和蔗糖10g，并量取吐温-80 1ml、溴甲酚绿-甲基红溶液2mL，以及体积百分含量为75％的甜菜液糖，去离子水补至1000mL，121℃高压灭菌20min备用。

对得到菌株进一步进行摇瓶发酵复筛：选取初筛的9株突变菌株与出发菌株W103一起，转接至斜面活化，然后制备菌悬液，接种至含有150mL的摇瓶发酵培养基的三角瓶中，50-55℃，静置培养48h，发酵结束后，采用生物传感分析仪检测L-乳酸含量。摇瓶发酵复筛的结果如表3。

表3ARTP诱变菌株的摇瓶发酵复筛

由表3结果可知，RS804菌株的L-乳酸的产量为62.5g/L，显著高于其它菌株。将RS804菌株进行斜面保存及甘油保种，编号RS804。

选择其中产酸最高的RS804与出发菌株一起，采用点殖法进行产酶特性的验证，结果如图1(其中，AMY为淀粉酶；CMC为纤维素酶；XYL为木聚糖酶)。由图1可得，在含有不同底物的产酶筛选平板上，RS804菌株的菌落大小较出发菌株W103明显要大，而且产酶特性(AMY、CMC和XYL酶活)也明显优于出发菌株W103。

实施例3分子鉴定

首先利用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司)提取上述分离、筛选到的产L-乳酸能力较好的菌株RS804的基因组，并采用通用引物扩增其16S rDNA部分序列，通用引物序列如下：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO：1)

1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO：2)

反应体系如下：

Pre-mix Ex Taq(Takara公司)12.5μL，27F引物(10μmol/L)1μL，1492R引物(10μmol/L)1μL，LA18基因组DNA模板0.5μL，超纯水10μL。

PCR条件:95℃预变性5min；94℃变性40s，57℃退火40s，72℃延伸90s，进行30个循环，最后72℃延伸10min，并在4℃保存。得到特异性扩增产物后采用PCR回收试剂盒(购自于购自于生工生物工程(上海)股份有限公司)回收目的片段，送样至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。RS804菌株的序列如SEQ ID NO：3所示。

测序结果在NCBI核酸库中进行Blast分析和比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，结果显示：与RS804菌株的亲缘关系最近的为芽孢杆菌科魏茨曼氏菌属(Bacillaceae；Weizmannia)，并选取具有较高相似度的同源菌株16SrDNA序列进行系统发育分析，采用MEGA4.0中的N-J法(Neighbor-Joining method)构建系统发育进化树，如图2。

RS804与芽孢杆菌属的菌株聚为一大类，而且与凝结魏茨曼氏菌属分支进化距离最近，表明RS804与凝结魏茨曼氏菌属在进化上属于近缘物种。结合其菌落与菌体形态特征，确定RS804为凝结魏茨曼氏菌(Weizmannia coagulans)，编号为WeizmanniacoagulansRS804，简称为凝结魏茨曼氏菌RS804。

实施例4遗传稳定性验证

将上述获得的优良突变菌株：凝结魏茨曼氏菌RS804进行传代培养，每3天传代一次，传代15代，每隔一代进行摇瓶发酵，测量发酵液L-乳酸含量，考察菌株在传代过程中的稳定性。结果显示：凝结魏茨曼氏菌RS804在传代过程中发酵液中的L-乳酸含量无明显变化，具备良好的遗传稳定性。

将获得遗传稳定的优良突变菌株凝结魏茨曼氏菌RS804于2022年8月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC；地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510075)，RS804菌株的保藏编号为GDMCC No:62692。

实施例5凝结魏茨曼氏菌RS804的发酵应用

1、种子培养

(1)菌株活化

首先，接种凝结魏茨曼氏菌RS804甘油菌至改良的MRS琼脂培养基斜面(18×180mm)，培养箱中于55℃培养48h，此即为F1代。

然后，再用5mL无菌生理盐水洗下斜面菌株，制备菌悬液，转接于含有改良的MRS培养基的茄瓶培养基，于培养箱中55℃培养24h，此即为F2代活化菌株。

所述改良的MRS培养基为不含琼脂的改良的MRS琼脂培养基。

(2)摇瓶种子培养

将活化培养的茄瓶菌种，加入20mL无菌水洗脱制备菌悬液，转接于装有2000mL的改良的MRS培养基的5L的摇瓶中，于恒温振荡培养器，100r/min，55℃振荡培养12h，然后再55℃静置培养12h，进一步提高菌落总数，同时强化菌株活力。

(3)种子扩大培养

采用种子罐进行摇瓶种子的扩大培养，种子摇瓶按接种量20％移接含有种子培养基的种子罐，控制工艺如下：罐压：0.06Mpa，罐温：55℃，初搅拌：100r/min，溶氧自然下降，培养6h，然后停止搅拌，保持罐体正压，继续55℃静置培养12h，移种标准为菌落数＞10⁹CFU/mL。

上述的种子培养基包括以下质量体积百分含量的组分：1.5％酵母膏、0.2％磷酸二氢铵、0.5％硫酸铵、1.0％轻质碳酸钙、0.02％硫酸镁、0.01％硫酸锌，以及以下体积百分含量的组分：75％甜菜液糖；去离子水补足余量；调节pH值为6.0-6.5。121℃高压灭菌20min。

2、发酵产L-乳酸

将种子培养液移种至装有发酵培养基的发酵罐，移种量为50％。在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为150-200mL/min，不开搅拌控制一定量的溶氧主要是为了前期菌体的繁殖，温度控制在50-55℃，初始总糖的浓度控制在100-160g/L，溶氧控制自然。全过程通过控制流加25％的石灰乳控制发酵液pH值为5.5-6.0，并通过补加浓缩型甜菜液糖(40-50％)溶液，维持发酵罐中的总糖含量在16-20g/L。维持发酵罐内正压，发酵48h，停止发酵。发酵结束时发酵液中的残糖含量小于5g/L，采用SBA-40D型生物传感分析仪(购自济南研科实验仪器有限公司)利用酶促反应来进行定量分析发酵培养基中的L-乳酸的含量。

上述发酵培养基组成包括以下质量体积百分含量的组分：0.25％酵母膏、5％甜菜糖蜜、0.05％磷酸氢二钾、0.025％磷酸二氢钾、0.18％磷酸二氢铵、0.5％硫酸铵、0.01％硫酸锌、0.02％叶酸、0.02％生物素和10.0％碳酸钙，以及以下体积百分含量的成分：75％甜菜液糖；去离子水补足余量。培养基121℃高压灭菌15min。

3、对照菌株发酵

将出发菌株W103代替RS804采用同样的条件进行发酵，并采用同样的方法检测L-乳酸的产量。

4、L-乳酸产量比较

结果显示：RS804菌株发酵液中L-乳酸含量达到194.8g/L，而出发菌株W103的L-乳酸产量仅为160.6g/L，优良突变菌株RS804具备更好的L-乳酸合成与积累的能力，其L-乳酸的产量分别较出发菌株提高21.3％，体现了非常好的产L-乳酸的发酵能力。

实施例6

本实施例与除以下提及部分，其余和实施例5相同：

所述培养、发酵的培养温度为50℃；

所述摇瓶种子培养的过程中，将菌悬液转接于装有改良的MRS培养基的摇瓶中，以150r/min振荡培养18h，然后再静置培养18h。

所述种子扩大培养的过程中，搅拌培养条件为150r/min搅拌培养10h，静置培养条件为培养18h。

所述产L-乳酸发酵过程中，移种量为20％，培养时间为40h。

该实施例条件下所述RS804菌株能有效将培养基中的甜菜蔗糖转化为L-乳酸。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一株肠源凝结魏茨曼氏菌(Weizmannia coagulans)RS804，其特征在于，所述肠源凝结魏茨曼氏菌RS804于2022年8月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNo:62692，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2.如权利要求1所述的肠源凝结魏茨曼氏菌在发酵中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肠源凝结魏茨曼氏菌用于发酵生产L-乳酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：将所述肠源凝结魏茨曼氏菌接种于以甜菜蔗糖为主要碳源的发酵培养基中，通过发酵生产L-乳酸。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述以甜菜蔗糖为主要碳源的发酵培养基包括以下质量体积百分含量的成分：0.25％酵母膏、5％甜菜糖蜜、0.05％磷酸氢二钾、0.025％磷酸二氢钾、0.18％磷酸二氢铵、0.5％硫酸铵、0.01％硫酸锌、0.02％叶酸、0.02％生物素和10.0％碳酸钙，以及以下体积百分含量的成分：75％甜菜液糖；去离子水补足余量。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵生产L-乳酸的过程为：50-55℃静置培养40-48h。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，还包括菌株活化、摇瓶种子培养以及种子扩大培养的过程。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述菌株活化的过程为：将所述肠源凝结魏茨曼氏菌接种至改良的MRS琼脂培养基斜面，50-55℃培养48h；再用无菌生理盐水洗下斜面菌株，制备菌悬液，转接于含有改良MRS培养基的培养基中，50-55℃培养24h。

所述摇瓶种子培养的过程为：将活化培养得到的菌种加入无菌水洗脱制备菌悬液，转接于装有改良的MRS培养基的摇瓶中，100-150r/min，50-55℃振荡培养12-18h，然后再50-55℃静置培养12-18h。

所述种子扩大培养的过程为：种子摇瓶按接种量20％移接含有种子培养基的种子罐，在罐压为0.06Mpa的条件下，50-55℃，100-150r/min搅拌培养6-10h，然后停止搅拌，保持罐体正压，继续50-55℃静置培养12-18h，移种标准为菌落数＞10⁹CFU/mL；

所述改良的MRS培养基含有以下质量体积百分含量的组分：1％蛋白胨，1％牛肉膏、0.5％酵母膏、0.2％柠檬酸氢二铵、0.5％乙酸钠、0.2％磷酸氢二钾、0.06％硫酸镁、0.025％硫酸锰、0.6％碳酸钙，以及以下体积百分含量的组分：75％甜菜液糖和0.1％的吐温-80；pH值6.5左右，去离子水补足余量；

所述改良的MRS琼脂培养基为在所述改良的MRS培养基基础上加入以下质量体积百分含量的组分：2％的琼脂粉；

所述种子培养基含有以下质量体积百分含量的组分：1.5％酵母膏、0.2％磷酸二氢铵、0.5％硫酸铵、1.0％轻质碳酸钙、0.02％硫酸镁、0.01％硫酸锌，以及以下体积百分含量的组分：75％甜菜液糖；调节pH值为6.0-6.5，去离子水补足余量。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵过程为：将移种量为20-50％种子培养液移种至装有发酵培养基的发酵罐，控制发酵罐通气量为150-200mL/min，初始总糖的浓度控制在100-160g/L，pH值为5.5-6.0，50-55℃静置培养；维持发酵罐中的总糖含量在16-20g/L，发酵罐内正压，发酵48h。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，发酵过程中调节pH的方法为通过控制流加25％的石灰乳控制。

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