CN115786300B - 一株低产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株低产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明菌在液态发酵生产中性蛋白酶中能降低其产孢能力，从而大幅降低发酵液中孢子数量，达到提高中性蛋白酶的产量及活性。本发明解淀粉芽孢杆菌的磷酸丝氨酸磷酸酶氨基酸序列突变及其编码基因rsbU的位点突变是使得该菌具有低产孢特性的关键因素。本发明所述低产孢突变菌株获得的发酵液易于后续的分离提取中性蛋白酶。本发明所述低产孢突变菌株的发酵液经上述分离过程后，酶活回收率可达89％。

Description

一株低产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株低产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

芽孢杆菌是自然界中常见的细菌，因其具有形成芽孢的能力，故能够耐受较为恶劣的外部环境，如：耐高温、耐高盐、耐射线等。也正因如此，芽孢杆菌的分布很广，土壤、水、空气以及动物肠道中都有芽孢杆菌的存在。解淀粉芽孢杆菌为芽孢杆菌的一种，目前对于解淀粉芽孢杆菌的研究大多集中于其产酶能力上，尤其是产蛋白酶的能力。

芽孢杆菌在发酵产酶过程中，尤其是在菌体生长达到稳定期后，由于营养物质的消耗及某些代谢产物的积累，发酵条件发生了变化，菌体极易形成芽孢，从而以芽孢休眠体的形式对不适宜生长的环境进行应答。芽孢一旦形成，将对发酵产酶带来诸多不利影响，如会使发酵液粘度增加、泡沫增多，造成冒料；并且形成芽孢后的菌体处于休眠状态，大量芽孢的形成会严重影响蛋白酶的产量、酶活及高密度营养菌体的获得，从而降低原料利用率；芽孢的形成不仅受到外部生长环境的诱导，同时还取决于菌体内芽孢形成相关基因的激活表达或抑制。因为营养菌体形成芽孢的过程包含多个步骤，所以芽孢形成是一个多基因调控过程。

有研究报道，磷酸丝氨酸磷酸酶是一种能够间接激活SigB(一种胁迫应答RNA聚合酶sigma因子)的磷酸酶，其编码基因rsbU的活跃能够间接导致SigB的活跃。SigB是可能发生在生长或静止期的应激性生理信号(如磷酸盐限制、盐胁迫、酸冲击等)的主要应答者，可以激活约150个基因的表达，SigB的激活会使得细菌产孢能力降低。因此，通过激活磷酸丝氨酸磷酸酶编码基因rsbU降低细菌的产孢能力成为降低芽孢杆菌产孢的新手段。

发明内容

本发明的目的在于通过筛选磷酸丝氨酸磷酸酶编码基因rsbU的自然突变菌种，获得一株低产孢突变解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌的磷酸丝氨酸磷酸酶表达量较高。本发明将该菌株2022年7月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCC NO:62651，分类学名称为：Bacillus amyloliquefaciens，将其命名为：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens ZH806。

为实现上述目的，发明人进行了深入研究，并经重复多次研究论证而完成获得本发明方案，具体如下：

第一个方面，本发明提供了一种磷酸丝氨酸磷酸酶，所述磷酸丝氨酸磷酸酶的氨基酸序列的第173位由甲硫氨酸变为缬氨酸。本发明通过诱变技术使解淀粉芽孢杆菌的磷酸丝氨酸磷酸酶的氨基酸序列第173位由甲硫氨酸变为缬氨酸。突变后的磷酸丝氨酸磷酸酶在解淀粉芽孢杆菌中的表达量显著提高，SigB因子被激活，从而减弱了解淀粉芽孢杆菌的产孢能力。

进一步地，所述磷酸丝氨酸磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。经测序突变后的磷酸丝氨酸磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

第二个方面，本发明提供了一种磷酸丝氨酸磷酸酶的编码基因rsbU，所述基因rsbU的cDNA序列的第517bp由A变为G。经过基因鉴定发现基因rsbU发生位点突变，在该基因cDNA的第517bp发生了由A到G的突变。

进一步地，所述磷酸丝氨酸磷酸酶的编码基因rsbU序列如SEQ IDNO:2所示。经测序突变后的rsbU基因的cDNA序列如SEQ ID NO:2所示。

第三个方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏号为GDMCC No:62651。所述菌株通过常压室温等离子体诱变技术进行诱变使其产孢能力大大降低，然而产中性蛋白酶能力却显著提高。

某些实施例中，经过基因鉴定发现上述解淀粉芽孢杆菌的磷酸丝氨酸磷酸酶的氨基酸序列第173位由甲硫氨酸变为缬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

某些实施例中，经过基因鉴定发现上述解淀粉芽孢杆菌的基因rsbU发生位点突变，在该基因cDNA的第517bp发生了由A到G的突变，突变后的rsbU基因序列如SEQ ID NO:2所示。

第四个方面，本发明提供了所述解淀粉芽孢杆菌在制备中性蛋白酶中的应用。实验证明本发明菌株经诱变后在10L发酵罐发酵液的中性蛋白酶酶活力相较野生型菌株提升了196.5％。

第五个方面，本发明提供了所述的磷酸丝氨酸磷酸酶、其编码基因，以及含有所述酶与所述基因的解淀粉芽孢杆菌株在降低解淀粉芽孢杆菌发酵液孢子中的应用。本发明通过诱变技术对解淀粉芽孢杆菌进行诱变获得一株突变菌株，该菌株的磷酸丝氨酸磷酸酶由于其编码基因的突变，显著提高了该酶的表达量，从而间接提高SigB活性，达到降低芽孢杆菌产孢的能力，使得使用该菌株发酵的发酵液中孢子数量大幅度减少。实验证明本发明菌株经诱变后在270L发酵罐发酵液的芽孢数量较野生型菌株减少了99.89％。

第六个方面，本发明提供了一种降低解淀粉芽孢杆菌发酵液孢子数量的方法，该方法为使用本发明所述的解淀粉芽孢杆菌进行液态发酵的方法。实验证明使用本发明解淀粉芽孢杆菌发酵生产不仅生产中性蛋白酶，还可有效降低发酵液中的孢子数量，从而提高中性蛋白酶的产量与酶活。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

1、解淀粉芽孢杆菌的产孢能力降低：本发明通过常压室温等离子体诱变技术并定向筛选，获得一株解淀粉芽孢杆菌。该菌株在液态发酵生产中性蛋白酶中能降低其产孢能力，从而大幅降低发酵液中孢子数量，达到提高中性蛋白酶的产量及活性的效果。例如，在10L发酵罐中发酵，发酵液芽孢数量较野生型菌株减少了99.86％，发酵液的中性蛋白酶酶活力相较野生型菌株提升196.5％；在500L发酵罐中发酵，发酵液芽孢数量较野生型菌株减少了99.89％，发酵液的中性蛋白酶酶活力相较野生型菌株提升190.2％。

2、对产孢调控基因的特定位点进行突变：经全基因组测序分析鉴定，本发明解淀粉芽孢杆菌菌株的磷酸丝氨酸磷酸酶编码基因rsbU发生了位点突变，在该基因cDNA的第517bp发生了由A到G的突变，导致影响产孢水平的磷酸丝氨酸磷酸酶的氨基酸序列也发生了突变，由第173位的甲硫氨酸变为缬氨酸。本发明解淀粉芽孢杆菌的磷酸丝氨酸磷酸酶氨基酸序列突变及其编码基因rsbU的位点突变是使得该菌具有低产孢特性的关键因素。另需说明的是，并非磷酸丝氨酸磷酸酶的氨基酸序列或编码基因序列的任意突变都能达到降低解淀粉芽孢杆菌的目的。原因是由于SigB是发生在生长或静止期的应激性生理信号的主要应答者，调节细菌的产孢能力，SigB的激活会使得细菌产孢能力降低，而磷酸丝氨酸磷酸酶能够间接激活SigB，从而间接调控细菌的产孢能力。因此，突变后的磷酸丝氨酸磷酸酶仍能被SigB识别是调节产孢能力的前提，如若突变后的磷酸丝氨酸磷酸酶的SigB识别位点或结构发生了改变，则不能激活SigB。另外，磷酸丝氨酸磷酸酶表达量越高激活SigB的信号越强烈，SigB信号因子则越活跃，抑制细菌产孢的能力则越强。本发明突变的磷酸丝氨酸磷酸酶的基因rsbU不仅保留SigB识别位点还可提高该酶的表达量，从而达到增强激活SigB信号的作用，SigB一旦被激活，则进一步达到降低细菌产孢能力的目的。因此，本发明突变后的序列(氨基酸序列或编码基因序列)不仅具有SigB识别的位点还具有提高磷酸丝氨酸磷酸酶表达量的功效。

3、易于产物的分离提取：本发明所述低产孢突变菌株获得的发酵液易于后续的分离提取中性蛋白酶。使用板框压滤过程进料压力低，进料全过程压力维持在0.5MPa，仅使用5％的珍珠岩助滤剂即可实现良好的分离效果，且压滤清液浊度＜5NTU，超滤浓缩通量衰减缓慢；而野生型菌株发酵液板框压滤分离时滤布极易堵塞，进料压力可在短时间内升高至1.0MPa，导致分离难以进行；为减小进料压力需增加珍珠岩助滤剂用量至10％，且收得压滤清液浊度＞20NTU，较浑浊的清液在超滤时更易堵膜，影响生产效率。

4、酶活回收率高：本发明所述低产孢突变菌株的发酵液经上述分离过程后，酶活回收率可达89％；野生型菌株的发酵液经上述分离过程后，酶活回收率仅78％。

附图说明

图1本发明菌株划线分离平板菌落形态图；

图2本发明菌株镜检细胞形态图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1目的菌株的筛选与鉴定

1、菌株分离纯化

固体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，2.5％琼脂粉，其他为水，121℃灭菌15min。

取5g传统酱油黄豆曲样品加至50g无菌水中，于摇床中以180rpm转速摇1小时充分混匀。吸取上清液2mL至折好的滤纸上过滤，获得菌液。将菌液梯度稀释至适当浓度后，置于80℃水浴锅中孵育30分钟。吸取菌液50ul，涂布至固体培养基平板上，30℃培养15小时，所得平板上的单菌落即为纯种芽孢杆菌菌株。

2、出发菌株摇瓶发酵筛选

液体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，其他为水，121℃灭菌15min。

从菌株分离纯化平板中挑单菌落接种于盛有50mL液体培养基的三角瓶中，在30℃摇床中以180rpm转速培养48小时，将发酵液离心后取上清液，即为粗酶液。

中性蛋白酶酶活力测定：将离心后得到的粗酶液进行适当稀释，使得最后测定酶活时吸光度在0.2～0.8。按照GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》采用福林法测定中性蛋白酶活力。

根据测定的酶活力结果挑选出酶活力最高的菌株作为出发菌株，进行后续的诱变育种。

3、诱变菌株

采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对步骤2所得到的菌株进行诱变。

设备准备：ARTP-ⅢS，无锡源清天木生物科技有限公司，按照设备使用说明书正常操作。

实验操作：将培养至对数期的菌液离心收集，生理盐水洗涤3次后，用生理盐水重新悬浮至OD600在0.5左右。在超净台中将10μL菌悬液均匀涂抹在ARTP金属载片上，随后将载片转移至ARTP载盘。在控制面板设置功率120W，气量10SLM，诱变时间30s，点击“开始”进行样品处理。样品处理完毕，将金属载片转移至盛有1mL无菌生理盐水的离心管中，充分振荡混匀，形成新的菌悬液。将菌悬液适度稀释后，涂布于固体培养基。

4、诱变菌株摇瓶发酵筛选

从诱变菌株分离平板中分别挑取单菌落接种于盛有50mL液体培养基的三角瓶中，在30℃摇床中以180rpm转速培养48小时，取均一菌液进行芽孢数量检测，取上清液进行酶活力检测。

中性蛋白酶酶活力检测与步骤2方法相同。

芽孢数量检测方法：取10mL均一菌液，置于80℃水浴30分钟，随后取出用无菌生理盐水进行10倍系列稀释，根据对芽孢数量的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液作为接种样，吸取100ul涂布于固体培养基。在37℃培养箱倒置培养12～15h，选取合适的平板进行菌落计数，计算出原菌液中的芽孢数量。

根据测定的结果综合选择酶活力高且芽孢数量少的菌株作为目标菌株。

5、菌种鉴定

将上述筛选获得菌株按照天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)说明书提取所得芽孢杆菌菌株基因组DNA，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rDNA鉴定。鉴定结果显示该菌株与解淀粉芽孢杆菌16S rDNA序列的同源性为100％(Gene Bank：CP054415.1)，测得的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明将该菌株2022年7月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCC NO:62651，分类学名称为：Bacillus amyloliquefaciens，将其命名为：解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens ZH806。该菌株平板菌落形态如图1所示，镜检细胞形态如图2所示。

实施例2目的菌株特性验证

1、摇瓶发酵产孢情况研究

(1)目的菌种活化：从甘油管中蘸取目的菌株菌液在固体培养基平板上划线接种，37℃培养15h得到单菌落。

固体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，2.5％琼脂粉，其他为水，121℃灭菌15min。

(2)种子液培养：从平板挑选活化的单菌落转接到装有种子培养基的50mL三角瓶，在摇床中以37℃、200rpm培养14h。

种子培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，其他为水，121℃灭菌15min。

(3)摇瓶培养：按体积比1％的接种量将步骤(2)所得种子液接种到盛有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在摇床中以30℃、200rpm培养48h。

发酵培养基：1％葡萄糖，1％酵母提取物，1％玉米浆，0.1％碳酸钠，其他为水，121℃灭菌15min。

(4)芽孢检测和酶活力测定

按照实施例1的方法进行芽孢数量检测和中性蛋白酶酶活力测定，所得到的发酵液芽孢数量为120CFU/mL，较野生型菌株减少了99.78％；发酵液的中性蛋白酶酶活力为189U/mL，相较野生型菌株提升了39.4％。

2、全基因组测序分析

通过全基因组测序分析，发现本发明所述低产孢解淀粉芽孢杆菌菌株的磷酸丝氨酸磷酸酶编码基因rsbU发生位点突变，在该基因cDNA的第517bp发生了由A到G的突变，突变后的rsbU基因序列如SEQ ID NO:2所示。

由于上述基因位点的突变导致磷酸丝氨酸磷酸酶的氨基酸序列第173位由甲硫氨酸变为缬氨酸，突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。该突变使得磷酸丝氨酸磷酸酶在本发明低产孢解淀粉芽孢杆菌中的表达量提高，SigB因子被激活，从而大幅度减弱了该菌株的产孢能力，使利用该菌株发酵生产中性蛋白酶的产量大幅提高，降低了生产成本。

实施例3目的菌株10L发酵罐产中性蛋白酶

1、目的菌种活化：从甘油管中蘸取菌液在固体培养基平板上划线接种，37℃培养15h得到单菌落。

固体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，2.5％琼脂粉，121℃灭菌15min。

2、一级种子液培养：从平板挑选活化的单菌落转接到装有10mL种子培养基的50mL三角瓶，在摇床中以37℃、200rpm培养14h。

种子培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，121℃灭菌15min。

3、二级种子液培养：按体积比2％接种量将步骤2所得一级种子液接种到盛有50mL种子培养基的250mL三角瓶，在摇床中以37℃、200rpm培养8h。种子培养基同步骤2。

4、发酵罐培养：按体积比0.5％接种量将步骤3所得二级种子液接种到盛有7L发酵培养基的10L发酵罐中，发酵温度30℃，搅拌转速180rpm，通气量3V/V/min，发酵40h。

发酵培养基：5％糖蜜，2％酵母提取物，1％玉米浆干粉，0.5％磷酸二氢钾，0.5％磷酸氢二钾，0.05％硫酸镁，其他为水。

5、芽孢检测和酶活力测定

按照实施例1的方法进行芽孢数量检测和中性蛋白酶酶活力测定，所得到的发酵液芽孢数量为2.63×10³CFU/mL，较野生型菌株减少了99.86％；发酵液的中性蛋白酶酶活力为1467U/mL，相较野生型菌株提升了196.5％。

实施例4目的菌株500L发酵罐产中性蛋白酶

1、菌种活化：从甘油管中蘸取菌液在固体培养基平板上划线接种，37℃培养15h得到单菌落。

固体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，2.5％琼脂粉，其他为水，121℃灭菌15min。

2、一级种子液培养：从平板挑选活化的单菌落转接到装有100mL种子培养基的500mL三角瓶，在摇床中以37℃、200rpm培养14h。

种子培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，其他为水，121℃灭菌15min。

3、二级种子液培养：按体积比1.5％接种量将步骤2所得一级种子液接种到盛有6L种子培养基的10L发酵罐，培养温度37℃，搅拌转速200rpm，培养7h。

种子培养基：2％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，其他为水，121℃灭菌30min。

4、发酵罐培养：按体积比2％接种量将步骤3所得二级种子液接种到盛有270L发酵培养基的500L发酵罐中。发酵0-8h，控制温度37℃，搅拌转速250rpm，通气量为30方/h。发酵8h后控制温度30℃，搅拌转速200rpm，通气量25方/h，再发酵32h。

发酵培养基：10％葡萄糖，4％酵母提取物，2％玉米浆干粉，0.5％磷酸二氢钾，0.5％磷酸氢二钾，0.1％硫酸镁，其他为水。

5、芽孢检测和酶活力测定

按照实施例1的方法进行芽孢数量检测和中性蛋白酶酶活力测定，所得到的发酵液芽孢数量为7.14×10³CFU/mL较野生型菌株减少了99.89％；中性蛋白酶酶活力为2652U/mL，相较野生型菌株提升了190.2％。

实施例5发酵液中性蛋白酶的分离提取

1、分离提取方法：通过板框压滤和超滤浓缩两个步骤对发酵液中的中性蛋白酶进行分离提取。

2、分离提取效果：

利用本发明低产孢突变菌株获得的发酵液易于分离，板框压滤过程进料压力低，进料全过程压力维持在0.5MPa，仅使用5％的珍珠岩助滤剂即可实现良好的分离效果，且压滤清液浊度＜5NTU，超滤浓缩通量衰减缓慢。而野生型菌株发酵液板框压滤分离时滤布极易堵塞，进料压力可在短时间内升高至1.0MPa，导致分离难以进行；为减小进料压力需增加珍珠岩助滤剂用量至10％，且收得压滤清液浊度＞20NTU，较浑浊的清液在超滤时更易堵膜，影响生产效率。

3、酶活回收效果：

本发明低产孢突变菌株的发酵液经上述分离过程后，酶活回收率可达89％；野生型菌株的发酵液经上述分离过程后，酶活回收率仅78％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种磷酸丝氨酸磷酸酶，其特征在于，所述磷酸丝氨酸磷酸酶的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。

2.一种磷酸丝氨酸磷酸酶的编码基因rsbU，其特征在于，所述基因rsbU的cDNA序列如SEQ ID NO:2所示。

3.如权利要求2所述的编码基因rsbU，其特征在于，所述基因rsbU编辑权利要求1所述的氨基酸序列。

4.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏号为GDMCC No:62651。

5.如权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌在制备中性蛋白酶中的应用。

6.如权利要求1所述的磷酸丝氨酸磷酸酶或如权利要求2所述的磷酸丝氨酸磷酸酶的编码基因rsbU或如权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌在降低解淀粉芽孢杆菌发酵液孢子中的应用。

7.一种降低解淀粉芽孢杆菌发酵液孢子数量的方法，其特征在于，包含使用权利4所述的解淀粉芽孢杆菌进行发酵的步骤。