KR101776679B1 - 숙신산 고생산성 변이 균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 숙신산을 고효율로 생산하는 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) 유래의 변이 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 숙신산 고생산성 변이 균주는 악티노바실러스 숙시노게네스의 돌연변이 유도 및 단일 콜로니 획득법에 의하여 얻어지는 숙신산 고생산성 및 고안정성을 갖는 변이 균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 숙신산을 고효율로 생산하는 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) 유래의 변이 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 숙신산 고생산성 변이 균주는 악티노바실러스 숙시노게네스의 돌연변이 유도 및 단일 콜로니 획득법에 의하여 얻어지는 숙신산 고생산성 및 고안정성을 갖는 변이 균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조 방법에 관한 것이다.
혹위 박테리아(rumen bacteria)인 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)는 높은 농도의 숙신산(succinic acid)을 생산하는 것으로 가장 주목받고 있는 박테리아 중 하나이다. 숙신산은 식료품, 의류, 의약, 플라스틱 등 산업적인 유도체로 여러 방면에 활용되는 물질로서 석유화학 기술의 한 축을 담당할 정도로 그 용도가 다양하면서도 넓다. 미국 에너지자원부가 발표한 미래 10대 중요 에너지 자원에 속할 정도로 그 중요성이 남달라지고 있으며, 더하여 생물학적 공정 및 반응을 통하여 생산하는 생물학적 생산은 최근 들어 재생 가능한 에너지 자원의 활용 및 환경오염의 방지 등 여러 가지 이유로 관심의 대상이 되고 있다. 숙신산등 C4 대사물은 탄소 중심대사의 특성상 해당작용의 결과물인 피루브산(pyruvic acid, C3)의 이산화탄소고정화(CO2 fixation) 경로를 통해 생성되므로, 이론적으로는 생성되는 C4 대사물과 동일수의 이산화탄소가 반응물로 소비되어 이산화탄소 소비를 공업적으로 촉진할 수 있다. 따라서 생물학적인 숙신산 생산을 통해 이산화탄소의 소비를 촉진할 수 있다. 이에 생물공학적인 방법을 통하여 숙신산을 대량생산하는 플랫폼은 그 중요성이 점점 대두되고 있는 시점에서 강력하게 경쟁력을 가질 수 있는 방법 중 하나는 고 효율과 산업현장에서 안정성을 가진 균주의 개발이 될 수 있다. 거대하게 형성되어 있는 숙신산의 세계시장은 이러한 균주 개발의 필요성을 더욱 뒷받침하게 해준다. 숙신산의 세계시장은 현재 약 20조 원 규모로 형성되어 있고, 지금까지 생산 플랫폼의 대부분은 화학합성을 통한 생산이었지만 생물 공정을 통한 숙신산 생산의 비중이 상당히 높아지고 있기에 향후 전망도 높은 편이다.
따라서 본 발명은 종래의 균주보다 더 높은 숙신산 생산성 및 안정한 생산성을 가진 균주를 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.
또한, 본 발명은 숙신산 고생산성 변이 균주를 이용하여 고효율로 숙신산을 생산하는 방법을 제공하는 것을 다른 기술적 과제로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 숙신산의 생산성 및 수율이 우수하고 안정성이 뛰어난 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) KCTC 11882BP를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 i) 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) KCTC 11882BP를 배양하는 단계; 및 ii) 상기 배양액으로부터 숙신산을 수득하는 단계를 포함하는 숙신산의 생산 방법을 제공한다.
이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면 숙신산 생산성 및 안정성이 우수한 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) 변이 균주가 제공된다.
본 발명에서는 숙신산 생산균주로서 미국의 ATCC(American Type Culture Collection)에서 얻은 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) 야생균주(ATCC 55618)를 친균주로 하여 균체를 UV 돌연변이 및 연속 희석(serial dilution)을 통한 단일 콜로니 획득법으로 얻어낸 균주를 배양하여 숙신산 생산성 및 수율을 확인함으로써 숙신산 고생산성 균주를 선별하였으며, 이를 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) sm28로 명명하였다. 상기 균주는 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 2011년 2월 28일자로 수탁번호 KCTC 11882BP를 부여받았다.
본 발명의 다른 측면에 따르면 i) 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) KCTC 11882BP를 배양하는 단계; 및 ii) 상기 배양액으로부터 숙신산을 수득하는 단계를 포함하는 숙신산의 생산 방법이 제공된다.
본 발명에서 배양 배지나 배양 방법은 그 필요에 따라 적절히 선택될 수 있다. 본 발명에서 숙신산 생산용 배양 배지는 바람직하게는 포도당, 효모 추출물, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 및 탄산마그네슘(MgCO3)을 포함한다. 본 발명에서 배양 배지는 바람직하게는 포도당 50 내지 70 g/ℓ, 효모 추출물 15 내지 30 g/ℓ, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 7 내지 15 g/ℓ 및 탄산마그네슘(MgCO3) 50 내지 70 g/ℓ; 더 바람직하게는 포도당 55 내지 65 g/ℓ, 효모 추출물 20 내지 28 g/ℓ, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 8 내지 12 g/ℓ 및 탄산마그네슘(MgCO3) 55 내지 65 g/ℓ; 가장 바람직하게는 포도당 60 g/ℓ, 효모 추출물 25 g/ℓ, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 10 g/ℓ 및 탄산마그네슘(MgCO3) 60 g/ℓ를 포함한다. 본 발명에서 숙신산 생산용 배양 배지의 pH는 바람직하게는 7 내지 7.3, 가장 바람직하게는 7이다. 본 발명에서 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) KCTC 11882BP 배양시, 예를 들면 온도는 35 내지 40℃, 더 바람직하게는 37 내지 38℃의 조건으로 배양하고, 진탕배양시 교반속도는 180 내지 260 rpm, 더 바람직하게는 200 내지 240 rpm으로 할 수 있다.
본 발명에서 배양액으로부터 숙신산을 수득하는 것은 당 분야에 알려진 통상의 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면 황산이나 염산 등의 강산의 첨가로 결정화를 유도하는 방법 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 숙신산 고생산성 변이 균주인 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) sm28은 친균주에 비해 숙신산 생산성 수율이 약 2배 정도 높을 뿐만 아니라 안정성도 뛰어나다. 따라서 본 발명에 따른 숙신산 고생산성 변이 균주를 이용한 산업적 규모의 액상 배양을 통하여 석유화학 유도체 및 의약, 식품산업 등에 다양하게 이용되는 숙신산의 대량공급이 가능하다.
도 1은 친균주와 UV 돌연변이된 균주의 선별과정시 배양 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 연속 희석 방법을 통한 단일 콜로니 사진이다.
도 3a는 친균주와 변이 균주 sm28의 생산성 분포도를 나타내고(wild: 친균주, mutant: 변이 균주), 도 3b는 친균주와 변이 균주 sm28의 생산된 평균 숙신산 양을 나타낸 것이며, 도 3c는 실험군의 숙신산 생산량에 따른 분포도를 나타낸 히스토그램이다.
도 4a는 population stability test에서 숙신산 생산성 분포도를 나타내고, 도 4b는 실험군의 숙신산 생산량에 따른 분포도를 나타낸 히스토그램이다.
도 2는 연속 희석 방법을 통한 단일 콜로니 사진이다.
도 3a는 친균주와 변이 균주 sm28의 생산성 분포도를 나타내고(wild: 친균주, mutant: 변이 균주), 도 3b는 친균주와 변이 균주 sm28의 생산된 평균 숙신산 양을 나타낸 것이며, 도 3c는 실험군의 숙신산 생산량에 따른 분포도를 나타낸 히스토그램이다.
도 4a는 population stability test에서 숙신산 생산성 분포도를 나타내고, 도 4b는 실험군의 숙신산 생산량에 따른 분포도를 나타낸 히스토그램이다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 다만 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시되는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실험방법
(1) 균주 및 보관
친균주로는 미국의 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입한 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)(ATCC 55618)를 사용하였다. 균주보관은 액상배양을 통해 얻은 균체를 4℃에 보관하거나 20% 글리세롤 stock을 만들어 -80℃에 보관하였고, 필요시 마다 보관된 stock을 꺼내어 고체 계대배양 배지에 접종 후 배양하여 사용하였다.
(2) 배지 및 배양 조건
고체배양은 TSA(tryptic soy agar) 배지(pancreatic digest of casein 15 g, papaic digest of soybean 5 g, NaCl 5 g, 한천(agar) 15 g, 증류수 1ℓ)를 이용하였다. 생산배양에 앞서 균체를 늘리기 위한 성장배양은 TSB(tryptic soy broth) 배지(pancreatic digest of casein 17 g, papaic digest of soybean 3 g, 덱스트로스 2.5 g, NaCl 5 g, K2HPO4(potassium phosphate dibasic) 2.5 g, 증류수 1ℓ)를 사용하였다. 숙신산 생산을 위하여는 액상배지(포도당 60 g, 효모 추출물 25 g, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 10 g, 탄산마그네슘(MgCO3) 60 g, 증류수 1ℓ, pH 7.0)를 사용하였다.
배양은 24 well microplate에서 1.25 ㎖의 배양 부피로 배양되거나 100 ㎖ serum bottle에서 30 ㎖의 배양부피로 진행되었다. 균체의 액상배양은 진탕 배양기에서 38℃, 200 rpm으로 1 내지 2일간 배양하거나, 9시간 배양한 후 다른 플라스크로 계대 배양하였다.
(3)
균체농도
측정
균체농도 측정은 균체 건조중량(D.C.W)을 이용하였다. 배양액으로부터 균일하게 균체를 회수한 다음 1 ㎖의 세포를 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 상등액을 회수하여 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 옮겨 남아 있는 당의 측정에 사용하였고, 나머지 상등액을 제거한 후 3번의 세척과정을 통해서 남아 있는 당, 불용성 물질이나 염류들을 제거하였다. 이후 무게측정용 접시에 담아 90℃에서 12시간 건조하여 건조균체농도의 무게에 변화가 없는 것을 확인한 후 건조중량을 측정하여 1ℓ당 세포농도로 환산하여 나타내었다.
(4) 숙신산의 정량분석
악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)의 배양액에서 숙신산의 정량분석을 위해 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 시료를 채취하고 연속 희석(serial dilution)을 통하여 희석한 다음 0.45 ㎛ 여과지를 이용하여 2번의 여과 과정을 수행한 후, HPLC를 이용하여 다음의 조건으로 분석하였다.
분석 온도: 25℃
유속: 0.8 ㎖/min
이동상: 0.01N H2SO4
분석시간: 20분
시료 주입양: 20 ㎕
칼럼: Metacarb organic acid column 67H (Varian)
검출기: UV detector
(5) 당 분석
배양액 중의 당분석은 배양액을 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 12,000 rpm에서 10분간 3회 원심분리를 반복 수행하여 상등액만을 취한 다음 0.45 ㎛ HPLC용 여과지를 이용하여 여과하였다. HPLC를 이용한 당분석 조건은 다음과 같았다:
분석 온도: 40℃
유속: 1.2 ㎖/min
이동상: 아세토니트릴, 물 (아세토니트릴:물 = 3:1(부피비))
분석 시간: 15분
시료 주입양: 20 ㎕
칼럼: NH2 column (250 ㎜×46 ㎜, RS tech)
검출기: RI detector
실시예
(1) 자외선(
UV
)를 이용한
친균주의
돌연변이의 유도
상기 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) 친균주로부터 숙신산 함량 및 생산성이 향상된 돌연변이주를 얻기 위해 친균주의 균체를 수거하여 변이처리에 이용하였다. UV처리는 암소에서 254 nm의 UV 램프 2개를 최대 200초 (약 97% 사멸조건) 동안 조사하여 0.1 ㎖씩 한천 플레이트에 도말하였다. 생존한 콜로니를 계수하여 UV를 처리하지 않은 대조군에 대한 백분율을 구하여 치사율이 약 90% 정도 되는 UV 처리시간을 변이조건으로 이용하였다. 본 결과를 바탕으로 UV의 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) 친균주에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration: MIC)인 40초에서 UV 돌연변이 실험을 수행하였다. UV 돌연변이를 수행한 균체는 가시광선에 의해 UV 돌연변이가 무력화될 수 있는 광회복(photoreactivation) 현상을 막기 위해 약 1일간 밀봉하여 배양하였다.
(2) 단일
콜로니
획득을 위한 연속 희석
연속 희석(serial dilution) 방법을 통하여 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)의 단일 콜로니를 회수 하였다. 여러 가지 다양한 희석 배수의 검증을 통하여 1개의 평판접시(plate dish)에 100개 이하의 단일 콜로니가 재생되는 조건을 확인하였으며, 약 10-6으로 희석하여 접종하였을 때 1개의 모균으로부터 생장된 단일 콜로니를 획득할 수 있었다. 실험 결과는 표 1에 나타내었다. 우선 친균주를 한천배지에 1일간 도말하여 콜로니를 획득한 후 액상 성장 배양 단계를 거쳐서 배양액 내의 세포수를 포화 상태로 만들었다. 이는 실험 수행 시 stock 보관된 균수가 사용 시마다 다를 수 있으므로 미리 활성화(activation)를 시키는 단계와 포화(saturation)시키는 단계를 통하여 오차범위가 최소화되는 효과를 보기 위해서였다. 얻어진 포화상태의 균을 준비된 멸균수 또는 20% 글리세롤을 이용하여 연속 희석을 조심스럽게 수행하였다. 얻어진 희석배양액 5 ㎖을 돌연변이 처리한 다음 0.1 ㎖씩 한천배지에 도말하여 재배양 하였다.
(3) 숙신산 고생산성 균주의 선별
선별 과정은 여러 번의 대량 균주의 선별과정을 통하여 선별되었으며 하나의 친균주에서 유래된 균주들임에도 불구하고 UV 돌연변이에 의해 매우 다양한 성격의 변이주가 생성된 것을 알 수 있었다. 얻어진 변이주들의 배양 결과를 그래프로 도 1에 나타내었다. 28번 균주의 경우 52 g/ℓ의 숙신산 생산성을 보여 이를 고생산성 숙신산 생산 균주로 선별할 수 있었고 ‘sm28’로 명명하였다.
친균주가 약 25 내지 30 g/ℓ의 숙신산 생산성을 보이는 반면, 52 g/ℓ의 생산성을 보인 sm28 균주는 포도당 60g/ℓ에서 얻어낼 수 있는 이론적 숙신산 수율인 78 g/ℓ에 70% 가까이 근접하였다는 것은 주목할 만하였다.
친균주와 변이 균주 sm28을 숙신산 생산용 액상배지(포도당 60 g, 효모 추출물 25 g, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 10 g, 탄산마그네슘(MgCO3) 60 g, 증류수 1ℓ, pH 7.0)에서 38℃, 200 rpm으로 2일간 배양 후 생산성 및 수율을 비교한 결과를 다음의 표 2에 나타내었다.
상기 표 2에서 볼 수 있듯이, 친균주에 비해 변이 균주 sm28의 숙신산 생산성은 2.08배, 수율은 2.09배 향상된 것을 확인 할 수 있었다. 친균주는 포도당에 대한 수율이 변이 균주보다 낮아서 그에 해당하는 만큼 다른 부산물이 발생하거나 미생물의 기초대사 유지에 사용되었지만 변이 균주 sm28은 거의 100%에 가깝게 숙신산을 생산해 내는 것을 확인하였다.
얻어진 균주의 안정성을 테스트하기 위하여 얻어진 균주를 무작위로 생산성 테스트를 하여 그 생산성 차이가 얼마나 나는지를 확인하는 실험과 얻어진 균주를 고체배양에서 콜로니(colony)를 확보한 후 여러 개의 성장 배양을 실시한 다음 배양된 종균을 합쳐 생산배양을 실시하여 생산성이 얼마나 같은 수준으로 유지되는지 알아보는 실험을 수행하였다.
먼저, 얻어진 균주를 무작위로 생산성 테스트를 하여 그 결과를 도 3a 내지 도 3c에 나타내었다. 도 3a는 친균주와 변이 균주 sm28의 생산성 분포도를 나타내고, 도 3b는 친균주와 변이 균주 sm28의 생산된 평균 숙신산 양을 나타낸 것이다. 도 3c는 테스트해 본 실험군들을 히스토그램으로 나타낸 결과이다. 안정성 테스트에서 변이 균주 sm28은 친균주보다 높은 생산성과 안정적인 생산성을 갖는 것이 확인되었다.
종균을 합친 후 여러 번의 생산배양을 실시하는 population stability test 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다. 도 4a는 여러 실험군에서의 숙신산 생산성 분포도를 나타내고, 도 4b는 여러 실험군의 결과를 히스토그램으로 나타낸 결과이다. Population stability test에서도 변이 균주 sm28이 친균주보다 높고 안정적인 생산성을 유지하여 산업균주로 사용될 수 있음을 확인하였다.
Claims (4)
- 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) KCTC 11882BP; 및
포도당 50 내지 70 g/l, 효모 추출물 15 내지 30 g/l, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 7 내지 15 g/l 및 탄산마그네슘(MgCO3) 50 내지 70 g/l를 포함하는 액체 배지를 포함하는, 숙신산 생산용 조성물. - i) 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) KCTC 11882BP를 포도당 50 내지 70 g/l, 효모 추출물 15 내지 30 g/l, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 7 내지 15 g/l 및 탄산마그네슘(MgCO3) 50 내지 70 g/l를 포함하는 액체 배지에서 배양하는 단계; 및
ii) 상기 i) 단계에서 수득한 배양액으로부터 숙신산을 수득하는 단계를 포함하는, 숙신산의 생산 방법. - 삭제
- 삭제
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