CN102660482B - 一种北京棒杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，公开了一种北京棒杆菌，其保藏编号为CGMCC No.5923。本发明所述保藏编号为CGMCC No.5923的北京棒杆菌MHZ-0111以野生型北京棒杆菌AS 1.299为出发菌株，经紫外照射后通过含有新霉素培养基筛选得到，其能够大幅降低发酵过程中乳酸的产量，特别是L-谷氨酸发酵中，从而改善乳酸抑制的问题，利于最终代谢产物的生产。因此，本发明所述保藏编号为CGMCC No.5923的北京棒杆菌能够广泛应用于发酵中来降低乳酸的生成。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体的说是涉及一种北京棒杆菌及其应用。
背景技术
微生物发酵，即是指利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。微生物发酵分为需氧发酵和厌氧发酵，目前工业上的发酵几乎都是以糖质（主要是葡萄糖和蔗糖）为原料，利用微生物代谢途径来合成对人类有用的产物，在所有的发酵中大部分为需氧发酵。
无论需氧发酵还是厌氧发酵，糖酵解是微生物所共有的代谢途径，微生物都会经历葡萄糖→6-磷酸葡萄糖→3-磷酸甘油醛→丙酮酸的过程，丙酮酸是糖酵解的必然产物，如果进一步发酵，可形成多种产物。例如L-谷氨酸（氨基酸）发酵、2,3-丁二醇发酵以及乳酸链球菌素发酵等，L-谷氨酸发酵中就是由丙酮酸生成乙酰辅酶A，然后和草酰乙酸缩合成柠檬酸，进入三羧酸循环途径生成α-酮戊二酸，进而生成L-谷氨酸；2,3-丁二醇发酵中是由丙酮酸生成3-羟基丁酮，进而生成2,3-丁二醇；而乳酸链球菌素也是在经历糖酵解后由丙酮酸经过多步转化生成。
然而，在一些需氧发酵过程中溶氧受限的情况极易出现，一旦溶氧不足，丙酮酸就会进入乳酸代谢途径，生成副产物-乳酸，而不会转化成乙酰辅酶A等其他物质，乳酸积累并超过一定限度，就会抑制最终产物的生成，影响产物的高效生产，因此能够在需氧发酵过程中降低乳酸产量，有利于最终产物的生成。同时，在一些厌氧发酵过程中可能也需要适当的降低乳酸以达到生产上的某些目的。
因此，在微生物发酵领域，筛选出能够在发酵过程中降低乳酸产量的新型菌株对微生物发酵有着十分重要的意义。但是，现有技术中尚无这类菌株的报道，特别是适用于氨基酸发酵的降乳酸菌株的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种北京棒杆菌及其应用，使得所述北京棒杆菌能够降低发酵过程中乳酸的产量，应用于微生物发酵中。
为实现上述发明目的，本发明以野生型北京棒杆菌AS 1.299（购自于中国科学院微生物研究所）为出发菌株，通过紫外线对其进行物理诱变，然后将经紫外照射后的北京棒杆菌AS 1.299的悬浮菌液涂布在含有新霉素的培养基上，从含有新霉素培养基上筛选出具有新霉素抗性的菌株，命名为菌株MHZ-0111。
本发明将上述筛选出的菌株MHZ-0111按照东秀珠、蔡妙英主编的《常见细菌系统鉴定手册》的方法对其进行生理生化特性检测，检测结果与野生型北京棒杆菌一致。此外，经16S DNA检测分析，菌株MHZ-0111与野生型北京棒杆菌同源性高达99%，结合生理生化特征，鉴定其为北京棒杆菌。
本发明所述北京棒杆菌MHZ-0111已于2012年3月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.5923。
本发明所述北京棒杆菌MHZ-0111与野生型北京棒杆菌AS 1.299的L-谷氨酸发酵对比试验显示，其能够显著降低乳酸产量，本发明所述北京棒杆菌MHZ-0111发酵得到的发酵液中乳酸含量为4g/L，而野生型北京棒杆菌AS1.299发酵得到的发酵液中乳酸含量为15g/L，乳酸产量降低了73.3%。
新霉素是一种氨基糖苷类抗生素，通过结合于细胞内的核糖体上干扰细菌蛋白质合成，使之合成异常的蛋白质，并使细菌细胞膜通透性增加，导致细胞内重要生理物质外漏而呈现杀菌作用，对静止期细菌杀菌作用较强，为静止期杀菌类抗生素。在野生菌株获得新霉素抗性后，可能由于本发明所述北京棒杆菌MHZ-0111合成异常的蛋白质抵抗新霉素，这些异常的蛋白质导致代谢合成酶系改变了某些产物的反馈抑制作用，或者一定程度的抑制了乳酸脱氢酶的活性，从而导致突变株的乳酸产量大幅下降。
本领域技术人员公知，无论是厌氧发酵专门生产乳酸还是需氧发酵中生产其他产物时带出的副产物乳酸，均需要微生物经过糖酵解代谢途径，由丙酮酸经乳酸脱氢酶作用生成，上述试验结果表明，本发明所述北京棒杆菌具有降低发酵过程中乳酸产量的活性，特别是需氧发酵中的L-谷氨酸发酵。
因此，本发明所述北京棒杆菌MHZ-0111能够应用于发酵中来降低乳酸产量。其中所述发酵优选为需氧发酵，所述需氧发酵优选为氨基酸发酵，所述氨基酸优选为L-谷氨酸。
此外，本发明还提供一种L-谷氨酸发酵方法，将保藏编号为CGMCCNo.5923的北京棒杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵，发酵期间维持pH值为6.8-7.4。
其中，所述种子培养基为本领域所公知，本发明优选由25g/L葡萄糖、5g/L尿素、30g/L玉米浆、1g/L KH2PO4、0.4g/L MgSO4·7H2O、2mg/L硫酸亚铁、2mg/L硫酸锰组成，pH值为6.8-7.4。
所述发酵培养基为本领域所公知，本发明优选由80g/L葡萄糖、20g/L尿素、8g/L玉米浆、1.2g/L KH2PO4、0.7g/L MgSO4·7H2O、2mg/L硫酸亚铁、2mg/L硫酸锰、200ug/L硫胺素、2mL/L 1%苯酚红组成，pH值为6.8-7.4。
本发明所述扩繁后的培养物与发酵培养基的体积比优选为1∶10。
由以上技术方案可知，本发明所述保藏编号为CGMCC No.5923的北京棒杆菌MHZ-0111以野生型北京棒杆菌AS 1.299为出发菌株，经紫外照射后通过含有新霉素培养基筛选得到，其能够大幅降低发酵过程中乳酸的产量，特别是L-谷氨酸发酵中，从而改善乳酸抑制的问题，利于最终代谢产物的生产。因此，本发明所述保藏编号为CGMCC No.5923的北京棒杆菌能够广泛应用于发酵中来降低乳酸的生成。
生物保藏信息说明
分类命名：北京棒杆菌，Corynebacterium pekinense.于2012年3月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.5923。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种北京棒杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的菌株已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：本发明所述北京棒杆菌MHZ-0111的筛选
将出发菌株-野生型北京棒杆菌AS 1.299接种在液体培养基中30℃培养11小时获得处于对数生长期的菌悬液，然后将该菌悬液浓度调整至每毫升含有约108个细胞后置于紫外线下照射35秒，最后将经过紫外线照射的菌悬液涂布在含有0.5mg/L新霉素的完全培养基平板上，30℃继续培养2天，根据菌落形态、颜色等特征挑取单菌落，命名为MHZ-0111。
其中，液体培养基配方如下：葡萄糖25g/L、尿素5g/L、玉米浆30g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、硫酸亚铁2mg/L、硫酸锰2mg/L，用蒸馏水溶解并调节pH至6.8-7.4后定容至1000ml。
完全培养基组成如下：新霉素0.5mg/L、牛肉膏10g、蛋白胨10g、NaCl5g、葡萄糖5g、琼脂18g，用蒸馏水溶解并调节pH至6.8-7.4后定容至1000ml。
将上述筛选出的菌株MHZ-0111按照东秀珠、蔡妙英主编的《常见细菌系统鉴定手册》的方法对其进行生理生化特性检测，检测结果与野生型北京棒杆菌一致。此外，经16S DNA检测分析，菌株MHZ-0111与野生型北京棒杆菌同源性高达99%，结合生理生化特征，鉴定其为北京棒杆菌。
实施例2：L-谷氨酸发酵乳酸产量对比试验
1、发酵方法
将本发明所述北京棒杆菌MHZ-0111接种在以下所述的种子培养基中扩繁，于30℃振荡培养11小时，将所得培养物接种到以下所述的发酵培养基中，培养物与发酵培养基的体积比为1∶10（本领域技术人员可根据实际生产中的发酵培养基的量适当调节，本比例只是优选比例），30℃振荡培养至不再产生L-谷氨酸为止（一般为40小时左右）。在发酵培养基中振荡培养时，根据苯酚红作为指示剂指示的培养基pH变化情况加入适量尿素，维持发酵培养基中的pH值介于6.8-7.4之间。
种子培养基：
25g/L葡萄糖、5g/L尿素、30g/L玉米浆、1g/L KH2PO4、0.4g/LMgSO4·7H2O、2mg/L硫酸亚铁、2mg/L硫酸锰，用蒸馏水溶解并调节pH至6.8-7.4。
发酵培养基：80g/L葡萄糖、20g/L尿素、8g/L玉米浆、1.2g/L KH2PO4、0.7g/L MgSO4·7H2O、2mg/L硫酸亚铁、2mg/L硫酸锰、200ug/L硫胺素、2mL/L 1%苯酚红，用蒸馏水溶解并调节pH至6.8-7.4。
2、L-谷氨酸发酵对比试验
将本发明所述北京棒杆菌MHZ-0111和野生型北京棒杆菌AS 1.299按照上述生产方法同时进行发酵，两种菌株的发酵环境、接种量均相同，停止发酵后通过生物传感仪测定两种菌株所合成的乳酸含量。
结果显示，野生型北京棒杆菌AS 1.299发酵合成的乳酸含量为15g/L，本发明所述北京棒杆菌MHZ-0111发酵合成的乳酸含量仅为4g/L，突变菌株乳酸产量较出发菌株AS 1.299降低了73.3%。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种北京棒杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.5923。
2.保藏编号为CGMCC No.5923的北京棒杆菌在L-谷氨酸发酵中降低乳酸产量的应用。
3.一种L-谷氨酸发酵方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No.5923的北京棒杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵，发酵期间维持pH值为6.8-7.4。
4.根据权利要求3所述发酵方法，其特征在于，所述种子培养基由25g/L葡萄糖、5g/L尿素、30g/L玉米浆、1g/L KH2PO4、0.4g/L MgSO4·7H2O、2mg/L硫酸亚铁、2mg/L硫酸锰组成，pH值为6.8-7.4。
5.根据权利要求3所述发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基由80g/L葡萄糖、20g/L尿素、8g/L玉米浆、1.2g/L KH2PO4、0.7g/L MgSO4·7H2O、2mg/L硫酸亚铁、2mg/L硫酸锰、200ug/L硫胺素、2mL/L1%苯酚红组成，pH值为6.8-7.4。
6.根据权利要求3所述发酵方法，其特征在于，所述扩繁后的培养物与发酵培养基的体积比为1:10。
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