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CN115768861A - 包含去除细胞培养袋内的空气的细胞培养系统 - Google Patents

包含去除细胞培养袋内的空气的细胞培养系统 Download PDF

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CN115768861A
CN115768861A CN202180036895.2A CN202180036895A CN115768861A CN 115768861 A CN115768861 A CN 115768861A CN 202180036895 A CN202180036895 A CN 202180036895A CN 115768861 A CN115768861 A CN 115768861A
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cells
cell
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末永亮
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Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Original Assignee
Toyo Seikan Group Holdings Ltd
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Abstract

本发明的目的在于提供一种能够简便且高效地去除在投入培养基时进入细胞培养袋内的空气的新方法，并且提供了一种使用细胞培养袋的细胞或细胞聚集体的培养系统，所述培养系统包括用于对加入了培养基的具有包括多个凹部的下表面的细胞培养袋在加入细胞之前施加压力以使所述细胞培养袋内的空气通过所述细胞培养袋去除的机构。

Description

包含去除细胞培养袋内的空气的细胞培养系统
技术领域
本发明涉及用于在细胞培养袋内制造培养细胞或细胞聚集体并去除包括多个凹部的该细胞培养袋内的空气的培养系统。
背景技术
近年来，在基因治疗和再生医疗等领域中，正在进行在人工环境下大量培养目标细胞。例如，有使用形成有一个或多个凹部的细胞培养板(也称为“孔板”)，将细胞和培养基导入各个凹部内进行培养的方法。但是，在该方法中，由于凹部向大气开放，因此有可能混入异物。
为了得到更大量的细胞，需要大型化容器或缩小凹部来增加数量等，在1个孔内配置有多个小凹部的“微模式培养板(micropatterned plate)”被开发并利用。但是，微模式培养板由于凹部较小，在加入培养基时空气往往会堵塞凹部。在这种情况下，为了去除空气，利用移液管等将移取的水流直接吹到堵塞凹部的空气中进行剥离，但有时培养基会变得满是泡沫，难以看到细胞。另外，难以完全去除堵塞凹部的空气，尤其是孔越小、配置的凹部的数量越多(微模式培养板越大型化)，就越难以去除空气，并且对操作人员来说成为了很大的负担。
对此，开发并报告了使用气体透过性袋状容器(也称为“细胞培养袋”)封闭地进行大量培养的方法(例如，专利文献1-专利文献4等)。根据该方法，与使用前述孔板的情况相比，具有改善密闭性、能够降低异物混入风险的优点。
另一方面，即使在使用了这样的细胞培养袋的封闭培养中，也有在投入培养基时空气一起进入从而妨碍细胞的培养和观察的情况。特别是，在包括多个微小凹部的细胞培养袋(例如，专利文献3、专利文献4)的情况下，有时气泡附着在凹部内部而堵塞凹部，这在进行细胞培养方面成为了很大的妨碍。
以往，细胞培养袋内的空气的去除是通过对细胞培养袋施加物理刺激，使附着在袋内壁上的气泡浮在培养基中，汇集至一处后，用注射器等对其进行吸引来进行的。然而，这项操作不仅费事，而且难以完全去除空气。特别是，细胞培养袋越大型化，操作就变得越困难。
因此，在该领域中，迫切需要能够简便且高效地去除在投入培养基时进入细胞培养袋内的空气并进行细胞培养的新手段。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开第2012-239401号公报
专利文献2：日本特开第2016-86774号公报
专利文件3：WO 2016/208526
专利文献4：日本特开第2019-118319号公报
发明内容
发明要解决的问题
在专利文献1中，公开了在不以通常加湿状态而以干燥状态使用孵化器时，通过使封入有细胞和培养基的细胞培养袋内的空气成分分压与培养孵化器内的干燥空气的气压相同或比其大来防止空气从袋的外侧向内侧的移动，能够防止在细胞培养袋内产生气泡，并且进一步叙述了在即便是这样还依然产生气泡的情况下，通过进一步对细胞培养袋加压，能够消除产生的气泡。在专利文献1中作为对象的空气不是在投入培养基时一起进入细胞培养袋内的空气。另外，在专利文献1中，细胞培养袋被夹在加压板与装载台之间并加压，此时袋表面与加压板及装载台的表面紧密接触，袋内产生的气泡无法从与加压板及装载台的表面紧密接触的位置逃至袋外、溶解在培养基中而消失。因此，有时在释放对细胞培养袋的压力时，会再次成为气泡而出现。
因此，上述现有技术均未公开、暗示完全去除在投入培养基时进入细胞培养袋内的空气。因此，本发明的目的在于提供一种能够简便且高效地去除在投入培养基时进入细胞培养袋内的空气的新手段。
用于解决问题的手段
为了解决上述问题，本发明人等进行了深入研究，结果发现，在向包括多个凹部的细胞培养袋中加入培养基后，通过对该袋施加压力，能够使空气通过该袋而从该袋内去除。本发明基于该新认知，包含以下发明。
[1]一种使用细胞培养袋的细胞或细胞聚集体的培养系统，
所述培养系统包括用于对加入了培养基的具有包括多个凹部的下表面的细胞培养袋在加入细胞之前施加压力以使所述细胞培养袋内的空气通过所述细胞培养袋去除的机构。
[2]根据[1]所述的培养系统，其中，对所述细胞培养袋的压力的施加是通过从所述细胞培养袋的上方施加压力来进行的。
[3]根据[1]或[2]所述的培养系统，进一步包括用于在加入了细胞的所述细胞培养袋被搅拌之后进行培养的机构。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的培养系统，进一步包括用于在培养结束后对形成的培养细胞或细胞聚集体进行回收的机构。
[5]根据[4]所述的培养系统，包括用于在培养结束后使所述细胞培养袋上下翻转来对形成的培养细胞或细胞聚集体进行回收的机构。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的培养系统，其中，所述细胞培养袋的下表面包括10个～100万个凹部。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的培养系统，其中，所述细胞培养袋中的所述凹部为球冠状。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的培养系统，其中，所述细胞培养袋中所述凹部的直径与深度之比为1:0.25～1。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的培养系统，其中，所述凹部的直径为300μm～1500μm，深度为100μm～1000μm。
[10]一种从包括多个凹部的细胞培养袋中去除空气的方法，
所述方法包括将培养基加入所述细胞培养袋，然后施加压力以使所述细胞培养袋内的空气通过所述细胞培养袋去除的工序。
[11]根据[10]所述的方法，其中，所述细胞培养袋的下表面包括10个～100万个凹部。
[12]根据[10]或[11]所述的方法，其中，所述细胞培养袋中的所述凹部为球冠状。
[13]根据[10]至[12]中任一项所述方法，其中，所述细胞培养袋中所述凹部的深度与直径之比为1:1.5～2.5。
[14]根据[10]至[13]中任一项所述方法，其中，所述凹部的直径与深度之比为1:0.25～1。
[15]根据[10]至[14]中任一项所述方法，其中，所述凹部的直径为300μm～1500μm，深度为100μm～1000μm。
[16]根据[10]至[15]中任一项所述方法，其中，对所述细胞培养袋的压力的施加是通过从所述细胞培养袋的上方施加压力来进行的。
本说明书包含作为本申请优先权的基础的日本专利申请第2020-93446号的说明书和/或附图中所记载的内容。
本说明书中所引用的所有刊物、专利以及专利申请直接作为参考并入本说明书中。
发明的效果
根据本发明，能够简便且高效地去除在投入培养基时进入包括多个凹部的细胞培养袋内的空气。
附图说明
图1是示出了在本发明中可利用的包括多个凹部的细胞培养袋的一个例子的示意图，其中，(a)是立体图，(b)是透视立体图。
图2是示出了在本发明中可利用的细胞培养袋的另一个例子的示意图，其中，(a)是立体图，(b)是透视立体图。
图3(1)是示出了用于载置在本发明中可利用的细胞培养袋的载置台的一个例子的立体图；图3(2)是示出了通过将细胞培养袋载置在该载置台上夹在该载置台与按压部件之间并施加压力从而在细胞培养袋的下表面形成凹部的示意图。
图4是在本发明中可利用的按压装置的剖面示意图，其中，(a)是示出了包括形成有容纳细胞培养袋的凹部的开口部的载置面的例子；(b)是示出了载置面为平面的例子。
图5是在本发明中可利用的按压装置的另一个例子的立体图。
图6是示出了关于凹部内有无气泡，施加压力的大小与保存时间的关系的(A)照片图及(B)曲线图。
图7-1是示出了关于对施加了压力的细胞培养袋凹部内有无气泡进行经时观察的结果的照片图。
图7-2是示出了关于对施加了压力的、在下表面具有气体非透过性膜的细胞培养袋凹部内有无气泡进行经时观察的结果的照片图。
图8是示出了关于对施加了压力的大型细胞培养袋凹部内有无气泡进行经时观察的结果的照片图。
具体实施方式
1.细胞培养袋
本发明中“细胞培养袋”意指使用气体透过性柔性膜材料形成袋状的培养容器。细胞培养袋优选具有至少包括具备凹部的下表面的形状，进一步具有包括与下表面相对的上表面的形状。
“气体透过性”意指使气体通过柔性膜材料的性质，本发明中的细胞培养袋中优选在JIS K 7126的气体透过度试验方法中在试验温度37℃下测定的氧的透过度为5000mL/(m2 day atm)及以上的柔性膜材料。
作为可用于细胞培养袋的柔性膜材料，例如可以举出聚乙烯、聚丙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酯、有机硅系弹性体、聚苯乙烯系弹性体、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物(FEP)等树脂膜，但不限于这些。它们可以以单层膜的形式使用，也可以层叠同种或异种材料以多层(例如，两层或三层)膜的形式使用。在将2片膜重叠热封形成细胞培养袋的情况下，考虑到热熔融性，优选具有作为密封剂层发挥功能的层的材料。例如，柔性膜材料可以具有从细胞培养袋内侧起由内层、基层、外层这3层组成的结构。基层和内层优选使用具备高气体透过性、热封性和透明性的材料构成。另外，内层除了上述特性之外，优选由具备低细胞毒性的材料构成。作为这样材料，例如可以适当地使用线性低密度聚乙烯(LLDPE，Linear Low Density Polyethylene)、极低密度聚乙烯(VLDPE，Very Low DensityPolyethylene/ULDPE，Ultra Low Density Polyethylene)、低密度聚乙烯(LDPE，LowDensity Polyethylene)或它们的混合物等聚乙烯系树脂。外层为密度为0.886g/cm3～0.93g/cm3的聚乙烯系树脂较为适当。另外，外层也可以适当省略。此外，为了使细胞容易聚集在凹部的底部中央，成为细胞培养袋的内表面的表面(至少下表面的表面)，优选实施细胞的低粘附处理。作为细胞的低粘附处理，例如可以举出利用磷脂聚合物、聚乙烯醇衍生物、表面活性剂、白蛋白等进行涂覆。膜的厚度为50μm～300μm、优选80μm～160μm左右，细胞培养袋的上表面和下表面的厚度可以相同，也可以不同。
细胞培养袋的下表面所包括的凹部的数量可以根据细胞培养袋的尺寸、期望的细胞聚集体的数量来决定，例如可以从10个～100万个的范围内适当选择。
凹部的形状没有特别限定，优选在凹部的底部容易聚集细胞的形状。例如，作为凹部的形状，可以举出球冠状、凹陷成研钵状(圆锥状)的形状等。另外，为了使细胞容易聚集在凹部的底部，凹部的直径与深度之比优选设为1:0.25～1、更优选为1:0.3～0.6。例如，在一个实施方式中，凹部的开口直径(直径)可设为300μm～1500μm、深度可设为100μm～1000μm。
凹部的排列作为蜂窝状，优选使凹部在下表面所占的占有面积尽可能大的蜂窝状，但也可以根据需要排列成格子状。相邻的凹部4的中心间隔(间距)没有特别限定，例如优选在凹部的轮廓彼此不重叠的范围内尽可能小，例如可以将轮廓和轮廓的间隙设定为大于0mm小于等于1mm、优选为0.05mm～0.1mm。
细胞培养袋的厚度没有特别限定，只要具有能够使加入培养基时的液深(与培养液接触的下表面膜平坦面(除去凹部的部位)的内表面到上表面膜内表面的距离)为1mm～20mm、优选为2mm～8mm左右的厚度即可。
细胞培养袋中，可以包括培养基或细胞等能够流通的管状部件(以下，有时将本部件称为“端口”)。端口可以由例如聚乙烯、聚丙烯、氯乙烯、聚乙烯系弹性体、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物(FEP)等热塑性树脂成形。
本发明中的“细胞培养袋”的形式可以参照以往公知的使用气体透过性柔性膜材料形成的袋状培养容器(专利第5344094号公报、WO 2016/208526号公报、日本特开第2016-86774号公报、日本特开第2019-118319号公报等)的形式。
图1中示出了本发明中的细胞培养袋的一个例子。细胞培养袋1具有包括袋主体2和端口3的袋状结构，该袋主体通过将构成上表面的上表面膜21与构成下表面的下表面膜22重叠并对周边部20进行密封而形成；在下表面膜22上，排列成蜂窝状的多个凹部4通过热压成形等成形技术形成并保持。构成上表面的上表面膜21能够通过形成为具有覆盖全部多个凹部4的上方的基本平坦的顶面部分21a和顶面部分21a周围的倾斜部分21b的鼓出形状，与下表面膜22密封而形成具有厚度的细胞培养袋，在将该袋充满培养基时或在对该袋施加压力时，能够抑制下表面膜22的周围抬起的变形。
图2中示出了本发明中的细胞培养袋的另一个例子。在细胞培养袋1’中，凹部不直接形成在下表面膜22’上，而是将细胞培养袋1’载置在载置台上后模仿与下表面膜22’相接的载置台的载置面的形状而形成。
细胞培养袋1’的载置台是具有用于载置细胞培养袋的平坦的载置面和用于在细胞培养袋的下表面形成凹部的凹陷的板状部件。载置台可以由金属或硬质树脂等形成，载置面的凹陷只要是被按压的细胞培养袋的下表面能够形成上述凹部的形状即可，也可以在载置面上设置对应的凹部和/或凸部而形成凹陷，或者也可以将适当配置在载置面上的贯通孔用作凹陷。
图3(1)中示出了在细胞培养袋1’上形成凹部的载置台5’的一个例子。载置台5’包括用于载置细胞培养袋1’的平坦的载置面5a’以及以贯通孔的形式用于在细胞培养袋1’的下表面形成凹部的凹陷5b’。如图3(2)所示，在将填充有细胞和规定培养液的细胞培养袋1’载置在载置台5’上后，通过用后述按压部件6和载置台5’夹紧该细胞培养袋1’并施加压力，下表面膜22’被按压在载置面5a上，一部分从凹陷5b’的部分以与载置面5a非接触的方式突出，从而形成凹部4’。
2.按压装置
本发明中可以利用具有能够对填充有规定培养基的细胞培养袋施加压力的结构的按压装置。按压装置至少包括载置细胞培养袋的载置台和按压细胞培养袋的上表面的按压部件、支撑它们中的一者或两者上下运动的支撑机构以及将它们中的一者或两者向细胞培养袋按压的压力施加单元，进一步包括经由细胞培养袋的端口进行细胞或培养基的注入、排出的送液单元。在通过按压部件的自重对细胞培养袋施加压力的情况下，也可以省略压力施加单元。作为送液单元，可以举出蠕动泵等泵或注射器等，但不限于这些。按压装置可以可携带地移动到孵化器内利用，或者也可以设置在孵化器内。
本发明中载置台具有其载置面与凹部以低接触或非接触的方式支撑细胞培养袋的形状。由此，与上述专利文献1的细胞培养袋不同，在施加压力时，细胞培养袋的表面不与载置台的表面紧密接触，能够维持气体透过性，能够使空气从袋内向袋外移动。
本发明中“施加压力”意指使填充有规定培养基的细胞培养袋内的内压增大，可以通过将细胞培养袋夹在载置台的上表面(载置面)与按压部件的下表面之间来进行。即，可以利用支撑机构和压力施加单元，通过将按压部件向细胞培养袋下压而从细胞培养袋上方施加压力来进行，和/或利用支撑机构和压力施加单元，通过将载置台向细胞培养袋上推而从细胞培养袋下方施加压力来进行。
图4是示出了在本发明中可利用的按压装置的一个例子的剖面示意图。图4的按压装置100、100”具有将按压部件6从上方下压而对载置在载置台5上的细胞培养袋1施加压力的结构。
按压装置100、100”包括载置细胞培养袋1的载置台5、具有按压上表面膜21的顶面部分21a的底面6a的按压部件6、以及支撑按压部件6的支撑机构7。
另外，在图4中，省略从细胞培养袋1的端口3进行细胞或培养基的注入、排出的送液单元的图示。
载置台5具有水平载置细胞培养袋1的载置面5a。该载置面5a可以为平面(图4(b))，也可以形成有容纳在细胞培养袋1的下表面膜22上形成的多个凹部4的开口部5b(图4(a))。在存在开口部5b的情况下，载置面5a以非接触的方式将下表面膜22支撑在凹部4上。开口部5b的形状并不限定于开口部，例如可以是凹部，也可以为金属网状，另外，不仅是接受各个凹部4的形状，还可以是能够容纳多个凹部4的形状。
按压部件6是具有与细胞培养袋1的顶面部分21a搭配的平面形状的板状部件，具有平坦的底面6a。
支撑机构7由设置在载置面5上的框架71、从按压部件6的上表面的四角向上方延伸并可上下移动地贯通框架71的导销72、以及将按压部件6向下方下压的压力施加单元73构成。压力施加单元73将按压部件6向细胞培养袋1下压，对细胞培养袋1施加压力。施加的压力可以通过压力施加单元73对按压部件6下压的力或下压的高度进行调节来调整。压力施加单元73只要是能够将按压部件6以规定的力下压或下压到规定的高度的结构即可，可以具有由螺钉、弹簧、磁铁或它们的组合组成的结构。
图5是示出了在本发明中可利用的培养装置的另一个例子的立体图。图5的培养装置100’包括具备载置面5a的载置台5以及经由铰链9’与该载置台5连接的上盖8’，上盖8’构成为能够以铰链9’为轴开闭。上盖8’由具有与细胞培养袋1的顶面部分21a搭配的平坦的底面6a的按压部件6、从按压部件6的上表面的四角向上方延伸并可上下移动地贯通上盖8’的导销(未图示)、以及将按压部件6向细胞培养袋1下压的压力施加单元(未图示)构成。
在将细胞培养袋1收容在培养装置100’中时，首先，使上盖8’处于经由铰链9’打开的状态(图5的(a))，然后，在具有容纳多个凹部的开口部(未图示)的载置面5a上载置细胞培养袋1后，如图5的(b)所示关闭上盖8’并通过锁定机构10’维持。对细胞培养袋1的压力的施加可以通过压力施加单元将按压部件6向下方下压直到施加规定的压力来进行。
另外，上述图4和图5均示出了使用了细胞培养袋1的例子，但在使用细胞培养袋1’的情况下，只要利用作为载置台的载置台5’那样包括能够在细胞培养袋1’上形成凹部的载置面5a’的载置台即可，除此之外，可以分别使用具有与上述按压装置同样结构的按压装置。
3.细胞
在本发明中，用于制造细胞聚集体的细胞没有特别限定，例如可以举出多能干细胞或其分化诱导细胞、神经干细胞、肝细胞、角膜干细胞、胰岛细胞、心肌细胞等。
在本发明中，“多能干细胞(pluripotent stem cell)”是指胚胎干细胞(ES细胞)及潜在地具有与之相同的分化多能、即分化为生物体的各种组织(内胚层、中胚层、外胚层全部)的能力的细胞。作为具有与ES细胞同样的分化多能的细胞，可以举出“诱导性多能干细胞”(本说明书中，有时也称为“iPS细胞”)。优选地，在本发明中，多能干细胞是人类多能干细胞。“诱导性多能干细胞”是指通过将Oct3/4、Sox2、Klf4及c－Myc等特定因子(核重编程因子)导入哺乳动物体细胞或未分化干细胞以对其重编程而得到的细胞。另外，上述多能干细胞的“分化诱导细胞”意指通过分化诱导多能干细胞而得到的规定表型或标记的表达而表征的细胞。“标记”意指“标记蛋白”、“标记基因”等通过规定的细胞型特异性表达的细胞抗原或其基因。
在本发明中可利用的细胞可以是从生物体采集的细胞，也可以是培养细胞，还可以是将这些细胞冻融的细胞。细胞使用解离或分散的状态。
4.细胞或细胞聚集体的培养系统以及用于去除填充有培养基的细胞培养袋内的空气的方法
(1)去除细胞培养袋内的空气的机构
本发明的细胞或细胞聚集体的培养系统的特征在于，包括对填充有培养基的细胞培养袋施加压力以去除该袋内的空气、特别是附着在凹部内的气泡的机构，在该机构中实施以下内容。
培养基可以适当选择与使用的细胞对应的适合的培养基来利用。培养基使用蠕动泵等泵或注射器等送液单元从细胞培养袋所包括的端口投入。加入到细胞培养袋的培养基的量可以根据细胞培养袋的尺寸、加入到细胞培养袋的细胞的数量、培养时间段、期望的细胞聚集体的尺寸等因素适当调整，没有特别限定，优选在细胞培养袋中填充培养基时在该袋中不形成气层的最大限度的量。
对细胞培养袋的压力的施加可以使用上述按压装置来进行，可以通过用载置细胞培养袋的载置台和面向细胞培养袋的顶面部分的按压部件夹紧细胞培养袋来进行。
对细胞培养袋施加的压力的大小和施加时间只要能够去除细胞培养袋内的空气、特别是附着在凹部内的气泡即可，可以根据细胞培养袋的大小、凹部的开口部的大小和深度等因素适当调整，没有特别限定，例如，可以在从0.001kgf/cm2～0.2kgf/cm2、优选0.01kgf/cm2～0.1kgf/cm2的范围内选择的压力下处理1小时～3天、优选2小时～1天。在本发明中，细胞培养袋内的空气的去除是在细胞加入细胞培养袋之前实施的。由此，不需要考虑施加压力对细胞的影响，能够应用最适合去除袋内的空气的压力的大小和施加时间。对细胞培养袋的压力的施加可以在用于培养的孵化器内进行，也可以在孵化器之外进行。
根据本发明，通过对细胞培养袋的压力的施加，填充有培养基的细胞培养袋内的空气、特别是附着在凹部内的气泡能够通过构成细胞培养袋的气体透过性柔性膜材料向该袋外移动去除，而不是将空气或气泡溶解在培养基中而消失。因此，即使在之后释放施加的压力的情况下，去除了的空气或气泡也不会再次出现。
(2)培养细胞的机构
本发明的细胞或细胞聚集体的培养系统可以包括在填充了上述培养基的细胞培养袋内的空气被去除的该袋内培养细胞的机构。在该机构中实施以下内容。细胞使用蠕动泵等泵或注射器等送液单元从细胞培养袋所包括的端口投入。投入到细胞培养袋中的细胞的数量可以根据细胞培养袋的尺寸、培养时间段、期望的细胞聚集体的尺寸等因素适当调整，没有特别限定，例如，可以为1×105～1×107个细胞/mL左右。将细胞加入细胞培养袋后，与培养基一起搅拌。通过搅拌，在后面的工序中，能够使进入细胞培养袋下表面的各凹部的细胞的数量大致均等。搅拌可以通过人工或机械臂进行，和/或可以使用振动子(振动器)进行。
细胞的培养可以在与使用的细胞对应的适当条件下进行，可以在调整到适当的温度(30℃～40℃，例如37℃)、CO2浓度(5％～10％，例如5％)、以及湿度(90％～95％，例如95％)的孵化器内进行。培养的时间段可以根据期望的细胞聚集体的尺寸、细胞的种类等因素适当决定，没有特别限定，例如为1天～10天、优选2天～7天。
(3)对形成的培养细胞或细胞聚集体进行回收的机构
本发明的细胞或细胞聚集体的培养系统可以包括在上述培养结束后对在凹部内形成的培养细胞或细胞聚集体进行回收的机构。在该机构中实施以下内容。在凹部内形成的培养细胞或细胞聚集体的回收可以使用能够使细胞聚集体从凹部浮起在培养基中并取出的任意手段。作为这样手段，可以使用物理手段，使细胞培养袋上下翻转、对细胞培养袋施加振动、可以利用从细胞培养袋的外侧例如利用突起状的部件顶起凹部(日本特开2019-118319)、从载置面提起细胞培养袋使凹部平坦化(在凹部由载置面的凹陷形成的情况下)等手段。这些手段可以通过人工或机械臂进行，和/或可以使用振动子(振动器)进行。或者，也可以通过经由细胞培养袋的端口向细胞培养袋中注入空气或培养基或生理盐水等适当的缓冲液而产生的喷流，使细胞聚集体从凹部浮起并取出。浮在培养液中的细胞聚集体可以从细胞培养袋所包括的端口与培养基等一起回收。
以下，通过实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例
实验1.中型细胞培养袋中空气的去除
(1-1)中型细胞培养袋
制作并使用具有与图1所示的细胞培养袋同样结构的中型细胞培养袋。即，由2片厚度100μm由聚乙烯构成的气体透过性柔性膜重叠并对周围进行密封而成(密封的内侧面积为50cm2)，具有包括端口的结构。细胞培养袋的下表面膜包括1.8×104个直径500μm、深度200μm的凹部，上表面膜具有在4mm的高度鼓出的鼓出形状。膜的内表面用磷脂聚合物进行细胞低粘附涂覆。
(1-2)实验方法
从上述中型细胞培养袋的端口向其中加入10mL培养基，关闭端口，在CO2孵化器(37℃、95％湿度、5％CO2)内，使用按压装置分别以0kgf、0.5kgf、1.0kgf、2.0kgf或4.0kgf(面压：0kgf/cm2、0.01kgf/cm2、0.02kgf/cm2、0.04kgf/cm2或0.08kgf/cm2)施加压力的同时进行保存。
分别观察保存前(0小时)以及保存后2.5小时、4.5小时、9小时、15小时及72小时凹部内有无气泡。
(1-3)结果
关于凹部内有无气泡，将施加压力的大小与保存时间的关系示于图6。在图6的照片图(A)中，凹部内(看起来圆的地方)以黑色示出的表示存在气泡，而以灰白色示出的表示不存在气泡。基于各照片图，施加压力的大小与直到凹部内的气泡被消除所需的时间的关系示于图6的曲线图(B)。观察到施加的压力越大，气泡被消除所需的时间越短。例如，确认了对于中型细胞培养袋，要在一夜(约12小时)消除凹部内的气泡时，施加0.5kgf～1.0kgf的压力就足够了。另外，如果凹部直径变大，则存在于其中的空气的体积变大，因此凹部直径的大小也可能成为影响气泡被消除所需时间的因素，在上述中型细胞培养袋中，将凹部直径从0.5μm变更为1.26μm时，直到气泡被消除所需的时间从9小时延长至57小时。
实验2.在下表面具有气体非透过性膜的细胞培养袋中空气的去除
(2-1)在下表面具有气体非透过性膜的中型细胞培养袋
制作除了将在上述实验1中使用的细胞培养袋中的下表面(凹部侧)的气体透过性膜替换成粘接聚乙烯和乙烯-乙烯醇共聚物(EVOH)而成的多层的气体非透过性膜以外具有同样结构的中型细胞培养袋来使用。所述气体非透过性膜(厚度118.5μm)从内侧开始由聚乙烯(厚度67.7μm)、粘接剂层(厚度17.3μm)、EVOH(厚度30.5μm)组成。实验中使用的气体透过性膜和气体非透过性膜的气体透过度如下所示。
【表1】
各膜的气体透过度(37℃-dry)
氧(mL/m<sup>2</sup> day atm) 氮(mL/m<sup>2</sup> day atm)
气体透过性膜 8250 3040
气体非透过性膜 91.7 34.5
(2-2)实验方法
从在下表面具有气体非透过性膜的细胞培养袋(以下，记载为“气体非透过性细胞培养袋”)和在上述实验1中制作的气体透过性细胞培养袋的端口分别向其中加入10mL培养基，关闭端口，在CO2孵化器(37℃、95％湿度、5％CO2)内，使用按压装置以0.8kgf(面压：0.016kgf/cm2)分别施加压力的同时进行保存。
分别观察保存前(0小时)以及保存后1小时～23小时凹部内有无气泡。
(2-3)结果
关于各细胞培养袋的凹部内有无气泡，将经时观察的结果示于图7-1(气体透过性细胞培养袋)及图7-2(气体非透过性细胞培养袋)。各照片图中，凹部内(看起来圆的地方)以黑色示出的表示存在气泡，而以灰白色示出的表示不存在气泡。
在气体透过性细胞培养袋(图7-1)中，在保存后15小时～16小时气泡被消除，而在气体非透过性细胞培养袋(图7-2)中，即使在保存后经过23小时气泡也没有被消除。根据该结果，确认了根据本方法，存在于细胞培养袋的凹部内的气泡通过气体透过性膜被去除。
实验3.大型细胞培养袋中空气的去除
(3-1)大型细胞培养袋
制作并使用具有与图1所示的细胞培养袋同样结构的大型细胞培养袋。由2片厚度100μm由聚乙烯构成的气体透过性柔性膜重叠并对周围进行密封而成(密封的内侧面积为1000cm2)，具有包括端口的结构。细胞培养袋的下表面膜包括65×104个直径350μm、深度150μm的凹部，上表面膜具有在4mm的高度鼓出的鼓出形状。膜的内表面用磷脂聚合物进行细胞低粘附涂覆。
(3-2)实验方法
从上述大型细胞培养袋的端口向其中加入200mL培养基，关闭端口，在CO2孵化器(37℃、95％湿度、5％CO2)内，使用按压装置以1.0kgf(面压：0.01kgf/cm2)施加压力的同时进行保存。
(3-3)结果
关于大型细胞培养袋的凹部内有无气泡，将经时观察的结果示于图8。在图8的照片图中，凹部内(看起来圆的地方)以黑色示出的表示存在气泡，而以灰白色示出的表示不存在气泡。凹部内的气泡在保存后约8小时被消除。确认了即使是大型的细胞培养袋，通过施加压力也能够去除凹部内的气泡。
根据以上结果，确认了根据本发明方法，能够简便且高效地去除附着在填充有培养基的细胞培养袋的多个凹部内的气泡。本实验中使用的大型细胞培养袋中的凹部的直径(350μm)比上述中型细胞培养袋中的凹部的直径(直径500μm)小，凹部的气泡的大小也小，因此在短时间内被去除。
标号说明
1、1’ 细胞培养袋
2、2’ 袋主体
20、20’ 周边部
21、21’ 上表面膜
21a、21a’ 顶面部分
21b、21b’ 倾斜部分
22、22’ 下表面膜
3、3’ 端口
4、4’ 凹部
5、5’ 载置台
5a、5a’ 载置面
5b 开口部
5b’ 凹陷
6 按压部件
6a 底面
7 支撑机构
71 框架
72 导销
73 压力施加单元
8’ 上盖
9’ 铰链
10’ 锁定机构
100、100’、100” 按压装置
11 空气

Claims (16)

1.一种使用细胞培养袋的细胞或细胞聚集体的培养系统，
所述培养系统包括用于对加入了培养基的具有包括多个凹部的下表面的细胞培养袋在加入细胞之前施加压力以使所述细胞培养袋内的空气通过所述细胞培养袋去除的机构。
2.根据权利要求1所述的培养系统，其中，对所述细胞培养袋的压力的施加是通过从所述细胞培养袋的上方施加压力来进行的。
3.根据权利要求1或2所述的培养系统，进一步包括用于在加入了细胞的所述细胞培养袋被搅拌之后进行培养的机构。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的培养系统，进一步包括用于在培养结束后对形成的培养细胞或细胞聚集体进行回收的机构。
5.根据权利要求4所述的培养系统，包括用于在培养结束后使所述细胞培养袋上下翻转来对形成的培养细胞或细胞聚集体进行回收的机构。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的培养系统，其中，所述细胞培养袋的下表面包括10个～100万个凹部。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的培养系统，其中，所述细胞培养袋中的所述凹部为球冠状。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的培养系统，其中，所述细胞培养袋中所述凹部的直径与深度之比为1:0.25～1。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的培养系统，其中，所述凹部的直径为300μm～1500μm，深度为100μm～1000μm。
10.一种从包括多个凹部的细胞培养袋中去除空气的方法，
所述方法包括将培养基加入所述细胞培养袋，然后施加压力以使所述细胞培养袋内的空气通过所述细胞培养袋去除的工序。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述细胞培养袋的下表面包括10个～100万个凹部。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述细胞培养袋中的所述凹部为球冠状。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中，所述细胞培养袋中所述凹部的深度与直径之比为1:1.5～2.5。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中，所述凹部的直径与深度之比为1:0.25～1。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中，所述凹部的直径为300μm～1500μm，深度为100μm～1000μm。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中，对所述细胞培养袋的压力的施加是通过从所述细胞培养袋的上方施加压力来进行的。
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