JP2011521640A - 超音波細胞除去方法 - Google Patents

Abstract

本発明により、多層細胞培養容器を含む、細胞培養容器に超音波エネルギー処理を施して細胞培養容器の表面に増殖している細胞を分離する方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照

本出願は、ここに引用することにより本明細書に組み込まれたものとする、米国仮出願第６１/１３０，５２１号（名称、超音波細胞除去方法、２００８年５月３０日出願）及び米国仮出願第６１/１１６，９２８号（名称、超音波細胞除去方法、２００８年１１月２１日出願）の優先権を主張するものである。

本発明は細胞培養容器に超音波エネルギー処理を施して表面から細胞を分離することにより、酵素を使用せずに細胞を除去する方法に関するものである。

細胞の対外培養により、薬理学、生理学、及び毒物学の分野における研究に必要な材料が得られる。最近の薬剤スクリーニング技術の進歩により、製薬会社は治療標的に対し抱えている膨大な化合物を迅速に選別することができる。このような大規模スクリーニング技術には体外で増殖、維持されている大量の細胞が必要である。このような大量の細胞を維持するためには、大量の細胞増殖培地及び試薬、並びに大量且つ多種類の実験用細胞培養容器及び実験装置が必要である。また、このような活動は労働集約的でもある。

細胞は、ローラーボトル、細胞培養皿及び細胞培養プレート、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、共通（単層）フラスコと多層細胞培養フラスコ及び多層細胞培養容器を含む、特定の細胞培養容器内で増殖される。培養中の細胞は適切な支持媒体中に浸漬されたフラスコの底面に付着して成長する。

細胞ベースの高スループットアプリケーションの出現により、必要なガス交換を確保しつつ細胞増殖のための大表面積を有する細胞培養容器が開発されている。また、このようなシステムは、共通フラスコ、ローラーボトル、細胞培養皿、多層フラスコ及び多層細胞培養皿を含む多層細胞増殖容器、生物反応器、細胞培養バッグ等を含む従来の細胞培養容器も採用しており、これらの容器の中には増殖密度及び分化因子を含む細胞培養パラメータの向上に特化した表面を備えているものもある。

また、細胞ベースの高スループット・アプリケーションは自動化が進んでいる。自動化により、操作者による手動操作と同じように細胞培養容器を操作することができる。更に多層細胞増殖面を有するフラスコは、１つの底面壁において細胞増殖が可能な一般的に知られているフラスコより高い接着細胞収率を上げることができる。このような多層容器により大量の細胞を増殖できる一方、日々の使用において特別な課題を抱えている。

本発明の幾つかの実施の形態により、多層細胞培養容器に超音波エネルギー処理を施すことにより多層細胞培養装置の細胞増殖面から接着細胞を分離する方法が提供される。

本発明の方法の幾つかの実施の形態により、超音波エネルギー処理を施すことにより多層細胞培養容器から細胞を除去する超音波処理方法が提供される。幾つかの実施の形態において、前記方法は、多層細胞培養容器であってよい、細胞培養容器内で細胞を増殖させる工程と、前記細胞培養容器に超音波エネルギー処理を施す工程と、分離した細胞を前記細胞培養容器から除去する工程とを有して成ることを特徴とするものである。前記処理を施す間、前記多層細胞培養容器は開放していても閉じていてもよく、培地又は緩衝剤である液体を含んでいてもいなくてもよい。必要があれば、前記細胞培養容器を元の位置に戻して処理を繰り返すことができる。

また、本発明の幾つかの実施の形態によれば、超音波トランスジューサ、ホーン、多層細胞培養容器、及び基板から成る、多層細胞培養容器に超音波エネルギーを供給する装置であって、前記ホーンを通して、前記超音波トランスジューサにより、前記基板によって前記ホーンに対向支持された前記多層細胞培養容器に超音波エネルギーが供給されることを特徴とする装置が提供される。前記装置は更に音響カプラを備えることにより前記多層細胞培養容器の形状に適合させ装置の音響結合を強化することができる。前記超音波エネルギーは１〜１００ｋＨｚのエネルギーであって１秒〜３００秒間供給される。

添付図面に照らして以下の詳細な説明を読むことにより、本発明をより良く理解できる。
多層細胞培養容器の実施の形態を示す図。 本発明の方法の実施の形態を示すフローチャート。 本発明の超音波エネルギー供給システムの実施の形態を示す図。 音響結合装置によって音響発生器に結合された多層フラスコの実施の形態を示す図。 細胞増殖面に細胞が残留付着していることを示す本発明の方法の実施の形態によって処理した後の染色多層フラスコの最初の５つの小フラスコを示す図。 細胞増殖面に細胞が残留付着していることを示す本発明の方法の実施の形態によって処理した後の染色多層フラスコの２番目の５つの小フラスコを示す図。 本発明の方法の実施の形態によって処理する前の多層フラスコのガス透過性ポリスチレン膜層から分離したＣＨＯＫ１細胞の顕微鏡写真。 本発明の方法の実施の形態によって処理した後の多層フラスコのガス透過性ポリスチレン膜層において増殖したＣＨＯＫ１細胞の接着単層の顕微鏡写真。 本発明の実施の形態によって処理された細胞の生存能力を示す、超音波によって多層フラスコから切り離され、標準のＴ−１７５フラスコに再播種された細胞の画像。

本発明の実施の形態は超音波エネルギーを用いて細胞培養面から細胞を分離する方法に関連したものである。本発明の実施の形態において、超音波エネルギーを用いて統合多層細胞装置内に細胞増殖チャンバーの多数の層を有する多層細胞培養容器の細胞培養面から細胞を分離することができる。以下の詳細な説明において、限定を意図したものではなく、説明を目的とし、本発明に対する理解を深めるために、詳細な情報を開示した実施の形態例について説明する。しかし、本発明はここに開示する詳細な情報から外れた別の実施の形態において実施可能であることは当業者にとって明白である。また、本発明の説明が不明瞭になるのを避けるため、周知の装置及び方法については、その詳細な説明は省略してある。

細胞培養、特に接着細胞培養においては、例えば、米国出願番号第２００７/００２６５１６号明細書に記載されているように、培養器のスペースを小さくし、細胞培養増殖面を大きくした、積層型、省スペース高密度容器の使用が進んでいる。細胞培養容器の効率化が進み内部のスペースが制限されるにつれ、少量の液体を出し入れする必要が生じ実際の使用において複雑度が増している。

接着細胞培養における継続的課題は、細胞増殖面から細胞を分離する方法である。当技術分野において、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ等の酵素に細胞を晒す方法がある。しかし、このような酵素の使用には限界がある。

このような酵素には動物由来のものもある。動物由来の酵素は、例えば、酵素と一緒に動物から分離されたウイルスによる汚染の危険がある。治療薬の製造における動物由来成分の使用に対する法的規制が益々厳しくなっており、動物由来酵素を薬剤開発関連用途に使用することが不適切となってきている。様々な組み換えプロテアーゼが使用可能である。

このような酵素により細胞同士及び基板からの細胞の分離が可能であるが、細胞表面の蛋白質を剥ぎ取り細胞を損傷する可能性がある。特に、生細胞が治療薬の場合には、細胞は無傷である必要がある。プロテアーゼに対し非常に敏感であり、酵素処理後急速に生存能力を失う細胞もある。酵素は制御が難しく、細胞を損傷する恐れがあり、培養細胞における細胞株及び幹細胞の不安定化や細胞核型異常につながる恐れがある。

更に、複雑な３次元構造を有する細胞培養面の出現により、酵素処理では十分に細胞を除去できなくなっている。従って、酵素又は他の化学処理を必要とせずに細胞培養面から細胞を分離する方法が必要である。

非酵素溶液である、エチレンジアミン四酢酸を含む生理リン酸緩衝液（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ）のようなキレート剤溶液も細胞の分離に利用できる。しかし、単層培養においてこれ等の溶液は何れも細胞同士を分離することができない。基板から細胞を切り離すことはできるが、細胞は互いに接着したままであり塊として切り離される。細胞塊に対しては一般に、個々の細胞の集団になるまで、ピペット操作を繰り返すような機械的又は化学的（酵素を含む）操作が更に必要となる。

このような化学的及び酵素的方法を使用した場合には、細胞から溶液を洗浄除去する必要があると共に、遠心分離又はろ過のような別の方法によって細胞を収集する必要がある。最終的に、これ等の工程により細胞の化学的分離のための時間と費用が嵩むことになる。

細胞スクレーパーによって基板表面から細胞を物理的に掻き落とすことにより除去することもできる。この方法は細胞スクレーパーが届かない細胞培養容器が多いことからあまり使用されていない。細胞スクレーパー操作によって細胞が容易に損傷を受け、損傷した細胞からプロテアーゼが放出されることにより更に損傷する。このような損傷を軽減するために、掻き落し操作において、プロテアーゼ阻害剤を使用することができる。このような試薬は高価である。従って、細胞を掻き落す方法は、細胞培養面から接着細胞を除去するための時間と費用が嵩む多工程の方法である。

超音波の振動や摩擦熱とそれに伴う溶融を利用して似たような材料の組立て及び接続が行われている。また、超音波は医療及び生物学的用途にも利用されている。更に、超音波は体外培養細胞の応答分析及び細胞の遠隔操作にも利用されている。超音波の他の生物学的用途には、微小流路における細胞移動制御、全血からのプラズマ分離、ターゲット薬物送達、基板に対する細胞の接着力測定、超音波遺伝子導入、細胞分化促進等がある。

超音波水槽におけるキャビテーション気泡の生成より供給物を浄化できる一方、微生物の生産性向上、バクテリア細胞増殖の増加、培養装置からの細胞除去にも利用できる。しかし、キャビテーション気泡の生成は細胞にとって有害であり、一般的には細胞を破壊する方法として利用されている。従って、キャビテーション気泡を利用する場合には、超音波周波数の選定に注意を払い細胞の損傷を最小限に抑える必要がある。

超音波水槽に容器を浸漬することにより、細胞培養面から接着細胞を分離することができる。しかし、この方法にも問題がある。例えば、細胞培養容器を水槽に浸漬することにより汚染の危険性が著しく増大する。

本発明の実施の形態において、超音波衝撃を受けることにより接着基板内に生じた共鳴波により基板から細胞を分離する方法が提供される。この方法を実施するための装置も提供される。実施の形態の方法を用いることにより、酵素やキレート剤のような成分を培地に追加する必要がない。本発明の実施の形態において、多層細胞培養フラスコであってよい、細胞培養容器内で増殖している細胞から細胞培地が除去される。幾つかの実施の形態において、細胞が接着基板に接着している間に、ＰＢＳのような緩衝液によって残留培地成分を細胞から洗浄除去できる。別の実施の形態において、培地又は緩衝剤である液体が存在することができる。幾つかの実施の形態において、多層細胞培養フラスコであってよい、細胞培養容器が固定治具に載置され、そこで短時間超音波周波数に晒される。この超音波周波数に晒された細胞は細胞培養容器の細胞培養層から切り離される。追加の洗浄又は濃縮工程を必要とせずに、容器から注ぐことにより細胞を収集できる。別の実施の形態において、多層細胞培養フラスコであってよい、細胞培養容器を更に洗浄することにより、完全に細胞を除去している。

本発明の実施の形態において、多層フラスコが提供される。図１は本発明の多層フラスコ１００の実施の形態を示す部分切取り斜視図である。多層フラスコ１００は、上部板１１０で画成される外側容器本体１０１、底部トレイ（図示せず）、側壁１１２、及び端壁１１４を有している。フラスコ１００の内部に配置されているのは、個々の細胞増殖チャンバー１１１であり、図１の切取り部分においてはっきりと見える。細胞増殖チャンバー１１１の各々は底面１１３と上面１１５とによって画成されている。表面１１３及び１１５は側壁１１２及び端壁１１４に沿ってフラスコ本体１０１に取り付けられている。各々のチャンバー１１１の少なくとも１つの底面１１３が、細胞１１７の増殖面となり得るガス透過、液体不透過材料から成ることが好ましい。ガス透過、液体不透過材料は細胞を接着する表面、細胞増殖チャンバーの床面、対向面、又は細胞増殖チャンバーの天井となり得る。底面１１３又は細胞培養面１１３は可撓性であってよい。上面１１５は細胞成長チャンバー１１１を支持する剛性且つ一般的にガス不透過材料から成っていてよい。この多層フラスコの表面は透明、不透明、有色、又は無色であってよい。本発明の実施の形態において、各々の細胞増殖チャンバー１１１間に気管空間１１８が設けられている。チャンバー１１１の対向する上面１１５によって、細胞増殖チャンバー１１１の上部壁及び気管チャンバー１１８の底部が画成される。従って、気管チャンバー１１８は第１細胞増殖チャンバーのガス透過、液体不透過面１１３を含むと同時に、第２増殖チャンバー１１１の対向面１１５も含んでいる。単一のフラスコ１０１の内部に増殖チャンバー１１１と気管空域とを交互に形成する際、表面１１３及び１１５を一体的に組み込むための構造的支持をする支持体１１９を備えることもできる。従って、各々の細胞増殖チャンバー１１１は、縦方向において、気管チャンバーと交互に配置される。

本発明の１つの実施の形態において、多数の細胞増殖チャンバー１１１が多層フラスコ１００の本体１０１と一体となり、細胞増殖のための培養液で完全に満たされることにより、個々の細胞増殖チャンバー１１１がガス透過膜１１３上において細胞を増殖することができる。多層フラスコ１００の一連の気管空域１１８によって、多層フラスコ内部の個々の細胞増殖チャンバー１１１内の培地１２７内のガス透過面１１３上で増殖している細胞１１７と外部環境との間でガス交換が行われる。気管空間１１８によって、ガス透過面１１３を通して、細胞増殖チャンバー１１１内の培地に酸素を供給することができる。また、気管空間１１８は任意の空隙又は空域形状を成すことができると共に液体の進入を防止する。その結果、気管空間１１８と交互に配された多数の増殖チャンバー１１１を有する剛性細胞培養多層フラスコ１００は、大量の細胞１１７に均等にガスを供給できるよう協調形成されていることになる。

接着又は溶剤結合、ヒートシール又は溶接、圧縮、超音波溶接、レーザー溶接、及び/又は部品同士の封止に一般的に使用されるその他の方法を含みこれに限定されない様々な方法によって、ガス透過膜１１３を支持体１１９及び側壁１１２に固定することができる。膜が支持体１１９の表面と同一平面で重複融合し多層フラスコ内表面の一部を構成するよう膜１１３の縁部をレーザー溶接により気密封止することが好ましい。ガス透過膜１１３を側壁及び端壁に取り付けた後、上部板１１０及び底部トレイ１２０を取り付けることができる。底部トレイ１２０及び上部板１１０は射出成形することができる。様々な大きさ及び形状の支持体１１９を用いることにより、細胞培養容器１００内において細胞１１７を培養するための膜質層１１３の位置調整を容易にすることができる。

ガス透過、液体不透過膜１１３（図１）は当技術分野で周知の１つ以上の膜から成っていてよい。膜は、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリオレフィン、エチレン、酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）又は相溶性フッ素重合、シリコーンゴム又は共重合体、ポリ(スチレン−ブタジエン−スチレン)及びこれらの組み合わせを含む適切な材料から成っている。製造及び細胞増殖に対する親和性の観点から様々な高分子材料が用いられている。ポリスチレンは特性が優れていることが知られており、（様々な厚さのものが細胞増殖に使用可能であるが、厚さ約０．００３インチ（０．００７６２ｃｍ）の）膜の材料として好ましい。このように、膜の厚さは任意であるが、約２５〜２５０μｍが好ましく、約２５〜１２５μｍが理想的である。

本発明の実施の形態において、ガス透過、液体不透過膜１１３は、十分薄く柔軟性に富み多層フラスコに超音波周波数が印加されるとそれに応じて振動する。この振動が多層フラスコの細胞培養面に伝わり、接着細胞が細胞培養面から切り離される。

本発明の多層フラスコ１００は当業者周知の任意の方法によって作製できる。製造方法の１つの実施の形態において、多層フラスコ１００が個別に射出成形された部品から組み立てられる。成形に適し一般に実験器具の製造に使用される任意のポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル、ポリエステル）を使用できるが、ポリスチレンが好ましい。必須ではないが、光学的透明性を確保するため、厚さは２ｍｍ未満であることが好ましい。個別の部品は、接着又は溶剤結合、ヒートシール又は溶接、圧縮、超音波溶接、レーザー溶接、及び/又は多層フラスコの内表面の一部を構成するよう部品同士の封止に一般的に使用されるその他の方法を含みこれに限定されない様々な方法によって組み立てることができる。上部板１１０及び底部トレイの位置を合わせて、例えば、レーザー溶接によって接続することができる。

１つの実施の形態において、個々の部品が一緒に保持され、継ぎ目に沿った接着結合、超音波溶接、レーザー溶接、熱盤による結合、又は他の任意の方法により結合される。部分又は完全自動化された組立システムにおいて、レーザー溶接装置を用いることが好ましい。接続部の外縁部に沿ってレーザー溶接する間に前記上部板とトレイとが適切に位置合せされる。

膜層を含む多層フラスコ１００の内表面に細胞増殖を可能とする処理を施すことにより、細胞の接着及び増殖を促進することが好ましい。この処理は、コーティング、プラズマ放電、コロナ放電、ガスプラズマ放電、イオン衝撃、イオン化放射、高強度ＵＶ光を含む、当技術分野で周知の様々な方法によって施すことができる。

別の実施の形態において、液体を通さないよう側壁１１２に取り付けられたガス透過膜１１０の層に個々の細胞増殖チャンバーの一方の側を固定し、他方の側を硬質層である上部面に固定することにより、個々の細胞増殖チャンバー１１１及び多層フラスコ全体に剛性要素を加えることができる。例えば、上部側が硬質層１１５によって固定され、端部が側壁によって固定され、底部側がガス透過膜によって固定された個々の細胞増殖チャンバー１１１が可能である。このような細胞増殖チャンバー１１１を積層することにより、１つの個別細胞増殖チャンバー１１１の硬質層１１５の上面によって、隣接する個別細胞増殖チャンバーのガス透過膜１１３の下部に気管空間を画成する支持構造体が形成される。１つの実施の形態において、個別細胞増殖チャンバーを大型多層細胞培養容器に組み立てることができる。これ等の個別の層はスナップ止め又は当技術分野で周知の任意の方法によって相互接続できる。

図１はフラスコ１００の内部を構成する交互配置された気管空域１１８及び個別細胞増殖チャンバー１１１の層を示している。個別細胞増殖チャンバー１１１は、液体を通さないよう細胞培養容器の側壁及び端壁に取り付けられた、液体不透過、ガス透過膜１１３によって画成される。膜１１３と膜１１３との間に細胞培地１２７が含まれ、膜１１３の液接触面において細胞が増殖する。本実施の形態において、液体を通さないよう側壁１１２に取り付けられたガス透過膜の２つの層によって個々の細胞増殖チャンバー１１１を形成することができる。気管空域１１８がガス透過膜とガス透過膜との間の層を成しエアポケットを形成することにより、ガス透過膜１１３によって細胞培地１２７に空気を送ることができる。本実施の形態おいては、気管空域１１８は個別の細胞増殖チャンバー１１１を成すガス透過膜１１３の層を分離支持する支持体１１９によって支持されている。好ましい実施の形態において、多層フラスコの製造、取り扱い、及び操作において更に耐久性のある膜１１３を備えている。多層フラスコについて説明したが、本発明の実施の形態は単層細胞培養容器に適用可能であることは勿論である。

図２は本発明の方法の実施の形態のフローチャートである。図２の工程１において、細胞培養容器内で細胞を増殖させ、工程２において、細胞培養容器に超音波エネルギー処理を施すことにより、細胞培養容器の増殖面から細胞を切り離し、工程３において、細胞培養容器から細胞を除去する。別の実施の形態において、工程２の前に、細胞培養容器から細胞培地液又は緩衝液を除去することができる。これは細胞培養容器から液体を抜き取ることによって行われる。これにより、容器内に一部の液体が残留するが、結果に悪影響を及ぼすことはない。別の実施の形態において、工程２の処理を施す間、細胞培養容器を培地又は緩衝剤で完全又は部分的に満たすことができる。工程２の処理を施す間、容器に蓋をするか、蓋を取るか、あるいは軽く蓋をすることができる。これ等の実施の形態において、細胞培養容器は単層又は多層細胞培養容器であってよい。

図３は本発明の超音波処理装置の実施の形態を示す図である。図３は接続アーム３１５によって下降して処理予定の細胞培養装置３００に結合するホーン３２０に接続された超音波トランスジューサ３１０を示す図である。ホーンは多層細胞培養容器に適切に嵌合するよう構成配置することができる。ホーンを多層細胞培養装置に適切に嵌合するよう構成配置することにより、超音波エネルギーを効率良く多層細胞培養装置に加えることができる。図３には多層細胞培養容器が示してあるが、任意の細胞培養容器であってよい。細胞培養容器は、図３に示すように、横臥位又は装置内部の任意方向に配置することができる。

多層細胞培養容器は多くの層を有しているため、すべての層が処理されるよう多層細胞培養容器と超音波発生器との接続を考慮する必要がある。たとえば、多層細胞培養容器を図３に示すような横臥位にして処理することが効率的である。横臥位において、超音波発生器は多数の細胞培養層の各層に超音波エネルギーを供給することができる。別の実施の形態において、首及び/又は蓋を含む側及び首及び/又は蓋を含む側に対向する側を含む細胞培養装置の側面に超音波エネルギーを供給できる。例えば、多層細胞培養装置が通常細胞を培養する際の向きにあるとき超音波エネルギーを供給できると共に、多層細胞培養装置の片側又は両側から超音波発生器を近づけることができる。別の実施の形態において、超音波発生器と多層細胞培養装置との結合を強化する音響カプラを採用し、超音波発生器又はトランスジューサと多層細胞培養装置との間において最大の超音波エネルギーが伝達されるようにすることにより、超音波処理の効率を向上させることができる。

細胞培養容器は、超音波処理時に有っても無くてもよい蓋３３５を備えることができる。 また、超音波処理時において、蓋３３５を堅く又は緩く閉じてもよい。超音波伝達において、細胞培養容器を所定の場所に保持する固定治具３４０を用意することができる。固定治具３４０は音響結合装置又は音響カプラを備えることができる。固定治具３４０はベースプレート３５０に対して細胞培養容器を保持することができる。コンピュータ３７０と通信することにより操作者が超音波処理のパラメータをモニターできる測定装置３６０にベースプレートを固定できる。

細胞培養容器を超音波処理する際、ホーン３２０を処理対象の細胞培養容器３００に接触するまで下降させることにより、超音波トランスジューサ３１０を処理対象の細胞培養容器３００に結合する。超音波トランスジューサ３１０によって細胞培養容器３００に一定期間超音波エネルギーが供給され細胞が切り離される。超音波処理終了後、ホーン３２０を引き上げることにより、細胞培養容器３００が装置から除去され更に別の処理が行われる。例えば、細胞培養容器表面から切り離された細胞が細胞培養容器から除去される。切り離された細胞は細胞培養容器内部の培地又は緩衝液内を自由に浮遊している細胞であり、容器の細胞増殖面に固着してはいない。

図４は音響結合装置４２５によって固定治具又はベースプレート４５０に保持された多層フラスコ４００を示す図である。幾つかの実施の形態において、音響結合装置はベースプレートと細胞培養容器との間又はホーンと細胞培養容器（図示ぜず）との間にゴムパッドを有している。この音響結合装置は、超音波発生器と細胞培養容器との間又はベースプレートと細胞培養容器との間の音響結合を向上させるよう構成配置されている。ここではゴムパッドを開示しているが、超音波発生器と細胞培養容器との間、又はベースプレートあるいは他の固定面と細胞培養容器との間の音響結合を向上させるものであればどのような構造体を音響結合装置４２５としてもよい。

図５及び６は、本発明の実施の形態により多層細胞培養容器（組立体）を超音波処理した後に、多層培養容器を分解したときの小フラスコを示す図である。これ等の小フラスコは染色されており、容器から細胞が除去されていることを示している。これ等の小フラスコは１から１０の番号の連続した細胞培養チャンバー１１１であり、１０層から成る細胞培養容器組立体の小フラスコを示している。例えば、番号５の小フラスコは多層細胞培養容器の中央に位置し、番号１及び番号１０の小フラスコはそれぞれ最上部と最下部に位置している。例えば、個々の細胞増殖チャンバー１１１は上部側を硬質層１１５に固定され、下部側をガス透過膜１１３に固定される。細胞はガス透過膜１１３において増殖する。個々の増殖チャンバー１１１のガス透過膜１１３に残留付着している細胞が標準のクリスタルバイオレット染色法によって染色されているため図５及び６では黒く見える。

図５は、超音波処理後において、細胞増殖面に細胞が残留付着している（又は細胞増殖面に細胞が付着していない）最初の５つの小フラスコを示している。図６は染色され細胞増殖面に細胞が残留付着している２番目の５つの小フラスコを示している。図５及び６に示すフラスコは、標準ホーンを用いて、フラスコ接触表面領域及び超音波衝撃波を加える間フラスコを保持する固定治具に適合するように構成された超音波溶接発生器から２０ｋＨｚ、振幅１５％又は２０％の超音波を３０秒間加えたものである。固定治具はホーンの一部であっても超音波発生器をホーン又は多層細胞培養装置に接続する別の装置であってもよい。本発明の幾つかの実施の形態において、１〜４０ｋＨｚ、１０〜４０ｋＨｚ、１５〜４０ｋＨｚ、あるいは１５〜３０ｋＨｚの超音波エネルギーによって適切な超音波処理が行われる。超音波エネルギーは１０〜３０秒間加えられ、これを２回以上繰り返すことができる。例えば、処理対象品の一方の側に超音波エネルギーを加え、次に装置内においてその処理対象品を移動、反転、あるいは再調整し、再度処理を行うことができる。別の実施の形態においては、両面から同時に超音波エネルギーを加えることにより、処理対象品を反転又は再調整して再度処理するステップを省略している。幾つかの実施の形態において、適切な振幅範囲は１０〜２０％である。一部の実施の形態において、ゴムパッド（図４の符号４２５参照）をホーンに適用することにより、超音波発生器から細胞培養容器へのホーンを介した超音波エネルギー伝達の向上を図っている。このゴムパッドは超音波発生器と多層細胞培養装置との間又はベースプレートと細胞培養容器との間の音響結合を強化するよう構成配置された音響結合装置である。ここではゴムパッドを開示しているが、超音波発生器と細胞培養容器との間、又はベースプレートあるいは他の固定面と細胞培養容器との間の音響結合を向上させるものであればどのような構造体を音響結合装置としてもよい。

図５及び６のフラスコは、超音波処理の間、培地を含まず、蓋が固く取り付けられている。ここでは、超音波処理の間、培地を含まず蓋が固く閉じたフラスコを開示しているが、超音波処理の間、培地を含むフラスコに蓋をした場合、蓋をしない場合、あるいはこれらを組み合せた場合について実験したが、何れも結果は良好であった（結果は示さず）。本発明の方法の実施の形態は、培地が存在している場合、培地が存在していない場合、蓋を固く閉じた場合、蓋を緩く閉じた場合、及び蓋がない場合の何れにおいても有効であった。本発明の幾つかの実施の形態において、超音波処理後、フラスコが実験室の作業台に軽く又は強く当てられる。図５及び８のフラスコは、洗浄分解する前に、実験室の作業台に２回軽く当てたものである（２衝撃を加えたものである）。次いで、フラスコから細胞が除去され、生体染色法により細胞生存率が示される。超音波処理によりこのフラスコから除去された細胞の生存率は９２．２％であった。図５及び６が示すように、本発明の方法の実施の形態による処理の後、多層細胞培養装置の各小フラスコからほぼ完全に細胞が除去されている。
図７は本発明の方法の実施の形態によって処理する前の多層フラスコのガス透過性ポリスチレン膜において増殖したＣＨＯＫ１細胞の接着単層の顕微鏡写真である。また、図８は本発明の方法の実施の形態によって処理した後の多層フラスコのガス透過性ポリスチレン膜において増殖したＣＨＯＫ１細胞の接着単層の顕微鏡写真である。本発明の方法による処理を行う前に細胞増殖面に接着していたほとんどの細胞は、その処理後、もはや細胞増殖面に接着していないことを図７及び８は示している。図８は処理後細胞培養面に残留付着している一部の丸い細胞を示しているが、ほとんどの細胞は培養面から切り離され小フラスコ内の残留液に浮遊している。

図９は本発明の実施の形態によって処理された、即ち、多層細胞増殖容器から除去され別の容器において再生された細胞の生存能力を示す、超音波によって多層フラスコから解放され、標準のＴ−１７５フラスコに再播種されコンフルエンス（コンフルエンス以上）に増殖した細胞を示す画像であって、処理された細胞の生存能力を立証している。

細胞培養
多層フラスコ内の１０％のウシ胎仔血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）において、３７℃にて単層が形成されるまでＣＨＯＫ１接着細胞を培養した。

本発明の実施の形態により多層フラスコから除去した細胞を標準のＴ−１７５フラスコに再播種し、１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地において、コンフルエンス（コンフルエンス以上）に増殖させることにより図９の画像を得た。

超音波処理
培地を除去しＰＢＳによって洗浄した後、多層フラスコを横臥位にして超音波ホーンの真下の治具上に載置した。超音波周波数を２０ｋＨｚとし振幅を２０％とした。ブランソン２００超音波溶接機によって、多層フラスコの一方の側に３０秒間パルスを発生させ、その後反転させもう一方の側に３０秒間パルスを発生させた。超音波パルスを付与する前後の細胞を光学顕微鏡によって視覚化することにより、接着面から細胞が切り離されたか否かを判定した。容器から細胞を排出し生存率を測定したところ９８％であった。

フラスコの染色
超音波処理を施した後、多層フラスコを個々の小フラスコ、即ち、個々の細胞培養チャンバーに分解した。切り離された細胞を容器から除去した後、クリスタルバイオレットによって残留接着細胞を染色した。容器にクリスタルバイオレットを加え、容器を揺動することにより細胞培養面にコーティングを施した。所定の場所に染料を５分間放置し、その後容器を水洗いした。容器を乾燥させてから層を引き離して個々の層が見えるようにした。超音波処理によって、多層フラスコの可撓ガス透過膜（細胞培養面）からは細胞が除去された一方、小フラスコの対向する硬質プラスチック側に増殖した細胞は除去できなかった（データ表示せず）。

小フラスコの接着基板をクリスタルバイオレットによって染色することにより、基板に残留している細胞を検出した。容器にクリスタルバイオレットを加え、容器を揺動することにより細胞培養面にコーティングを施した。

本発明について説明したが、本発明の開示によって恩恵を受ける当業者にとって、説明した内容を様々に変形できることは明白である。かかる変形は本発明の精神及び範囲から逸脱すると見なされるものではく、当業者にとって自明の改良は以下の特許請求の範囲及びその法的な均等物の範囲に含まれると解釈されるべきものである。

１００ 多層フラスコ
１１１ 細胞増殖チャンバー
１１３ 底面/ガス透過膜
１１５ 上面
１１７ 細胞
１１８ 気管空域
１１９ 支持体
１２７ 培地
３００ 細胞培養装置
３１０ トランスジューサ
３１５ 接続アーム
３２０ ホーン
３３５ 蓋
３４０ 固定治具
３５０ ベースプレート
３６０ 測定装置
３７０ コンピュータ
４００ 多層フラスコ
４２５ 音響結合装置
４５０ ベースプレート

Claims (10)

1. 多層細胞培養容器から細胞を除去する超音波処理方法であって、該多層細胞培養容器に超音波エネルギー処理を施す工程を有して成ることを特徴とする方法。
2. 超音波エネルギー処理を施す間、前記多層細胞培養容器が液体を含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 超音波エネルギー処理を施す前に、前記多層細胞培養容器から液体を除去することを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 前記多層細胞培養容器が閉じた多層細胞培養容器であることを特徴とする請求項１記載の方法。
5. 前記多層細胞培養容器が開放した多層細胞培養容器であることを特徴とする請求項１記載の方法。
6. 前記多層細胞培養容器に超音波エネルギー処理を施す工程が、超音波発生器又は超音波発生器のホーンに対して該多層細胞培養容器を保持するように構成配置された音響カプラを介して、該多層細胞培養容器に超音波エネルギー処理を施す工程であることを特徴とする請求項１記載の方法。
7. 前記音響カプラが前記超音波発生器と前記多層細胞培養容器との間にゴムパッドを有して成ることを特徴とする請求項６記載の方法。
8. 前記超音波エネルギーが１０〜３０ｋＨｚであることを特徴とする請求項１記載の方法。
9. 前記超音波エネルギーを１５％〜３０％の振幅にて１０秒〜９０秒間加えることを特徴とする請求項８記載の方法。
10. 多層細胞培養容器から細胞を除去する超音波処理方法であって、
    （ａ）多層細胞培養容器内で細胞を増殖させる工程と、
    （ｂ）前記多層細胞培養容器に超音波エネルギー処理を施す工程と、
    （ｃ）分離した細胞を前記多層細胞培養容器から除去する工程と
    を有して成ることを特徴とする方法。

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