CN114989257A - 金刚烷胺抗原模拟表位及其在磁微粒酶促化学发光均相免疫检测方法中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种金刚烷胺抗原模拟表位及其在磁微粒酶促化学发光均相免疫检测方法中的应用，其氨基酸序列为：SVYNALYLAASE，将该抗原模拟表位多肽与荧光素酶进行融合表达，生物合成多肽‑荧光素酶融合蛋白，将融合蛋白作为传统的化学合成的金刚烷胺半抗原‑荧光素酶偶联物的替代物应用于免疫分析中，建立磁微粒酶促化学发光均相免疫检测金刚烷胺的方法，该方法具有操作简单、成本低廉、灵敏度高、绿色环保等特点。

Description

金刚烷胺抗原模拟表位及其在磁微粒酶促化学发光均相免疫 检测方法中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种金刚烷胺抗原模拟表位及其在磁微粒酶促化学发光均相免疫检测方法中的应用。

背景技术

金刚烷胺(Amantadine,AMD)属于三环胺类，最早是一种抑制流感病毒的人用抗病毒药，但在养殖业中也被用于预防和治疗禽流感、猪流感等疾病。由于其在人体内的蓄积性与能使病毒产生耐药性的特点，中国农业部已明令禁止金刚烷胺作为兽药使用。目前常用的金刚烷胺检测方法主要为仪器检测方法如高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。这些方法虽然在检测灵敏度、特异性和稳定性等方面各有优势，但也普遍存在耗时、繁琐、测试费用高等缺点。免疫学分析方法因其具有特异性强、灵敏度高且适合大规模筛查等优点，在农、兽药残留的快速检测领域发挥着重要作用。现有的免疫分析方法包括ELISA、胶体金免疫层析试纸条、FRET均相检测法等。

磁微粒酶促化学发光均相免疫检测方法是一种将磁性分离技术、酶促化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种分析方法，其检测小分子物质的原理是：将半抗原与酶偶联为半抗原-酶，同时制备抗体与磁微粒的偶联物，将两种偶联物与待测样本混合孵育反应。当待测样本中不含靶标物质时，溶液中形成“磁微粒-抗体-半抗原-酶”复合物，将反应液置于磁场中后“磁微粒-抗体-半抗原-酶”会吸附于反应管壁，弃去管中溶液后加入底物液，酶触发底物发光且此时的发光值最大；当待测样本中含有靶标物质时，靶标会竞争结合磁微粒-抗体，使形成的“磁微粒-抗体-半抗原-酶”复合物减少，而形成的磁微粒-抗体-靶标复合物增加，将反应物置于磁场作用后，“磁微粒-抗体-半抗原-酶”复合物将固定于反应管壁，而溶液中的游离的磁微粒-抗体-靶标复合物被弃去，加入底物液后，由于“磁微粒-抗体-半抗原-酶”复合物量减少，其发光值将会降低，并且其降低的量与加入的待测靶标量呈现反向线性关系，从而实现定量检测。该方法具有无需洗板、检测时间短、线性范围宽等优点。

磁微粒酶促化学发光均相免疫检测方法中半抗原-酶偶联物的制备至关重要。然而传统的半抗原-酶偶联物的制备主要通过化学合成的方法直接将半抗原与酶通过化学修饰的方法进行制备，存在着批次误差大、步骤繁琐、成本高且易造成环境污染等诸多问题。此外，由于半抗原-酶偶联物是直接使用待测的半抗原为原料，因此在竞争免疫分析过程中，其与天然半抗原和抗体的竞争能力是一样的，进而会影响反应体系的灵敏度和线性范围。

基于噬菌体展示多肽技术，可以通过生物淘选的方式，以抗体为配体，投入噬菌体展示多肽库，获得特异性结合抗体的多肽分子，该多肽分子具备与天然半抗原竞争结合对应抗体的属性，并能应用于免疫分析领域，该多肽分子即为抗原模拟表位。

发明内容

本发明以金刚烷胺单克隆抗体为靶分子，将靶分子结合到酶标板孔上，投入噬菌体随机展示十二肽库，进行液相亲和淘选，结合金刚烷胺竞争性洗脱的方式，获得了一种可与金刚烷胺竞争结合金刚烷胺单克隆抗体的多肽分子，其氨基酸序列为：SVYNALYLAASE。

上述多肽分子结构中，大写英文字母分别代表已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即S代表丝氨酸残基，V代表缬氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，N代表天冬氨酸残基，A代表丙氨酸残基，L代表亮氨酸残基，E代表谷氨酸残基。

本发明还涉及编码上述多肽分子氨基酸序列的核苷酸，具体的，其序列为：

AGCGTGTATAACGCGCTGTATCTGGCGGCGAGCGAA

本发明提及的多肽分子可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有多肽分子的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有多肽分子的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的模拟表位的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码多肽分子的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行多肽分子的大量制备。

本发明具体采用基因工程技术将金刚烷胺抗原模拟表位，即前述多肽分子与荧光素酶重组表达为多肽-荧光素酶融合蛋白，将该多肽-荧光素酶融合蛋白作为传统的金刚烷胺半抗原-荧光素酶偶联物的替代物应用于金刚烷胺的磁微粒酶促化学发光均相免疫分析方法中。

本发明的有益效果是：本发明所提及的金刚烷胺抗原模拟表位可替代传统的金刚烷胺半抗原，作为金刚烷胺半抗原的模拟物与荧光素酶融合表达，并应用于均相免疫检测分析。相较于传统的化学合成的金刚烷胺半抗原-荧光素酶偶联物，生物合成的多肽-荧光素酶融合蛋白具有制备成本低、均一性好、绿色环保等优点，选用的荧光素酶具有发光信号强、线性范围宽、灵敏度高等特点，所建立的磁微粒酶促化学发光均相免疫分析方法具有操作简单、反应步骤少、灵敏度高且成本低廉的优点。

附图说明

图1基于噬菌体展示多肽的金刚烷胺间接竞争ELISA标准曲线

图2基于抗原模拟表位的磁微粒酶促化学发光均相免疫方法检测金刚烷胺的标准曲线

具体实施方式

实施例1：金刚烷胺抗原模拟表位的淘选与鉴定

1)金刚烷胺抗原模拟表位的亲和淘选：具体方法为：用10mM的PBS(pH 7.2)稀释金刚烷胺单克隆抗体，并以终浓度5μg/mL包被于酶标板孔(100μL/孔)，15℃孵育20h。用PBST(10mM PBS pH 7.2包含0.1％Tween-20(v/v))洗涤5次，加入300μL封闭液(3％脱脂牛奶)37℃孵育1h。弃封闭液用PBST洗涤5次。

2)取100μL噬菌体展示肽库(噬菌体展示十二肽库，购自NEB公司，用PBS 10倍稀释噬菌体原液，约2.0×10 ¹¹pfu)，将其加入至包被金刚烷胺抗体的酶标板孔中，20℃振荡反应5h。弃去液体中游离的未结合噬菌体，用PBST洗涤5次。结合上的噬菌体用400ng/mL溶于PBS的金刚烷胺标准品进行竞争洗脱，取10μL洗脱噬菌体测滴度，其余的用于感染20mL生长至对数前期的E.coli ER2738菌株进行扩增。PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。

3)在第二、第三轮的淘选过程中，投入的金刚烷胺单克隆抗体浓度分别为2μg/mL、1μg/mL，用于洗脱的金刚烷胺标准品分别为200ng/mL、100ng/mL，其余步骤同第一轮。

4)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取100个噬菌体斑，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：首先，用10mM PBS(pH 7.4)稀释金刚烷胺单克隆抗体至1μg/mL，包被酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有5％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1h；投入100μl噬菌体斑扩增液(1.0×10 ¹¹pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育0.5h；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育0.5h；加入100μL TMB底物液，37℃孵育7min，酶标仪读取OD₄₅₀。选取OD₄₅₀大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

5)金刚烷胺抗原模拟表位的鉴定：采用间接ELISA方法确定筛选的阳性克隆对于金刚烷胺单克隆抗体的结合特性，具体方法：分别包被金刚烷胺单克隆抗体、孔雀石绿单克隆抗体、氯霉素单克隆抗体、烯效唑单克隆抗体1μg/mL，200μL/孔包被酶标板，4℃孵育过夜；第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有5％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育0.5h；投入100μL噬菌体斑扩增液(1.0×10 11pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育0.5h；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育0.5h；加入100μLTMB底物液，37℃孵育7min，酶标仪读取OD₄₅₀。

采用间接竞争ELISA的方法进行金刚烷胺抗原模拟表位的鉴定，具体方法为：用10mM PBS(pH 7.4)稀释抗金刚烷胺单克隆抗体，1μg/mL包被酶标板，4℃孵育过夜；第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有5％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育0.5h；投入50μL经间接ELISA鉴定为阳性且不与其它种类单克隆抗体结合的噬菌体克隆(1.0×10 11pfu)和50μL金刚烷胺标准品(浓度范围为0-50ng/mL)，37℃孵育0.5h，PBST洗板后加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育0.5h；PBST洗板后加入100μL TMB底物液，避光显色5min，读取OD ₄₅₀。

间接ELISA结果显示：在筛选到的阳性克隆中，有一个噬菌体克隆(其氨基酸序列为SVYNALYLAASE)，其与金刚烷胺单克隆抗体的结合OD数值为1.5，与其它孔雀石绿单克隆抗体、氯霉素单克隆抗体、烯效唑单克隆抗体的结合OD值均小于0.1，表明该噬菌体展示多肽与金刚烷胺单克隆抗体具有良好的结合性。

进一步采用间接竞争ELISA对上述噬菌体克隆进行鉴定，结果显示：投入的该噬菌体克隆(氨基酸序列：SVYNALYLAASE)能与金刚烷胺标准品竞争性结合包被于酶标板上的金刚烷胺单克隆抗体，并且呈现线性竞争阻断关系，标准曲线呈S型，线性相关性较好，IC₅₀为4.3ng/mL(图1)，鉴定该噬菌体展示的多肽为金刚烷胺的抗原模拟表位。

实施例2.金刚烷胺抗原模拟表位编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

将经过间接竞争ELISA鉴定展示有金刚烷胺抗原模拟表位的噬菌体进行扩增，提取噬菌体的DNA测序模板。简要过程如下：进行噬菌体扩增，在第一步离心后，将800μL含噬菌体上清转入一新离心管。加入200μL PEG/NaCl沉淀噬菌体。离心后将沉淀重悬于100μL碘化物缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA,4M NaI)，离心后再用70％乙醇洗涤沉淀(DNA测序模板)。沉淀最终重悬于20μL灭菌水，取2μL进行琼脂糖凝胶电泳分析；取5μL噬菌体模板进行DNA测序，其中-96gIII测序引物为：5’-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’。DNA测序结果为：AGCGTGTATAACGCGCTGTATCTGGCGGCGAGCGAA，依据密码子表可获得金刚烷胺抗原模拟表位的氨基酸序列为：SVYNALYLAASE。

实施例3.金刚烷胺抗原模拟表位多肽与荧光素酶融合蛋白的生物合成

A目的基因的合成

将模拟表位多肽的基因序列通过柔性linker((GGGGS)₃)与纳米荧光素酶(Nanoluciferase,Nluc)基因连接，融合蛋白基因两端设计酶切位点Nco I、Xho I，送通用生物合成，基因序列为：accatgggcAGCGTGTATAACGCGCTGTATCTGGCGGCGAGCGAAGGTGGAGGTTCGGGATCCGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTTCTGTCTTCACTCTTGAAGATTTCGTGGGAGACTGGCGCCAGACGGCGGGTTACAACTTGGATCAGGTCCTTGAGCAGGGGGGGGTGTCGAGCTTGTTTCAAAACCTGGGTGTCAGCGTCACCCCTATCCAACGTATTGTCTTGTCAGGAGAGAATGGCCTGAAGATAGACATTCACGTCATCATTCCGTATGAAGGTCTGAGTGGCGACCAGATGGGACAAATAGAGAAGATTTTTAAGGTCGTTTATCCCGTGGACGATCATCATTTCAAGGTTATACTTCATTACGGTACCCTGGTTATTGATGGCGTAACCCCGAACATGATTGACTATTTCGGAAGACCGTATGAGGGTATTGCGGTCTTCGATGGCAAAAAAATCACGGTCACCGGAACATTGTGGAACGGAAACAAGATAATTGATGAGCGTCTGATCAATCCTGATGGATCGTTGTTGTTCCGCGTCACCATCAATGGAGTAACTGGGTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCG ctcgag。

B.目的基因与表达载体的双酶切

选用Nco I、Xho I限制性酶对目的基因、表达载体pET28a进行双酶切。

C.酶切后产物的连接及转化

将质粒pET28a和目的片段以1∶10(摩尔比)混匀，在T4 DNA连接酶体系下于16℃金属浴连接16h,取5μL连接产物加至100μL感受态细胞DH5α中，充分混匀。冰浴35min后，42

℃水浴热激90s，立即冰浴3min后补加37℃预热的700μL LB液体培养液，37℃，200rpm培养45min，取转化产物约100μL，涂布于LB-A固体(Amp)培养基中，37℃过夜培养，得到阳性亚克隆。

D.克隆转化

将上述步骤得到的亚克隆用天根试剂盒提取目的质粒，取10μL至100μL感受态细胞Rosseta中，充分混匀。其余转化步骤同上一步骤C，得到阳性克隆Rosseta pET28a金刚烷胺模拟表位多肽-荧光素酶。

E.多肽-荧光素酶融合蛋白的表达/

在平板上挑取上述获得的阳性克隆接种于5mL LB-A，0.5％蔗糖中，37℃，220r/min，振荡培养12h，将培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的LB-A，0.2％蔗糖培养基中，37℃，220r/min振荡培养至培养物细菌浓度OD₆₀₀达到0.6，加入终浓度为0.4mM IPTG，25℃，180r/min振荡培养16h，将诱导后的培养物于4℃，5000g，离心15min收集菌体沉淀，弃上清。重悬细胞于10mM PBS，pH 7.4(80mL/g细胞湿重)，超声破碎(200w，8min)，8000g，4℃离心15min，收集上清，用镍柱纯化，再经10mM PBS(pH：7.4)透析，获得金刚烷胺模拟表位多肽-荧光素酶融合蛋白。

实施例4基于抗原模拟表位的磁微粒酶促化学发光均相免疫方法检测金刚烷胺

1)磁微粒与金刚烷胺抗体的偶联

取200μL 10mg/mL羧基化修饰磁微粒(直径200nm)到含有800μL 50mM MES(pH6.0，含0.005％SDS)的2mL离心管中，加入新鲜配置的20mg/mL EDC和NHS溶液分别为20μL，40μL，快速混匀后，利用垂直混合仪在室温下活化30min。活化结束后，10000rpm离心15min，去上清，用1mL 0.005％SDS清洗1遍后，用10mM PB(pH7.0)补至1mL，超声10min至充分分散，再加入200μg金刚烷胺抗体充分混匀，用旋转混合仪室温偶联2h，再加入110μL 10％酪蛋白酸钠封闭1h，10000rpm离心15min,去上清，用1mL保存液(20mM Tris-HCl，1％酪蛋白酸钠，0.5％Tween-20,0.02％叠氮钠，pH 8.0)清洗一遍后，用保存液补至1mL，4℃备用。

2)检测方法的建立

将PBS、磁微粒-金刚烷胺抗体、多肽-荧光素酶融合蛋白(1mg/mL)按体积比400:2:1混合，每孔100μL加入到反应管中,再加入一系列不同浓度的100μL待测样本，37℃震荡孵育15min，磁分离5min，去上清，用PBST清洗3次，加入100μL化学发光底物液(5μg/mL腔肠素，10mM PBS，0.25mg/mLBSA，10mM EDTA二钠)，2min内用化学发光仪测定化学发光值。以RLU为纵坐标，金刚烷胺标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，IC₅₀为0.4ng/mL。

应用该标准曲线，可进行后续待测样本的金刚烷胺含量测定。

序列表

<110> 南昌富泰力诺检测应用系统有限公司

力德力诺生物技术（北京）有限公司

<120> 金刚烷胺抗原模拟表位及其在磁微粒酶促化学发光均相免疫检测方法中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Val Tyr Asn Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Ser Glu

1 5 10

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agcgtgtata acgcgctgta tctggcggcg agcgaa 36

Claims (7)

1.一种基于多肽的金刚烷胺抗原模拟表位，其氨基酸序列为：SVYNALYLAASE。

2.编码权利要求1所述抗原模拟表位的核苷酸序列。

3.编码权利要求1所述抗原模拟表位的核苷酸序列，5’-3’：AGCGTGTATAACGCGCTGTATCTGGCGGCGAGCGAA。

4.基于权利要求1所述抗原模拟表位在金刚烷胺磁微粒酶促化学发光均相免疫检测中的应用，其特征在于：包括下述步骤：

将抗原模拟表位多肽与荧光素酶进行偶联，制备多肽-荧光素酶偶联物；

将金刚烷胺单克隆抗体与磁微粒进行偶联制备磁微粒-抗体偶联物；

将多肽-酶偶联物、磁微粒-抗体偶联物置于PBS缓冲液中作为核心检测元件；

具体检测步骤：投入多肽-酶偶联物、磁微粒-抗体偶联物、待测样本提取液于反应管中，37℃孵育反应后用磁力架将磁微粒吸附于管壁，将反应管中的溶液弃去后，在管中加入荧光素酶的底物液进行发光值测定；若样本中不含有金刚烷胺，则磁微粒-抗体偶联物将全部与多肽-酶偶联物进行结合，形成磁微粒-抗体-多肽-酶复合物，加入底物后其发光值最大；若样本中含有金刚烷胺，则磁微粒-抗体将吸附待测样本中的金刚烷胺，形成部分磁微粒-抗体-金刚烷胺复合物，磁微粒-抗体-多肽-酶复合物的形成量将减少，而游离在液相中的多肽-酶复合物将增多并随后从反应管中弃去，从而导致管中的发光值降低，管中的发光值随着投入的金刚烷胺含量增大而逐步降低，形成定量反应曲线，进而可获知据具体待测样本中的金刚烷胺含量。

5.权利要求4所述检测方法中使用的多肽-荧光素酶偶联物，其特征在于：为金刚烷胺抗原模拟多肽与荧光素酶的融合蛋白。

6.权利要求5所述多肽-荧光素酶偶联物的制备方法，其特征在于：采用基因工程重组表达的方式，将抗原模拟表位多肽的基因序列通过柔性linker与纳米荧光素酶基因连接，克隆至原核表达载体，表达融合蛋白获得。

7.权利要求4所述检测方法中使用的磁微粒，其特征在于：由磁性内核及包覆其内核外表面的外壳组成，直径范围为100-2000nm。

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