CN114736292B

CN114736292B - 靶向诺如病毒蛋白的纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN114736292B
Application number: CN202210651337.3A
Authority: CN
Inventors: 叶其壮; 王梓杨; 白晓康; 陈锦德; 肖利群
Original assignee: Guangzhou Ming Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Ming Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-10
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2023-03-07
Anticipated expiration: 2042-06-10
Also published as: CN114736292A

Abstract

诺如病毒是一种能引起急性胃肠炎的病毒。本发明公开了两个靶向诺如病毒衣壳蛋白的纳米抗体，以及它们的表达、纯化和鉴定。靶向诺如病毒的纳米抗体可以用于诺如病毒的环境监控和诺如病毒感染的临床诊断和治疗。

Description

靶向诺如病毒蛋白的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术和生物医药领域，特别是对诺如病毒传播的监控和对诺如病毒感染疾病的诊断与治疗。

背景技术

诺如病毒（Norovirus）是由Kapikian于1972年通过使用免疫电镜法，对1968年在美国诺瓦克市（Norwalk）暴发的急性胃肠炎患者粪便进行检测时发现的。现今，诺如病毒已经成为了非细菌性急性腹泻的主要成因，美国每年所有的非细菌性腹泻暴发中，60%~90%是由诺如病毒引起的。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒的检出率为15%左右。但是到目前为止，市面上尚没有能够有效治疗诺如病毒感染的特效药。因此，研究快速并准确的诺如病毒早期检测方法，对于该病毒的防治具有深远的意义。

抗体是免疫检测的关键原材料，检测依赖于抗原与抗体的特异性结合。用于免疫检测的单克隆抗体主要以实验小鼠为宿主进行制备，由诺如病毒感染小鼠，免疫成功的小鼠在无菌条件下取其脾脏，将其与骨髓瘤细胞进行融合，通过ELISA等方法筛选出阳性克隆。筛选得到的细胞经过克隆化后形成稳定的细胞株，将此细胞株进行体外培养或小鼠体内诱生腹水形成，再从培养基或者腹水中纯化即可得到抗诺如病毒的单抗，最后用蛋白质印迹法等方法进行鉴定即可。

目前通过上述手段进行制备的诺如病毒特异性抗体为传统单克隆抗体，而单克隆抗体存在以下不足：生产周期长，制备成本高，较高的免疫原性，在机体内不易被清除，组织穿透能力弱。纳米抗体是羊驼类动物抗体的片段，是常规抗体的简化，保留了抗体与抗原结合的部分，保留了常规抗体对抗原的亲和性和特异性，有部分取代常规抗体的潜力，特别是在诊断试剂领域。有报道描述了三个针对诺如病毒的纳米抗体（Ruoff, K., et al. JVirol 93:e02005-18）。纳米抗体是新型抗体材料，还处于发展阶段，目前市面上还鲜有纳米抗体产品，靶向诺如病毒的纳米抗体的产品更是空缺。

诺如病毒是一类单链RNA无包膜病毒，属杯状病毒科。诺如病毒蛋白包括结构蛋白（VP1和VP2）和病毒复制相关的非结构蛋白。目前根据完整的VP1基因氨基酸多样性和ORF1上编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）区域的核苷酸多样性分别构建系统发生树，可以将诺如病毒分为不同的基因组（Genogroup，G）和聚合酶组（P），并进一步分为多种基因型和P型。其中GI、GII、GIV、GVIII和GIX感染人，GI和GII是引起人类感染性腹泻的两个主要基因组。因此，开发鉴别诺如病毒的诊断试剂要考虑到诺如病毒的多样性，同样诺如病毒与抗体结合的表位的多样性，要有多种多样的靶向诺如病毒的常规抗体和纳米抗体，满足诺如病毒相关诊断与治疗的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供两种靶向诺如病毒衣壳蛋白的纳米抗体，该纳米抗体对诺如病毒衣壳蛋白抗原有高亲和力，可用于诺如病毒的分离、检测和治疗，特别是检测试剂盒的研发，具有良好的应用前景。

一般来讲，纳米抗体的氨基酸序列由大约100-130个氨基酸残基组成，有四个骨架区（FM1-4）和三个互补决定区（CDR1-CDR3），按顺序交错排列构成。本发明公布了两个靶向诺如病毒的纳米抗体Nor2和Nor3，它们具有相同的四个骨架区和不同的三个互补决定区氨基酸序列。纳米抗体Nor2的互补决定区分别由SEQ ID NO: 1对应其CDR1、SEQ ID NO: 2对应其CDR2、SEQ ID NO: 3对应其CDR3。同样的，纳米抗体Nor3的互补决定区分别由SEQ IDNO: 4对应其CDR1、SEQ ID NO: 5对应其CDR2、SEQ ID NO: 6对应其CDR3。

本发明公布的两个靶向诺如病毒蛋白的纳米抗体Nor2和Nor3，除了三个互补决定区对抗原的识别起决定性作用外，四个骨架区对互补决定区的空间结构有影响、进而影响对抗原的识别。因而，纳米抗体Nor2和Nor3的完整氨基酸序列也是决定抗原识别的重要基础。Nor2的完整氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，Nor3的完整氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

本发明公布的靶向诺如病毒蛋白的纳米抗体两个都含有122个氨基酸残基，形成该纳米抗体的核心结构。纳米抗体的核心结构本身，在不增加氨基酸残基的情况下，具有与所述抗原蛋白的高亲和性和高特异性。实际上，纳米抗体常以融合蛋白的形式存在，即在纳米抗体的核心结构的N末端或C末端加上多肽和蛋白，形成融合蛋白，在保留原本纳米抗体的高亲和性和高特异性的同时，赋予融合蛋白更多的特性和功能。例如在淘选和鉴定本发明公布的纳米抗体的过程中，在其C末端与作为蛋白标签（如组氨酸标签、人流感血凝素标签）的多肽融合，使其能够用镍柱进行纯化、用抗人流感血凝素抗体进行鉴定。编码纳米抗体Nor2与组氨酸标签和人流感血凝素标签构成的融合蛋白的完整核酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码纳米抗体Nor3与组氨酸标签和人流感血凝素标签构成的融合蛋白的完整核酸序列如SEQ ID NO: 10所示。

对纳米抗体在蛋白基因水平加以修饰，是纳米抗体相对于常规抗体的明显优势，有成熟的分子生物学方法，融合蛋白也是常见的纳米抗体具体体现的形式。可以与纳米抗体融合的多肽和蛋白多种多样，包括各种蛋白标签（组氨酸标签His，人流感病毒血凝素标签HA，FLAG标签，MBP标签、Myc标签、等）、绿色荧光蛋白、碱性磷酸酶、发光酶、谷胱甘肽转移酶、毒素蛋白、抗体Fc片段、等。融合蛋白使具有靶向抗原功能的纳米抗体有了更多的功能，如与荧光蛋白融合显色和显荧光用于示踪、与细胞毒蛋白融合成为免疫毒素（immunotoxins）用于治疗等。

更进一步，通过对纳米抗体或纳米抗体构建的融合蛋白加以化学修饰，可以赋予修饰后的纳米抗体蛋白更多的特性和功能。例如在实施例中描述的，本发明公布的纳米抗体在鉴定过程中，对其进行生物素化，使其能够与亲和素或链霉亲和素结合、更便于定量。

本发明公布的靶向诺如病毒蛋白的两个纳米抗体都只有122个氨基酸残基，结构明确，抗体蛋白表面的可修饰基团的定位也很明确，可以对本发明的纳米抗体或纳米抗体构建的融合蛋白进行化学修饰，常用的修饰位点是修饰在赖氨酸残基上的氨基、谷氨酸和天冬氨酸的羧基、等。为了使修饰更方便、使修饰定位和定量更加准确，也可以在纳米抗体的N末端、C末端或其他特定部位引入特定的化学修饰基团，然后对其进行化学修饰，如引入半胱氨酸得到特定可修饰位点的巯基。与氨基、羧基、巯基的蛋白修饰反应多种多样，技术成熟。如与异硫氰酸荧光素（FITC）反应，或活化的生物素反应，发生在纳米抗体的氨基上，得到具有荧光的、或生物素化的纳米抗体。可以对本发明的纳米抗体进行化学修饰的材料多种多样，包括亲和层析填料、量子点、磁珠、彩色微球或荧光微球、蛋白（如辣根过氧化物酶）、化学小分子等。对所述的化学修饰的材料的要求是具有可以用于化学修饰的活性基团或可活化基团，如羧基、氨基、巯基、等。

具体的纳米抗体的应用场景很多。举例一是纳米抗体Nor2和Nor3与磁珠结合，用于诺如病毒的浓缩和分离。市售的磁珠有很多在表面具有氨基或羧基等可修饰基团，纳米抗体表面也有可修饰基团，因而可以通过成熟的蛋白偶联方法（如重氮法、戊二醛法、戊二酸酐法、碳化二亚胺法、等），将纳米抗体与磁珠共价键连接。溶液中，纳米抗体识别并结合诺如病毒，纳米抗体与磁珠的偶联物可以用磁场将诺如病毒捕获、富集、分离。举例二是用纳米抗体Nor2或Nor3构建定量免疫检测试剂盒。制备酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒时，用诺如病毒抗原蛋白包被酶标板，加入含有诺如病毒的待测溶液，再加入生物素化的纳米抗体蛋白。溶液中诺如病毒上的抗原将与包被在酶标板上的诺如病毒抗原，竞争性地与生物素化的纳米抗体蛋白结合。洗涤后，留下的、能够与酶标板上包被的诺如病毒抗原结合的纳米抗体的量，反映出待测溶液中诺如病毒的含量。该纳米抗体的量，可以用亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）偶联蛋白进行定量。

对本发明公布的纳米抗体加以蛋白融合和化学修饰，在这些纳米抗体对诺如病毒特异识别的基础上，赋予了诸如颜色、荧光、磁性、生物活性、等外加功能，使其在病毒分离和浓缩、病毒的检测、病毒的清除、等方面有广泛的应用前景。

附图说明

图1为纳米抗体Nor2和Nor3的蛋白电泳结果。

图2为纳米抗体Nor2和Nor3对病毒蛋白抗原的亲和性分析结果。

图3为纳米抗体Nor2，在Nor3存在与否时，对病毒蛋白抗原的亲和性分析结果。

图4为纳米抗体Nor3，在Nor2存在与否时，对病毒蛋白抗原的亲和性分析结果。

图5为纳米抗体Nor2和Nor3的氨基酸全长序列和CDR区域。CDR1，CDR2和CDR3区域分别用下划线标注。

具体实施方式

在本发明的研究中，纳米抗体文库的库容量和多样性是淘选出高特异性、高亲和力纳米抗体的关键。本发明使用的合成文库的最终库容量达到8×10⁹ pfu，保证了文库的多样性。抗原采用的是诺如病毒的衣壳蛋白VP1，抗原蛋白的克隆和表达可以参见文献（Leuthold, M.M., et al. J. Vis. Exp. (110), e53845）。本发明采用固相淘选的方式，淘选过程中，聚苯乙烯塑料平板上包被诺如病毒的衣壳蛋白抗原，用噬菌体展示的纳米抗体文库进行生物淘选。抗原的纯度、抗原的包被浓度、封闭液的种类和浓度、PBST的浓度、噬菌体投入量、结合时间以及洗脱时间等因素都会影响噬菌体颗粒的富集情况。本发明筛选过程采用不封闭和5%牛奶交替封闭手段、逐渐加大洗涤强度等方式来提高生物淘选的特异性，通过优化淘选条件以获得具有高特异性、高亲和力的纳米抗体。

实施例一、噬菌体展示文库的淘选

按照结合、洗涤、洗脱及扩增的方式，对噬菌体展示文库进行亲和淘选，采用诺如病毒衣壳蛋白VP1抗原包被，作为淘选靶向诺如病毒纳米抗体的抗原，并通过不封闭与5%牛奶交替封闭的方法来降低非特异性吸附。淘选的具体步骤如下。在八连孔酶标条的孔中分别加入100 μL浓度为10 μg/mL（1 μg/孔）的病毒蛋白抗原，37 °C包被2小时。弃去上清，用0.05% PBST洗涤酶标条5次。封闭时，每孔加入200 μL 5%牛奶，37 °C封闭2小时。弃去封闭液，0.05% PBST洗涤酶标条5次。每孔加入100 μL噬菌体文库悬液（库容为8×10⁹ pfu，滴度为1×10⁹ cfu/mL），室温摇床震荡孵育1小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次。每孔加入100 μL 0.2 M Gly-HCl洗脱缓冲液（pH 2.2）进行洗脱，室温静置洗脱10分钟后将洗脱液收集至1.5 mL离心管中。加入120 μL 1 M Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）进行中和，涡旋混匀，取20 μL保存作为测定滴度样本，剩下的样本全部进行扩增后用于下一轮淘选。

实施例二、阳性克隆的鉴定

从测定滴度的平板上随机挑取单菌落进行噬菌体的拯救纯化，之后采用ELISA方法进行阳性克隆的鉴定。具体步骤如下。在八连孔酶标条的孔中分别加入100 μL浓度为10μg/mL（1 μg/孔）病毒蛋白抗原，37 °C包被2小时。弃去上清，PBST洗涤酶标条5次。每孔加入200 μL 5%牛奶，并另外多做一条作为阴性对照，37 °C封闭2小时。PBST洗涤酶标条5次。每孔加入100 μL扩增后的单克隆噬菌体悬液，室温摇床震荡孵育1小时。PBST洗板5次。每孔加入100 μL 小鼠抗人流感血凝素（HA）一抗，室温摇床震荡孵育1小时。PBST洗板5次。每孔加入100 μL 羊抗鼠二抗，室温摇床震荡孵育45分钟。PBST洗板5次，在纸上将酶标条内的液体尽可能拍干。每孔加入100 μL TMB显色液，显色至合适深度的颜色。每孔加入100 μL 1 M的HCl溶液终止反应，然后立即用酶标仪读取OD₄₅₀数值。将阳性样本送测序，确定纳米抗体的氨基酸序列。Nor2和Nor3是淘选中得到的两个阳性克隆。

实施例三、纳米抗体Nor2和Nor3与组氨酸标签和人流感病毒血凝素标签的融合

噬菌体展示文库中，纳米抗体是与M13噬菌体的衣壳蛋白P3融合，展示在噬菌体颗粒的表面。我们将得到的纳米抗体Nor2和Nor3的碱基序列用限制性内切酶NdeI和XhoI切为基因片段，插入到pET23a质粒中，在纳米抗体的C末端引入了组氨酸标签和人流感病毒血凝素标签，便于重组蛋白用镍柱分离纯化和鉴定。纳米抗体Nor2和Nor3的融合蛋白的C末端氨基酸序列是：GQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYALEHHHHHH*。

实施例四、纳米抗体Nor2和Nor3在大肠杆菌中的表达和纯化

取1 μL构建好含有纳米抗体目的基因的pET23a质粒加入到50 μL大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，冰上放置30分钟后，放入42°C水浴锅中热激60秒。冰上放置5分钟后，向菌液中加入450 μL SOC培养液。混匀后，置于37°C摇床200 rpm震荡培养复苏1小时。然后，吸取200 μL菌液涂布到LB+Amp固体平板上，将液体吹干后，将平板倒置放入37°C培养箱中培养过夜。第二天从过夜培养的平板上挑取单克隆，置于5 mL LB+Amp培养液中，37°C摇床200 rpm震荡培养8 小时后，将菌液全部转移至330 mL TB+磷酸盐+Amp培养液中，30 °C摇床200 rpm培养过夜。第三天将菌液离心收集后，用1×磷酸盐缓冲液（20 mM，pH 7.4）进行重悬，然后将其进行超声破碎。条件为150 w的75%即112.5 w，破碎5秒，间歇20秒。然后4°C，20,000 rpm离心20分钟后，分别收集超声上清与超声沉淀，超声上清置于-20 °C保存。通过对超声沉淀进行变性复性来获取浓度及纯度更高的蛋白。用10 mL 2 M尿素溶液重悬超声沉淀样本，加入2 M尿素溶液至40 mL洗涤包涵体。4°C，8,000 rpm，离心10分钟。用10 mL8 M尿素溶液重悬洗涤后的沉淀，加8 M尿素溶液至35 mL溶解包涵体，将其置于室温摇床80rpm振荡小时。然后将它们通过4°C，10,000 rpm离心20分钟。收集上清液（含变性目的蛋白）并保留沉淀。蛋白变性后通过透析进行复性，采用阶梯降低尿素浓度进行透析，取15 mL 8M 尿素变性上清液（目的蛋白样本）快速加入15 mL 1×PBS，使得8 M尿素溶液浓度降为4M。用600 mL 2 M尿素溶液进行透析（4°C冰箱中搅拌透析液）1小时。倒掉200 mL透析液，加入200 mL 1 M尿素溶液，然后透析过夜。第二天倒掉200 mL透析液，加入200 mL PBS，继续透析1小时。倒掉200 mL透析液，加入200 mL PBS，继续透析1小时。倒掉200 mL透析液，加入200 ml PBS，继续透析1小时。透析结束后收样，复性后蛋白溶液通过4°C，10000 rpm离心25分钟。收集上清，收集到的上清液即为复性后蛋白溶液。经变性复性后的纳米抗体，经过蛋白电泳后结果如图1所示，结果表明C末端带有标签的纳米抗体Nor2和Nor3相对分子质量在15-20 kDa之间，与理论分子质量相符，且纯化后的条带无明显杂带，表明两种纳米抗体纯度较高。

实施例五、纳米抗体Nor2和Nor3的生物素化修饰

准确称量NHS-Biotin试剂，使用DMSO将其溶解为10 mM溶液，取出已纯化好的Nor2或Nor3蛋白样本，使用1×PBS（20 mM，pH 7.4）将其稀释成浓度为1 mg/mL，以8:1的摩尔比加入上述NHS-Biotin试剂（No2与No3蛋白大小约为15 kDa，换算后加入的试剂体积为3.6 μL），然后将其置于室温50 rpm摇床上振荡孵育1小时。上述样本生物素化后需要经过脱盐纯化处理，使用葡聚糖凝胶（Sephadex G-25 Resin）柱进行纯化，纯化时使用1×PBS（20 mM，pH 7.4）对纯化柱进行平衡，平衡后加入生物素化蛋白样本，使用考马斯亮蓝R-250对流出液体进行检测，当流出液体遇考马斯亮蓝变蓝时，即刻收集流出液，收集完后使用PBS对纯化柱进行冲洗，最后加入20%乙醇保存纯化柱。上述纯化收集后即为制备好的生物素化的纳米抗体蛋白样本，分别命名为Nor2-biotin与Nor3-biotin。

实施例六、纳米抗体Nor2和Nor3对病毒蛋白抗原亲和力检测

通过ELISA实验测定纳米抗体Nor2和Nor3对病毒蛋白抗原的EC50并作出曲线。在八孔酶标条中每孔分别加入100 μL浓度为10 μg/mL的病毒蛋白抗原，37°C包被2小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次。每孔分别加入100 μL浓度为10 μg/mL的纳米抗体样本（含有0.05% Tween-20），2倍梯度稀释样本16个点，室温摇床震荡孵育1小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次，每孔分别加入100 μL稀释度为1:5000的鼠源的抗组氨酸标签一抗，室温摇床震荡孵育1小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次。每孔分别加入100 μL稀释度为1:5000的羊抗鼠二抗，室温摇床震荡孵育1小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次，在吸水纸上尽量地拍干酶标条。然后每孔分别加入100 μL TMB显色液，显色时间根据显色的情况把握，一般为5-10 分钟。达到合适的显色深度后则每孔加入100 μL 1 M HCl终止反应，终止反应后立刻通过酶标仪读取OD₄₅₀的数值，最后通过Microsoft excel进行数据分析与作图。ELISA的结果如图2所示，纳米抗体Nor2和Nor3的EC50值分别为167与79 ng/mL，亲和力表现较好。

实施例七、纳米抗体Nor2和Nor3的相互竞争检测

通过竞争ELISA实验测定纳米抗体与病毒蛋白抗原结合的特异性。在八孔酶标条中每孔分别加入100 μL浓度为10 μg/mL的病毒蛋白抗原，37°C包被2小时。弃去上清，0.05%PBST洗涤酶标条5次。每孔分别加入100 μL浓度为10 μg/mL的纳米抗体Nor2或Nor3，然后每孔分别再加入100 μL浓度为10 μg/mL的Nor3-biotin与Nor2-biotin（即生物素化的Nor2与Nor3抗体）样本，2倍梯度稀释样本16个点，室温摇床震荡孵育1小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次。每孔分别加入100 μL稀释度为1:10000的链霉亲和素-HRP抗体，室温摇床震荡孵育1小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次，在吸水纸上尽量地拍干酶标条。然后每孔分别加入100 μL TMB显色液，显色时间根据显色的情况把握，一般为5-10 min。达到合适的显色深度后则每孔加入100 μL 1 M HCl终止反应，终止反应后立刻通过酶标仪读取OD₄₅₀的数值，最后通过Microsoft excel进行数据分析与作图。ELISA的结果如图3所示，在加入Nor2抗体后，其先于病毒蛋白抗原结合，后续Nor3抗体与病毒蛋白抗原的结合曲线明显右移，EC50增大；同样，在加入Nor3抗体后，其先于病毒蛋白抗原结合，后续Nor2抗体与病毒蛋白抗原的结合曲线明显右移，EC50增大。结果显示纳米抗体Nor2和Nor3特异地结合在病毒蛋白抗原的同一表位。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 广州明药科技有限公司

<120> 靶向诺如病毒蛋白的纳米抗体及其应用

<130> to be filed

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<211> 7

<212> PRT

<213> hybride

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<211> 7

<212> PRT

<213> hybride

<400> 2

Thr Ile Asn Gly Gly Thr Ser

1 5

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<212> PRT

<213> hybride

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1 5 10

<210> 4

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<212> PRT

<213> hybride

<400> 4

Tyr Ile Ser Ser Pro Val Ser

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> hybride

<400> 5

Gly Ile Ser Arg Gly Thr Thr

1 5

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> hybride

<400> 6

Val Phe Ser Ser Arg Lys Tyr Asn Ile Ser His Val Tyr Arg

1 5 10

<210> 7

<211> 122

<212> PRT

<213> hybride

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Pro Ile Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Gly Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Phe Ala Phe Arg Arg His Phe Met Asn Gln Tyr Tyr Arg Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 122

<212> PRT

<213> hybride

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ser Ser Pro Val

20 25 30

Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Arg Gly Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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Val Phe Ser Ser Arg Lys Tyr Asn Ile Ser His Val Tyr Arg Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 444

<212> DNA

<213> synthetic

<400> 9

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cgtttaagct gtgcagcatc tggttacatt tttcccatct acgccatggg ttggtatcgt 120

caagcaccag gtaaagaacg cgaattagtt gccaccatta acggcggtac cagcacctat 180

tatgcggata gcgtgaaagg tcgttttact atttctcgtg ataatgcaaa aaatactgtt 240

tatttacaaa tgaattcttt aaaaccagaa gatactgcag tgtattattg tgcagcgttt 300

gcttttcgcc gtcattttat gaatcagtat tatcgttatt ggggtcaagg tactcaagtt 360

actgtttctt ctggccaggc cggccagcac catcaccatc accatggcgc atacccgtac 420

gacgttccgg actacgctct cgag 444

<210> 10

<211> 444

<212> DNA

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<400> 10

catatgcaag tacagctgca agaatctggt ggtggtctgg ttcaggccgg tggatcctta 60

cgtttaagct gtgcagcatc tggttacatt tctagccccg tcagcatggg ttggtatcgt 120

caagcaccag gtaaagaacg cgaattagtt gccggtattt ctagaggtac tactacctat 180

tatgcggata gcgtgaaagg tcgttttact atttctcgtg ataatgcaaa aaatactgtt 240

tatttacaaa tgaattcttt aaaaccagaa gatactgcag tgtattattg tgcagtgttt 300

agttctagga agtacaatat ttctcacgtt tataggtatt ggggtcaagg tactcaagtt 360

actgtttctt ctggccaggc cggccagcac aatcaccatc accatggcgc atacccgtac 420

gacgttccgg actacgctct cgag 444

Claims

1.靶向诺如病毒蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区CDR1, CDR2, CDR3分别由SEQ ID NO: 1-3所示；或分别由SEQ ID NO: 4-6所示。

2.靶向诺如病毒蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO: 7或8所示。

3.纳米抗体与多肽和蛋白融合构建的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白含有：（a）权利要求1或2所述的纳米抗体；和（b）选自下组的多肽和蛋白的融合部分：蛋白标签、碱性磷酸酶、谷胱甘肽转移酶、毒素蛋白、和抗体Fc片段。

4.权利要求3所述的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白的融合部分为组氨酸蛋白标签和人流感血凝素蛋白标签。

5.编码纳米抗体融合蛋白的核酸序列，其特征在于，（a）含有权利要求4所述的纳米抗体融合蛋白，（b）缺失信号肽，导致融合蛋白表达在细胞浆内，（c）核酸序列分别由SEQ IDNO: 9或10所示。

6.表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求5所述的核酸序列；表达载体的宿主细胞为大肠杆菌。

7.纳米抗体或纳米抗体融合蛋白经化学修饰产生的衍生物，其特征在于，该衍生物含有：（a）权利要求1或2所述的纳米抗体，或权利要求3所述的纳米抗体融合蛋白，和（b）选自下组的修饰纳米抗体的衍生部分：亲和层析填料、量子点、磁珠、彩色微球或荧光微球、和化学小分子；所述化学小分子包括生物素；纳米抗体与衍生部分通过共价键偶联。

8.权利要求1或2所述的纳米抗体，权利要求3所述的纳米抗体融合蛋白，或权利要求7所述纳米抗体衍生物的用途，其特征在于，用于制备诺如病毒的（a）分离浓缩介质、（b）检测和诊断试剂、和（c）治疗性抗体。