CN104480072A - 一种分泌抗金刚烷胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分泌抗金刚烷胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。所述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株7G4.3，保藏编号为CCTCC No.C2014169。本发明利用自行设计的金刚烷胺人工抗原免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾细胞制备获得杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗金刚烷胺单克隆抗体，效价高，特异性强，可用于对金刚烷胺进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌抗金刚烷胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
金刚烷胺可以抑制病毒繁殖，临床上用于预防和治疗各种A型流感病毒的感染。但由于经济利益驱使和疫病防控的压力，我国目前家禽饲养中存在滥用金刚烷胺的现象。金刚烷胺的残留蓄积会对食用者产生嗜睡、失眠、眩晕、抑郁、恶心等症状；长期使用还将使禽流感等病毒产生耐药性，诱导产生新型耐药病毒。
然而，2012年11月媒体曝出国内养殖的“速生鸡”从孵出到端上餐桌只需45天，不法商贩为了保证其存活，给鸡喂养了大剂量人用药物来抑制禽类的禽流感等病症。2012年12月，央视调查中称，一些养殖户为进一步缩短养殖周期，让原本已经是速成品种的白羽鸡长得更快，偷偷喂食违禁药物，其中包括金刚烷胺等抗病毒药品和地塞米松等激素类药品。“速成鸡”事件的爆发引发了全国消费者对禽肉食品安全的广泛关注和担忧，对建立快速、灵敏、准确的检测技术提出了迫切需求。
目前，对金刚烷胺的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、质谱法(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时的缺陷，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速、准确的要求。
免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。近年来，美国已开发了用于检测金刚烷胺的酶联免疫试剂盒，但检测成本较高，操作相对复杂。
杂交瘤技术能有效制备单克隆抗体，其原理是利用聚乙二醇为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测、筛选和单个细胞培养(克隆化)，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。
杂交瘤技术制备单克隆抗体的核心是获得理想的杂交瘤细胞株，但现有技术中还未有能分泌抗金刚烷胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
发明内容
本发明提供了一种分泌抗金刚烷胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能产生高效价的抗金刚烷胺单克隆抗体。
一种分泌抗金刚烷胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株7G4.3，已于2014年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.C2014169；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。
本发明采用小剂量肌肉注射免疫方法和腹腔免疫相结合的方法，利用金刚烷胺人工抗原注射小鼠，获得免疫的小鼠脾细胞，进而将免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，从而获得所述杂交瘤细胞株。
金刚烷胺本身的分子量太小，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，因此本发明对金刚烷胺进行化学修饰，获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的金刚烷胺人工抗原。所述金刚烷胺人工抗原的分子结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，BGG为牛丙种球蛋白。
每次注射时，金刚烷胺人工抗原的用量为10μg。
采用小剂量肌肉注射免疫方法和腹腔免疫相结合的方法免疫小鼠，免疫效价高。
本发明还提供了所述杂交瘤细胞株在制备金刚烷胺检测试剂盒中的应用；提供了所述杂交瘤细胞株在制备用于检测金刚烷胺的试纸条中的应用。
将所述杂交瘤细胞株扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中可得到高效价的抗金刚烷胺单克隆抗体，利用该抗金刚烷胺单克隆抗体可用于制备金刚烷胺检测试剂盒。
本发明还提供了一种抗金刚烷胺单克隆抗体，由所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
本发明还提供了所述抗金刚烷胺单克隆抗体在检测金刚烷胺中的应用。
本发明还提供了一种金刚烷胺的检测试剂盒，含有所述的抗金刚烷胺单克隆抗体。
作为优选，所述检测试剂盒为竞争型酶联免疫试剂盒；其内含有包被有所述抗金刚烷胺单克隆抗体的酶标板、金刚烷胺标准品、酶标金刚烷胺、底物和终止液。使用时，待检测样品和酶标金刚烷胺一起加入酶标板反应，若检测样品中残留有金刚烷胺，则会与酶标金刚烷胺抗原竞争结合酶标板板上的抗体，再加入底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的金刚烷胺量成反比。根据金刚烷胺标准品做出的标准曲线，计算出样品中的金刚烷胺的含量。
本发明还提供了一种用于检测金刚烷胺的试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，所述标记物垫包被有胶体金标记或酶标记的所述抗金刚烷胺单克隆抗体。
本发明的试纸条中，所述反应膜的检测线(T线)处包被有金刚烷胺-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。所述二抗可选用羊抗鼠IgG。
本发明的试纸条也是以竞争抑制ELISA原理制备的，金刚烷胺-牛血清白蛋白复合物的包被量也是以所述抗金刚烷胺单克隆抗体对金刚烷胺的检测限为宜。检测时，若只有C线显色，表示待测样品中含有金刚烷胺且检测金刚烷胺的含量高于检测限；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测金刚烷胺的含量低于检测限，或待测样品中无金刚烷胺；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明利用自行设计的金刚烷胺人工抗原免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾细胞制备获得杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗金刚烷胺单克隆抗体，效价高，特异性强，可用于对金刚烷胺进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
附图说明
图1为本发明一种金刚烷胺胶体金检测试纸条的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
实施例1杂交瘤细胞株的制备
(1)小鼠免疫
选择8周龄的BALB/c雌鼠用金刚烷胺人工抗原10μg与quick antibody-5w佐剂等体积混合成100μl，注射小鼠后小腿肌肉；所述的后小腿肌肉部位为小鼠腿部暴露在外部有大块肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被腹部皮肤包裹，也可找到膝关节区分小腿大腿；两周后同样方式注射 第2针；再2周后，用10μg抗原进行腹腔注射。
金刚烷胺人工抗原的分子结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，BGG为牛丙种球蛋白。
(2)制备淋巴细胞
取经步骤(1)处理的BALB/c雌鼠的脾脏，研磨脾脏细胞至悬液；淋巴细胞悬液离心，取沉淀；在沉淀中加入含有15％胎牛血清的IMDM培养基，调整淋巴细胞至10ml；加入金刚烷胺人工抗原至终浓度100μg/ml孵育培养6小时。
(3)淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合：
(3-1)饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75％酒精中消毒10min，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，用无菌注射器注入8mL 37℃预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；1500rpm下离心3min，沉淀物用1×HAT的IMDM培养液重悬，得到饲养细胞悬液。
(3-2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10％的FBS的IMDM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代，以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长状态良好用于细胞融合。
(3-3)淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合：将调整浓度后的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为2：1混合均匀，1500rpm下离心洗涤细胞1次，去除上清液，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀松动，置于37℃水浴，在90s内缓缓加入1mL 37℃预温的1mL PEG 1450，边加边轻微摇动；加入25ml 37℃预温的IMDM无血清培养基终止PEG作用；1000rpm下离心5min，取沉淀；然后在沉淀中加入步骤(3-1)制备的饲养细胞悬 液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(4).杂交瘤细胞的融合筛选
(4-1)初筛：
步骤(3-3)中融合细胞在5％CO2培养箱中培养3天后，换用1×HT的IMDM培养液，继续培养4天后，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇(在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小以占满1/3视野为宜)时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。
间接ELISA方法的操作步骤是：
①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释金刚烷胺抗原至1μg/mL，96孔酶标板每孔中分别加入100μl稀释后的金刚烷胺人工抗原，4℃包被过夜，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；
②将PBS缓冲液加入到融合细胞培养上清液稀释至25倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的融合细胞培养上清液，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；
③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；
④每孔加入50μl底物TMB，37℃下反应8分钟；
⑤加入50μl浓度为2M的H2SO4终止反应，在450nm下测定其OD值，以融合细胞培养上清液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性克隆，将筛选到的阳性克隆进一步地用竞争抑制ELISA方法进行复筛。
(4-2)复筛：
竞争抑制ELISA方法的操作步骤是：
①取包被有金刚烷胺人工抗原的酶标板，先向酶标孔中加入50μl浓度为500ng/ml的金刚烷胺标准品，再加入50μl步骤(4-1)得到的阳性克隆培养上清液，混合；同时设计空白对照，即先向酶标孔中加入50μl PBS缓冲液，再加入50μl阳性克隆培养上清液，混合，37℃孵育60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；
②将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃下孵育30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；
③每孔加入50μl底物TMB，37℃下反应8分钟；
④加入50μl浓度为2M的H2SO4终止反应，在450nm下测定其OD值，计算竞争抑制率，结果如表1所示。
表1各杂交瘤细胞株的竞争抑制ELISA结果
| 细胞株 | 对照OD值 | 竞争抑制OD值 | 竞争抑制率 |
| 1D2 | 1.938 | 1.495 | 22.9％ |
| 2E7 | 1.906 | 0.944 | 50.5％ |
| 2G3 | 1.607 | 1.010 | 37.1％ |
| 3F4 | 1.593 | 0.869 | 45.4％ |
| 3C6 | 1.327 | 0.819 | 38.3％ |
| 4A5 | 1.371 | 0.874 | 36.3％ |
| 5F3 | 0.521 | 0.342 | 34.4％ |
| 7G4 | 1.175 | 0.465 | 60.4％ |
由表1可见，杂交瘤细胞株7G4.3的竞争抑制率最高，故挑取杂交瘤细胞株7G4.3做克隆培养。
(4-3)杂交瘤细胞株7G4.3的克隆化
杂交瘤细胞株7G4.3的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含体积分数为15％的FBS的IMDM培养基稀释成4个/mL的细胞悬液，然后以每孔200μl接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况，并检测细胞培养板中细胞培养上清液的抗体水平，选择3个抗体效价最高的单克隆，再次做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率达到100％；然后挑取单克隆细胞，命名为7G4.3，扩大培养后进行抗金刚烷胺单克隆抗体纯化。
(5)抗金刚烷胺单克隆抗体纯化
取扩大培养后的杂交瘤细胞株7G4.3，接种1×106细胞于小鼠腹腔，10天后采集腹水。取12ml腹水，用2倍体积的PBS稀释，再加入3倍体积的饱和硫酸铵，将得到混合液离心，取沉淀。沉淀用pH7.4的PBS溶解，然后用pH7.4的PBS透析过夜4次。收集抗体溶液，过滤。用OD280测定蛋白含量,蛋白浓度为3.47mg/ml。
实施例2抗金刚烷胺单克隆抗体的反应活性测试
采用间接ELISA方法检测实施例1制备的抗金刚烷胺单克隆抗体的反应活性，检测步骤包括：①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释金刚烷胺人工抗原至500ng/mL，然后在96孔酶标板中分别加入100μl/每孔稀释后的金刚烷胺人工抗原，4℃包被过夜；
②用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后加入100μl浓度为0.3μg/ml的抗金刚烷胺单克隆抗体溶液，做1:3稀释，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；
③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中加入100μl/每孔稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后每孔加入50μl底物TMB 37℃反应8分钟后，浓度为2M的H2SO4终止反应，450nm测定其OD值，以抗金刚烷胺单克隆抗体溶液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性值；检测结果见表2。
表2不同浓度下抗金刚烷胺单克隆抗体的OD450值
| 抗金刚烷胺单克隆抗体浓度 | OD450值 |
| 0.3μg/ml | 2.109 |
| 0.1μg/ml | 1.748 |
| 0.03μg/ml | 1.129 |
| 0.01μg/ml | 0.603 |
| 0.003μg/ml | 0.253 |
| 0.001μg/ml | 0.187 |
| 0.0003μg/ml | 0.129 |
| PBS(空白对照) | 0.074 |
由表2可见，实施例1制备的抗金刚烷胺单克隆抗体反应活性可以到达0.001μg/ml。
实施例3
如图1所示，本实施例一种金刚烷胺胶体金检测试纸条，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾搭接在底板上。其中，胶体金垫上包被有胶体金标记的实施例1制备的抗金刚烷胺单克隆抗体，硝酸纤维素膜的检测线(T)处包被有金刚烷胺-牛血清白蛋白复合物，质控线(C)处包被有羊抗鼠IgG。金刚烷胺-牛血清白蛋白复合物的包被量为抗金刚烷胺单克隆抗体对金刚烷胺的检测限(以20μg/kg为例)。试纸条的制备方法为本领域的常规方法。
检测时，室温下将试纸条样品垫的一端插入待测样品中，注意待测样品的液面不要超过试纸条上的MAX线；肉眼观察，并记录C线和T线的显色情况。
若只有C线显色，表示待测样品中含有金刚烷胺且检测金刚烷胺的含量高于20μg/kg；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测金刚烷胺的含量低于20μg/kg，或待测样品中无金刚烷胺；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。
Claims (9)
1.一种分泌抗金刚烷胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株7G4.3，保藏编号为CCTCC No.C2014169。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备金刚烷胺检测试剂盒中的应用。
3.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备用于检测金刚烷胺的试纸条中的应用。
4.一种抗金刚烷胺单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
5.如权利要求4所述抗金刚烷胺单克隆抗体在检测金刚烷胺中的应用。
6.一种金刚烷胺的检测试剂盒，其特征在于，含有如权利要求4所述的抗金刚烷胺单克隆抗体。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，为竞争型酶联免疫试剂盒。
8.一种用于检测金刚烷胺的试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，其特征在于，所述标记物垫包被有胶体金标记或酶标记的权利要求4所述的抗金刚烷胺单克隆抗体。
9.如权利要求8所述的试纸条，其特征在于，所述反应膜的检测线处包被有金刚烷胺-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线处包被有二抗。
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