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CN116478242A - 一种靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽及其用途 - Google Patents

一种靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽及其用途 Download PDF

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CN116478242A CN202211023300.2A CN202211023300A CN116478242A CN 116478242 A CN116478242 A CN 116478242A CN 202211023300 A CN202211023300 A CN 202211023300A CN 116478242 A CN116478242 A CN 116478242A
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Abstract

本发明提供了一种靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽及其用途，属于生物技术领域。本发明通过噬菌体展示技术，将新型冠状病毒受体结合区蛋白作为靶分子对噬菌体展示十二肽库进行筛选，获取一种靶向新型冠状病毒受体结合区蛋白的噬菌体多肽，其氨基酸序列为：SerValTyrAsnAlaLeuTyrLeuAsnAlaAlaGlu。上述多肽与新型冠状病毒受体结合区蛋白具有较好的结合性能和特异性。本发明所述多肽可应用于新型冠状病毒分析检测、多肽药物的开发、新型冠状病毒的捕获与释放等领域，为新型冠状病毒的免疫分析与治疗药物提供了元件。

Description

一种靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽及其 用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与新冠受体结合区蛋白结合的噬菌体多肽。
技术背景
由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的疾病可通过人群或环境介质传播，具有极高的致病性和传染性，成为人类史上面临最严峻的挑战之一，对人民生命健康、公共卫生体系和经济发展造成巨大威胁。
新型冠状病毒(SARS-COV-2)，颗粒呈圆或椭圆型，直径60-140nm，β冠状病毒属，包括非结构蛋白(orf 1\ab编码)与结构蛋白(N：核衣壳蛋白、S：刺突糖蛋白、E：包膜蛋白、M：膜蛋白)。SARS-COV-2进入宿主过程中，刺突糖蛋白上的受体结合区(Receptor-BindingDomain，RBD，319aa-541aa)蛋白有着至关重要的作用，是病毒进入宿主的桥梁，因此，RBD蛋白通常被当作为优良的检测与治疗靶点。新型冠状RBD单克隆抗体常作为新型冠状病毒的检测元件或治疗药物，如专利“一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用”(申请号：CN202010151348.6)公开了一种可应用于新型冠状病毒诊断、预防和治疗的新型冠状RBD蛋白单抗，但单抗具有的制备成本高、周期长、需要专业的操作人员、消耗抗原、批间差异大等缺点，故寻找其替代元件是十分必要的。
噬菌体展示技术于1985年由Smith发明，于2018年荣获诺贝尔化学奖，该技术原理是将外源基因(编码多肽或蛋白质)片段插入丝状噬菌体外壳蛋白基因，外源基因会随外壳蛋白的表达展示在噬菌体的表面，保持独立生物活性和空间构象，以利于靶蛋白的识别与结合。将噬菌体随机展示肽库投入包被有靶物质的固相载体上，投入肽库经过一段时间孵育后，洗去未结合或亲和力弱的噬菌体，以竞争洗脱或酸洗脱方式获取结合噬菌体，按此步骤进行3-5轮筛选，得到可结合目标特性目标的噬菌体。该技术自第一次报道以来，已被广泛应用于单克隆抗体、大分子蛋白质、小分子、酶等物质的筛选。噬菌体展示多肽具有制备成本低、时间短、批间差异小等优点，是单克隆抗体、毒素抗原等物质的优良替代品。
发明内容
针对传统单抗的不足，本发明的目的是提供与新型冠状受体结合区蛋白特异性结合噬菌体多肽，以期作为传统RBD单克隆抗体的替代品，应用于新型冠状的检测与治疗。
本发明的目的通过下述技术方案实施：
(1)将购买的新型冠状RBD蛋白包被于酶标孔，3-5％脱脂奶粉封闭两小时，加入噬菌体展示随机十二肽库，适用PBST吸取不结合或结合力弱的噬菌体，酸洗脱靶标噬菌体，再将洗脱的噬菌体扩增至一定滴度作为下一轮筛选的肽库。按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”步骤进行了三轮筛选，在筛选的过程中，改变PBST的浓度、噬菌体孵育时间、酸洗脱时间等条件，使得筛选条件变得逐渐苛刻，以便筛选到亲和力及特异性更强的噬菌体。
(2)在经过三轮筛选之后，挑取了46个单克隆噬菌体进行phage-ELISA的初步鉴定，将能够于新型冠状受体结合区蛋白结合的噬菌体，使用牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、麦芽糖蛋白、人可溶性生长刺激表达蛋白、抗伏马毒素纳米抗体、人脂联素蛋白作为阴性对照，PBS作为空白对照，获取两个与受体结合区蛋白特异性结合的噬菌体，将这两个噬菌体进行扩增、质粒提取、测序，发现其中一个噬菌体的插入多肽链丢失，另一噬菌体插入多肽序列为S-V-Y-N-A-L-Y-L-N-A-A-S-E，所述多肽为12个氨基酸组成，插入在噬菌体的外壳蛋白基因上。
本发明的噬菌体展示多肽可特异性与新型冠状受体结合区蛋白结合，作为传统RBD单抗的替代元件，应用于新型冠状的检测与治疗。
本发明具有以下益处：
(1)与传统的单抗相比，本发明的噬菌体展示多肽具有操作简单、成本较低、易于制备、易于修饰、生物安全性高等优点。
(2)本发明多肽序列是国内外首次报道，具有较高的创新性。
(3)本发明提供的噬菌体展示多肽可应用于新型冠状病毒的免疫分析或治疗所用的探针或试剂盒等产品。
附图说明
图1是挑选46个噬菌体克隆，通过Phage-ELISA验证阳性克隆的结果；横坐标为噬菌体克隆的编号，纵坐标为450nm处吸光值；
图2通过Phage-ELISA验证3-22噬菌体特异性的结果；横坐标为于酶标板包被的蛋白类型；纵坐标为450nm处吸光值。
具体实施方式
本发明实施例中所用材料、所用试剂及配方如下：
主要实验材料：
新型冠状病毒受体结合区蛋白(宁波迈跃)，噬菌体随机展示十二肽库、E.coilER2738由南昌大学中德联合研究院食品质量与安全实验室保存。
主要试剂：
HRP(辣根过氧化物)酶-抗噬菌体单克隆抗体(北京义翘神州科技有限公司)，Tween-20(北京索莱宝科技有限公司)，鸡卵清白蛋白(北京索莱宝科技有限公司)，牛卵清白蛋白(美国sigma公司)，脱脂奶粉(上海生工生物有限公司)，四甲基联苯胺(上海生工生物科技有限公司)，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(上海生工生物科技有限公司)，5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(天根生化科技有限公司)，四环素(北京索莱宝科技有限公司)，PEG8000(北京索莱宝科技有限公司)，LB肉汤(青岛海博生物科技有限公司)
主要试剂配方：
1、LB液体培养基：称取25g LB肉汤溶解于1000mL超纯水中，121℃高压灭菌15min；
2、LB/IPTG/X-gal平板：LB固体培养基，高压灭菌，加入1％IPTG/X-gal混匀，每个灭菌平板中倒入25mL，冷却后4℃封口避光贮存；
3、顶层琼脂：LB液体培养基，1g/LMgCl2·6H2O，7.5g/L琼脂粉，4mL/管分装，高压灭菌15min；
4、20％PEG-NaCl：50g PEG-8000，36g NaCl，超纯水加热溶解，定容至250mL，高压灭菌15min；
5、洗脱液：0.2M Gly-HCl，调整pH＝2.2，高压灭菌15min；
6、中和缓冲液：1M Tris-HCl，调整pH＝9.1，高压灭菌15min；
7、TBS缓冲液：50mM Tris-Hcl，150mM NaCl，高压灭菌15min；
8、0.1％、0.25％、0.5％TBST缓冲液：1000μL、2500μL、5000μL的Tween-20加入到1LTBS缓冲液中，高压灭菌15min；
新型冠状病毒受体结合区(RBD)蛋白噬菌体多肽的筛选与鉴定：
1、新型冠状病毒受体结合区蛋白噬菌体多肽的筛选
按照“包被-吸附-洗涤-洗脱-扩增-鉴定”的步骤，进行了三轮筛选
(1)将96孔酶标板用无菌超纯水润湿后，置于超净工作台中，紫外光线下照射半小时杀菌；
(2)取100μL浓度为50μg/mL RBD蛋白至紫外灭菌后的酶标板中，4℃冷藏柜中包被过夜；
(3)在无菌操作台中，用无菌0.1％TBST洗涤液清洗三次，每次均在无菌纸上拍干，然后加入250-350μL经过滤除菌的1-3％BSA-TBS封闭液，37℃恒温箱中封闭1-2h；
(4)用无菌0.1％TBST洗涤液清洗三次，每次均在无菌纸上拍干，取十二肽库(2×1011pfu/孔)，加入100μL无菌1×TBS，混匀后加入上述酶标板中，37℃结合1h；
(5)0.1％TBST清洗三次，加入100μL Gly-HCl洗脱缓冲液，37℃摇床匀速振荡洗脱8-15min，吸出洗脱产物，迅速加入预先调试好的适当体积的Tris-HCl中和缓冲液至中性；
(6)取10-15μL用于噬菌体滴度的测定，剩余全部用于噬菌体的扩增。
(7)在LB/Tet固体培养基平板上划线接种E.coli ER2738，37℃培养12-16h；
(8)从平板上挑取单克隆菌落接种至LB/Tet液体培养基试管中，37℃、220rpm振荡培养12-16h；
(9)吸取100-500μL上述培养物至40-60mL LB/Tet液体培养基中，加入洗脱的噬菌体，37℃、220rpm振荡培养4-6h；
(10)将扩增产物转移至灭菌离心管中，4℃、8000rpm离心10-15min，收集上清液至新鲜灭菌离心管中；
(11)在上清中加入8-10mL(1/6上清的体积)无菌的10-20％PEG-NaCl溶液，充分摇匀，4℃静置12-16h；
(12)4℃、8000rpm条件下离心10-15min，弃上清，用1mL无菌PBS缓冲液重悬沉淀，转至无菌离心管中，加入200μL 20％PEG-NaCl溶液，混匀后冰浴2h；
(13)4℃、12000rpm条件下离心10-15min，弃上清，再短暂离心，吸尽残余上清，用200μL无菌PBS重悬沉淀，4℃、5000rpm条件下离心1-2min；
(14)将上清转入新鲜离心管。取10μL测定噬菌体滴度，-20℃保存；
(15)步骤(1)-(14)为第一轮的扩增过程，第二轮与第三轮的淘选步骤大体相同，每轮的噬菌体投入量均为2×1011pfu，RBD的包被浓度逐轮降低分别为30μg/mL和10μg/mL，1-3％OVA-TBS和1-3％BSA-TBS封闭液进行交替封闭，投入噬菌体与RBD蛋白结合时间分别为45min、30min，洗涤液浓度分别为0.25％TBST和0.5％TBST。淘选方案见表1。
表1新型冠状病毒受体结合区蛋白噬菌体多肽的筛选流程
噬菌体滴度的测定
(1)在LB/Tet固体培养基平板上划线接种E.coli ER2738，37℃培养12-16h；
(2)从平板上挑取单克隆菌落接种至LB/Tet液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至对数生长期(OD600nm≈0.5-0.6)；
(3)分别取(2)中的200μL菌液至无菌1.5mL离心管中；
(4)稀释洗脱噬菌体至10-2、10-3、10-4倍，将顶层琼脂放于微波炉中加热融化；
(5)取不同稀释度噬菌体溶液10μL加至(4)中离心管，充分混匀，37℃静置孵育10-15min；
(6)将侵染噬菌体的菌液注入顶层琼脂中，轻微摇晃混匀，迅速将其倒至LB/IPTG/X-gal平板，37℃培养12-16h；
(7)挑取长约30～300个蓝斑的平板计数，并计算噬菌体滴度，计算公式：菌落形成单位(cfu)＝平板中菌落数×稀释倍数×100。
2、阳性克隆的筛选与鉴定
三轮筛选结束后，挑取长约200个蓝斑的平板，选取了46个克隆进行扩增以及phage-ELISA的鉴定，具体操作步骤如下：
(1)挑单菌落克隆接种LB/Tet液体培养基中，37℃、220rpm培养12-16h；
(2)取500μL过夜的E.coil ER2738培养物到50mL液体培养基，混匀；
(3)将吸取(2)中培养基1mL分装至离心管中；
(4)挑取单个蓝色噬菌斑至每个离心管中，37℃，220rpm震荡培养4.5-6h；
(5)培养结束后，8000rpm离心2min，吸取上清液至新鲜离心管，编号标记。4℃静置备用。
(6)每孔取100μL浓度为1μg/mL RBD蛋白包被至酶标板，4℃过夜；
(7)0.05％PBST洗板三次，加入300μL 5％脱脂牛奶封闭，37℃孵育1-2h；
(8)0.05％PBST洗板三次，加入100μL噬菌斑上清培养液，37℃孵育45-60min；
(9)0.05％PBST洗板三次，每孔加入100μL抗M13二抗，37℃孵育45-60min；
(10)0.05％PBST洗板三次，加入100μL TMB显色液，37℃孵育8-15min；
(11)每孔加入50μL 2M H2SO4，测定OD450nm吸光值。附图1示出了挑选46个噬菌体克隆，通过Phage-ELISA验证阳性克隆的结果；横坐标为噬菌体克隆的编号，纵坐标为450nm处吸光值；
(12)在挑取的46个克隆中，有16个克隆能够与RBD蛋白结合，挑取阳性克隆进行下一步的特异性验证。
Phage-ELISA鉴定阳性克隆特异性：
(1)每孔取100μL浓度为1μg/mL RBD蛋白，1-3μg/mL牛血清白(BSA)蛋白、鸡卵清白(OVA)蛋白、麦芽糖(MBP)蛋白、人可溶性生长刺激表达(SST2)蛋白、抗伏马毒素B1(FB1)纳米抗体、人脂联素(gAd)蛋白包被至酶标板，设置三组平行对照，4℃过夜；
(2)步骤同阳性克隆鉴定中(7)-(11)；
(3)在鉴定的13个阳性噬菌斑中，3-22噬菌斑呈现较好的亲和力与特异性(图2)。
本发明的具体应用：本发明具体涉及一种与新型冠状受体结合区蛋白结合的噬菌体多肽，可通过体外表达技术，将其做为检测元件应用基于免疫均相、免疫试纸条、微流控等检测手段的新型冠状病毒分析体系及检测试剂盒开发。
以上所述实施例为本发明的实施方法，对于领域内的技术人员，在不脱离本明构思前提下，可以做出若干的应用及改进，但都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽，其特征在于，由12个氨基酸组成，与新型冠状病毒受体结合区RBD蛋白有着较好的结合性能及特异性。
3.根据权利要求1或2所述的靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽，其特征在于，通过GGGSS连接在M13噬菌体外壳蛋白上。
4.权利要求1-3任一项所述的靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽的制备方法，其特征在于，主要包括如下步骤：
(1)将新型冠状RBD蛋白作为筛选靶标，投入噬菌体展示12肽库进行三轮固相筛选。
(2)随机挑取三轮筛选后的单克隆噬菌斑扩增。
(3)Phage-ELISA鉴定与RBD蛋白的结合能力及特异性，将靶向结合新型冠状RBD蛋白的噬菌斑测序。
5.根据权利要求4所述的靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽的制备方法，其特征在于，第一轮筛选扩增步骤为：
(1)将96孔酶标板用无菌超纯水润湿后，置于超净工作台中，紫外光线下照射半小时杀菌；
(2)取100μL浓度为50μg/mL RBD蛋白至紫外灭菌后的酶标板中，4℃冷藏柜中包被过夜；
(3)在无菌操作台中，用无菌0.1％TBST洗涤液清洗三次，每次均在无菌纸上拍干，然后加入250-350μL经过滤除菌的1-3％BSA-TBS封闭液，37℃恒温箱中封闭1-2h；
(4)用无菌0.1％TBST洗涤液清洗三次，每次均在无菌纸上拍干，取十二肽库(2×1011pfu/孔)，加入100μL无菌1×TBS，混匀后加入上述酶标板中，37℃结合1h；
(5)0.1％TBST清洗三次，加入100μL Gly-HCl洗脱缓冲液，37℃摇床匀速振荡洗脱8-15min，吸出洗脱产物，迅速加入预先调试好的适当体积的Tris-HCl中和缓冲液至中性；
(6)取10-15μL用于噬菌体滴度的测定，剩余全部用于噬菌体的扩增；
(7)在LB/Tet固体培养基平板上划线接种E.coli ER2738，37℃培养12-16h；
(8)从平板上挑取单克隆菌落接种至LB/Tet液体培养基试管中，37℃、220rpm振荡培养12-16h；
(9)吸取100-500μL上述培养物至40-60mL LB/Tet液体培养基中，加入洗脱的噬菌体，37℃、220rpm振荡培养4-6h；
(10)将扩增产物转移至灭菌离心管中，4℃、8000rpm离心10-15min，收集上清液至新鲜灭菌离心管中；
(11)在上清液中加入1/6上清液体积的无菌的10-20％PEG-NaCl溶液，充分摇匀，4℃静置12-16h；
(12)4℃、8000rpm条件下离心10-15min，弃上清液，用1mL无菌PBS缓冲液重悬沉淀，转至无菌离心管中，加入200μL 20％PEG-NaCl溶液，混匀后冰浴2h；
(13)4℃、12000rpm条件下离心10-15min，弃上清液，再短暂离心，吸尽残余上清液，用200μL无菌PBS重悬沉淀，4℃、5000rpm条件下离心1-2min；
将上清液转入新鲜离心管，取10μL测定噬菌体滴度，-20℃保存。
6.根据权利要求4所述的靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽的制备方法，其特征在于，第二轮和第三轮筛选中，RBD的包被浓度降低分别为30μg/mL和10μg/mL，分别用1-3％OVA-TBS和1-3％BSA-TBS封闭液进行交替封闭，投入噬菌体与RBD蛋白结合时间分别为45min、30min，洗涤液浓度分别为0.25％TBST和0.5％TBST；每轮的噬菌体投入量均为2×1011pfu。
7.权利要求1-3任一项所述的靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽的用途，其特征在于：用于制备可应用于分析或中和新型冠状病毒的产品。
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