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CN117924469A - 一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法和应用 Download PDF

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CN117924469A CN202311678268.6A CN202311678268A CN117924469A CN 117924469 A CN117924469 A CN 117924469A CN 202311678268 A CN202311678268 A CN 202311678268A CN 117924469 A CN117924469 A CN 117924469A
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Abstract

本发明公开了一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法和应用，旨在提供一种亲和力高、特异性强的单链抗体。本发明通过噬菌体抗体库构建、噬菌体筛选技术，获取3种抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体。上述单链抗体由重链可变区、15aa连接肽、轻链可变区顺次连接构成，具有如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。本发明公开的单链抗体与新冠病毒核衣壳蛋白有着优异的结合性能和特异性，可应用于新型冠状病毒的多种免疫分析平台，在新冠病毒检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体设计一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法和应用。
技术背景
新型冠状病毒由一条正义RNA链和4种结构蛋白(S：刺突蛋白；N：核衣壳蛋白；M：膜蛋白；E：包膜蛋白)组成。目前新冠的主要检测方法为核酸检测法和免疫分析法。实时荧光PCR法为代表的核酸检测法，由于其高灵敏度做为新冠检测的金标准，但其操作步骤繁琐、样本制备程序复杂、需专业的操作人员及设备，极大限制新冠的筛选效率，仍需一种操作简单、快速、灵敏的新冠检测手段。基于双单克隆抗体夹心的免疫层析试纸条具有操作简单、检测速度快、原位检测等优点，如专利“一种基于荧光免疫层析法的新冠病毒抗原检测试剂盒”(申请号：CN202210582441.1)，基于双单克隆抗体夹心的方法提供一种原位快速检测新冠抗原的荧光层析试纸条，新冠诊疗方案(试行第十版)也已将免疫层析试纸条法做为新的诊断标准。在新冠的免疫层析法，单克隆抗体是最常用的免疫分析元件，如专利“抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用”(申请号：CN202210623337.2)，描述了一种抗新冠核衣壳蛋白单抗及其在免疫分析中的应用，然而单克隆抗体制备周期长、稳定性差、成本较高、批间差异大，开发一种单抗的替代元件是十分必要的。
单链抗体(single chain antibody fragment，scFv))是由10-20个氨基酸的短肽链连接重链可变区和轻链可变区组成的一种抗体片段。相比传统单抗，具有制备简单、成本低廉、易于改造等优点。因此，开发高灵敏、强特异的抗新冠病毒单链抗体将在免疫分析领域具有广阔的应用前景。
发明内容
为解决传统单克隆抗体存在的不足，本发明旨在开发高灵敏、强特异的单链抗体，以期做为传统抗体的替代品，应用于各种新冠的免疫分析平台。
首先，本发明第一个目的是提供一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体，所述单链抗体具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
其中，所述单链抗体由重链可变区、连接肽、轻链可变区组成，与新型冠状病毒核衣壳蛋白有着优异的结合性能及特异性；所述连接肽的氨基酸序列为：(GGGGS)×3。
本发明第二个目的是提供一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将新冠N蛋白(核衣壳蛋白)表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，将转化的单菌落接种至250mL锥形瓶中培养至对数生长期，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，将表达产物进行超声破碎后，Ni-NAT柱进行纯化，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、ELISA鉴定表达重组N蛋白。
(2)将表达新冠N蛋白作为免疫源，选择3只小鼠做为免疫小鼠，初次免疫使用弗氏完全佐剂与新型冠状病毒N蛋白等比例混合后注射，免疫2周后进行第二次免疫，采用弗氏不完全佐剂与抗原等比例混合后注射。每隔1周如上进行第3-5次免疫。免疫方法为皮下多点注射，在背部、腹部和腋窝处。最后一次免疫后，ELISA测定每只小鼠血清效价。
(3)解剖小鼠，提取小鼠脾细胞RNA，反转录成cDNA，合成重链可变区和轻链可变区扩增引物，PCR扩增重链可变区和轻链可变区，重叠延伸PCR将抗体重链可变区通过连接肽(GGGGSGGGGSGGGGS)与轻链可变区进行拼接成scFv片段；快切酶酶切scFv和噬菌粒pCANTAB5E，T4连接酶重新连接，将重组噬菌粒转入大肠杆菌TG1中，构建单链抗体噬菌体文库；取部分噬菌体文库，加入辅助噬菌体M13K07，构建重组噬菌体，测定滴度。
(4)将表达的新冠N蛋白做为包被蛋白至酶标孔，投入重组噬菌体孵育一段时间，PBST洗去不结合或结合力弱的重组噬菌体，酸洗脱靶标噬菌体，再将洗脱的噬菌体扩增至一定滴度作为下一轮筛选的单链抗体。按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”步骤进行了3-5轮筛选，在筛选的过程中，改变PBST的浓度、噬菌体孵育时间等条件，使得筛选条件变得逐渐苛刻，以便筛选到亲和力及特异性更强的单链抗体噬菌体。
(5)经过几轮筛选之后，选取20个噬菌体进行Phage-ELISA的鉴定，使用新冠受体结合区蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白做为作为阴性对照，PBS作为空白对照；获取了7条效果较佳与新冠N蛋白特异性结合的重组噬菌体展示单链抗体，将这7个单链抗体噬菌体进行扩增、质粒提取、测序，获取3种单链抗体，所述单链抗体由重链可变区、连接肽、轻链可变区组成，插入在噬菌体的外壳蛋白基因上。
进一步的，所述核衣壳蛋白由原核表达系统产出；抗核衣壳蛋白的噬菌体单链抗体通过pH洗脱法筛选得到，洗脱法的ph值为2-10；所述鉴定噬菌体特异性使用蛋白为新冠受体结合区蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白。
进一步的，所述的单链抗体噬菌体文库的构建方法，主要包含如下步骤：
(1)从鼠脾细胞扩增抗体重链和轻链并拼接成单链抗体，在抗体两端引入sfi I和Not I酶切位点；(2)与噬菌粒pCANTAB 5E酶切重组，T4连接酶进行连接构建噬菌体展示文库。
其中，抗体两端引入sfi I和Not I酶切位点所用试剂和用量为：2-6μL 10×Quickcutbuffer，1-3μL sfi I酶，1-3μL Not I酶，20-140μL RNase free H2O，10-50μgscFv抗体基因，10-50μg噬菌粒pCANTAB 5E。
进一步的，所述抗体基因扩增体系为：1-100nM VH-上，1-100nM VH-下，1-100nMVL-上，1-100nM VL-下，0.1-10μg重链可变区，0.1-10μg轻链可变区，20-140μL RNase freeH2O，10-100μL primestar扩增酶，1-5μLprimestarbuffer；反应条件为：98℃180s，50℃15s，72℃15s，重复25cycle，72℃3min。
进一步的，所述pH洗脱法筛选，主要包含如下步骤：
(1)包被5-50μg新冠核衣壳蛋白至400μL酶标孔，37℃孵育1-2h；
(2)0.1-0.5％PBST洗板5-10次，3-5％牛血清包蛋白BSA或卵清白蛋白OVA 37℃封闭1-2h；
(3)0.1-0.5％PBST洗板5-10次，投入1-9×109重组噬菌体，37℃孵育30-60min；
(4)0.1-0.5％PBST洗板5-10次，100-200μL 0.1MpH＝2.2的Gly-Hcl孵育15min，加入10-20μL 1M pH＝9.1的Tris-Hcl，测定滴度，并挑取单克隆噬菌体进行phage-ELISA鉴定。
其中，所述步骤(3)中重组噬菌体由噬菌粒pCANTAB 5E和辅助噬菌体M13K07重组构建。
第三方面，本发明提供一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的应用，本发明的噬菌体展示单链抗体可特异性与新冠N蛋白结合，可作为传统新冠N蛋白单克隆抗体的替代元件，应用于新冠的免疫分析领域。
本发明具有以下益处：
(1)与传统的单抗相比，本发明的噬菌体展示单链抗体具有制备流程简单、成本低廉、生物安全性高、易于改造和修饰等优点。
(2)本发明的3条单链抗体序列是国内外首次报道，具有较高的创新性。
(3)本发明提供的噬菌体展示单链抗体可做为核心检测元件，应用于多种检测新冠病毒的免疫分析平台。
附图说明
图1是通过ELISA验证3只免疫小鼠血清抗体效价的结果；横坐标为小鼠血清稀释倍数，纵坐标为450nm处吸光值；
图2通过Phage-ELISA验证1-20噬菌体展示单链抗体亲和力及特异性的结果；横坐标为噬菌体克隆编号；纵坐标为450nm处吸光值。
具体实施方式
发明实施例中所用材料、所用试剂及配方如下：
主要实验材料：
SARS-CoV-2核衣壳(N)蛋白质粒、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌TG1、辅助噬菌体M13K07、噬菌粒pCANTAB 5E由本实验室保存。
主要试剂：
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、鸡卵清白蛋白、牛卵清白蛋白购买自美国sigma公司，辣根过氧化物(HRP)酶-抗M13单克隆抗体购买自北京义翘神州科技有限公司，脱脂奶粉、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)显色液、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购买自上海生工生物科技有限公司，LB肉汤、2×YT培养基购买自青岛海博生物科技有限公司。
主要试剂配方：
1、2×YT液体培养基：称取31g 2×YT粉末，溶解于1000mL超纯水中，121℃高压灭菌15min；
2、2×YT固体培养基：称取31g 2×YT粉末和18g琼脂，溶解于1000mL超纯水中，121℃高压灭菌15min；
3、LB液体培养基：称取25g LB培养基，溶解于1000mL超纯水中，121℃高压灭菌15min；
4、20％聚乙二醇(PEG)-NaCl：50g PEG-8000，36gNaCl，超纯水加热溶解，定容至250mL，高压灭菌15min；
5、洗脱液：0.2M甘氨酸(Gly)，加入盐酸调整pH＝2.2，高压灭菌15min；
6、中和缓冲液：1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入盐酸调整pH＝9.1，高压灭菌15min；
1、小鼠的免疫及血清效价测定
新冠N蛋白的原核表达
(1)将含有SARS-CoV-2N蛋白质粒的BL21(DE3)划线于LB平板，37℃孵育12-16h。
(2)在平板上挑取单菌落，接种于5mL LB培养基中，37℃孵育12-16h。
(3)吸取500μL菌液，接种50mL LB培养基中，37℃孵育3h后，加入0.1-0.5M的IPTG，20℃孵育12-16h。
(4)4000-8000rmp离心10-20min，取菌体沉淀重悬于PBS中，200-300w超声破碎10-20min。
(5)4000-8000rmp离心10-20min，取上清过Ni-NAT重力柱纯化，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定纯化产物的纯度及活性。
小鼠免疫及效价测定
(1)取免疫前小鼠尾端血作阴性对照。
(2)初次使用免疫弗氏完全佐剂与60-120μg新冠N蛋白等比例混合，免疫三只小鼠。免疫后一周，采用弗氏不完全佐剂与抗原等比例混合后注射，重复2-4次，免疫结束后，取小鼠血清。
(3)包被1μg/mL的新冠N蛋白至酶标孔，每孔加入100-200μL，37℃孵育1-2h。
(4)PBST洗板3-5次，每孔加入200-300μL脱脂奶粉，37℃孵育1-2h。
(5)PBST洗板3-5次，每孔加入1：100-102400的小鼠血清，37℃孵育30-60min。
(6)PBST洗板3-5次，每孔加入1：3000-5000的鼠二抗(HRP标记)，37℃孵育30-60min。
(7)PBST洗板3-5次，每孔加入100μL四甲基联苯胺(TMB)显色液，37℃孵育8-15min后，每孔50μL 2M硫酸(H2SO4)，测定A450 nm。附图1展示3只免疫小鼠的血清稀释不同的倍数与1-5μg/mL新冠N蛋白的结合能力，横坐标为噬菌体克隆的编号，纵坐标为450nm处吸光值。结果表示小鼠3具有最高的抗体效价为1：102400。
2、噬菌体展示单链抗体库的构建及筛选
鼠脾细胞及反转录
(1)取小鼠50-500mg脾细胞放入RNase-free的EP管中，研磨器研磨组织
1000-2000rpm离心10-20min后弃上清，用PBS洗涤细胞。
(2)将细胞加入1-2mL Trizol的最初使用量加入0.5-1mL的异丙醇，颠倒数次混匀，室温放置10-20min.
(3)10000-14000g离心10-20min，弃除上清，获取细胞的RNA沉淀。
(4)加入1-3mL 75％乙醇，颠倒数次混匀，室温放置10min，10000-14000g离心10-20min，弃上清。
(5)室温倒置5-10min晾干或真空抽干，加入25-50uL DEPC-ddH2O，溶解RNA，凝胶电泳检测RNA质量并测定浓度。用反转录试剂盒把提取的RNA逆转录得到cDNA模版，-80℃保存。
抗体可变区的扩增
根据小鼠抗体可变区片段设计引物
VHBACKSfi1TTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCSAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG
VH-Linker-VK
GGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTC
VLFOR1Not1
ATAAGAATGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC
VLFOR2Not1:
ATAAGAATGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCC
VLFOR3Not1:
ATAAGAATGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCC
VLFOR4Not1:
ATAAGAATGCGGCCGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCC
注：R＝A/G；Y＝C/T；M＝A/C；K＝G/T；S＝C/G；W＝A/T；H＝A/C/T；B＝C/G/T；V＝A/C/G；D＝A/G/T
重链可变区扩增体系：1-100nM VH-back，1-100nM VH-for，0.1-10μgcDNA基因，20-140μL RNase free H2O，10-100μLprimestar扩增酶，1-5μLprimestarbuffer；反应条件为：98℃180s，50℃15s，72℃15s，重复25cycle，72℃3min。
轻链可变区扩增：1-100nM VL-back，1-100nM VL-for，0.1-10μg重链可变区，0.1-10μg轻链可变区，20-140μL RNase free H2O，10-100μLprimestar扩增酶，1-5μLprimestarbuffer；反应条件为：94℃180s，50℃15s，72℃15s，重复25cycle，72℃3min。
scFv片段的扩增：10-100μLprimestar扩增酶，1-5μLprimestarbuffer，0.1-10μg重链可变区，0.1-10μg轻链可变区，10-50ngVH-linker-VL，20-140μL RNase free H2O；反应条件：94℃50s，56℃50s，7个循环；72℃10min。
第二步：0.1-10μg scFv片段，10-100μL primestar扩增酶，1-5μLprimestarbuffer，20-140μL RNase free H2O，1-100nM VL-forNot I 1-4，1-100nMVH-back sfi I；反应条件：94℃3min；94℃15s，50℃15s，72℃15s，25个循环；72℃3min，4℃保存。
新冠N蛋白噬菌体文库的构建
scFv片段/pCANTAB 5E酶切：1-5μg scFv片段/pCANTAB 5E，20-140μLRNase freeH2O，1-2μLNot I快切酶，1-2μL sfi I快切酶，5-10μL快切酶buffer；反应条件：37℃反应45-60min。
scFv片段克隆至噬菌粒pCANTAB 5E：10-30ng scFv酶切片段，50-100ng pCANTAB5E酶切，0.8-1.2μLT4连接酶，1-3μLT4连接酶buffer，7-14μL RNase free H2O。反应条件：16℃反应12-18h。
新冠N蛋白噬菌体展示单链抗体库的构建
(1)将大肠杆菌(E.coil)TG1划线于2×YT平板培养基，37℃培养10-14h。
(2)挑取E.coil TG1接种5mL 2×YT液体培养基，37℃培养10-14h后，接种至50mL2×YT液体培养基培养至OD600为0.3。
(3)取菌体沉淀冰浴10-20min。0.1M氯化钙处理10min后，4000-6000g离心10-15min。
(4)重复上述操作，1mL超纯水重选菌体沉淀，100μL每支分装制成E.coil TG1感受态。
(5)100-200ng pCANTAB 5E-scFv重组噬菌粒转化至E.coil TG1感受态，37℃培养10-14h后，洗脱平板上所有单菌落构成噬菌体抗体文库。
(6)取50-100μL洗脱噬菌体文库接种5mL 2×YT/氨苄青霉素(Amp)培养基，培养基至对数生长期，按照大肠杆菌：噬菌体＝1：20的感染比例加入辅助噬菌体M13K07，37℃静置1h。
(7)上述5mL培养体系全部加入50mL 2×YT/Amp/卡那霉素(kana)培养基，37℃培养10-14h。
(8)12000-16000g离心10-15min，取上清加入12mL PEG/NaCl，冰上静置4-6h。
(9)12000-16000g离心30-40min，弃去上清，1mL TBS重悬沉淀，加入200-300μLPEG/NaCl，冰上静置1-2h。
(10)12000-16000g离心30-40min，弃去上清，200-300μL TBS重悬沉淀，取1μL噬菌体稀释至1：102-1014，测定重组噬菌体滴度。
新冠N蛋白噬菌体展示单链抗体的筛选
(1)无菌水洗涤酶标板3-5次，置于超净工作台中，紫外光线杀菌30-60min。(2)100-200μL 50μg/mL新冠N蛋白包被酶标板，37℃孵育2-3h。
(3)0.1％TBST洗板5-10次，无菌纸拍干，加入250-350μL 1-3％BSA-TBS，37℃封闭1-2h。
(4)0.1％TBST洗板5-10次，无菌纸拍干，取重组噬菌体文库(1×109pfu/孔)，加入100-200μLTBS，加入酶标板中，37℃结合30-60h。
(5)0.1％TBST洗板5-10次，无菌纸拍干，加入100-200μL 0.1M Gly-HCl缓冲液(pH＝2.2)，37℃洗脱8-15min，吸出洗脱产物，迅速加入10-20μL 1M Tris-HCl(pH＝9.1)缓冲液。
(6)取1μL噬菌体稀释至1：102-104，测定重组洗脱噬菌体滴度，剩余噬菌体全部用于噬菌体的扩增。扩增步骤同新冠N蛋白噬菌体展示单链抗体库的构建。
(7)步骤(1)-(6)为第一轮的扩增过程，第2-5轮的淘选步骤大体相同，每轮的噬菌体投入量均为1×109pfu，RBD的包被浓度逐轮降低分别为30-5μg/mL，1-3％OVA-TBS和1-3％BSA-TBS封闭液进行交替封闭，投入噬菌体与新冠N蛋白结合时间为45-30min，洗涤液浓度为0.25％-0.5％TBST。淘选方案见表1。
表1新型冠状病毒核衣壳蛋白噬菌体展示单链抗体的筛选流程
轮次 RBD蛋白包被浓度 封闭液 噬菌体量 洗涤液 孵育时间
一 50 BSA-TBS 1×109 0.1％TBST 60min
二 30 OVA-TBS 1×109 0.25％TBST 45min
三 10 BSA-TBS 1×109 0.5％TBST 30min
四 5 OVA-TBS 1×109 0.5％TBST 30min
五 5 BSA-TBS 1×109 0.5％TBST 30min
3、阳性克隆的筛选与鉴定
五轮筛选结束后，挑取20个噬菌体展示单链抗体单菌落，选取了20个克隆进行扩增以及phage-ELISA的鉴定，具体操作步骤如下：
(1)挑20个单菌落克隆接种LB/Amp液体培养基中，37℃、220rpm培养12-16h。
(2)取50-100μL上述培养物各加入到1mL 2×YT/Amp液体培养基，混匀220rpm震荡培养3-5h。
(3)各管加入0.5-1μL辅助噬菌体M13K07，37℃孵育30-60min。
(4)加入1μL卡那霉素(kana)，37℃，220rpm震荡培养10-14h。
(5)培养结束后，8000-10000rpm离心2-5min，吸取上清液至新鲜离心管，编号标记，4℃静置备用。
(6)每孔取100-200μL浓度为5-20μg/mL新冠N蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白包被至酶标板，37℃孵育2-3h。
(7)0.05％PBST洗板三次，加入250-350μL 3-5％脱脂牛奶封闭，37℃孵育1-2h。
(8)0.05％PBST洗板三次，N蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白包被孔各加入100μL噬菌斑上清培养液，37℃孵育45-60min。
(9)0.05％PBST洗板三次，每孔加入100-200μL抗M13二抗，37℃孵育30-60min。
(10)0.05％PBST洗板三次，加入100μLTMB显色液，37℃孵育8-15min，
每孔加入50μL 2M H2SO4，测定A450 nm。附图2展示出了挑选20个重组噬菌体克隆与新冠N蛋白、BSA、OVA的结合能力，横坐标为噬菌体克隆的编号，纵坐标为450nm处吸光值。
(11)在挑取的20个克隆中，20个克隆均能与新冠N蛋白结合；其中克隆N1、N3、N6、N9、N10、N11、N14与新冠N蛋白具有较好的结合能力与特异性，将这7个克隆进行扩增并使用噬菌体S1通用引物进行测序，分析得到3条序列不同的噬菌体展示单链抗体氨基酸序列。
本发明的具体应用：本发明具体涉及一种与新冠N蛋白结合的噬菌体展示单链抗体，可通过体外蛋白表达技术，表达对应氨基酸的单链抗体，做为新冠的检测元件应用基于免疫酶联吸附试验、免疫层析试纸条、免疫传感器等新冠病毒分析体系及检测试剂盒开发。
以上所述实施例为本发明的实施方法，对于领域内的技术人员，在不脱离本明构思前提下，可以做出若干的应用及改进，但都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体，其特征在于，所述单链抗体具有SEQID NO：1-SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体，其特征在于，所述单链抗体由重链可变区、连接肽、轻链可变区组成，与新型冠状病毒核衣壳蛋白有着优异的结合性能及特异性；
所述连接肽的氨基酸序列为：(GGGGS)×3。
3.根据权利要求1或2所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，主要包含如下步骤：
(1)将新冠核衣壳蛋白作为免疫源，免疫3-5次小鼠，最后一次免疫后，酶联免疫吸附实验ELISA测定小鼠血清效价；
(2)提取小鼠脾细胞，将抗体重链可变区通过连接肽与轻链可变区进行拼接，与噬菌粒连接并转入大肠杆菌TG1中，构建单链抗体噬菌体文库；
(3)以核衣壳蛋白做为包被蛋白，pH洗脱法筛选得到抗核衣壳蛋白的噬菌体单链抗体；
(4)Phage-ELISA鉴定与核衣壳蛋白的结合能力及特异性，将特异性靶向新冠核衣壳蛋白的噬菌斑测序。
4.根据权利要求3所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，所述核衣壳蛋白由原核表达系统产出；所述洗脱法的ph值为2-10；所述鉴定噬菌体特异性使用蛋白为新冠受体结合区蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白。
5.根据权利要求3所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，所述的单链抗体噬菌体文库的构建方法，主要包含如下步骤：
(1)从鼠脾细胞扩增抗体重链和轻链并拼接成单链抗体，在抗体两端引入sfi I和NotI酶切位点；
(2)与噬菌粒pCANTAB 5E酶切重组，T4连接酶进行连接构建噬菌体展示文库。
6.根据权利要求5所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，所述两端引入sfi I和Not I酶切位点所用试剂和用量为：2-6μL 10×Quickcutbuffer，1-3μL sfi I酶，1-3μL Not I酶，20-140μL RNase free H2O，10-50μgscFv抗体基因，10-50μg噬菌粒pCANTAB 5E。
7.根据权利要求5所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，所述抗体基因扩增体系为：1-100nM VH-上，1-100nM VH-下，1-100nM VL-上，1-100nM VL-下，0.1-10μg重链可变区，0.1-10μg轻链可变区，20-140μL RNase free H2O，10-100μL primestar扩增酶，1-5μLprimestarbuffer；反应条件为：98℃180s，50℃15s，72℃15s，重复25cycle，72℃3min。
8.根据权利要求3所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，所述pH洗脱法筛选，主要包含如下步骤：
(1)包被5-50μg新冠核衣壳蛋白至400μL酶标孔，37℃孵育1-2h；
(2)0.1-0.5％PBST洗板5-10次，3-5％牛血清包蛋白BSA或卵清白蛋白OVA 37℃封闭1-2h；
(3)0.1-0.5％PBST洗板5-10次，投入1-9×109重组噬菌体，37℃孵育30-60min；
(4)0.1-0.5％PBST洗板5-10次，100-200μL 0.1MpH＝2.2的Gly-Hcl孵育15min，加入10-20μL 1M pH＝9.1的Tris-Hcl，测定滴度，并挑取单克隆噬菌体进行phage-ELISA鉴定。
9.根据权利要求8所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的制备方法，其特征在于，所述重组噬菌体由噬菌粒pCANTAB 5E和辅助噬菌体M13K07重组构建。
10.根据权利要求1或2所述的一种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白单链抗体的应用，其特征在于，所述单链抗体应用于新型冠状病毒的多种免疫分析平台。
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