CN114106211A

CN114106211A - 一种云南鸡油菌多糖及其分离纯化方法

Info

Publication number: CN114106211A
Application number: CN202111336779.0A
Authority: CN
Inventors: 曾念开; 张玉卓; 王勇; 谢惠菁; 徐畅; 张絮; �田润; 韩云霄
Original assignee: Hainan Medical College
Current assignee: Hainan Medical College
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2022-03-01
Also published as: CN114369070B; CN114369070A

Abstract

本发明提供了一种云南鸡油菌多糖及其分离纯化方法，通过预处理、水浸提、醇沉、脱色处理、分离和纯化制得云南鸡油菌多糖，本发明提取得到的鸡油菌多糖不含蛋白质、多肽和核酸，鸡油菌粗多糖的提取率为9.38％，鸡油菌粗多糖中多糖含量为30.2％。通过高效液相色谱、紫外分光光度计、核磁共振法等方法检测制得的多糖主要含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和L‑岩藻糖等8种单糖。

Description

一种云南鸡油菌多糖及其分离纯化方法

技术领域

本发明涉及多糖分离纯化领域，特别涉及一种云南鸡油菌多糖及其分离纯化方法。

背景技术

鸡油菌在分类上隶属于鸡油菌目齿菌科。鸡油菌常与松、栎、杉等针阔叶树的根系共生，子实体较小，金黄色，香味独特，脆嫩可口，营养丰富，为全球六大著名菌根性食用菌之一。目前全球已知鸡油菌属约有70种，但确切种类与数目还需要进一步考证。鸡油菌广泛分布于欧洲、亚洲和北美洲的温带、亚热带、热带地区，非洲和大洋洲也有分布。目前国内报道的鸡油菌有17种。据推测，我国西南高山、亚高山和热带地区是鸡油菌属的一个多样性分布中心。

鸡油菌多糖主要从子实体和菌丝两方面获取，例如，CN201310480649.3一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，从鸡油菌菌丝中提取多糖。《赤峰学院学报》2008年第8期，刘成荣等发表“鸡油菌菌丝体多糖和胞外多糖分离提取的工艺要求”，公开了影响鸡油菌菌丝体多糖提取因素为提取温度、乙醇浓度和提取时间。以上专利均没有提及如何从鸡油菌子实体分离纯化多糖。

发明内容

鉴于此，本发明提出了一种云南鸡油菌多糖的分离纯化方法，本发明分离纯化方法制得的多糖不含蛋白质、多肽和核酸，提取率高。

本发明的技术方案是这样实现的：

(1)预处理：取云南鸡油菌子实体样品，粉碎，过筛，制得云南鸡油菌粉末，加入料液比为1g：10～30mL的乙醇溶液，超声提取后浸泡12～16h，将浸泡后的云南鸡油菌粉末进行离心，转速为3500～4500r/min，离心时间为8～12min，弃上清液，制得滤渣。

(2)水浸提：取滤渣，按料液比1g：15～25mL加入蒸馏水，水浴锅浸提，浸提温度为70～90℃，浸提时间为1.5～3h，过滤，重复提取2～4次，合并滤液，旋转蒸发浓缩，制得浸提液。

(3)醇沉：将浸提液装入锥形瓶中放在磁力搅拌器上按料液比为1mL：3～5mL加入乙醇溶液，放入温度控制为2～6℃的冰箱中冷藏20～26h，离心，收集沉淀物。

(4)脱色处理：将步骤(3)制得的沉淀物加入料液比为1g：15～25mL的蒸馏水溶解，制得沉淀物水溶液，将沉淀物水溶液和Sevag试剂混合，萃取，制得第一上清液，将第一上清液加入大孔树脂中，脱色，制得第二上清液，第二上清液加入乙醇溶液中，放入冰箱静置12～16h，离心，收集析出的沉淀并置于-20℃冰箱冷冻24h，制得云南鸡油菌粗多糖，将云南鸡油菌粗多糖进行冷冻干燥，制得云南鸡油菌粗多糖。

(5)分离：步骤(4)制得的云南鸡油菌粗多糖加水溶解，制得云南鸡油菌粗多糖溶液，料液比为1g：20～30mL，云南鸡油菌粗多糖溶液使用柱色谱分离，洗脱液为氯化钠溶液，收集CY-1、CY-2洗脱组分进行浓缩，制得CY-1、CY-2洗脱组分浓缩液。

(6)纯化：将步骤(5)分离得到的CY-1、CY-2洗脱组分浓缩液装入透析袋中，分别使用自来水和蒸馏水进行透析，透析后冷冻干燥24h，即得云南鸡油菌多糖。进一步的，步骤(1)中，所述超声提取为在30～50℃下超声20～40min，超声功率为50～150Hz。

进一步的，所述磁力搅拌器搅拌速率为50～150r/min，所述乙醇溶液质量分数为95％。

进一步的，步骤(4)中，所述沉淀物和Sevag试剂质量比为1:1，所述Sevag试剂由体积比为4:1的氯仿和正丁醇制得。

进一步的，步骤(4)中，所述萃取步骤为将沉淀物和Sevag试剂混合振荡20min，静置30min，收集上层萃取液，将上层萃取液继续萃取3次，制得第一上清液。

进一步的，步骤(5)中，所述氯化钠溶液浓度为0.1～0.2mol/L。进一步的，步骤(5)中，所述柱色谱分离使用DEAE-52纤维素(二乙氨基乙基纤维素52)。

进一步的，步骤(6)中，所述自来水透析24h，每隔6h换一次自来水，再用蒸馏水透析12h，每隔4h换一次蒸馏水，制得浓缩液。

进一步的，步骤(4)中，所述大孔树脂型号为SP825。

进一步的，步骤(4)中，所述大孔树脂吸附步骤为：将大孔树脂和第一上清液放入具塞三角瓶中，在恒温摇床中脱色5～7h。

进一步的，步骤(4)中，恒温摇床温度为37℃，频率为150r/min。

进一步的，步骤(5)中，所述洗脱速度为0.1～1mL/min。

进一步的，所述冷冻干燥温度为-75～-85℃，时间为23～25h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的鸡油菌多糖分离纯化方法，提取得到的鸡油菌多糖不含蛋白质、多肽和核酸，鸡油菌粗多糖的提取率为9.38％，鸡油菌粗多糖中多糖含量为30.2％。通过高效液相色谱、紫外分光光度计、核磁共振法等方法检测制得的多糖主要含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和L-岩藻糖等8种单糖。

附图说明

图1葡萄糖标准曲线

图2蛋白质的标准曲线

图3云南鸡油菌多糖的DEAE-52纤维素色谱洗脱曲线

图4分子量测定的标准曲线

图5云南鸡油菌CY-1多糖的GPC测定图

图6云南鸡油菌CY-2多糖的GPC测定图

图7单糖标准品衍生化产物的色谱图

图中，从左至右色谱峰分别为：古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和L-岩藻糖。

图8云南鸡油菌CY-1多糖水解样品衍生化产物的色谱图

图中，从左至右色谱峰分别为：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和L-岩藻糖。

图9云南鸡油菌CY-2多糖水解样品衍生化产物的色谱图

图10云南鸡油菌CY-1多糖紫外分光光度波长扫描图

图11云南鸡油菌CY-2多糖紫外分光光度波长扫描图

图12云南鸡油菌CY-1多糖的红外图谱

图13云南鸡油菌CY-2多糖的红外图谱

图14云南鸡油菌CY-1多糖的¹H-NMR

图15云南鸡油菌CY-1多糖的¹³C-NMR

图16云南鸡油菌CY-2多糖的¹H-NMR

图17云南鸡油菌CY-2多糖的¹³C-NMR

图18云南鸡油菌CY-1、CY-2多糖电镜扫描图

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

表1仪器

表2试剂

实施例1云南鸡油菌粗多糖的提取方法

(1)预处理：取云南鸡油菌子实体样品，粉碎，过筛，制得云南鸡油菌粉末，加入质量分数为95％的乙醇溶液，料液比为1g：20mL，超声提取后浸泡14h，将浸泡后的云南鸡油菌粉末进行离心，转速为4000r/min，离心时间为8～12min，弃上清液，制得滤渣。

(2)水浸提：取滤渣，按料液比1g：20mL加入蒸馏水，水浴锅浸提，浸提温度为80℃，浸提时间为2h，过滤，重复提取3次，合并滤液，旋转蒸发浓缩，制得浸提液。

(3)醇沉：将浸提液装入锥形瓶中放在磁力搅拌器上按料液比为1mL：4mL加入质量分数为95％的乙醇溶液，放入温度控制为4℃的冰箱中冷藏24h，离心，转速为4000r/min，离心时间为10min，收集沉淀物。

(4)脱色处理：将步骤(3)制得的沉淀物加入料液比为1g：20mL的蒸馏水溶解，制得沉淀物水溶液，将沉淀物水溶液和Sevag试剂混合，所述Sevag试剂由体积比为4:1的氯仿和正丁醇制得，将沉淀物和Sevag试剂放入分液漏斗中混合振荡20min，静置30min，收集上层萃取液，将上层萃取液继续萃取3次，制得第一上清液，将第一上清液和SP 825大孔树脂放入具塞三角瓶中，在恒温摇床中脱色6h，恒温摇床温度为37℃，频率为150r/min，制得第二上清液，第二上清液加入质量分数为95％乙醇溶液中，放入冰箱静置14h，离心，析出的沉淀并置于-20℃冰箱冷冻24h，制得云南鸡油菌粗多糖，将云南鸡油菌粗多糖进行冷冻干燥，温度为-80℃，时间为24h，制得云南鸡油菌粗多糖。

实施例2云南鸡油菌粗多糖的分离方法

将实施例1制得的云南鸡油菌粗多糖加水溶解，制得云南鸡油菌粗多糖溶液，料液比为1g：25mL，云南鸡油菌粗多糖溶液使用DEAE-52柱色谱分离，洗脱液分别为浓度为0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L的氯化钠溶液和蒸馏水，收集CY-0、CY-1、CY-2、CY-4、CY-8、CY-10洗脱组分进行浓缩，制得CY-0、CY-1、CY-2、CY-4、CY-8、CY-10洗脱组分浓缩液。

实施例3云南鸡油菌多糖的纯化方法

将实施例2分离得到的CY-1、CY-2洗脱组分浓缩液装入透析袋中，自来水透析24h，每隔6h换一次自来水，再用蒸馏水透析12h，每隔4h换一次蒸馏水，透析后冷冻干燥温度为-80℃，时间为24h，即得云南鸡油菌多糖。

对比例1

在实施例1的基础上，将SP 825大孔树脂分别替换为，HP 2MGL、HP 20、SP 850进行脱色试验。

试验例1云南鸡油菌多糖含量测定

(1)检测方法

1、样品总糖测定方法

1.1、精密称取葡萄糖标准品1.0012g，105℃干燥至恒重后放干燥器冷却0.5h，再精确称重0.5003g加入少量蒸馏水使其溶解，定容于50mL容量瓶中，配制成浓度为10mg/mL葡萄糖标准溶液，精密吸取贮备液1mL定容于100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，配成浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液备用。

1.2标准曲线的建立

移取0.1mg/mL葡萄糖标准溶液0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL分别置于7个试管中，每个试管加蒸馏水补至2mL。再各加5％苯酚试液1mL摇匀，迅速加入5mL浓硫酸，振荡混匀静置10min，再于100℃水浴加热15min，然后迅速冷却至室温。在490nm测其吸光度。蒸馏水2mL经相同处理做空白对照，平行实验三次以减小误差。于490nm时测定吸光度A。以葡萄糖的质量浓度为横坐标，以吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3实验结果，参见图1，回归方程：Y＝8.1621x-0.0024，R²＝0.9994，表明线性关系良好。

2、蛋白质含量测定

2.1、测定原理

由于考马斯亮蓝在没有与蛋白质结合时为蓝色，其与蛋白质分子相结合时，其颜色会变为青色，且蛋白质浓度在0～1000μg/mL范围内，其吸光度值与蛋白含量成线性变化，在595nm波长下有最大光吸收，因此可用于蛋白质的定量测定。

2.2、试剂的配制

考马斯亮蓝G-250溶液的配制：精确称取0.0201g的考马斯亮蓝G-250，溶于10.0mL浓度为95％的乙醇，然后再加入20.0mL85％的浓H₃PO₄，用纯化水定容至200mL，经双层滤纸过滤后避光保存。

牛血清蛋白标准溶液的配制：精确称取标准牛血清白蛋白0.0204g并倒入烧杯，加去离子水溶解，定容至200.0mL，得到浓度为0.1020mg/mL的牛血清蛋白标准品。

2.3标准曲线的绘制及样品的测定

标准曲线的绘制：分别准确量取标准牛血清白蛋白溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于6支洁净的试管中，补水至每支试管中溶液体积为1.0mL。用移液枪准确移取5.0mL考马斯亮蓝G-250溶液分别加入6支规格相同的试管中，振摇均匀，5min后测定595nm处的吸光度值。以标准牛血清白蛋白溶液的浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(A595)为纵坐标绘制标准曲线。

2.4实验结果，参见图2，回归方程：Y＝6.5314x-0.0532，R²＝0.9947，表明线性关系良好。

3、多糖的含量

使用苯酚-硫酸法检测多糖含量。

(2)实验结果

2.1实施例1实验结果

项目	粗多糖提取率(％)	粗多糖中多糖含量(％)
			实施例1	9.38	30.2

2.2不同浓度的氯化钠溶液对云南鸡油菌粗多糖的分离结果

名称	CY–0	CY–1	CY–2	CY–4	CY–8	CY–10
							质量(g)	0.0055	0.0548	0.1077	0.0157	0.0281	0.0072
多糖含量(％)	98.33	80.8	68.18	33.20	30.10	28.00

参见图3试验结果表明DEAE-52纤维素柱色谱后，得到6个明显的洗脱峰，含量各有不同。分别将其命名为CY–0(蒸馏水洗脱)、CY–1(0.1mol/L氯化钠溶液洗脱)、CY–2(0.2mol/L氯化钠溶液洗脱)、CY–4(0.4mol/L氯化钠溶液洗脱)、CY–8(0.8mol/L氯化钠溶液洗脱)、CY–10(1.0mol/L氯化钠溶液洗脱)，将6个洗脱峰进行冻干后计算重量以及计算多糖含量，其中，使用蒸馏水组分多糖含量最高，但是收率比CY–1和CY–2组分低，从综合考量多糖的分离质量和多糖含量，本申请选用浓度为0.1～0.2mol/L的氯化钠溶液进行洗脱。

2.3对比例1实验结果

以脱色率(a)、多糖保留率(b)和蛋白质去除率(c)三者的权重系数分别为0.4，0.4，0.2，得到综合评分M＝0.4a+0.4b+0.2c，对树脂型号初步筛选。

实验结果表明，本发明中选用SP 825的大孔吸附树脂的纯化效果最好。

试验例2鸡油菌多糖结构表征

(1)分析方法

1.1、将系列标准葡聚糖，分子量分别为3300Da，8100Da，18300Da，100000Da进行HPLC分析，对洗脱体积和标准分子量的对数值进行线性回归方程分析，将云南鸡油菌多糖配制成浓度为7mg/mL的溶液，进样量为10μL，以已知标准分子量的对数值为纵坐标，以洗脱体积为横坐标，得标准曲线。

1.2实验结果参见图4，回归方程为Log Mol Wt＝-0.9295V+11.97，R²＝0.9988，线性关系良好。

1.3使用GPC凝胶色谱仪检测多糖分子量。

1.4使用高效液相色谱分析鉴别鸡油菌多糖的单糖组成。

1.4.1多糖水解

称取10mg多糖样品于20mL的钳口瓶中，加入5mL的2mol/L三氟乙酸，充氮气封管(10L/min，1min)，100℃烘箱中水解2h；冷却后打开盖，取1mL加入1mL甲醇后，70℃水浴下用N₂吹干，如此重复加甲醇并用氮气吹干2次，以去除TFA；加入1mL0.3mol/LNaOH溶液充分溶解残渣，为多糖水解液，做一定稀释后衍生测定。

1.4.2单糖衍生化

分别取400μL的混合单糖标准液或多糖水解液于5mL的具塞试管中，加400μLPMP甲醇溶液，漩涡混匀；于70℃水浴中反应2h；取出放置冷却至室温；加400μL0.3mol/L的HCl调节pH为6～7；加水1200μL，再加等体积的氯仿，涡旋混匀振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取2次。将水相用0.45μm微孔膜(水系)过滤后供HPLC进样分析。

1.4.3 HPLC检测条件

仪器型号：Agilent1100，配DAD检测器

色谱条件：色谱柱C₁₈柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相A为90mmol/L磷酸钠缓冲液(pH＝7.8)；流动相B为乙腈；检测波长为250nm；柱温30℃；流速1mL/min；进样量为10μL。

梯度洗脱程序表

t/min	A％	B％
			0	86	14
9	83	17
			28	78	22
29	50	50
			31	50	50
32	86	14
			36	86	14

1.5使用紫外吸收光谱检测鸡油菌多糖中杂蛋白、多肽和核酸。

将云南鸡油菌多糖配制成0.136mg/mL的水溶液，以蒸馏水作为空白，在200～400nm范围内进行紫外吸收光谱的扫描。

1.6使用红外光谱和核磁共振确定鸡油菌多糖的化学结构。

1.6.1红外光谱分析

称取云南鸡油菌多糖2mg与KBr混合，压片，在4000～400cm^-1的测定红外吸收光谱。

1.6.2核磁共振

称取云南鸡油菌多糖16mg溶于0.7mL重水(D₂O)中，混匀后加入核磁管中，密封。在核磁共振波谱仪上进行¹H-NMR和¹³C-NMR检测。

1.7电镜检测

取少量真空干燥多糖样品固定在样品架上，真空镀金使样品处于导电状态，在10kV的加速电压下，分别在500倍，1000倍和2000倍的放大倍数的高真空条件下，使用Sigma300扫描电镜观察和记录样品的微观形态。

(2)实验结果

2.1云南鸡油菌CY-1、CY-2组分多糖分子量

峰号	Mn	Mw	MP	Polydispersity
					CY-1	15036	30594	27696	2.03
CY-2	15097	30495	26932	2.02

Mn为数均分子量，Mw为重均相对分子量，MP为峰值分子量，Polydispersity为分子量分布系数，用于衡量聚合物分子量分布的广度是Mw/Mn比值。

参见图5和图6，云南鸡油菌CY-1、CY-2多糖的水相GPC洗脱曲线只有一个峰，实验结果表明多糖组分均一。

2.2云南鸡油菌CY-1、CY-2多糖水解样品衍生化产物的色谱图

参见图7、图8和图9，进行分析，根据13种单糖混合对照品进行对比，云南鸡油菌CY-1多糖由8种单糖组成，分别为甘露糖Man、鼠李糖Rham、葡萄糖醛酸GlcUA、葡萄糖Glc、半乳糖Gal、木糖Xyl、阿拉伯糖Ara、L-岩藻糖Fuc，其物质的量比为2.253：0.034：0.026：1.032：0.068：0.186：0.087：0.422：4.109，其摩尔百分比为依次为54.83％：0.83％：0.64％：25.11％：1.64％：4.53％：2.12％：10.28％。云南鸡油菌CY-2多糖由8种单糖组成，分别为甘露糖Man、鼠李糖Rham、葡萄糖醛酸GlcUA、葡萄糖Glc、半乳糖Gal、木糖Xyl、阿拉伯糖Ara、L-岩藻糖Fuc，其物质的量比为1.653：0.012：0.052：0.251：0.023：0.037：0.040：0.336，其摩尔百分比为依次为68.82％：0.48％：2.16％：10.44％：0.95％：1.52％：1.66％：13.97％。结果表明云南鸡油菌多糖由8种单糖组成，分别为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和L-岩藻糖。

2.3云南鸡油菌CY-1、CY-2多糖紫外分光光度计波长扫描图

参见图10和图11，在260nm，280nm处无明显吸收峰，结果表明本发明提取的云南鸡油菌多糖不含有杂蛋白、多肽和核酸。

2.4云南鸡油菌CY-1、CY-2多糖红外分析结果

参见图12，在3500～3200cm^-1区间有一个宽而钝的强吸收峰，该区间主要是游离羟基或氨基官能团的特征峰，但该图谱在1150～1050cm^-1也出现了强吸收峰，即1075cm^-1旁证峰，主要由与C-OH键的伸缩振动(V_C-OH)引起的，因此证明3385cm^-1处的吸收峰为O-H伸缩振动吸收峰，属于羟基类化合物，且在3400～3200cm^-1出现强而宽的吸收峰是由于多糖分子内或分子间氧键缔合的-OH伸缩振动的结果，表现为-OH多聚体。

2924cm^-1处的吸收峰是由于分子中的C-H键伸缩振动引起的，该官能团一般还应在1500～1300cm^-1区间出现强吸收峰作为旁证峰，正好与谱图中的1416cm^-1相符合，且1416cm^-1为C-H弯曲振动峰；1651cm^-1处为糖的水化物吸收峰或C＝O非对称伸缩振动峰；849cm^-1处的吸收峰属于844±4cm^-1是D-吡喃环α端基差向异构的C-H振动，且C-H为平伏键；808cm^-1在～800cm^-1附近表明有甘露糖。

参见图13，在3500～3200cm^-1区间有一个宽而钝的强吸收峰，该区间主要是游离羟基或氨基官能团的特征峰，但该图谱在1150～1050cm^-1也出现了强吸收峰，即1078cm^-1旁证峰，主要由与C-OH键的伸缩振动(V_C-OH)引起的，因此证明3404cm^-1处的吸收峰为O-H伸缩振动吸收峰，属于羟基类化合物，且在3400～3200cm^-1出现强而宽的吸收峰是由于多糖分子内或分子间氧键缔合的-OH伸缩振动的结果，表现为-OH多聚体。

2921cm^-1处的吸收峰是由于分子中的C-H键伸缩振动引起的；1647cm^-1处为糖的水化物吸收峰或C＝O非对称伸缩振动峰；1418cm^-1、1385cm^-1处的吸收峰是C-H的弯曲振动；858cm^-1为α型糖苷键的吸收峰；985cm^-1和817cm^-1是吡喃环的特征吸收峰。

2.5云南鸡油菌CY-1、CY-2多糖核磁共振分析结果

参见图14，在CY-1的¹H-NMR图中，多糖的位移大多集中在δ3.5ppm～δ4.4ppm之间。在异头质子区δ4.4ppm～δ5.8ppm有δ5.37ppm，δ5.25ppm，δ5.16ppm，δ5.01ppm，δ4.87ppm和δ4.76ppm共6个信号。其中，δ5.37ppm，δ5.25ppm，δ5.16ppm和δ5.01ppm是α型吡喃糖的质子信号；δ4.87ppm和δ4.76ppm是β型吡喃糖的质子信号，且δ4.87ppm的吸收峰较强。表明CY-1糖链中有6个糖残基组成的重复单位；3.29ppm、3.43ppm等化学位移在3.0～4.0ppm区域为糖残基中非异头质子的次甲基和亚甲基共振区，即结构信息共振信号。其中，δ3.43ppm是半乳糖6位甲基的信号，δ1.18ppm是岩藻糖甲基的信号。

参见图15，在CY-1的¹³C-NMR谱图中，异头碳的化学位移在δ90ppm～δ110ppm之间，δ103.12ppm是β型吡喃糖异头C1的信号，较强。δ101.00ppm和δ100.65ppm，δ99.46ppm和δ98.44ppm是α异头C1的信号，且含量较高；δ82ppm～δ84ppm区域中无信号，表明所有的糖残基为吡喃型糖苷；δ78.70ppm，δ78.60ppm是发生氧取代的(1→4)糖苷键的C4的信号，δ76.04ppm，δ75.68ppm，δ75.02ppm，δ73.33ppm，δ73.17ppm和δ71.96ppm分别为C5，C4，C3和C2的信号；大量信号堆积在δ67ppm～δ70ppm之间，说明CY-1的糖链中C-6大部分被取代；δ61.15ppm和δ60.83ppm是游离的C6信号，稍弱。进一步说明C-6被取代较多；15.47ppm为岩藻糖的CH₃上的C的共振信号，即多糖中岩藻糖具有CH₃结构。综合IR和NMR的结果推测，CY-1可能有α(1→4)和β(1→6)两种糖苷键的连接方式且含有岩藻糖。

参见图16，在CY-2的¹H-NMR图中，多糖的位移大多集中在δ3.5ppm～δ4.4ppm在异头碳区δ4.4ppm～δ5.8ppm有δ4.82ppm，δ4.72ppm，δ4.45ppm和δ4.43ppm共4处的信号。其中，δ4.82ppm是β型吡喃糖的质子信号，δ4.72是溶剂重水的残余氢峰，表明CY-2糖链中有3个糖残基组成的重复单位。3.61ppm、3.71ppm等化学位移在δ3.0～δ4.0ppm区域为糖残基中非异头质子的次甲基和亚甲基共振区，即结构信息共振信号。δ3.41ppm是半乳糖6位甲基的信号；δ1.15ppm和δ1.13ppm是岩藻糖甲基双峰。

参见图17，在CY-2的¹³C-NMR谱图中，δ102.99ppm和δ99.41ppm是α异头C1的信号，且含量较高，δ82ppm～δ84ppm区域中无信号，表明所有的糖残基为吡喃型糖苷。在非异头碳区域δ70～75ppm中，δ75.57ppm，δ73.10ppm和δ72.91ppm分别是C5，C4和C3的信号，大量信号堆积在δ70ppm附近，说明CY-2的糖链中C-6大部分被取代；δ60.77ppm是游离的C6信号，较弱，也进一步说明C-6取代较多。综合IR和NMR的结果推测，CY-2可能有α(1→6)糖苷键连接方式。

2.6云南鸡油菌CY-1、CY-2多糖电镜分析结果

参见图18，在扫描电镜下观察到CY-1在电镜下呈现网孔状，彼此连接呈整体的多层分枝结构，分子间交叉，网状结构边缘光滑、平整，整体结构较疏松。CY-2在电镜下表面粗糙，有像海绵状的小空洞，整体较致密。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种云南鸡油菌多糖的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)预处理：取云南鸡油菌子实体样品，粉碎，过筛，制得云南鸡油菌粉末，加入料液比为1g：10～30mL的乙醇溶液，超声提取后浸泡12～16h，将浸泡后的云南鸡油菌粉末进行离心，转速为3500～4500r/min，离心时间为8～12min，弃上清液，制得滤渣；

(2)水浸提：取滤渣，按料液比1g：15～25mL加入蒸馏水，水浴锅浸提，浸提温度为70～90℃，浸提时间为1.5～3h，过滤，重复提取2～4次，合并滤液，旋转蒸发浓缩，制得浸提液；

(3)醇沉：浸提液中按照料液比为1mL：3～5mL加入乙醇溶液，放入温度控制为2～6℃的冰箱中冷藏20～26h，离心，转速为3500～4500r/min，离心时间为8～12min，收集沉淀物；

(4)脱色处理：将步骤(3)制得的沉淀物加入料液比为1g：15～25mL的蒸馏水溶解，制得沉淀物水溶液，将沉淀物水溶液和Sevag试剂混合，萃取，制得第一上清液，将第一上清液加入大孔树脂中，脱色，制得第二上清液，第二上清液加入乙醇溶液中，放入冰箱静置12～16h，离心，收集析出的沉淀并置于-20℃冰箱冷冻24h，制得云南鸡油菌粗多糖，将云南鸡油菌粗多糖进行冷冻干燥，制得云南鸡油菌粗多糖；

(5)分离：步骤(4)制得的云南鸡油菌粗多糖加水溶解，制得云南鸡油菌粗多糖溶液，料液比为1g：20～30mL，云南鸡油菌粗多糖溶液使用柱色谱分离，洗脱液为氯化钠溶液，收集目标洗脱组分进行浓缩，制得目标洗脱组分浓缩液；

(6)纯化：将步骤(5)分离得到的目标洗脱组分浓缩液装入透析袋中，分别使用自来水和蒸馏水进行透析，透析后冷冻干燥，即得云南鸡油菌纯化多糖。

2.如权利要求1所述的云南鸡油菌多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声提取为在30～50℃下超声20～40min，超声功率为50～150Hz。

3.如权利要求1所述的云南鸡油菌多糖，其特征在于，步骤(1)中，所述乙醇溶液质量分数为95％。

4.如权利要求1所述的云南鸡油菌多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，所述沉淀物和Sevag试剂质量比为1:1，所述Sevag试剂由体积比为4:1的氯仿和正丁醇制得。

5.如权利要求1所述的云南鸡油菌多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，所述萃取操作为将沉淀物和Sevag试剂混合振荡20min，静置30min，收集上层萃取液，将上层萃取液继续萃取3次，制得第一上清液。

6.如权利要求1所述的云南鸡油菌多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤(5)中，所述氯化钠溶液浓度为0.1～0.2mol/L，所述柱色谱的填料为DEAE-52纤维素。

7.如权利要求1所述的云南鸡油菌多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤(6)中，所述自来水透析24h，每隔6h换一次自来水，再用蒸馏水透析12h，每隔4h换一次蒸馏水，制得浓缩液。

8.如权利要求1所述的云南鸡油菌多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，所述大孔树脂型号为SP 825，所述大孔树脂吸附步骤为：将大孔树脂和第一上清液放入具塞三角瓶中，在恒温摇床中脱色5～7h。

9.如权利要求1所述的云南鸡油菌多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述冷冻干燥温度为-75～-85℃，时间为23～25h。

10.一种云南鸡油菌多糖，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的分离纯化方法制得。