CN109206532B - 一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法，该方法包括以下步骤：将桃金娘果实回流提取，得桃金娘果实粗多糖，然后加入30％H₂O₂溶液脱色；脱色后的多糖加入Sevag试剂去蛋白，得到初步纯化的桃金娘果实多糖；用梯度浓度的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用苯酚‑硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，分别得到多糖P1、P2、P3和P4。本发明建立了一条完整可行的桃金娘果实多糖提取、分离纯化、结构特征和生物活性研究的技术路线，为野生植物资源桃金娘果实多糖的提取分离纯化提供了技术指导。

Description

一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法

技术领域

本发明涉及一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法。

背景技术

桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa)又名岗稔(广东)、豆稔干(广西)、石都捻子(《本草拾遗》)、倒捻子(《岭表录异》)、倒粘子(《苏沈良方》)等，广泛分布于南亚热带区域；在常绿阔叶林生态系统为优势种，覆盖度30％～60％，呈先锋群落；在中国主要分布于岭南，是我国南方地区主要的林下植被，资源非常丰富，大多生于丘陵坡地、旷野、路边，而且野生桃金娘的分布面积广泛，但目前对其开发利用率较低，加工利用水平也相对较低，桃金娘属于一种尚未进行规模化开发利用的潜在的食品新资源。

桃金娘的果实为浆果，成熟时果皮呈紫黑色，果肉则呈紫红色，肉质多汁，营养丰富。有研究表明，野生桃金娘果实成熟时，总糖含量占8.06％、还原糖占7.72％、果胶占1.01％、总酸占0.38％、蛋白质占1.30％、脂肪占0.32％、淀粉占3.08％、粗纤维占34.97％，维生素C含量为5.48mg/kg。

桃金娘果实含有多糖类、黄酮类、皂苷类、多酚类、蒽醌类等多种活性成分，具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抑菌、保肝等生物活性。作为一种野生植物资源，桃金娘在食品加工、保健品开发及医学药物研究等方面有着广阔的开发前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法，利用水提醇沉法对桃金娘果实进行多糖提取，并通过离子交换柱层析法对多糖进行分离纯化，由此提取分离出纯度较高、具有生物活性的多糖组分。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法，包括以下步骤：

(1)提取桃金娘果实多糖：将桃金娘果实烘干并粉碎，取其干粉和蒸馏水于回流装置中煮沸提取数次，合并提取液并减压浓缩，在浓缩液中加入数倍体积的95％(V/V)乙醇，不断搅拌使多糖均匀沉淀，然后在4℃下静置12h以上，离心收集沉淀，烘干后得桃金娘果实粗多糖；

步骤(1)所述的煮沸提取，每次的提取时间优选4h；

步骤(1)所述的离心优选5000r/min离心15min；

(2)H₂O₂法脱色：取桃金娘果实粗多糖加蒸馏水溶解，调节pH值至8.0，然后一边滴加30％H₂O₂溶液，一边搅拌，直至溶液颜色变浅，随后在50℃水浴下保温2h；

步骤(2)所述的粗多糖加蒸馏水溶解的浓度优选0.2g/mL；

(3)Sevag法脱蛋白：在脱色后的多糖溶液中加入该溶液1/5体积的Sevag试剂，振荡培养20min，静置10min后离心，弃去下层有机相和中间层蛋白质与氯仿和正丁醇生成的凝胶物，重复该离心和弃去有机相、凝胶物的操作若干次；最后一次操作后，旋蒸除去溶液中残留的Sevag试剂，得到脱蛋白后的桃金娘果实多糖溶液，按步骤(1)的醇沉法收集沉淀，烘干后得初步纯化的桃金娘果实多糖；

步骤(3)所述的Sevag试剂，是由氯仿和正丁醇按体积比5:1组成；

步骤(3)所述的振荡培养，其转速优选150r/min；

步骤(3)所述的离心优选4000r/min离心10min；

(4)DEAE-Sepharose fast flow离子交换柱层析分离桃金娘果实多糖：DEAE-琼脂糖凝胶填料经预处理后装柱，步骤(3)的初步纯化的桃金娘果实多糖用去离子水溶解后过0.45μm微孔滤膜，然后上柱；用梯度浓度的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，分别得到多糖P1、P2、P3和P4；

步骤(4)所述的填料预处理包括以下步骤：将填料进行抽滤并且用蒸馏水冲洗，由于在冲洗过程中会产生气泡，之后用超声波进行脱气泡，静置；

步骤(4)所述的装柱包括以下步骤：将填料缓慢引流至层析柱(柱规格为1.5cm×20cm)中，柱床体积约为20mL；先用蒸馏水冲洗层析柱1h，再用浓度为1mol/L的NaCl溶液冲洗1h，最后用蒸馏水冲洗2h，即可准备上样；

步骤(4)所述的初步纯化的桃金娘果实多糖用去离子水溶解，其浓度优选50mg/mL；

步骤(4)所述的上样和洗脱流速优选0.5mL/min；

步骤(4)所述的NaCl溶液梯度是0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mol/L；

步骤(4)所述的透析是在透析袋(3000Da)中于4℃透析48h。

相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：

(1)本发明建立了一条完整可行的桃金娘果实多糖提取、分离纯化、结构特征和生物活性研究的技术路线，为野生植物资源桃金娘果实多糖的提取分离纯化提供了技术指导。

(2)本发明所用的水提醇沉法可以完成大量的多糖提取操作，成本较低，重复性好，得率高，适用于工业化大规模生产。

(3)本发明所用的DEAE-Sepharose fast flow理化稳定性能和机械性能更好，交换容量大，可以在位清洗，床体积随pH值的离子强度变化很小，由于流速和载量高，适合于进行大量粗产品的纯化工作。

(4)本发明创造性地将多糖的水提醇沉提取方法与离子交换层析分离纯化方法结合起来用于桃金娘果实多糖的研究，比较并得到较优的工艺参数，为桃金娘果实多糖的提取分离纯化提供技术指导和新思路。

附图说明

图1是桃金娘果实多糖的洗脱曲线图。

图2是多糖P1的紫外光谱图。

图3是多糖P2的紫外光谱图。

图4是多糖P3的紫外光谱图。

图5是多糖P4的紫外光谱图。

图6是桃金娘果实多糖体外结合胆酸盐能力。

图7是多糖P1的红外光谱图。

图8是多糖P2的红外光谱图。

图9是多糖P3的红外光谱图。

图10是多糖P4的红外光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中，所得到的桃金娘果实多糖组分P1、P2、P3、P4的分析由中国广州分析测试中心进行，报告编号分别为2017011500-2、2017011500-3、2018000533-1、2018000533-2。

实施例1

一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法，包括以下步骤：

(1)提取桃金娘果实多糖：称取110g烘干后的桃金娘果实粉碎，过40目筛后称取100g干粉，加1000mL蒸馏水，于回流装置中煮沸4h，抽滤后，取滤渣再加入1000mL蒸馏水，于回流装置中煮沸4h，合并上清液，减压浓缩。在浓缩液中缓慢加入4倍体积的95％(V/V)乙醇，并不断用玻璃棒搅拌使多糖均匀沉淀，然后放入4℃冰箱静置12h，之后5000r/min离心15min，收集沉淀，烘干后得桃金娘果实粗多糖；

(2)H₂O₂法脱色：称取20g桃金娘果实粗多糖，加100mL蒸馏水溶解，用1％NaOH溶液调节多糖溶液pH值至8.0，然后一边滴加30％H₂O₂溶液，一边搅拌，直至颜色逐渐变浅，随后在50℃水浴下保温2h；

(3)Sevag法脱蛋白：在脱色后的多糖溶液中加入该溶液1/5倍体积的Sevag试剂(氯仿和正丁醇按体积比5:1配制而成)以150r/min转速在摇床上振荡20min，静置10min后离心，弃去下层有机相和中间层蛋白质与氯仿和正丁醇生成的凝胶物，反复5次。最后一次4000r/min离心10min后旋蒸除去溶液中残留的Sevag试剂，得到脱蛋白后的桃金娘果实多糖溶液，按步骤(1)的醇沉法收集沉淀，烘干后得初步纯化的桃金娘果实多糖；

(4)DEAE-Sepharose fast flow离子交换柱层析分离桃金娘果实多糖：

4.1填料预处理：为了除掉20％乙醇的保护液，抽滤时用蒸馏水进行冲洗。由于在冲洗过程中会产生气泡，之后用超声波进行脱气泡，静置；

4.2装柱：将调料缓慢引流至层析柱(柱规格为1.5cm×20cm)中，柱床体积约为20mL。先用蒸馏水冲洗层析柱1h，再用浓度为1mol/L的NaCl溶液冲洗1h，最后用蒸馏水冲洗2h，即可准备上样；

4.3上样：取多糖样品0.1g，用2mL蒸馏水溶解，配置成浓度为50mg/mL的溶液，过0.45μm微孔滤膜后，以0.5mL/min流速上样；

4.4梯度洗脱：依次用浓度分别为0(即蒸馏水)、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mol/L的NaCl溶液以0.5mL/min流速洗脱，每5mL收集一管，用苯酚硫酸法测定每管的多糖含量，各组分洗脱至无多糖检出则视为收集完毕。以接收的管数为横坐标，以波长490nm处的吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，即图1；

苯酚-硫酸法检测多糖含量具体操作如下：准确移取0.1mg/mL无水葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，依次置于6支试管中，然后依次加入蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0mL，再依次加入6％苯酚溶液0.5mL、浓硫酸2.5mL，混合均匀后，室温放置20min，在波长490nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。量取样品溶液1mL，按标准曲线操作方法，测定相应吸光度，计算样品溶液中总多糖含量。

4.5透析：分别收集洗脱下来的各组分，浓缩后转入透析袋(3000Da)中于4℃透析48h，减压浓缩后进行冷冻干燥，得到桃金娘果实多糖的4个纯化组分P1、P2、P3、P4。

实施例2

对实施例1得到的桃金娘果实多糖进行紫外光谱分析，各称取1mg多糖样品，配制1mg/mL多糖溶液，扫描在200-500nm范围内紫外图谱。

图2为P1的紫外光谱图，图3为P2的紫外光谱图，图4为P3的紫外光谱图，图5为P4的紫外光谱图，结果显示，4个纯化组分中在260nm、280nm处均无明显的吸收峰，表明不含蛋白质和核酸物质。

实施例3

对实施例1得到的桃金娘果实多糖进行多糖分子量分析，具体实验方法如下：

采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定分子量。取多糖样品2mg，加0.02mol/L磷酸缓冲液溶解，配制成2.0mg/mL溶液，用0.22μm无菌滤膜过滤，取过滤清液备用。色谱条件：柱温35℃，以0.02mol/L磷酸盐缓冲液为流动相，流速为0.6mL/min，进样量20μL，Waters 2410示差折光检测器检测。配制一系列不同分子量的葡聚糖溶液(700，400，200，100，50，30，10，5kD)作为标准品，绘制标准曲线，样品分子量则根据其相应的洗脱体积对照标准曲线进行计算。

测得桃金娘果实多糖纯化组分的分子量如下表1所示：

表1桃金娘果实多糖纯化组分的分子量

实施例4

对实施例1得到的桃金娘果实多糖进行单糖组成分析，具体方法如下：

称取多糖样品10mg，加入4mol/L三氟乙酸5mL，在100℃水解2h，水解液用氮吹仪吹干，用色谱纯甲醇洗涤3次，得多糖水解物。在多糖水解物中依次加入盐酸羟胺10mg、内标肌醇1mg和吡啶2mL，90℃水浴30min后加入醋酸酐2mL，90℃水浴30min后加入蒸馏水2mL终止反应。用二氯甲烷2mL萃取2次，合并二氯甲烷相，加入无水硫酸钠干燥，过0.22μm有机微孔滤膜，备用。

气相色谱检测条件：分析柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；进样体积为1μL；进样口温度为250℃；恒压模式为20PSI；程序升温：初始柱温100℃，保持0.5min，然后以20℃/min升至140℃，保持5min，随后以3℃/min速度升至160℃，再以10℃/min速度升到250℃，保持5min；分流比为10:1，流动相为氦气，流速为1mL/min。

单糖标准品检测：取核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖标准品，按照上述相同步骤进行处理和检测，作为标准对照。

测得桃金娘果实多糖的单糖组成结果如下表2：

表2桃金娘果实多糖纯化组分的单糖组成

实施例5

对实施例1得到的桃金娘果实多糖进行傅里叶红外光谱分析。

称取2mg多糖样品，将其与干燥后的KBr(溴化钾)于研钵中混匀研磨，经压片机压成片，采用傅里叶变换红外光谱仪，在400-4000cm^-1的波数范围内扫描。

官能团在红外光谱图中具有特征吸收峰，因此，红外光谱图能较好地分析多糖的结构。图7～图10是桃金娘果实多糖纯化组分P1、P2、P3、P4的红外光谱图，分别在3354、3402、3402、3442cm^-1处的吸收峰是由O-H伸缩振动产生，2928、2930、2935、2944cm^-1处的吸收峰是由C-H伸缩振动产生，1458、1385、1385、1418cm^-1处的吸收峰是由C-O伸缩振动产生，这些峰都是多糖的特征峰，可以判断P1、P2、P3、P4都属于多糖类物质。

P1的红外光谱图(图7)中，在1649cm^-1处有明显的吸收峰，是结合水的特征吸收峰；在1236cm^-1处的吸收峰是由S＝O的伸缩振动产生，说明P1中存在硫酸根；在1050cm^-1处的吸收峰说明了葡萄糖单元的存在。

P2的红外光谱图(图8)中，在1152cm^-1处的吸收峰，说明P2存在吡喃糖环；在1049cm^-1处的吸收峰说明了葡萄糖单元的存在。

P3的红外光谱图(图9)中，在1046cm^-1处的吸收峰说明了葡萄糖单元的存在。

P4的红外光谱图(图10)中，在837cm^-1处的吸收峰，说明P4中存在α-糖苷键；在769cm^-1处的吸收峰说明了甘露糖苷的存在。

实施例6

对实施例1得到的桃金娘果实多糖进行体外结合胆酸盐能力测定，以考来烯胺为阳性对照，初步表征降血脂能力。测定方法如下：

胆酸盐标准曲线的绘制：以0.1mol/L、pH＝6.3磷酸缓冲溶液分别配制0.3mmol/L的牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、胆酸钠。分别取上述溶液0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于10mL具塞试管中，加入0.1mol/L、pH＝6.3磷酸缓冲溶液至2.5mL，然后加入质量浓度为60％硫酸溶液7.5mL，于70℃水浴20min，取出后放入冰浴5min，测387nm波长处吸光度。以胆酸盐浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制各种胆酸盐的标准曲线。

样品模拟人体胃肠道环境：取样品溶液1mL于10mL具塞试管中，加入0.01mol/L盐酸溶液1mL，在37℃下恒温振荡消化1h，然后以0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.3，随后加入10mg/mL胰酶(以pH6.3的0.1mol/l磷酸缓冲液配制)4mL，在37℃下恒温振荡消化30min。

体外结合胆酸盐的实验：分别向经模拟人体胃肠道环境处理后的样液中加入0.3mmol/L的各种胆酸盐(牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、胆酸钠)溶液4mL，在37℃下恒温振荡1h后转入离心管，以4000r/min离心20min。对上清液中的胆酸盐含量进行分析：分别取上清液2.5ml于具塞试管中，加入质量浓度为60％硫酸溶液7.5ml，于70℃水浴20min，取出冰浴5min，在387nm处测定吸光度。由标准曲线方程求得样液中胆酸盐的浓度，用加入的胆酸盐浓度减去此浓度即为结合的胆酸盐浓度，计算单位质量结合胆酸盐的含量。

图6是桃金娘果实多糖体外结合胆酸盐能力，结果表明，四种多糖纯化组分都有不同程度的结合胆酸盐能力，其中，P4结合胆酸盐的能力比其它纯化组分稍强，这可能是其中半乳糖醛酸含量较高的原因；其次是P2结合胆酸盐的能力较强，这可能是其分子量较大的原因，有研究发现，多糖分子量大小会影响与胆酸盐的结合效果，对于同一来源的多糖，分子量越大，表观粘度越大，对胆酸盐的吸附作用越好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将桃金娘果实烘干并粉碎，取其干粉和蒸馏水于回流装置中煮沸提取数次，合并提取液并减压浓缩，在浓缩液中加入数倍体积的95％(V/V)乙醇，不断搅拌使多糖均匀沉淀，然后在4℃下静置12h以上，离心收集沉淀，烘干后得桃金娘果实粗多糖；

(2)取桃金娘果实粗多糖加蒸馏水溶解，调节pH值至8.0，然后一边滴加30％H₂O₂溶液，一边搅拌，直至溶液颜色变浅，随后在50℃水浴下保温2h；

(3)在脱色后的多糖溶液中加入该溶液1/5体积的Sevag试剂，振荡培养20min，静置10min后离心，弃去下层有机相和中间层蛋白质与氯仿和正丁醇生成的凝胶物，重复该离心和弃去有机相、凝胶物的操作若干次；最后一次操作后，旋蒸除去溶液中残留的Sevag试剂，得到脱蛋白后的桃金娘果实多糖溶液，按步骤(1)的醇沉法收集沉淀，烘干后得初步纯化的桃金娘果实多糖；

(4)DEAE-琼脂糖凝胶填料经预处理后装柱，步骤(3)的初步纯化的桃金娘果实多糖用去离子水溶解后过0.45μm微孔滤膜，然后上柱；用梯度浓度的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，分别得到多糖P1、P2、P3和P4；

所得四种多糖的分子量如表1所示：

表1 桃金娘果实多糖纯化组分的分子量

所得四种多糖的单糖组成如表2所示：

表2 桃金娘果实多糖纯化组分的单糖组成

步骤(4)所述的NaCl溶液，梯度是0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mol/L；

步骤(4)所述的上柱 和洗脱流速为0.5mL/min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述的透析，是将浓缩后的流分转入透析袋中于4℃透析48h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的Sevag试剂，是由氯仿和正丁醇按体积比5:1组成。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的煮沸提取，每次的提取时间为4h。

Images