CN108047318A

CN108047318A - 一种灵芝活性成分多糖肽、多糖肽对照品及多糖肽分离纯化方法

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Publication number: CN108047318A
Application number: CN201711399922.4A
Authority: CN
Inventors: 林树钱; 林冬梅; 王赛贞; 林占熺; 罗虹建; 郭嘉铭; 林树光
Original assignee: BACTERIAL GRASS TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co FUJIAN AGRICULTURE UNIV
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2018-05-18
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: CN108047318B

Abstract

本发明公开了一种灵芝活性成分多糖肽、多糖肽对照品及多糖肽分离纯化方法，将灵芝粉碎、水浸泡提取获得灵芝水提取液，通过净化处理经分子量级的膜分离，采用10KD透析膜所截留的高分子量透过液，经乙醇梯度分离，Bio‑GL，P‑10柱色谱分离，纯化获活性物质多糖肽对照品，在高效色谱条件下进行成分鉴定和口味鉴别及含量测定。本发明采用分子量膜分离方法把低分子部分苦味分开与传统乙醇提取比较，风险性小，安全性高，无毒副作用，易于工业化生产的方法。

Description

一种灵芝活性成分多糖肽、多糖肽对照品及多糖肽分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种灵芝活性成分分离纯化方法，特别是一种灵芝活性成分多糖肽、多糖肽对照品及多糖肽分离纯化方法。

背景技术

国内外学者研究表明：组成灵芝的化学有效成分有多糖（肽）、三萜、生物碱、甾醇等有几十种成分，针对高分子部位多糖肽与低分子三萜类组分离与纯化，如贺俊杰，陈彦，杜萌等.多指标评价微乳提取灵芝有效组分的实验研究，中成药，2013，35（3）：479～482。目前，工业化生产工艺主要采用水煎煮提取多糖和多糖肽组分。如：李艳，赵海燕，吕建宁.灵芝多糖提取工艺研究.中成药，2006，28（7）：1050-1054。如林树钱，王赛贞，林志彬，等.草栽灵芝多糖肽提取条件研究.食用菌学报，2003.10（1）：33～36

自1979年迄今美国国家医学书馆Pubmed网站收载灵芝论文1087篇，其中2008年11月份至2012年12月就收载灵芝论文520篇，同一期中国知网（CNKI）医药和农业科技收载灵芝研究论文2020篇。收载以灵芝为主题的硕、博士毕业论文超过300篇，以上大量研究论文和国内外专利文献均对灵芝提纯进行了大量的研发，但是仍然无法解决现有的灵芝的复杂成分中含有的苦味问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，而提供一种除去灵芝中苦味低分子复杂成分及其杂质。

本发明还在于提供一种灵芝活性成分多糖肽对照品。

本发明还在于提供一种灵芝活性成分多糖肽分离及纯化方法。

一种灵芝活性成分多糖肽，所述的灵芝活性多糖肽峰位分子量M_P为1.0×10⁴ Da以上的灵芝多糖肽高分子化合物。

所得的灵芝多糖肽高分子化合物，由二种或多种不同单糖与17种氨基酸构成。

段木灵芝多糖肽由葡萄糖和甘露糖组成；灵芝多糖肽由葡萄糖和甘露糖组成，其摩尔比为葡萄糖∶甘露糖=31.85∶1.00。

一种灵芝活性成分多糖肽对照品，将灵芝多糖肽高分子化合物经GL-PP分级醇沉，Bio-Gl，P-10柱色谱分离，获灵芝活性多糖肽GL-PPSQ纯品，纯度为97%以上，分位分子量为6.25×10⁴ Da。

一种灵芝活性多糖肽分离纯化方法，将净化后的灵芝提取液采用10KD膜分离或透析袋，截留峰位分子量M_P1.0×10⁴ Da以上，所得即为灵芝多糖肽高分子化合物。

将净化后的灵芝提取液采用10KD膜分离柱或透析袋，截留10KD分子量MP1.0×10⁴以上的成分为灵芝多糖肽高分子化合物，由于不含有低分子化合物，而低分子化合物为灵芝苦味的源泉，因此本发明的分离纯化方法所保留的灵芝多糖肽高分子化合物不含有苦味，改变了现有技术中灵芝活性成份因含有苦味导致实际销路不好的情况。

综上所述的，本发明相比现有技术如下优点：

本发明采用分子量膜分离把低分子苦味分开与传统乙醇提取，风险性小，安全性高，无毒副作用，易于工业化生产的方法。

本发明解决了现有技术中灵芝提取物复杂成分没有充分分离而造成灵芝提取物含有苦味无法被市场接受，通过现代分离分子量新技术，从分子水平上截留功效成分，除去非活性成分的方法，是目前本领域技术领先。本发明弥补了现有灵芝复杂多种成分和口感难以分开的技术难题。

本发明分子量级的水溶性灵芝活性成分明确，质量可控，可应用于产品开发。其产品有灵芝多糖肽粉剂，口服液等。

附图说明

图1本发明的图1是段木灵芝提取液中灵芝多糖肽的HPLC图。

图2菌草灵芝提取液中灵芝多糖肽的HPLC图。

图3菌草灵芝提取物分子量测定结果（分子量大于10KD以上）。

图4段木灵芝提取物分子量测定结果（分子量大于10KD以上）。

图5菌草灵芝精粉透析截留高分子部位。

图6灵芝多糖肽GL-PPSQ氨基酸图谱。

图7灵芝多糖肽GLPPSQ¹H-NMR图谱。

图8灵芝多糖肽GLPPSQ¹³C-NMR图谱。

图9异核多量子相关谱CHMQC图谱。

图10 HSQC-TOCSY（碳氢相关图-全相关图）：

图11 GLPPSQ的COSY 图谱（同核二维谱)。

图12 GLPPSQ的HMBC图谱。

图13 GLPPSQ的NOESY图谱（空间氢氢相关图）。

图14 段木灵芝多糖肽单糖组成（分子量范围＞10KD）图。

图15 菌草灵芝多糖肽单糖组成（分子量范围＞10KD）图。

图16 灵芝多糖肽含量检测标准曲线图。

图17是灵芝活性多糖肽产品制成口服液的步骤图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行更详细的描述。

实施例1

一种灵芝提取物原液图谱特征，在特定的图谱条件下，灵芝提取物具有多种高分子多糖肽，其保留时间是11.875′-15.297′，峰位分子量M_P1.5×10⁴-4.8×10⁵Da(见图1和图2)。

一种灵芝活性多糖肽，所述的灵芝多糖肽，峰位分子量在M_P1.0×10⁴ Da以上的灵芝多糖肽高分子化合物。

段木灵芝提取液在特定色谱条件下，保留时间8.093分，Mp2.8×10⁴Da ，Mn1.3×10⁴Da，Mw2.0×10⁴ Da，面积94.91%（见图3）为段木灵芝高分子多糖肽。

菌草灵芝提取物中多糖肽保留时间8.731分，Mp1.0×10⁴Da Mn1.1×10⁴Da，Mw1.5×10⁴Da，面积63.98%（见图4）为高分子菌草灵芝多糖肽。

菌草灵芝提取物（精粉），通过10KD在同等色谱条件下收集，出峰保留时间8.693分，Mp1.1×10⁴ Da， Mn1.1×10⁴ Da，Mw1.6×10⁴ Da，，面积56.50%（见图5），也同样获得灵芝多糖肽。

灵芝活性多糖肽GL-PPSQ的化学结构：其结构特征，主链由葡萄糖组成-4)Glcp(1-，-3)Glcp(1-和-6)Glcp(1-构成的主链，在-6)Glcp(1-的4位上有分支。结构中在肽链上的丝氨酸或苏氨酸的羟基相连的单糖是O-糖苷键连接。GLPPSQ是一种活性多糖肽，得率是灵芝子实体的0.53%。其纯度97%以上，含多糖88.18%和17种氨基酸构成，氨基酸总量为4.03%（见图6）。

灵芝活性成分多糖肽GLPPSQ结构推断依据，通过¹H（图7）、¹³C（图8）和多种二维核磁 COSY, HSQC, HSQC-TOCSY, NOESY和 HMBC（图9-13）测定谱图，同时结合GC-MS甲基化分析和GLPPSQ 的糖基组成。

根据气相-质谱的结果：以推测多糖中单糖排列顺序，多糖的主链、支链及连接点。实验条件：GC-MS系统（Thermo菲尼根公司，型号：Trace2000/MS），色谱柱：DB-5MS（30m ×0.25 mm, 0.25 µm, 0.2 mm膜厚）（见下表1）。

表1 多糖GLPPSQ的甲基化分析中葡萄糖残基的分析结果

保留时间（min）	甲基化碎片	糖苷键的类型	摩尔比
				12.794	2,3,4,6-Me4-Glc p	Glc p-(1→	5.32
13.999	2,4,6-Me3-Glc p	→3)-Glc p-(1→	2.85
				14.133	2,3,6-Me3-Glc p	→4)-Glc p-(1→	3.79
14.461	2,3,4-Me3-Glcp	→6)-Glc p-(1→	1.54
				15.853	2,3-Me2-Glc p	→4,6-Glc p-(1→	0.41
15.973	2,4-Me2-Glc p	→3,6-Glc p-(1→	1.00

表2 多糖GLPPSQ中葡萄糖残基化学位移全归属

表3 多糖GLPPSQ中葡萄糖残基的HMBC谱分析结果

从表3所示残基A和残基E的C-6和C-4相连；残基B和残基B/C的C-3相连；残基C和残基B的C-3相连；残基D和残基D的C-4以及残基F的C-6相连；残基E和残基D的C-4相连；残基F和残基F的C-6以及残基C的C-6相连。

表4 多糖GLPPSQ中葡萄糖残基的NOESY谱分析结果

从表4所示残基A和残基E的C-6和C-4相连；残基D和残基D的C-4以及残基F的C-6相连；残基E和残基D的C-4相连；残基F和残基F的C-6以及残基C的C-6相连，这一结果进一步验证了HMBC的分析结果。

根据上述实验结果推断灵芝活性成分（GL-PPSQ）结构的重复单元为：

综合核磁图谱分析、单糖组成和甲基化分析，可知多糖GLPPSQ以葡聚糖为主。

如上所述的灵芝多糖肽：其特征是段木灵芝多糖肽由葡萄糖的含量24.58%，甘露糖为2.51%（见图14）；菌草灵芝多糖肽或其他袋料的灵芝单糖由葡萄糖的含量14.27%，甘露糖含量2.91%，阿拉伯糖含量5.82%和木糖含量6.63%组成（见图15）。

上述灵芝活性多糖肽分离纯化方法；（1）灵芝提取物制备液与净化：把子实体切片或破碎成丝状；常温浸泡2.0～4.0h，物料和水比例为1∶10～20倍，沸水煮2次，每次分别为1.5h和1.0h，过滤合併滤液。置于真空浓缩，温度65～68℃，真空-0.09～-0.1MPa，减压浓缩至子实体质量的10倍左右，即为灵芝提取液。

上述制备液通过以下方式进行净化处理：如离心（速度为4000～6000r.min^-1或高速离心机（10000～12000r.min^-1），时间10～15分，除去粗大杂质；然后分别用孔径5μm、1μm、0.45μm、0.1μm的微孔滤膜过滤，或采用750KD中空纤维柱超滤。

（2）灵芝多糖肽提取：上述经微滤后的灵芝净化液，采用10KD膜或10KD中空纤维柱超滤截留10KD以上分子质量的超滤液，超滤速度控制1～10L.h^-1或20～25L.h^-1，工作温度为室温，工作压力0.1～0.2Mpa，泵：可变频高速。以一定的速度连续流过膜包表面或中空纤维柱，把灵芝提取液为高分子灵芝活性多糖肽。

本发明实施采用Centramate超滤系统：截留1.0×10⁴Da以上分子量，为灵芝多糖肽，由于栽培灵芝原料不同，实际上截留分子量略有差异，如段木灵芝提取物，其灵芝多糖肽分子量在1.4×10⁴Da以上，菌草灵芝提取物，其灵芝多糖分子量在1.0×10⁴Da以上。

灵芝多糖肽活性部位的提取：其特征是灵芝水提取液（实施例2操作）加入三倍体积95%乙醇沉淀，进一步纯化，冷冻干燥即得灵芝多糖肽有效部位（GL-PP）粗制品得率0.76%（n=3）。

（3）口服剂灵芝多糖肽原料的提取：采用切向流（TFF）截留分子量技术，具体操作如下：将灵芝提取液通过微滤（MF），膜的孔径在0.1微米（μm）至10μm之间，进样压力（控制0.68Mpa）：温度为常温，预净化，微滤处理。切向流截留分子量技术参数：1.选配10KD中空纤维柱，截留分子量为1.0×10⁴Da以上，柱规格：100～1400cm²；2.管道内径，规格：3.2～6.4mm；3.进口压力（Pf），规格：0.00～2000bar；4.进口流速，100～6000ml.min^-1＠4bar；5.回流压力（Pr），0.01～10.00bar；6.输送流速，20～1000ml.min^-1＠1bar；7. 滤出流速，20～1000ml.min^-1＠1bar；8.TMP，0.3～4.0bar。通过上述技术参数，分别收集截留相对分子质量为1.0×10⁴Da以上的大分子部位为灵芝多糖肽。通过真空喷雾干燥机，控制进口温度175～180℃，出口温度为90～95℃，深加工制成淡黄色粉末状提取物或通过流化床低温喷雾干燥成淡黄色粉末状提取物，其特征为无明显苦味的灵芝多糖肽粗制品。

（4）灵芝多糖肽含量检测方法：用HPLC-ELSD法检测，其色谱条件如下：

仪器Waters 1515型，蒸发光检测器条件：采用Waters 2424型蒸发光检测器；漂移管温度55℃。喷雾为加热模式；气体压力为45psi；色谱柱TSK G4000PW_XL柱；流动相：甲醇∶水=20∶80；流速：1ml/min ；柱温：35℃；进样量10ul；

操作步骤：

1.标准曲线绘制

精密称取干燥的多糖肽对照品0.0500g（纯度>95%，国家菌草工程技术中心）于10mL容量瓶中，用水溶解并定容，得浓度为5.00mg.mL^-1的多糖肽标准储备液；临用前，分别取100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、于5mL容量瓶中，用水稀释至刻度，得浓度分别为100.0、200.0、300.0、400.0、500.0μg.mL^-1标准工作液，以对照品浓度（μg /ml）的对数（X）为横坐标，峰面积对数（Y）为纵坐标，绘制标准曲线（见图16）。

2.样品溶液的配制

称取灵芝产品0.2g，加水8mL后于60℃水浴提取30min，冷却，定容至10mL；过滤，取滤液1mL，加16mL无水乙醇，混匀。于10000rpm离心15min，沉淀用流动相2ml溶解，0.22μm有机滤膜过滤，得供试样品滤液备用。

2.分析结果表示:

本实施例未述部分与现有技术相同。

实施例2

将本发明的灵芝活性多糖肽产品制成口服液的步骤见图17。

图1 段木灵芝提取液中灵芝多糖肽的HPLC图。色谱条件：仪器：高效液相色谱仪Waters 1515；2424蒸发光检测器，进样：10ul，柱温：35℃，TSK G5000PW_XL与TSK G3000PW_XL柱串取检测。高分子化合物主峰含量18.38%，面积49.23%；低分子化合物主峰含量44.79%，面积50.77%，合计面积100%。

图2 菌草灵芝提取液中灵芝多糖肽的HPLC图。色谱条件：仪器：高效液相色谱仪Waters1515；2424蒸发光检测器，进样：10ul，柱温：35℃，TSK G5000PW_XL与TSK G3000PW_XL柱串取检测。高分子化合物主峰含量22.77%，面积59.68%；低分子化合物主峰含量27.82%，面积40.33%，合计面积100.01%。

图3 是菌草灵芝提取物分子量测定结果（分子量大于10KD以上）。色谱条件：仪器：高效液相色谱仪Waters，2414示差检测器，进样：10ul，柱温：35℃，柱：TSK G4000PW_XL。保留时间8.093分，Mp2.8×10⁴，面积94.91%。

图4 段木灵芝提取物分子量测定结果（分子量大于10KD以上）。色谱条件：仪器：高效液相色谱仪Waters，2414示差检测器，进样：10ul，柱温：35℃，柱：TSK G4000PW_XL。保留时间7.958分，Mp2.6×10⁴，面积76.12%。

图5 菌草灵芝精粉透析截留高分子部位。色谱条件：仪器：高效液相色谱仪Waters，2414示差检测器，进样：10ul，柱温：35℃，柱：TSK G4000PW_XL。保留时间8.693分，Mp1.1×10⁴，面积56.50%。

图6 灵芝多糖肽GL-PPSQ氨基酸图谱。样品在L-8900日立氨基酸自动分析仪上的测定结果。

图7 灵芝多糖肽GLPPSQ¹H-NMR图谱：¹H NMR主要解决多糖结构中单糖组成的甙键构型问题，多糖的信号多数在δ4.0～5.5ppm范围，一般α型吡喃糖基C₁上质子的δ值超过5.0ppm，而β-型小于5.0ppm。

图8 灵芝多糖肽GLPPSQ¹³C-NMR图谱：¹³C NMR的化学位移可达200ppm，它不仅能确定各种碳的位置，而且还能区分单糖的型和构象。

根据灵芝多糖肽GL-PPSQ¹H-NMR和¹³C-NMR图谱，查文献对比表GL-PPSQ重复单位为主链由葡萄糖组成-4)Glcp(1-，-3)Glcp(1-和-6)Glcp(1-构成的主链，在-6)Glcp(1-的4位上有分支，连接一个Xylp。

图9 异核多量子相关谱CHMQC图谱：碳氢相关图—全相关图及同核二维谱（COSY）图。

图10 HSQC-TOCSY（碳氢相关图-全相关图）：多糖GLPPSQ样品的HSQC图谱中可以找出四个比较强的异头氢碳相关信号峰4.53/105.21, 4.53/105.21, 5.00/100.45 and4.79/105.21 ppm，表明多糖至少有四种不同构型的残基，标示为A, B, D和E。

图11 GLPPSQ的COSY 图谱（同核二维谱)(¹H-¹H）：COSY可以找出糖残基中相邻的质子，而HSQC-TOCSY也可以进一步确定相同糖残基内的碳氢信号。

图12 GL-PPSQ的HMBC图谱（氢与碳远程相关图谱）：HMBC可以得到糖苷键的连接位置。

图13 GL-PPSQ的NOESY图谱（空间氢氢相关图）：通过空间HH相关NOESY谱可以得到糖苷键的连接位置.

图14 段木灵芝多糖肽单糖组成（分子量范围＞10KD）。色谱条件：高效液相色谱仪(waters 1515输液泵、2424蒸发光检测器、2414示差检测器),waters色谱工作站，色谱柱:TSK G4000PW_XL； ACQUITY BEH Amide 色谱柱4.6×250mm 。

图15 菌草灵芝多糖肽单糖组成（分子量范围＞10KD）。色谱条件：高效液相色谱仪( waters 1515输液泵、2424蒸发光检测器、2414示差检测器),waters色谱工作站，色谱柱:TSK G4000PW_XL； ACQUITY BEH Amide 色谱柱4.6×250mm 。

图16 灵芝多糖肽含量检测标准曲线图。

图17 灵芝多糖肽口服液生产工艺流程图。

Claims

1.一种灵芝活性成分多糖肽，其特征在于：所述的灵芝活性多糖肽的峰位分子量M_P为1.0×10⁴ Da以上的灵芝多糖肽高分子化合物。

2.根据权利要求1所述的灵芝活性成分多糖肽，其特征在于：所得的灵芝多糖肽高分子化合物由二种或多种不同单糖与17种氨基酸构成。

3.根据权利要求2所述的灵芝活性成分多糖肽，其特征在于：灵芝多糖肽由葡萄糖和甘露糖组成；其摩尔比31.85∶1.00 。

4.根据权利要求3所述的灵芝活性成分多糖肽，其特征在于：所述的灵芝多糖肽高分子化合物以葡聚糖为主，葡聚糖部分的结构重复单元主链由

。

5. 一种灵芝活性成分多糖肽对照品，其特征在于：将权利要求1的灵芝多糖肽高分子化合物经GL-PP分级醇沉，Bio-Gl，P-10柱色谱分离，获灵芝活性多糖肽GL-PPSQ对照品，纯度为97%以上，分位分子量为6.25×10⁴ Da。

6.一种权利要求1所述的灵芝活性成分多糖肽的生产方法，其特征在于：将净化后的灵芝提取液采用10KD膜分离或透析袋，截留分子量M_P1.0×10⁴ Da以上，所得即为无苦味灵芝多糖肽高分子化合物。