CN114096677A - 使用补料分批预培养的微生物细胞工业发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于培养生产感兴趣的产物的微生物细胞的方法，其包括补料分批预培养。

Description

使用补料分批预培养的微生物细胞工业发酵方法

发明领域

本发明涉及一种用于培养生产感兴趣的产物的微生物细胞的方法，其包括补料分批预培养。

发明背景

微生物被广泛用作工业主力，用于生产感兴趣的产物，尤其是蛋白，特别酶。感兴趣的产物的生物技术生产是通过发酵和随后的产物纯化进行的。微生物如芽孢杆菌属(Bacillus species)能够将大量产物分泌至发酵液中。与细胞内生产相比，这允许简单的产物纯化过程，并且解释了芽孢杆菌在工业应用中的成功。

使用微生物的工业生物过程通常在尺寸超过50m³的大规模生产生物反应器中进行。由较小种子发酵罐中的至少一个培养步骤组成的预培养用来生产所需量的接种物，用于这些大规模生产生物反应器中的生产。由一个以上培养步骤组成的预培养，即涉及随后使用一个以上种子发酵罐，通常称作种子队列。种子发酵罐通常以分批模式运行。用于接种主生物反应器的接种物体积可以范围为生产生物反应器初始体积的0.1至15％(v/v)。根据接种物的量，主发酵的持续时间可以变化。更大的接种体积包含更多的生物质，因此可以显著减少直至收获所需产物的时间。但是，大于生产生物反应器初始体积15％(v/v)的接种体积从技术和经济角度来看是不合理的。因此，需要一种用于培养微生物细胞的新方法，其能够减少直至收获感兴趣的产物的时间而不超过生产生物反应器初始15％以上的接种体积。

发明概述

发明人发现以补料分批模式运行的预培养可以用来增加预培养种子发酵罐中的细胞密度，从而增加接种物中包含的生物质的量。与正常的预培养相比，本文描述的富含细胞的接种物可以用来缩短直至收获发酵罐的时间，其以分批模式运行，而不增加引入生产生物反应器的接种物体积。

因此，在第一方面，本发明涉及一种用于培养生产感兴趣的产物的微生物细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述微生物细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产所述感兴趣的产物的条件下在生产生物反应器中培养所述微生物细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

在一个实施方案中，用于接种生产生物反应器的预培养物体积不超过生产生物反应器中存在的发酵培养基体积的15％。

在另一实施方案中，预培养包括至少两个阶段，其中所述至少两个阶段中的至少最后一个阶段以补料分批模式进行。

在另一实施方案中，在生产生物反应器中培养微生物细胞以分批模式、补料分批模式或连续发酵模式进行。

在另一实施方案中，所述微生物细胞是细菌或真菌细胞。在优选实施方案中，所述细菌细胞是芽孢杆菌细胞。

在另一实施方案中，感兴趣的产物是蛋白。在优选实施方案中，所述蛋白是酶。

因此，特别地，本发明涉及一种用于培养生产感兴趣的蛋白的芽孢杆菌细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述芽孢杆菌细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产感兴趣的蛋白的条件下在生产生物反应器中培养芽孢杆菌细胞；

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

优选地，感兴趣的蛋白不是报告蛋白，优选不是GFP或YFP。

所述酶可以选自水解酶、氧化酶、异构酶，例如淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、蛋白酶、金属蛋白酶、肽酶、脂肪酶、角质酶、酰基转移酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纤维二糖水解酶(cellubiohydrolase)、木聚糖酶、木葡聚糖转移酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、植酸酶、磷酸酶、木糖异构酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶、乙酰乳酸脱羧酶、果胶酶、果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、裂解酶、果胶酸裂解酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶(galactanase)、漆酶、过氧化物酶以及天冬酰胺酶。

在一个实施方案中，感兴趣的产物由微生物细胞分泌至发酵液中。

在另一实施方案中，本发明的方法进一步包括步骤(d)，当感兴趣的产物的浓度为至少10g产物/kg发酵液时收获产物。

在另一方面，本发明涉及一种生产感兴趣的产物的方法，包括以下步骤：

(a)提供生产感兴趣的产物，特别是感兴趣的蛋白的微生物细胞，特别是芽孢杆菌细胞，的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产感兴趣的产物的条件下在生产生物反应器中培养微生物细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

在另一方面，本发明涉及一种提高感兴趣的产物产量的方法，包括以下步骤：

(a)提供生产感兴趣的产物，特别是感兴趣的蛋白的微生物细胞，特别是芽孢杆菌细胞，的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产感兴趣的产物的条件下在生产生物反应器中培养微生物细胞；

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

在另一方面，本发明涉及在发酵生产中减少直至收获感兴趣的化合物，特别是感兴趣的蛋白的时间的方法，包括以下步骤：

(a)提供生产所述感兴趣的化合物的微生物细胞，特别是芽孢杆菌细胞，的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产感兴趣的化合物的条件下在生产生物反应器中培养微生物细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

附图说明

图1说明在使用分批或补料分批预培养生产(A)蛋白酶和(B)淀粉酶的生产过程中直至收获的相对时间。在每种情况下，将结果归一化至以分批模式运行的预培养的直至收获的时间，该时间设置为100。

图2说明在使用分批或分批补料预培养并用体积为生产生物反应器中存在的发酵培养基初始体积的10％或1％(v/v)的接种物接种生产生物反应器的生产过程中直至收获的相对时间。对于每个体积，将结果归一化至以分批模式运行的预培养的直至收获的时间。

图3说明在预培养的种子发酵罐中使用化学成分确定的培养基或复合培养基的生产过程中直至收获的相对时间。将结果归一化至用化学成分确定的培养基进行的预培养的直至收获的时间。

图4说明在使用分批或补料分批预培养在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中生产蛋白酶的生产过程中直至收获的相对时间。

定义

除非另有说明，本文中使用的术语应根据相关领域普通技术人员的常规用法来理解。

在本说明书和所附权利要求书中使用时，除非上下文清楚地指出，否则单数形式的一个“(a)”和“一个(an)”还包括各自的复数。在本发明的上下文中，术语“约”和“大约”表示准确性的间隔，本领域技术人员会理解所述准确性的间隔仍确保考虑的特征的技术效果。该术语通常表示所示数值的±20％，优选±15％，更优选±10％，并且甚至更优选±5％的偏差。

应当理解术语“包含”不是限制性的。为了本发明的目的，认为术语“由…组成”是术语“包含”的优选实施方案。如果此后一个组定义为包含至少一定数量的实施方案，这表示还涵盖优选仅由这些实施方案组成的组。

此外，在说明书和权利要求书中，术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等用于区分相似的元素而不必然是描述顺序或时间顺序。应当理解这样使用的术语在适当的环境下可互换，并且本文描述的本发明的实施方案能够以与本文描述或说明的顺序不同的其他顺序进行。如果术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”、“i”、“ii”等涉及方法或用途或测定的步骤，则步骤之间没有时间或时间间隔一致性，即步骤可以同时进行，或者这些步骤之间可以有数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月或甚至数年的时间间隔，除非如上文或下文所示在本申请中其他地方指出。

应当理解本发明并不限于本文描述的特定方法、方案、试剂等，因为这些可以变化。还应当理解本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不是为了限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。

在本申请中，引用了各种出版物。所有这些出版物的公开内容以及那些出版物中引用的那些参考文献整体援引加入本申请，以便更全面地描述本发明所属领域的状态。

“培养生产感兴趣的产物的微生物细胞的方法”或“发酵方法”包括在合适的发酵培养基中以及在合适的条件如合适的温度和合适的pH下培养微生物细胞。“细胞的培养”或“细胞的生长”不应理解为限于指数生长期，而是还可以包括在接种后生长开始时和静止期期间细胞的生理状态。

如本文所用的术语“发酵液”或“培养液”描述包含微生物细胞的发酵培养基，将其培养以表达，并且取决于感兴趣的产物，将感兴趣的产物分泌至发酵培养基中。

术语“发酵培养基”是指包含一种或多种可以支持细胞生长的化合物的水基溶液。

术语“补料溶液”在本文中用于在用微生物细胞接种初始发酵培养基之后在发酵过程中添加至发酵培养基的溶液。补料溶液包含支持细胞生长的化合物。在一个实施方案中，补料溶液具有与初始发酵培养基相同的组成。在另一实施方案中，补料溶液具有与发酵培养基的组成不同的组成。与发酵培养基相比，补料溶液可以富含一种或多种化合物。

术语“预培养物”是指在种子发酵罐中培养并用于接种“生产生物反应器”的微生物细胞的液体活跃生长培养物。“活跃生长”旨在表示培养物处于培养物中微生物细胞数量增加的阶段。因此，在预培养开始时，细胞可能处于停滞期，并且随着时间的推移切换至指数生长期。预培养的细胞一般用作接种材料以避免或减少生产生物反应器中的停滞期。因此，在将预培养细胞转移至生产生物反应器或种子队列的下一个种子发酵罐的时间点，细胞优选处于指数期或晚期指数期，其中细胞活跃生长。

术语“种子发酵罐”是指一种培养容器，其中通过发酵微生物细胞直至获得足够多的细胞用于接种至主发酵罐或种子队列的下一个种子发酵罐中来形成预培养物。种子发酵罐的体积比生产生物反应器小。在一个实施方案中，种子发酵罐的体积在生产生物反应器体积的5％至20％之间。在一个实施方案中，种子发酵罐的体积在生产生物反应器体积的8％至15％之间。在一个实施方案中，种子发酵罐的体积是生产生物反应器体积的10％。

术语“种子队列”旨在表示一系列尺寸不断增加的种子发酵罐，其中在一系列发酵罐中进行预培养，其中种子队列的最后一个发酵罐具有足够的尺寸以容纳生产生物反应器所需的接种物。因此，种子队列中最后一个种子发酵罐的体积在生产反应器体积的5％至20％之间。在一个实施方案中，种子队列中最后一个种子发酵罐的体积在生产反应器体积的8％至15％之间。在一个实施方案中，种子队列中最后一个种子发酵罐的体积是生产反应器体积的10％。种子队列内种子发酵罐的体积从一个种子发酵罐到下一个种子发酵罐可以增加5-20倍，直至获得足够量的细胞来接种生产生物反应器。

术语“生产生物反应器”或“主生物反应器”或“主发酵罐”或“生产发酵罐”是本领域已知的术语，并且旨在表示其中发生大规模细胞培养和感兴趣的产物的大规模生产的容器。“大规模生产”、“大规模发酵”或本文中也称为“工业相关发酵”是指一种发酵方法，其中在生产生物反应器中培养细胞期间将超过200g碳源(优选地，化学成分确定的碳源)每升的初始发酵培养基添加至生产生物反应器中。因此，在“生产生物反应器”或“主生物反应器”或“主发酵罐”或“生产发酵罐”中培养细胞是指一种发酵过程，其中在生产生物反应器中培养细胞期间将超过200g碳源(优选地，化学成分确定的碳源)每升的初始发酵培养基添加至生产生物反应器中。在生产生物反应器中终止培养之后，收获发酵液并回收所关注的产物。生物反应器可以包含入口和出口，例如用于培养基，以及不同的传感器，例如用于在发酵过程中测量pH和温度。生产生物反应器中的发酵培养基可以与种子发酵罐或种子队列中最后一个种子发酵罐中使用的发酵培养基相同或不同。

生产生物反应器可以具有至少500L、至少1,000L、至少5,000L、至少10,000L、至少20,000L、至少50,000L或至少100,000L的体积。优选地，生产生物反应器可以具有500-1000L、1,000-5,000L、5,000-10,000L、10,000-20,000L、20,000-50,000L、50,000-100,000L或100,000-150,000L的体积。生产生物反应器可以具有500L、1,000L、5,000L、10,000L、20,000L 50,000L或100,000L的体积。

如果生产生物反应器具有500L的体积，则种子发酵罐的体积可以在25L和100L之间，或者在40L和75L之间或者50L。如果生产生物反应器具有1,000L的体积，则种子发酵罐的体积可以在50L和200L之间，或者在80L和150L之间或者100L。如果生产生物反应器具有5,000L的体积，则种子发酵罐的体积可以在250L和1,000L之间，或者在400L和750L之间或者500L。如果生产生物反应器具有10,000L的体积，则种子发酵罐的体积可以在500L和2,000L之间，或者在800L和1,500L之间或者1,000L。如果生产生物反应器具有20,000L的体积，则种子发酵罐的体积可以在1,000L和4,000L之间，或者在1,600L和3,000L之间或者2,000L。如果生产生物反应器具有50,000L的体积，则种子发酵罐的体积可以在2,500L和10,000L之间，或者在4,000L和7,500L之间或者5,000L。如果生产生物反应器具有10,000L的体积，则种子发酵罐的体积可以在5,000L和20,000L之间，或者在8,000L和15,000L之间或者10,000L。

如果生产生物反应器具有1,000L的体积，则种子队列中最后一个种子发酵罐的体积可以在50L和200L之间，或者在80L和150L之间或者100L。如果生产生物反应器具有5,000L的体积，则种子队列中最后一个种子发酵罐的体积可以在250L和1,000L之间，或者在400L和750L之间或者500L。如果生产生物反应器具有10,000L的体积，则种子队列中最后一个种子发酵罐的体积可以在500L和2,000L之间，或者在800L和1,500L之间或者1,000L。如果生产生物反应器具有20,000L的体积，则种子队列中最后一个种子发酵罐的体积可以在1,000L和4,000L之间，或者在1,600L和3,000L之间或者2,000L。如果生产生物反应器具有50,000L的体积，则种子队列中最后一个种子发酵罐的体积可以在2,500L和10,000L之间，或者在4,000L和7,500L之间或者5,000L。如果生产生物反应器具有100,000L的体积，则种子队列中最后一个种子发酵罐的体积可以在5,000L和20,000L之间，或者在8,000L和15,000L之间或者10,000L。

术语“接种物”旨在表示从种子发酵罐添加至生产生物反应器以开始生产生物反应器中的发酵方法的一定量的微生物细胞。此外，“接种物”还旨在表示来自种子发酵罐的一定量的微生物细胞，将其添加至种子队列中随后的种子发酵罐。

术语“分批模式”或“分批发酵”是指一种培养模式，其中将细胞在最初存在的发酵培养基中培养而培养基组成或培养基体积没有任何改变。因此，在分批模式中，在培养期间没有大量或显著量的新鲜液体培养基添加至细胞培养物，并且没有从细胞培养物移出大量或显著量的液体培养基。

术语“补料分批模式”或“补料分批发酵”是指一种培养模式，其中将细胞在最初存在的发酵培养基中培养，并且在培养期间以周期性或连续方式添加补料溶液而没有大量或显著移出液体培养基。补料分批培养可以包括各种补料方案和时间，例如，每天补料，每天补料一次以上，或者每天补料少于一次，等等。

术语“连续发酵模式”或“连续发酵”是指一种培养模式，其中将细胞在最初存在的发酵培养基中培养，将新的发酵培养基连续补料至发酵罐中，并且以相同速度从发酵罐移出发酵物，从而发酵罐中的体积是恒定的。

如本文所用的术语“感兴趣的蛋白的滴度”理解为以g/发酵液体积(以升计)(g/L)计的感兴趣的蛋白的量。

术语“收获”(如“收获感兴趣的产物”中)是指从发酵培养基中的至少一部分生物质分离感兴趣的产物。收获可以通过任何已知的方法进行，如过滤和离心。收获方法优选根据感兴趣的特定产物的需要和特征进行调整。

如本文所用的术语“直至收获的时间”或“收获时间”定义为生产生物反应器的接种和感兴趣的产物如蛋白的滴度达到以g产物/kg发酵液测量的某个量的时间点之间的时间。直至收获的时间可以是生产生物反应器的接种和感兴趣的产物的滴度达到2-20g产物/kg发酵液的时间点之间的时间。在一个实施方案中，直至收获的时间是生产生物反应器的接种和感兴趣的产物的滴度达到5-15g产物/kg发酵液的时间点之间的时间。在一个实施方案中，直至收获的时间可以是生产生物反应器的接种和感兴趣的产物的滴度达到8-12g产物/kg发酵液的时间点之间的时间。在一个实施方案中，直至收获的时间可以是生产生物反应器的接种和感兴趣的产物的滴度达到10g产物/kg发酵液的时间点之间的时间。直至收获的时间可以是生产生物反应器的接种和感兴趣的产物的滴度达到至少2g产物/kg发酵液、至少5g产物/kg发酵液、至少10g产物/kg发酵液、至少15g产物/kg发酵液或至少20g产物/kg发酵液，优选至少10g产物/kg发酵液的时间点之间的时间。在一个实施方案中，直至收获的时间是生产生物反应器的接种和感兴趣的蛋白如蛋白的滴度达到5-15g蛋白/kg发酵液的时间点之间的时间。在一个实施方案中，直至收获的时间可以是生产生物反应器的接种和感兴趣的蛋白如蛋白的滴度达到8-12g蛋白/kg发酵液的时间点之间的时间。在一个实施方案中，直至收获的时间可以是生产生物反应器的接种和感兴趣的蛋白如蛋白的滴度达到10g蛋白/kg发酵液的时间点之间的时间。直至收获的时间可以是生产生物反应器的接种和感兴趣的蛋白的滴度达到至少2g蛋白/kg发酵液、至少5g蛋白/kg发酵液、至少10g蛋白/kg发酵液、至少15g蛋白/kg发酵液或至少20g蛋白/kg发酵液，优选至少10g蛋白/kg发酵液的时间点之间的时间。直至收获的时间可以是生产生物反应器的接种和感兴趣的蛋白的滴度达到2g蛋白/kg发酵液、5g蛋白/kg发酵液、10g蛋白/kg发酵液、15g蛋白/kg发酵液或20g蛋白/kg发酵液，优选10g蛋白/kg发酵液的时间点之间的时间。

术语“异源”(或外源或外来或重组或非天然)多肽在本文中定义为非宿主细胞天然的多肽，宿主细胞天然的多肽，其中已通过重组DNA技术进行结构修饰，例如，缺失、取代和/或插入，以改变天然多肽，或者宿主细胞天然的多肽，其表达已定量改变，或由于通过重组DNA技术对宿主细胞DNA的操作，其表达是从不同于天然宿主细胞的基因组位置定向的，或者由于通过重组DNA技术对多核苷酸调节元件的操作，其表达已定量改变，例如通过使用更强的启动子；或者宿主细胞天然的多核苷酸，但是由于通过重组DNA技术的遗传操作而未整合到其天然遗传环境内。

关于两条或更多条多核苷酸序列或者两条或更多条氨基酸序列，术语“异源”用来表征两条或更多条多核苷酸序列或者两条或更多条氨基酸序列在彼此的特定组合中天然不存在。

为了本发明的目的，关于细胞或生物体的“重组”(或转基因)表示所述细胞或生物体包含由人通过基因技术引入的异源多核苷酸，而关于多核苷酸，术语“重组”包括由人通过基因技术/重组DNA技术带来的所有那些构建体，其中

(a)所述多核苷酸或其部分的序列，或者

(b)与所述多核苷酸可操作地连接的一个或多个遗传控制序列，包括但不限于启动子，或者

(c)a)和b)均不位于它们的野生型遗传环境中或已被修饰。

术语“天然”(或野生型或内源)细胞或生物体以及“天然”(或野生型或内源)多核苷酸或多肽分别是指在自然界中发现的细胞或生物体以及在细胞中以其天然形式和遗传环境发现的所讨论的多核苷酸或多肽(即，没有任何人为干预)。

发明详述

参考本发明的实施方案的以下详细描述和本文中包括的实施例，可以更容易地理解本发明。

本发明涉及用于在微生物细胞中生产感兴趣的产物的工业相关发酵方法。发明人惊奇地发现以补料分批模式运行的预培养步骤可以用来增加种子发酵罐中的细胞密度，从而增加用于接种生产生物反应器的接种物中包含的生物质的量而不增加接种物的体积。与其中预培养以分批模式运行的发酵过程相比，富集的接种物可以用来缩短直至收获感兴趣的产物的时间。

因此，在第一方面，本发明涉及一种用于培养生产感兴趣的产物的微生物细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述微生物细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产感兴趣的产物的条件下在生产生物反应器中培养微生物细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

在第二方面，本发明涉及一种生产感兴趣的产物的方法，包括以下步骤：

(a)提供生产所述感兴趣的产物的微生物细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产感兴趣的产物的条件下在生产生物反应器中培养微生物细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

在另一方面，本发明涉及一种提高感兴趣的产物产量的方法，包括以下步骤：

(a)提供生产所述感兴趣的产物的微生物细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产感兴趣的产物的条件下在生产生物反应器中培养微生物细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

步骤a)：预培养

大多数感兴趣的产物是通过在生产生物反应器中培养微生物细胞来生产的。因此，必须用这些微生物细胞的起始培养物，即接种物接种生产生物反应器中存在的发酵培养基。

一般来说，接种物是微生物细胞的液体培养物，其在种子发酵罐中制备。

在一个实施方案中，微生物细胞的预培养仅使用一个种子发酵罐，即仅一个预培养步骤。

在另一实施方案中，微生物细胞的预培养使用多于一个的预培养步骤，使用一个以上的种子发酵罐进行。包括多于一个种子发酵罐的预培养通常称作种子队列。用于工业规模生产方法的种子队列可以包括1-4个种子发酵罐，优选1-3个种子发酵罐。在一个实施方案中，种子队列包括2个种子发酵罐。在另一实施方案中，预培养包括3个种子发酵罐。种子发酵罐中存在的发酵培养基的体积可以在种子队列内增加。例如，第二种子发酵罐的体积可以大于第一种子发酵罐的体积。在一个实施方案中，第三种子发酵罐的体积大于第二种子发酵罐的体积，并且第二种子发酵罐的体积可以大于第一种子发酵罐的体积。

微生物细胞的预培养物可以通过，将生产感兴趣的产物的微生物细胞从冷冻小瓶或甘油储备接种至第一发酵罐中，并且使微生物细胞生长至期望密度制备。在第一种子发酵罐中培养之后，可以将微生物细胞直接接种至生产生物反应器中(如果不使用种子队列)，或者接种至种子队列内的一系列种子发酵罐的下一个中。

代替使用包含生产感兴趣的产物的微生物细胞的小瓶，预培养物还可以从琼脂平板上生长的微生物细胞制备。

将微生物细胞从一个种子发酵罐转移至随后的种子发酵罐的标准可以基于培养时间(例如在12h-40h的培养时间之后转移微生物细胞)，或者在线信号中达到某个值，例如摄氧率(OTR)(例如在30-180mmol/(L*h)的OTR时转移微生物细胞)，或者二氧化碳释放速率(CER)(例如在40-200mmol/(L*h)的CER时转移微生物细胞)，或者添加补料溶液的时间(例如在添加补料溶液5-30h之后转移微生物细胞)。在一个实施方案中，在培养微生物细胞16小时之后将微生物细胞从一个种子发酵罐转移至随后的种子发酵罐。在一个实施方案中，将种子发酵罐中存在的一部分发酵液转移至另一种子发酵罐或生产生物反应器。在一个实施方案中，将种子发酵罐中存在的全部发酵液转移至另一种子发酵罐或生产生物反应器。

从种子队列中的一个种子发酵罐转移至下一个种子发酵罐的发酵液的体积不少于种子队列随后的种子发酵罐中存在的发酵培养基初始体积的0.1％且不超过20％。在一个实施方案中，第一发酵罐的转移发酵液的体积是随后的种子发酵罐中存在的发酵培养基体积的0.1％-15％，优选1％-15％，更优选5％-10％，最优选8％-10％。在一个实施方案中，从种子队列中的一个种子发酵罐转移至下一个种子发酵罐的发酵液体积是随后的种子发酵罐中存在的发酵培养基体积的0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。在优选实施方案中，从种子队列中的一个种子发酵罐转移至下一个种子发酵罐的发酵液体积是随后的种子发酵罐中存在的发酵培养基体积的10％。

根据本发明，预培养以补料分批模式进行。如果使用种子队列，则至少种子队列的最后阶段，即在接种生产生物反应器之前最后一个种子发酵罐中的培养以补料分批模式进行。一个或多个前面的种子发酵罐中的发酵过程可以以分批模式、补料分批模式或连续模式进行。优选地，最后一个种子发酵罐之前的一个或多个种子发酵罐中的发酵过程以分批模式进行。还优选地，最后一个种子发酵罐之前的所有种子发酵罐中的发酵过程以分批模式进行。

用于预培养的发酵培养基和培养条件可能适合微生物细胞的快速生长。因此，预培养物中存在的细胞可能最初处于停滞期，随时间开始增殖，并且优选分别在转移至下一个发酵罐或生产生物反应器时处于指数期。

步骤b)：将接种物接种至生产生物反应器中

当预培养的(最后一个)种子发酵罐中的微生物细胞量达到其最大值时，将这个种子发酵罐中存在的发酵液转移至生产生物反应器中(在其中生产感兴趣的产物)并接种至发酵培养基中。

将微生物细胞从(最后一个)种子发酵罐转移至生产生物反应器的标准可以基于培养时间(例如在12h-40h的培养时间之后转移微生物细胞)，或者在线信号中达到某个值，例如摄氧率(OTR)(例如在30-180mmol/(L*h)的OTR时转移微生物细胞)，或者二氧化碳释放速率(CER)(例如在40-200mmol/(L*h)的CER时转移微生物细胞)，或者添加补料溶液的时间(例如在添加补料溶液5-30h之后转移微生物细胞)。在一个实施方案中，在(最后一个)种子发酵罐中培养微生物细胞22小时后将微生物细胞从(最后一个)种子发酵罐转移至生产生物反应器。在一个实施方案中，将种子发酵罐中存在的一部分发酵液转移至另一种子发酵罐或生产生物反应器。在一个实施方案中，将种子发酵罐中存在的全部发酵液转移至另一种子发酵罐或生产生物反应器。

从(最后一个)种子发酵罐转移至生产生物反应器的发酵液的体积不少于生产生物反应器中存在的发酵培养基初始体积的0.1％且不超过20％。在一个实施方案中，(最后一个)种子发酵罐的转移发酵液的体积是生产生物反应器中存在的发酵培养基体积的0.1％-15％，优选1％-15％或1％-12％，更优选1％-10％或5％-10％，最优选8％-10％。在一个实施方案中，从(最后一个)种子发酵罐转移至生产生物反应器的发酵液体积是生产生物反应器中存在的发酵培养基体积的0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。在一个实施方案中，，从(最后一个)种子发酵罐转移至生产生物反应器的发酵液体积是生产生物反应器中存在的发酵培养基体积的10％。在一个实施方案中，，从(最后一个)种子发酵罐转移至生产生物反应器的发酵液体积是生产生物反应器中存在的发酵培养基体积的15％。

步骤c)：在生产生物反应器中培养

在生产生物反应器中培养期间，生产大部分感兴趣的产物。因此，生产生物反应器中生产的产物量大于预培养中生产的产物量。可以通过在用来自预培养物的细胞接种生产生物反应器之前采集预培养物的样品并确定来自预培养物的样品中感兴趣的产物量来确定预培养中生产的感兴趣的产物量。可以通过在培养结束时和/或收获细胞之前从生产生物反应器采集样品并确定来自生产生物反应器的样品中感兴趣的产物量来确定生产生物反应器中生产的产物量。在一个实施方案中，预培养中生产的感兴趣的产物量比生产生物反应器中生产的感兴趣的产物量的百分比不超过10％或不超过8％。在一个实施方案中，预培养中生产的感兴趣的产物量比生产生物反应器中生产的感兴趣的产物量的百分比不超过7％，不超过6％或不超过5％。

在本发明的方法中，在生产生物反应器中培养期间，将超过200g碳源(优选地，化学成分确定的碳源)每升的初始发酵培养基添加至生产生物反应器。优选地，在生产生物反应器中培养期间添加至生产生物反应器的碳源(优选地，化学成分确定的碳源)的总量超过300g，优选超过400g每升初始发酵培养基。优选地，至少50％的碳源(优选地，化学成分确定的碳源)在生产生物反应器中的发酵方法中作为补料溶液提供，更优选发酵方法中提供的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的碳源(优选地，化学成分确定的碳源)在发酵方法中作为补料溶液提供。

在一个实施方案中，生产生物反应器中微生物细胞的培养可以以分批模式、补料分批模式或连续发酵模式进行。在一优选实施方案中，生产生物反应器中微生物细胞的培养以补料分批或连续发酵模式进行。更优选地，生产生物反应器中微生物细胞的培养以补料分批模式进行。

根据本发明，将接种至生产生物反应器中的微生物细胞在有利于生产感兴趣的产物的条件下培养。在一个实施方案中，将接种至生产生物反应器中的微生物细胞在有利于微生物细胞生长和生产感兴趣的产物的条件下培养。这些条件可以由使用的发酵培养基、pH和/或温度决定。

发酵方法可以用对于特定微生物细胞适合细胞生长和生产期望产物的任何培养基进行。

一般假设在发酵中微生物细胞以多个阶段生长，从停滞期开始(其中微生物细胞适应培养基并开始生长)，指数期(其中微生物细胞以恒定的增长率生长，提供细胞数量和细胞质量的指数增长)，静止期(其中生长停止，并且细胞数量保持不变)，最后是死亡期(其中细胞数量由于细胞死亡而减少)。优选地，在死亡期开始之前停止培养并收获感兴趣的产物。还优选地，在收获感兴趣的产物之前培养进入静止期。

生产生物反应器中使用的培养基和培养条件可能适合微生物细胞最佳生产感兴趣的产物。因此培养条件允许生产发酵罐中存在的细胞处于适合生产产物的任何生长期。

发酵培养基

用于种子发酵罐的发酵培养基可以是或可以不是与生产生物反应器中使用的相同的发酵培养基。此外，种子队列中的几个种子发酵罐的发酵培养基可以相同或不同。种子发酵罐的发酵培养基可以是化学成分确定的或复合的培养基。生产生物反应器的发酵培养基可以是化学成分确定的或复合的发酵培养基。在以补料分批模式运行的种子发酵罐中，可以使用复合培养基或化学成分确定的培养基。优选地，(最后一个)种子发酵罐的发酵培养基是化学成分确定的发酵培养基或复合发酵培养基，并且生产生物反应器的发酵培养基是化学成分确定的发酵培养基。在一个实施方案中，种子队列包括三个种子发酵罐，在第一个种子发酵罐中使用复合培养基，在第二个和第三个种子发酵罐以及生产生物反应器中使用化学成分确定的培养基。在一个实施方案中，种子队列包括三个种子发酵罐，在第一个和第三个种子发酵罐中使用复合培养基，在第二个种子发酵罐以及生产生物反应器中使用化学成分确定的培养基。在一个实施方案中，种子队列包括三个种子发酵罐，在第一个、第二个和第三个种子发酵罐中使用复合培养基，在生产生物反应器中使用化学成分确定的培养基。在一个实施方案中，种子队列包括三个种子发酵罐，在第一个、第二个和第三个种子发酵罐中使用化学成分确定的培养基，在生产生物反应器中使用化学成分确定的培养基。

复合发酵培养基

术语“复合发酵培养基”是指包含发酵培养基的0.5-30％w/v量的复合营养源的发酵培养基。

术语“复合营养源”在本文中用于由化学成分不确定的化合物组成的营养源，即，其化学式未知的化合物，优选包含不确定的有机含氮和/或碳化合物。与此相反，“化学成分确定的营养源”(例如，“化学成分确定的碳源”或“化学成分确定的氮源”)理解为用于由化学成分确定的化合物组成的营养源。“化学成分确定的组分”是其化学式已知的组分。

术语“复合氮源”在本文中用于由一种或多种化学成分不确定的含氮化合物组成的营养源，即，其化学式未知的含氮化合物，优选包含有机含氮化合物，例如，组成未知的蛋白和/或氨基酸。

术语“复合碳源”在本文中用于由一种或多种化学成分不确定的含碳化合物组成的碳源，即，其化学式未知的含碳化合物，优选包含有机含碳化合物，例如，组成未知的碳水化合物。

本领域技术人员清楚复合营养源可能是不同复合营养源的混合物。因此，复合氮源可以包含复合碳源，反之亦然，并且复合氮源可以以其作为碳源起作用的方式被细胞代谢，反之亦然。

在一个实施方案中，复合营养源是复合氮源。氮的复合来源包括但不限于包含蛋白的物质，如来自微生物、动物或植物细胞的提取物，例如，植物蛋白制品、大豆粉、玉米粉、豌豆粉、玉米面筋、棉籽粉、花生粉、马铃薯粉、肉、酪蛋白、明胶、乳清、鱼粉、酵母蛋白、酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、细菌-胰蛋白胨、细菌-蛋白胨、来自微生物细胞、植物、肉或动物体加工过程的废物，以及它们的组合。在一个实施方案中，复合氮源选自植物蛋白，优选马铃薯蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、花生、棉花蛋白和/或豌豆蛋白，酪蛋白，胰蛋白胨，蛋白胨和酵母提取物以及它们的组合。

在一个实施方案中，发酵培养基还包含确定的培养基组分。在一个实施方案中，发酵培养基还包含确定的氮源。无机氮源的实例是铵、硝酸盐和亚硝酸盐，以及它们的组合。在优选实施方案中，发酵培养基包含氮源，其中所述氮源是复合或确定的氮源或者它们的组合。在一个实施方案中，确定的氮源选自氨、铵、铵盐(例如，氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵、乙酸铵)、尿素、硝酸(nitrate)、硝酸盐、亚硝酸(nitrit)和氨基酸，优选地，谷氨酸盐，以及它们的组合。

在一个实施方案中，复合营养源的量是发酵培养基的2-15％v/w。在另一实施方案中，复合营养源的量是发酵培养基的3-10％v/w。

在一个实施方案中，复合发酵培养基还包含碳源。碳源优选是复合或确定的碳源或者它们的组合。在一个实施方案中，复合营养源包含碳水化合物源。各种糖和含糖物质是合适的碳源，并且糖可以存在于聚合的不同阶段。用于本发明的优选复合碳源选自糖蜜、玉米浆、蔗糖、糊精、淀粉、淀粉水解物和纤维素水解物，以及它们的组合。优选的确定的碳源选自碳水化合物、有机酸和醇，优选葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、甘油、肌醇、甘露醇和山梨醇，以及它们的组合。优选地，以糖浆的形式提供确定的碳源，其可以包含多达20％，优选多达10％，更优选多达5％杂质。在一个实施方案中，碳源是甜菜糖浆、甘蔗糖浆、玉米糖浆，优选高果糖玉米糖浆。在另一实施方案中，复合碳源选自糖蜜、玉米浆、糊精和淀粉，或者它们的组合，并且其中确定的碳源选自葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、乳糖或其组合。

在一个实施方案中，发酵培养基是包含复合氮源和复合碳源的复合培养基。在一个实施方案中，发酵培养基是包含复合氮源和碳源的复合培养基，其中复合氮源可以如WO2004/003216所述被部分水解。

在一个实施方案中，发酵培养基还包含氢源、氧源、硫源、磷源、镁源、钠源、钾源、微量元素源和维生素源，如下文进一步描述。

化学成分确定的发酵培养基

术语“化学成分确定的发酵培养基”(在本文中也称为“化学成分确定的培养基”、“确定的培养基”或“合成培养基”)理解为用于发酵培养基，其基本上由已知浓度的化学成分确定的组分组成。“化学成分确定的组分”是其化学式已知的组分。基本上由化学成分确定的组分组成的发酵培养基包括不含复合营养源的培养基，特别是不含复合碳和/或复合氮源，即，不含具有化学成分不确定的组成的复合原料。基本上由化学成分确定的组分组成的发酵培养基可以进一步包括这样的培养基，其包含实质上少(essentially small)量的复合营养源，例如复合氮和/或碳源，其量如下定义，这通常不足以维持微生物的生长和/或保证形成足够量的生物质。

在这方面，复合原料具有化学成分不确定的组成，这是由于，例如，这些原料包含许多不同化合物，其中复杂的杂聚化合物，并且由于季节变化和地理来源的差异而具有可变组成。在发酵中作为复合碳和/或氮源的复合原料的典型实例是大豆粉、棉籽粉、玉米浆、酵母提取物、酪蛋白水解物、糖蜜等。

实质上少量的复合碳和/或氮源可以存在于根据本发明的化学成分确定的培养基中，例如作为主发酵的接种物的残留物。主发酵的接种物不必通过在化学成分确定的培养基上发酵获得。大多数情况下，通过主发酵的化学成分确定的培养基中存在少量复合氮源可检测来自接种物的残留物。少量的复合培养基组分，如复合碳和/或氮源，也可以通过向发酵培养基添加少量的这些复合组分而被引入发酵培养基中。在用于主发酵的接种物的发酵过程中使用复合碳和/或氮源可能是有利的，例如以加速生物质的形成，即提高微生物的生长速度，和/或促进内部pH控制。出于同样的原因，向主发酵的初始阶段添加实质上少量的复合碳和/或氮源，例如酵母提取物，可能是有利的，特别是在发酵过程的早期加速生物质形成。

可以在根据本发明的发酵过程中添加至化学成分确定的培养基的实质上少量的复合营养源定义为在发酵过程中添加的各营养物总量的至多10％的量。特别地，可以添加至化学成分确定的发酵培养基的实质上少量的复合碳和/或氮源定义为导致碳总量的至多10％的复合碳源的量和/或导致氮总量的至多10％的复合氮源的量，其在发酵过程中添加，优选导致碳总量的至多5％的复合碳源的量和/或导致氮总量的至多5％的复合氮源的量，更优选导致碳总量的至多1％的复合碳源的量和/或导致氮总量的至多1％的复合氮源的量，其在发酵过程中添加。优选地，发酵过程中添加的碳总量的至多10％和/或氮总量的至多10％，优选碳总量的至多5％的量和/或氮总量的至多5％的量，更优选碳总量的至多1％的量和/或氮总量的至多1％的量是通过来自接种物的残留物添加的。更优选地，在发酵过程中不向发酵培养基添加复合碳源和/或复合氮源。

术语“化学成分确定的营养源”(例如，“化学成分确定的碳源”或“化学成分确定的氮源”)理解为用于由化学成分确定的化合物组成的营养源。

在化学成分确定的发酵培养基中培养微生物需要在包含各种化学成分确定的营养源的培养基中培养细胞，所述化学成分确定的营养源选自化学成分确定的氢源、化学成分确定的氧源、化学成分确定的碳源、化学成分确定的氮源、化学成分确定的硫源、化学成分确定的磷源、化学成分确定的镁源、化学成分确定的钠源、化学成分确定的钾源、化学成分确定的微量元素源和化学成分确定的维生素源。

优选地，化学成分确定的碳源选自碳水化合物、有机酸、烃、醇及其混合物。优选的碳水化合物选自葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、乳糖、糊精、麦芽糖糊精、淀粉和菊粉，以及它们的混合物。优选的醇选自甘油、甲醇和乙醇、肌醇、甘露醇和山梨醇及其混合物。优选的有机酸选自乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸和高级链烷酸及其混合物。优选地，化学成分确定的碳源包含葡萄糖或蔗糖。更优选地，化学成分确定的碳源包含葡萄糖，甚至更优选地，化学成分确定的碳源的主要量以葡萄糖提供。

更优选地，化学成分确定的碳源是葡萄糖。应当理解化学成分确定的碳源可以以糖浆的形式提供，优选作为葡萄糖浆。如本文理解的，术语“葡萄糖”应当包括葡萄糖浆。葡萄糖浆是一种具有高糖浓度的粘稠糖溶液。葡萄糖浆中的糖主要是葡萄糖，少量还有不同浓度麦芽糖和麦芽三糖，这取决于糖浆的质量等级。优选地，除了葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖，糖浆可以包含至多10％，优选至多5％，更优选至多3％杂质。优选地，葡萄糖浆来自玉米。

化学成分确定的氮源优选选自尿素、氨、硝酸、硝酸盐、亚硝酸、铵盐如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵和硝酸铵，以及氨基酸如谷氨酸盐或赖氨酸以及它们的组合。更优选地，化学成分确定的氮源选自氨、硫酸铵和磷酸铵。更优选地，化学成分确定的氮源是氨。使用氨作为化学成分确定的氮源的优点是氨还可以作为pH控制剂。

如下文所述，可以在复合和化学成分确定的发酵培养基中添加额外的化合物。

通常在细胞培养期间通过搅拌或充气使发酵培养基通气来提供氧。通常由于水性发酵培养基中水的存在来提供氢。但是，碳源和/或氮源内也包含氢和氧，并且可以以这种方式提供。

可以通过一种或多种镁盐，或者通过氢氧化镁，或者通过一种或多种镁盐以及氢氧化镁的组合向发酵培养基提供镁，所述镁盐优选选自氯化镁、硫酸镁、硝酸镁、磷酸镁及其组合。

可以通过一种或多种钠盐、氢氧化钠及其组合将钠添加至发酵培养基，所述钠盐优选选自氯化钠、硝酸钠、硫酸钠、磷酸钠。

可以通过一种或多种钙盐、氢氧化钙及其组合将钙添加至发酵培养基，所述钙盐优选选自硫酸钙、氯化钙、硝酸钙、磷酸钙。

可以通过一种或多种钾盐、氢氧化钾及其组合以化学成分确定的形式将钾添加至发酵培养基，所述钾盐优选选自氯化钾、硝酸钾、硫酸钾、磷酸钾。

可以通过一种或多种包含磷的盐将磷添加至发酵培养基，所述包含磷的盐优选选自磷酸钾、磷酸钠、磷酸镁、磷酸及其组合。优选地，每升初始发酵培养基添加至少1g磷。

可以通过一种或多种包含硫的盐将硫添加至发酵培养基，所述包含硫的盐优选选自硫酸钾、硫酸钠、硫酸镁、硫酸及其组合。

优选地，发酵培养基包含选自以下的一种或多种：

0.1-50g氮/升发酵培养基；

1-6g磷/升发酵培养基；

0.15–2g硫/升发酵培养基；

0.4–8g钾/升发酵培养基；

0.1–2g钠/升发酵培养基；

0.01–3g钙/升发酵培养基；以及

0.1–10g镁/升发酵培养基。

可以将一种或多种微量元素离子添加至发酵培养基，优选各自以低于10mmol/L初始发酵培养基的量添加。这些微量元素离子选自铁、铜、锰、锌、钴、镍、钼、硒和硼及其组合。优选地，将微量元素离子铁、铜、锰、锌、钴、镍和钼添加至发酵培养基。优选地，将所述一种或多种微量元素离子以一定量添加至发酵培养基，所述量选自50μmol-5mmol/升初始培养基的铁、40μmol-4mmol/升初始培养基的铜、30μmol-3mmol/升初始培养基的锰、20μmol-2mmol/升初始培养基的锌、1μmol-100μmol/升初始培养基的钴、2μmol-200μmol/升初始培养基的镍和0.3μmol-30μmol/升初始培养基的钼，以及它们的组合。为了添加每种微量元素，优选可以使用来自由氯化物、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐的一种或多种。

发酵培养基中可以任选包括的化合物是螯合剂，如柠檬酸、MGDA、NTA或GLDA，以及缓冲剂如磷酸一钾和磷酸二钾、碳酸钙等。当处理没有外部pH控制的过程时，优选添加缓冲剂。此外，在发酵过程之前和/或期间可以加入消泡剂。

维生素是指一组结构上不相关的有机化合物，其是细胞正常代谢必需的。已知细胞合成它们需要的维生素的能力差异很大。应当将维生素添加至不能合成所述维生素的芽孢杆菌细胞的发酵培养基。维生素可以选自硫胺素、核黄素、吡哆醛、烟酸或烟酰胺、泛酸、氰钴胺素、叶酸、生物素、硫辛酸、嘌呤、嘧啶、肌醇、胆碱和氯高铁血红素。

优选地，发酵培养基还包含选择剂，例如，抗生素，如氨苄西林、四环素、卡那霉素、潮霉素、博来霉素、氯霉素、链霉素或腐草霉素，细胞的可选择标记对其提供抗性。

待添加至培养基的必需化合物的量主要取决于在发酵过程中要形成的生物质的量。形成的生物质的量可以广泛变化，通常生物质的量为约10-约150克干细胞质量/升发酵液。通常，对于蛋白生产，认为生产生物质的量低于约10g干细胞质量/升发酵液的发酵与工业无关。

确定的培养基的每种组分的最佳量，以及哪些化合物是必需的和哪些是非必需的，取决于在培养基中进行发酵的微生物细胞的类型、生物质的量和形成的产物。通常，微生物细胞生长所必需的培养基组分的量可以根据发酵中使用的碳源的量来确定，因为形成的生物质的量主要由使用的碳源的量决定。

例如，当培养以补料分批模式运行时使用的补料培养基或补料溶液可以是任何上述培养基组分或其组合。在本文中应当理解作为补料溶液提供的至少部分化合物在补料所述化合物之前可以在一定程度上已存在于发酵培养基中。在一个实施方案中，补料溶液包含葡萄糖。在一个实施方案中，补料溶液包含40％-60％葡萄糖，优选42％-58％葡萄糖，更优选45％-55％葡萄糖，甚至更优选47％-52％葡萄糖并且最优选50％葡萄糖。在一个实施方案中，相同的补料溶液可以用于以补料分批模式运行的种子发酵罐和生产生物反应器。在一个实施方案中，用于以补料分批模式运行的种子发酵罐的补料溶液不同于生产生物反应器中使用的补料溶液。在一个实施方案中，用于以补料分批模式运行的种子发酵罐的补料溶液和用于生产生物反应器的补料溶液具有相同浓度的葡萄糖，但是用于生产生物反应器的补料溶液包含在用于以补料分批模式运行的种子发酵罐的补料溶液中不存在的盐。

各种补料谱(profile)在本领域中是已知的。在发酵方法过程中可以连续或不连续地添加补料溶液。补料溶液的不连续添加可以在发酵方法过程中以单次大剂量(bolus)进行一次或者以不同或相同体积进行几次。补料溶液的连续添加可以在发酵过程中以相同或不同速率(即，体积/时间)进行。在发酵过程中还可以应用连续和不连续补料谱的组合。作为补料溶液提供的发酵培养基的组分可以在一种补料溶液中或作为不同补料溶液添加。在应用一种以上补料溶液的情况下，如上文所述补料溶液可以具有相同或不同的补料谱。

优选地，在接种之前，将发酵培养基和补料溶液灭菌以防止或减少发酵方法过程中微生物的生长，这些微生物不同于接种的微生物细胞。灭菌可以用本领域已知的方法进行，例如但不限于高压灭菌或无菌过滤。一些或所有培养基组分可以与其他培养基组分分开灭菌，以避免在灭菌处理期间培养基组分的相互作用或避免培养基组分在灭菌条件下分解。

发酵的pH和温度

可以根据本领域已知的标准条件应用pH、温度、消泡剂或其他特定发酵条件。在一个实施方案中，调整发酵条件以获得感兴趣的蛋白的最大产量。

优选地，在25℃-45℃的温度下培养微生物细胞，优选27℃-40℃，更优选27℃-37℃，最优选在37℃的温度下。此外，可以应用温度变化，其中降低培养温度，例如从37℃降低至33℃、32℃、31℃、30℃、29℃或28℃的温度。

根据微生物细胞，在培养期间调整发酵液的pH。优选地，在接种之前调整化学成分确定的培养基的pH。优选地，在接种之前，但是在灭菌之后调整化学成分确定的培养基的pH。优选地，在接种之前将化学成分确定的培养基的pH调整至pH 6.6-9，优选至pH 6.6-8.5，更优选至pH 6.8-8.5，最优选至pH 6.8-pH 8.0。例如，如果使用芽孢杆菌细胞，将pH调整至或高于pH 6.8、pH 7.0、pH 7.2、pH 7.4或pH 7.6。优选地，在芽孢杆菌细胞培养期间将发酵液的pH调整至pH 6.8-9，优选至pH 6.8-8.5，更优选至pH7.0-8.5，最优选至pH 7.2-pH8.0。

在一个实施方案中，在搅拌和/或摇动发酵培养基的情况下进行发酵。在具体实施方案中，在以50–2000rpm，优选以50–1600rpm，进一步优选以800–1400rpm，更优选以50–200rpm搅拌发酵培养基的情况下进行发酵。

在一个实施方案中，在培养期间将氧添加至发酵培养基，优选如本文所述通过搅拌和/或搅动或者通过通气，优选用0-3巴空气或氧气。在一个实施方案中，在氧饱和的情况下进行发酵。

给定细胞类型的培养条件还可以在科学文献中和/或从细胞来源找到，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)和真菌遗传学储备中心。

收获时间

收获时间是从用微生物细胞接种生产生物反应器到感兴趣的产物的浓度达到预定水平并收获发酵液的时间点测量的时间跨度。在一个实施方案中，当其浓度为至少5g产物/kg发酵液，更优选至少7.5g产物/kg发酵液，最优选至少10g产物/kg发酵液时收获产物。在优选实施方案中，当其浓度为10g产物/kg发酵液时收获产物。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种用于培养生产感兴趣的产物的微生物细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述微生物细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产感兴趣的产物的条件下在生产生物反应器中培养微生物细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行，并且

其中所述方法进一步包括当发酵液中感兴趣的产物的浓度为至少10g产物/kg发酵液时收获产物的步骤(d)。

发酵液中感兴趣的产物的浓度可以通过连续测量来自发酵的样品中的浓度来监测。如果感兴趣的产物是酶，则可以进行酶活性测定，然后这提供有关样品中酶浓度的信息。例如，蛋白酶活性测定可以包括琥珀酰–Ala–Ala–Pro–Phe–p-nitroanilide(Suc-AAPF-pNA，简称：AAPF)作为底物。淀粉酶活性测定可以采用底物亚乙基-4-硝基苯基-α-D-maltoheptaosid(EPS)作为底物。包含EPS底物和α-葡糖苷酶的试剂盒可获得自RocheCostum Biotech(cat.No.10880078103)，并且在Lorentz K.et al.(2000)Clin.Chem.46(5):644–649中有所描述。

收获时间取决于微生物细胞生产的产物，并且因此可能变化。但是，当应用包括以补料分批模式进行的预培养步骤的本发明的方法时，与以分批模式进行预培养步骤的方法相比，直至收获的时间减少5％-30％，优选10-30％，最优选15-30％。在一个实施方案中，与以分批模式进行预培养的方法相比，生产生物反应器中的发酵时间减少至少5％，优选至少10％，更优选至少15％，更优选至少20％，更优选至少25％，最优选至少30％。

微生物细胞

根据本发明，感兴趣的产物是由微生物细胞生产的。所述微生物细胞可以是细菌、古细菌、真菌或酵母细胞。在一优选实施方案中，所述微生物细胞是细菌或真菌细胞。

在本发明的优选实施方案中，所述微生物细胞是细菌细胞。

细菌细胞包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。优选地，细菌细胞为革兰氏阳性。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)和海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。

在本发明的方法中，细菌细胞可以是任何芽孢杆菌细胞。在一优选实施方案中，细菌细胞是芽孢杆菌细胞。可用于本发明的实践的芽孢杆菌细胞包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一实施方案中，细菌细胞是地衣芽孢杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌的芽孢杆菌细胞。优选地，所述细胞是地衣芽孢杆菌。

在本发明的方法中，细菌细胞可以是嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricusk)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、Corynebacterium acetoglutamicum、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、Corynebacterium callunae、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、Corynebacterium thermoaminogenes、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)、Corynebacterium effiziens、Corynebacteriumefficiens、Corynebacterium deserti、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、Brevibacterium divarecatum、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)、Gluconobacter morbifer、泰国葡萄糖酸杆菌(Gluconobacterthailandicus)、醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、Clostridium saccharobutylicum、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.,Zooepidemicus)或Basfia succiniciproducens。

一些其他优选的细菌包括放线菌目的菌株，优选链霉菌属，优选Streptomycesspheroides(ATTC 23965)、热紫链霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)(IFO 12382)、变铅青链霉菌或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)或Streptoverticillum verticilliumssp.verticillium。其他优选的细菌包括类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、Rhodomonas palustri、乳链球菌(Streptococcus lactis)。进一步优选的细菌包括属于粘球菌属(Myxococcus)的菌株，例如，M.virescens。

革兰氏阴性细菌包括但不限于埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)。在一具体实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌(Echerichia coli)细胞。另一种革兰氏阴性细菌是Pseudomonas purrocinia(ATCC15958)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(NRRL B-11)或Basfiasucciniciproducens。此外，革兰氏阴性细菌包括Butiauxella，更具体地，Butiauxellaagrestis、Butiauxella brennerae、Butiauxella ferragutiae、Butiauxella gaviniae、Butiauxella izardii、Butiauxella noackiae和Butiauxella warmboldiae。

微生物细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和半知菌门(Deuteromycotina)以及所有有丝分裂孢子真菌。子囊菌门的代表性组包括，例如，脉孢菌属(Neurospora)/正青霉属(Eupenicillium)(＝青霉属(Penicillium))、裸胞壳属(Emericella)(＝曲霉属(Aspergillus))、散囊菌属(Eurotium)(＝曲霉属)、毁丝酶属(Myceliophthora)、Thermothelomyces，特别是Thermothelomycesthermophila，以及下文列出的真酵母。担子菌门的实例包括蘑菇、锈菌和黑粉菌。壶菌门的代表性组包括，例如，异水霉属(Allomyces)、Blastocladiella、雕蚀菌属(Coelomomyces)和水生真菌。卵菌门的代表性组包括，例如Saprolegniomycetous aquatic fungi(水霉)如绵霉属(Achlya)。有丝分裂孢子真菌的实例包括曲霉属，例如，黑曲霉(Aspergillusniger),青霉属，念珠菌属(Candida)和链格孢属(Alternaria)。接合菌门的代表性组包括例如根霉属(Rhizopus)和毛霉属(Mucor)。

一些优选的真菌包括属于半知菌亚门、丝孢菌纲(Hyphomycetes)的菌株例如，镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、漆斑菌属(Myrothecium)、轮枝菌(Verticillum)、Arthromyces、Caldariomyces、细基格孢属(Ulocladium)、埃里格孢属(Embellisia)、枝孢属(Cladosporium)或Dreschlera，特别是尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(DSM 2672)、Humicola insolens、Trichoderma resii、Myrothecium verrucana(IFO 6113)、Verticillum alboatrum、Verticillum dahlie、Arthromyces ramosus(FERM P-7754)、Caldariomyces fumago、纸龈枝孢(Ulocladiumchartarum)、Embellisia alli或Dreschlera halodes。

其他优选的真菌包括属于担子菌亚门(Basidiomycotina)、担子菌纲(Basidiomycetes)的菌株，例如鬼伞属(Coprinus)、平革菌属(Phanerochaete)、革盖菌属(Coriolus)或栓菌属(Trametes)，特别是Coprinus cinereus f.microsporus(IFO 8371)、长根鬼伞(Coprinus macrorhizus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)(例如NA-12)或栓菌属(以前称为多孔菌属(Polyporus))，例如变色栓菌(T.versicolor)(例如PR4 28-A)。

进一步优选的真菌包括属于接合菌亚门(Zygomycotina)、毛霉科(Mycoraceae)的菌株，例如根霉属或毛霉属，特别是冻土毛霉(Mucor hiemalis)。

微生物细胞可以是酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊孢子的酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子的酵母和属于半知菌门的酵母(芽孢纲(Blastomycetes))。产子囊孢子的酵母分为蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。后者由四个亚科组成，裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、Lipomycoideae和类酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)和酵母属(Saccharomyces))。产担子孢子的酵母包括Leucosporidim、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、线黑粉酵母属(Filobasidium)和线黑粉菌属(Filobasidiella)。属于半知菌门的酵母分为两个科，掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如，掷孢酵母属(Sporobolomyces)和布勒掷孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如念珠菌属)。在另一实施方案中，真菌细胞是丝状真菌细胞，例如，Ashbya spec，优选棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)(Eremothecium gossypii)。

在一个实施方案中，细胞包含一种或多种用于异源基因表达的遗传构建体，即经遗传修饰以表达蛋白。经过遗传修饰以表达蛋白的微生物细胞也称为“重组”或“转基因”微生物细胞。它们表达重组蛋白。重组蛋白可以是感兴趣的蛋白或参与感兴趣的蛋白合成的蛋白，如催化维生素生产的酶。

感兴趣的产物

本发明涉及一种培养微生物细胞以生产感兴趣的产物的方法。

感兴趣的产物可以是微生物细胞可以生产的任何产物。因此，感兴趣的产物选自蛋白、氨基酸、脂肪酸、维生素、辅酶、聚羟基烷酸酯、有机酸、抗生素、醇、萜、核苷酸、类固醇、类胡萝卜素和多糖。

蛋白

在优选实施方案中，感兴趣的产物是蛋白。对根据本发明的方法生产的感兴趣的蛋白来源没有限制。因此，术语感兴趣的蛋白不仅包括天然或野生型蛋白，还包括感兴趣的蛋白的任何突变体、变体、片段等，以及合成蛋白。这类遗传工程化的蛋白可以如本领域公知的那样制备，例如，通过位点定向诱变，通过PCR(使用包含期望突变的PCR片段作为PCR反应中的引物之一)，或者通过随机诱变。

微生物细胞可以包含内源性编码感兴趣的蛋白的基因(即，感兴趣的基因)，即微生物细胞不是重组的，或者感兴趣的基因可以与微生物细胞是异源的，即微生物细胞是重组的。优选地，编码感兴趣的蛋白的基因与微生物细胞是异源的。

期望的产物可以分泌至发酵液的液体部分中，或者可以保留在微生物细胞内。在优选实施方案中，发酵产物被微生物分泌至发酵液中。感兴趣的产物分泌至发酵培养基中允许从微生物细胞分离感兴趣的产物。为了将蛋白分泌至发酵培养基中，用于表达感兴趣的产物的核酸构建体可以包含编码信号肽的多核苷酸，所述信号肽指导感兴趣的蛋白分泌至发酵培养基中。各种信号肽是本领域已知的。优选的信号肽选自来自枯草芽孢杆菌的AprE蛋白的信号肽或来自枯草芽孢杆菌的YvcE蛋白的信号肽。

在更优选的实施方案中，感兴趣的蛋白是酶。

在优选实施方案中，所述酶选自水解酶、氧化酶、异构酶，例如淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、蛋白酶、金属蛋白酶、肽酶、脂肪酶、角质酶、酰基转移酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、木聚糖酶、木葡聚糖转移酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、植酸酶、磷酸酶、木糖异构酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶、乙酰乳酸脱羧酶、果胶酶、果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、裂解酶、果胶酸裂解酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、漆酶、过氧化物酶以及天冬酰胺酶，优选其中所述酶是淀粉酶或蛋白酶。

在特别优选的实施方案中，优选以下的酶：

蛋白酶

具有蛋白水解活性的酶称为“蛋白酶”或“肽酶”。蛋白酶是发挥“蛋白酶活性”或“蛋白水解活性”的活性蛋白。

蛋白酶是EC 3.4类的成员。蛋白酶包括氨肽酶(EC 3.4.11)、二肽酶(EC 3.4.13)、二肽基-肽酶和三肽基-肽酶(EC 3.4.14)、肽基-二肽酶(EC 3.4.15)、丝氨酸型羧肽酶(EC3.4.16)、金属羧肽酶(EC 3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(EC 3.4.18)、ω肽酶(EC 3.4.19)、丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(EC 3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(EC 3.4.23)、金属-内肽酶(EC 3.4.24)、苏氨酸内肽酶(EC 3.4.25)、催化机制未知的内肽酶(EC3.4.99)。

可商购的蛋白酶包括但不限于Lavergy^TM Pro(BASF)；

Duralase^TM、Durazym^TM、

Ultra、

Ultra、

Ultra、

Ultra、

和

(Novozymes A/S)，以商品名

Prime、Purafect

Purafect

Purafect

和

(Danisco/DuPont)、Axapem^TM(Gist-Brocases N.V.)出售的那些蛋白酶，迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶和来自Kao的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。

在一个实施方案中，蛋白酶可以选自丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶(EC 3.4.21)的特征在于在催化活性位点具有丝氨酸，其在催化反应期间与底物形成共价加合物。丝氨酸蛋白酶可以选自胰凝乳蛋白酶(例如，EC 3.4.21.1)、弹性蛋白酶(例如，EC 3.4.21.36、EC 3.4.21.37或EC 3.4.21.71)、颗粒酶(例如，EC 3.4.21.78或EC3.4.21.79)、激肽释放酶(例如，EC 3.4.21.34、EC 3.4.21.35、EC 3.4.21.118或EC3.4.21.119)、纤溶酶(例如，EC 3.4.21.7)、胰蛋白酶(例如，EC 3.4.21.4)、凝血酶(例如，EC 3.4.21.5)和枯草杆菌蛋白酶(也称作枯草杆菌肽酶，例如，EC 3.4.21.62)，后者在下文中也称作“枯草杆菌蛋白酶”。

Siezen et al.(1991),Protein Eng.4:719-737和Siezen et al.(1997),Protein Science 6:501-523提出一种暂时命名为枯草杆菌酶(subtilase)的丝氨酸蛋白酶亚组。它们是通过以前称作枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的超过170个氨基酸序列的同源性分析来定义的。枯草杆菌蛋白酶以前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，并且根据Siezen等人，目前是枯草杆菌酶的一个亚组。已经鉴定了多种枯草杆菌酶，并且已经确定了许多枯草杆菌酶的氨基酸序列。有关这类枯草杆菌酶和它们的氨基酸序列的更详细描述参考Siezen et al.(1997),Protein Science 6:501-523。

枯草杆菌酶可以分为6个亚类，即枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫细菌素肽酶家族、kexin家族和pyrolysin家族。

枯草杆菌酶的一个亚组是枯草杆菌蛋白酶，它们是来自MEROPS数据库(merops.sanger.ac.uk)定义的S8家族的丝氨酸蛋白酶。肽酶家族S8包含丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶及其同源物。在S8A亚家族中，活性位点残基经常出现在基序Asp-Thr/Ser-Gly、His-Gly-Thr-His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro中。肽酶家族S8的大多数成员在中性-弱碱性pH下具有活性。该家族中的许多肽酶是热稳定的。

S8家族、A亚家族的主要成员是：

名称	MEROPS S8家族，A亚家族
		枯草杆菌蛋白酶Carlsberg	S08.001
枯草杆菌蛋白酶lentus	S08.003
		嗜热蛋白酶	S08.007
枯草杆菌蛋白酶BPN’	S08.034
		枯草杆菌蛋白酶DY	S08.037
碱性肽酶	S08.038
		枯草杆菌蛋白酶ALP 1	S08.045
枯草杆菌蛋白酶sendai	S08.098
		碱性弹性蛋白酶YaB	S08.157

枯草杆菌蛋白酶类型(EC 3.4.21.62)的蛋白酶和变体可以是细菌蛋白酶。所述细菌蛋白酶可以来自革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属或链霉菌属(Streptomyces)，或者革兰氏阴性细菌如弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭形杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟菌属(Neisseria)、假单胞菌属、沙门氏菌属或脲原体属(Ureaplasma)。例如，在R.Siezen的“Subtilases:Subtilisin-like Proteases”，R.Bott和C.Betzel,NewYork,1996编辑的“Subtilisin enzymes”的第75-95页中提供了对这个家族的综述。

至少一种蛋白酶可以选自以下：来自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN'(由Vasantha et al.(1984)J.Bacteriol.Volume 159,p.811-819和JA Wells et al.(1983)in Nucleic Acids Research,Volume 11,p.7911-7925描述)；来自地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg；在EL Smith et al.(1968)in J.Biol Chem,Volume243,pp.2184-2191和Jacobs et al.(1985)in Nucl.Acids Res,Vol 13,p.8913-8926中公开)；枯草杆菌蛋白酶PB92(碱性蛋白酶PB92的原始序列在EP 283075A2中有描述)；如WO89/06279中公开的枯草杆菌蛋白酶147和/或309(分别为

)；如WO 91/02792中公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，例如来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483或如WO 95/23221所述的迟缓芽孢杆菌DSM 5483的变体；DE 10064983中公开的来自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)(DSM 11233)的枯草杆菌蛋白酶；如WO 2003/054184中公开的来自吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)(DSM 14391)的枯草杆菌蛋白酶；WO 2003/056017中公开的来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)(DSM 14390)的枯草杆菌蛋白酶；WO 2003/055974中公开的来自芽孢杆菌(DSM 14392)的枯草杆菌蛋白酶；WO 2003/054184中公开的来自吉氏芽孢杆菌(DSM 14393)的枯草杆菌蛋白酶；具有WO 2005/063974中描述的SEQ IDNO:4的枯草杆菌蛋白酶；具有WO 2005/103244中描述的SEQ ID NO:4的枯草杆菌蛋白酶；具有WO 2005/103244中描述的SEQ ID NO:7的枯草杆菌蛋白酶；以及具有申请DE102005028295.4中描述的SEQ ID NO:2的枯草杆菌蛋白酶。

蛋白酶还包括WO 92/19729、WO 95/23221、WO 96/34946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/11768、WO 01/44452、WO 02/088340、WO 03/006602、WO 2004/03186、WO2004/041979、WO 2007/006305、WO 2011/036263、WO 2011/036264和WO 2011/072099中描述的变体。合适的实例尤其包括源自EP 1 921 147中描述的SEQ ID NO:22的枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶变体，其在以下位置的一个或多个中具有氨基酸取代：3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274，具有蛋白水解活性。此外，枯草杆菌蛋白酶在位置Asp32、His64和Ser221处不发生突变。

枯草杆菌蛋白酶样酶可以具有EP 1921147中描述的SEQ ID NO:22，或者可以是与EP 1 921 147中描述的SEQ ID NO:22至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同且具有蛋白水解活性的其变体。在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶样酶与EP 1 921 147中描述的SEQ ID NO:22至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同，并且特征在于在位置101(根据BPN’编号)具有氨基酸谷氨酸(E)、或天冬氨酸(D)、或天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)、或丙氨酸(A)、或甘氨酸(G)、或丝氨酸(S)且具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶样酶与EP 1 921 147中描述的SEQ ID NO:22至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同，并且特征在于在位置101(根据BPN’编号)具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，并且具有蛋白水解活性。这样的枯草杆菌蛋白酶变体可以在位置101处包含氨基酸取代，如R101E或R101D，单独或与在以下位置的一个或多个氨基酸取代组合：3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和/或274(根据BPN’变化)，并且具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，所述蛋白酶包含一个或多个进一步的取代(a)-(h)：(a)在位置3处的苏氨酸(3T)，(b)在位置4处的异亮氨酸(4I)，(c)在位置63处的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(63A、63T或63R)，(d)在位置156处的天冬氨酸或谷氨酸(156D或156E)，(e)在位置194处的脯氨酸(194P)，(f)在位置199处的甲硫氨酸(199M)，(g)在位置205处的异亮氨酸(205I)，(h)在位置217处的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(217D、217E或217G)，(i)根据(a)-(h)的两个或更多个氨基酸的组合。

枯草杆菌蛋白酶样酶可以具有与EP 1 921 147中描述的SEQ ID NO:22至少80％相同的氨基酸序列，并且其特征还在于包含取代R101E，以及选自以下一个或多个取代：S156D、L262E、Q137H、S3T、R45E,D,Q、P55N、T58W,Y,L、Q59D,M,N,T、G61D,R、S87E、G97S、A98D,E,R、S106A,W,N117E、H120V,D,K,N、S125M、P129D、E136Q、S144W、S161T、S163A,G,Y171L、A172S、N185Q、V199M、Y209W、M222Q、N238H、V244T、N261T,D和L262N,Q,D(如WO 2016/096711所述并根据BPN’编号)，并且具有蛋白水解活性。

本发明中使用的蛋白酶具有蛋白水解活性。确定蛋白水解活性的方法在文献中是公知的(参见例如Gupta et al.(2002),Appl.Microbiol.Biotechnol.60:381-395)。可以通过使用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(Suc-AAPF-pNA,短AAPF；参见例如DelMar et al.(1979),Analytical Biochem 99,316-320)作为底物来确定蛋白水解活性。通过蛋白水解切割从底物分子切割pNA，导致释放黄色的游离pNA，其可以通过测量OD405来定量。

淀粉酶

α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)可以对包含三个或更多个(1->4)-α连接的D-葡萄糖单元的多糖中的(1->4)-α-D-糖苷键进行内水解。淀粉酶以随机方式作用于淀粉、糖原以及相关多糖和寡糖；还原基团以α-构型释放。淀粉酶的其他实例包括：β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖淀粉酶(maltotetraohydrolase)(E.C.3.2.1.60)、异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)、葡聚糖1,4-α-麦芽六糖苷酶(maltohexaosidase)(E.C.3.2.1.98)和葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(maltohydrolase)(E.C.3.2.1.133)。

淀粉酶已在专利文件中有所描述，包括但不限于：WO 2002/068589、WO 2002/068597、WO 2003/083054、WO 2004/091544和WO 2008/080093。

源自地衣芽孢杆菌的淀粉酶具有WO 95/10603中描述的SEQ ID NO:2。这种淀粉酶的合适变体是与WO 95/10603中描述的SEQ ID NO:2至少90％相同和/或在以下位置处包含一个或多个取代的那些变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444，并且具有淀粉分解活性。这类变体在WO 94/02597、WO 94/018314、WO 97/043424和WO 99/019467的SEQ IDNO:4中有所描述。

源自嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的淀粉酶具有WO 02/10355中描述的SEQ ID NO:6。这种淀粉的合适变体是与其至少90％相同且具有淀粉分解活性的那些变体。SEQ ID NO:6的合适变体包括与WO 02/10355中描述的SEQ ID NO:6至少90％相同和/或进一步包含在位置181和/或182中的缺失和/或在位置193中的取代的那些变体。

源自芽孢杆菌707的淀粉酶具有WO 99/19467中公开的SEQ ID NO:6或与其至少90％相同，具有淀粉分解活性。

源自盐敏芽孢杆菌(Bacillus halmapalus)的淀粉酶具有WO 96/23872中描述的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7，也描述为SP-722，或者与具有淀粉分解活性的序列之一至少90％相同。

源自芽孢杆菌DSM 12649的淀粉酶具有WO 00/22103中公开的SEQ ID NO:4或与其至少90％相同，具有淀粉分解活性。

源自芽孢杆菌菌株TS-23的淀粉酶具有WO 2009/061380中公开的SEQ ID NO:2或与其至少90％相同，具有淀粉分解活性。

源自嗜细胞菌(Cytophaga sp.)的淀粉酶具有WO 2013/184577中公开的SEQ IDNO:1或与其至少90％相同，具有淀粉分解活性。

源自巨大芽孢杆菌DSM 90的淀粉酶具有WO 2010/104675中公开的SEQ ID NO:1或与其至少90％相同，具有淀粉分解活性。

已知淀粉酶具有WO 00/60060中描述的SEQ ID NO:2的氨基酸1-485，或者包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1-485至少96％相同的氨基酸序列的具有淀粉分解活性的淀粉酶。

还已知淀粉酶具有WO 2006/002643中描述的SEQ ID NO:12，或者与其具有至少80％相同性且具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO:12相比具有至少80％相同性和/或在位置Y295F和M202LITV处包含取代并且具有淀粉分解活性的那些。

还已知淀粉酶具有WO 2011/098531中描述的SEQ ID NO:6，或者与其具有至少80％相同性的具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO:6相比具有至少80％相同性和/或在选自193[G,A,S,T或M]、195[F,W,Y,L,I或V]、197[F,W,Y,L,I或V]、198[Q或N]、200[F,W,Y,L,I或V]、203[F,W,Y,L,I或V]、206[F,W,Y,N,L,I,V,H,Q,D或E]、210[F,W,Y,L,I或V]、212[F,W,Y,L,I或V]、213[G,A,S,T或M]和243[F,W,Y,L,I或V]的一个或多个位置处包含取代且具有淀粉分解活性的那些。

已知淀粉酶具有WO 2013/001078中描述的SEQ ID NO:1，或者与其具有至少85％相同性的具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO:1相比具有至少85％相同性和/或在对应于位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476和G477的两个或更多个(几个)位置处包含改变且具有淀粉分解活性的那些。

已知淀粉酶具有WO 2013/001087中描述的SEQ ID NO:2，或者与其具有至少85％相同性且具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO:2相比具有至少85％相同性和/或包含位置181+182、或182+183、或183+184的缺失的那些，其具有淀粉分解活性。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO:2相比具有至少85％相同性和/或包含位置181+182、或182+183、或183+184的缺失的那些，其在对应于W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476和G477的位置中包含一个或两个或更多个修饰，并且具有淀粉分解活性。

淀粉酶还包括上述淀粉酶的杂合α-淀粉酶，例如WO 2006/066594中所述。

可商购的淀粉酶包括：

Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme^TM、Stainzyme Plus^TM、Natalase^TM、Liquozyme X and BAN^TM(来自Novozymes A/S)、和Rapidase^TM、Purastar^TM、PoweraseTM、Effectenz^TM(来自DuPont的M100)、Preferenz^TM(S1000、S110和F1000；来自DuPont)、PrimaGreen^TM(ALL；DuPont)、Optisize^TM(DuPont)。

在一个实施方案中，所述酶是Termamyl样淀粉酶。在本上下文中，术语“Termamyl样酶”旨在表示α-淀粉酶，其在氨基酸水平上与WO 96/23874中描述的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶具有至少60％的序列相同性。在一个实施方案中，Termamyl样α-淀粉酶与WO 96/23874中描述的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶表现出至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％相同性。

本文中的另一种α-淀粉酶是WO 95/26397、WO 99/19467和WO 01/66712中描述的Natalase或其变体。

脂肪酶

“脂肪酶”、“脂肪分解酶”、“脂质酯酶”均指EC类3.1.1的酶(“羧酸酯水解酶”)。脂肪酶(E.C.3.1.1.3，三酰甘油脂肪酶)可以将甘油三酯水解为更亲水的甘油单酯和甘油二酯、游离脂肪酸和甘油。脂肪酶通常还包括对不同于甘油三酯的底物有活性或切割特定脂肪酸的酶，如磷脂酶A(E.C.3.1.1.4)、半乳糖脂肪酶(E.C.3.1.1.26)、角质酶(EC3.1.1.74)，以及具有固醇酯酶活性(EC 3.1.1.13)和/或蜡-酯水解酶活性(EC 3.1.1.50)的酶。

现有技术中已描述了许多脂肪酶，包括但不限于：WO 00/032758、WO 03/089620、WO 2005/032496、WO 2005/086900、WO 2006/00976、WO 2006/031699、WO 2008/036863、WO2011/046812和WO 2014/059360。

纤维素酶

“纤维素酶”、“纤维素酶酶”或“纤维素分解酶”是参与纤维素水解的酶。已知三种主要类型的纤维素酶，即内切-β-1,4-葡聚糖酶(内切-1,4-P-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.4；水解纤维素中的β-1,4-糖苷键)、纤维二糖水解酶(1,4-P-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)。

纤维素酶已在专利和公开的专利申请中有所描述，包括但不限于：WO 97/025417、WO 98/024799、WO 03/068910、WO 2005/003319和WO 2009/020459。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM、Endolase^TM、Carezyme^TM、Cellusoft^TM、Renozyme^TM、Celluclean^TM(来自Novozymes A/S)、Ecostone^TM、Biotouch^TM、Econase^TM、Ecopulp^TM(来自AB Enzymes Finland)、Clazinase^TM、和Puradax HA^TM、Genencor去污剂纤维素酶L、IndiAge^TM Neutra(来自Genencor International Inc./DuPont)、Revitalenz^TM(2000来自DuPont)、Primafast^TM(DuPont)和KAC-500^TM(来自Kao Corporation)。

根据本发明的方法中使用的纤维素酶具有“纤维素分解活性”或“纤维素酶活性”。用于测量纤维素分解活性的测定是本领域技术人员已知的。例如，根据Hoffman,W.S.,J.Biol.Chem.120,51(1937)，纤维素分解活性可以通过纤维素酶将羧甲基纤维素水解为还原碳水化合物的事实来确定，其还原能力通过铁氰化物反应比色确定。

甘露聚糖酶(mannanase)

甘露聚糖酶(mannase)(E.C.3.2.1.78)酶水解甘露糖聚合物中的内部β-1,4键。“甘露聚糖酶”可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。已知甘露聚糖酶源自芽孢杆菌或腐质霉的野生型，特别是B.agaradhaerens、地衣芽孢杆菌、B.halodurans、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)或H.insolens。WO 99/064619中描述了合适的甘露聚糖酶。

可商购的甘露聚糖酶包括但不限于

(Novozymes AIS)。

果胶酸裂解酶

果胶酸裂解酶(E.C.4.2.2.2)催化(1->4)-α-D-聚半乳糖醛酸的消除切割，得到在其非还原末端具有4-脱氧-α-D-半乳糖-4-enuronosyl的寡糖。

果胶酸裂解酶已在专利和公开的专利申请中有所描述，包括但不限于：WO 2004/090099。已知果胶酸裂解酶源自芽孢杆菌，特别是地衣芽孢杆菌或B.agaradhaerens，或者源自任何这些的变体，例如US 6,124,127、WO 99/027083、WO 99/027084、WO 2002/006442、WO 02/092741、WO 03/095638中所述。

可商购的果胶酸裂解酶包括：XpectTM、PectawashTM和PectawayTM(Novozymes A/S)；PrimaGreenTM、EcoScour(DuPont)。

核酸酶

核酸酶(EC 3.1.21.1)，也称作脱氧核糖核苷酸酶I或Dnase，对5'-磷酸二核苷酸和5'-磷酸寡核苷酸终产物进行核算内切。

核酸酶已在专利和公开的专利申请中有所描述，包括但不限于：US 3,451,935、GB1300596、DE 10304331、WO 2015/155350、WO 2015/155351、WO 2015/166075、WO 2015/181287和WO 2015/181286。

酶变体可以通过它们与亲本酶相比时的序列相同性来定义。序列相同性通过提供为“％序列相同性”或“％相同性”。为了确定两个氨基酸序列之间的百分比相同性，在第一步中在这两个序列之间产生成对序列比对，其中将两个序列在它们的整个长度上比对(即，成对全局比对)。用实现Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(1979)48,p.443-453)的程序生成比对，优选通过使用程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))，用程序默认参数(gapopen＝10.0，gapextend＝0.5和matrix＝EBLOSUM62)。用于本发明目的的优选比对是可以由其确定最高序列相同性的比对。

比对两个序列之后，在第二步中，应当从比对确定相同性值。因此，根据本发明，以下百分比相同性的计算适用：

％相同性＝(相同残基/在其完整长度上显示本发明的各个序列的比对区域的长度)*100。因此，与根据这个实施方案的两个氨基酸序列的比较相关的序列相同性是通过将相同残基的数量除以比对区域的长度来计算的，所述比对区域在其完成长度上显示本发明的各个序列。这个值乘以100以给出“％-相同性”。

对于计算两个DNA序列的百分比相同性，与计算两个氨基酸序列的百分比相同性相同，具有一些规范。对于编码蛋白的DNA序列，应当在编码区的整个长度上进行成对比对，从起始密码子至终止密码子，不包括内含子。对于非蛋白编码DNA序列，应当在本发明序列的整个长度上进行成对比对，因此将本发明的完整序列与另一序列或另一序列之外的区域进行比较。此外，实现Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(1979)48,p.443-453)的优选比对程序是“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))，用程序默认参数(gapopen＝10.0、gapextend＝0.5和matrix＝EDNAFULL)。

激素

在另一实施方案中，感兴趣的产物可以是激素，例如但不限于胰岛素、人生长激素、生长抑素和胰岛素样生长因子。激素可以由任何微生物细胞生产。优选地，这些激素由大肠杆菌细胞生产。

维生素

在另一实施方案中，感兴趣的产物可以是维生素。维生素包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆、维生素B₅、维生素B₁₂和维生素B₂。优选地，生产的维生素是维生素B₅、维生素B₁₂或维生素B₂。维生素B₁₂的大规模工业生产通过微生物发酵进行，主要利用脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)或苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)和大肠杆菌，优选大肠杆菌。维生素B₂，也称作核黄素，可以由任何微生物细胞生产，优选由Eremothecium gossypii细胞或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞生产。Ledesma-Amaro etal.:“Microbial Production of Vitamins”in“Microbial production of foodingredients,enzymes and nutraceuticals”,Chapter:14,Publisher:WoodheadPublishing,Editors:Brian McNeil,David Archer,Ioannis Giavasis,Linda Harvey中提供了微生物细胞中的维生素生产的概述。

氨基酸

在另一实施方案中，感兴趣的产物可以是氨基酸。可以在微生物细胞中生产的氨基酸包括L-谷氨酸、L-赖氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。L-谷氨酸通常在棒状细菌如谷氨酸棒状杆菌中生产。L-赖氨酸可以在谷氨酸棒状杆菌中生产。甲硫氨酸可以在谷氨酸棒状杆菌中生产。色氨酸可以在谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌(E.coli)中生产。Zafr和Mahmood:“Microbial amino acids production”in“Microbial Biotechnology”,first edition,chapter 9,Taylor and Francis Group,Editors:Farshad Darvishi Harzevili中提供了微生物细胞中的氨基酸生产的概述。

下游加工

在进行本发明的方法之后，可以或可以不从发酵液进一步纯化感兴趣的产物。因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含通过根据本发明的发酵方法获得的感兴趣的蛋白的发酵液。

在收获发酵液之后，可以通过本领域已知的方法回收和进一步纯化期望产物。

期望的感兴趣的产物，优选期望的蛋白，可以被分泌(至发酵液的液体部分中)或者可以不从微生物细胞分泌(并且因此包含在发酵液的细胞中)。根据这一点，可以从发酵液的液体部分或从细胞裂解物回收期望蛋白。可以通过本领域技术人员已知的方法实现期望蛋白的回收。从发酵液回收蛋白的合适方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取和沉淀。如果感兴趣的蛋白在发酵液中沉淀或结晶或者至少部分结合发酵液的颗粒物质，则可能需要额外的处理步骤以从生物质释放感兴趣的蛋白或者溶解感兴趣的蛋白晶体和沉淀物。US6,316,240 B1和WO 2008/110498 A1描述了一种从发酵液回收感兴趣的蛋白的方法，所述蛋白在发酵期间沉淀和/或结晶。如果期望蛋白包含在发酵液的细胞中，则可能需要从细胞释放感兴趣的产物。从细胞释放可以例如但不限于通过用本领域技术人员公知的技术进行细胞裂解来实现，例如，溶菌酶处理、超声处理、弗氏压榨或它们的组合。

可以通过本领域已知的方法从发酵液纯化感兴趣的产物，优选感兴趣的蛋白。例如，可以通过常规程序从发酵液分离感兴趣的蛋白，包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。任何可以通过本领域已知的各种程序进一步纯化分离的多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排阻)、电泳程序(例如，制备等点聚焦(IEF)、差异溶解度(例如，硫酸铵沉淀)或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson and Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989)。然后可以通过本领域已知的程序浓缩纯化的多肽，包括但不限于超滤和蒸发，特别是薄膜蒸发。

可以将纯化的蛋白溶液进一步加工以形成“蛋白制剂”。“蛋白制剂”表示包含少量成分的任何非复杂制剂，其中所述成分用于稳定蛋白制剂中包含的蛋白和/或稳定蛋白制剂本身的目的。术语“蛋白稳定性”涉及在储存或操作期间作为时间函数的蛋白活性的保留。术语“蛋白制剂稳定性”涉及在储存或操作期间维持蛋白制剂的物理外观以及在储存或操作期间避免微生物污染。

蛋白制剂可以是固体或液体。可以通过使用本领域已知的技术获得蛋白制剂。例如，但不受其限制，可以通过挤出或造粒获得固体酶制剂。合适的挤出和造粒技术是本领域已知的，并且例如在WO 94/19444 A1和WO 97/43482 A1中有所描述。酶制剂上下文中的“液体”涉及在20℃和101.3kPa下的物理外观。液体蛋白制剂可以包含0.1重量％-40重量％、或0.5重量％-30重量％、或1重量％-25重量％、或3重量％-10重量％的量的酶，所有这些均相对于酶制剂的总重量。

通过本发明的方法生产的蛋白可以用于食品，例如所述蛋白可以是烘焙添加剂。所述蛋白可以用于饲料，例如所述蛋白是动物饲料添加剂。所述蛋白可以用于淀粉加工业，例如淀粉酶用于将淀粉转化为乙醇或糖(高果糖玉米糖浆)和其他副产品如油、干酒糟等。所述蛋白可以用于纸浆和纸张加工，例如，所述蛋白可以用于提高纸张强度。在一个实施方案中，通过本发明的方法生产的蛋白用于去污剂制剂或清洁制剂。“去污剂制剂”或“清洁制剂”表示指定用于清洁污染材料的组合物。清洁包括洗涤和硬表面清洁。根据本发明的污染材料包括纺织品和/或硬表面。

具体实施方案

以下示出本发明的具体实施方案的列表：

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于培养生产感兴趣的蛋白的芽孢杆菌细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述芽孢杆菌细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产感兴趣的蛋白的条件下在生产生物反应器中培养芽孢杆菌细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于培养生产感兴趣的蛋白的芽孢杆菌细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述芽孢杆菌细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产感兴趣的蛋白的条件下在生产生物反应器中培养芽孢杆菌细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行；并且

其中在生产生物反应器中培养芽孢杆菌细胞期间，将超过200g碳源(优选地，化学成分确定的碳源)每升的初始发酵培养基添加至生产生物反应器。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于培养生产酶的芽孢杆菌细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述芽孢杆菌细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产所述酶的条件下在生产生物反应器中培养芽孢杆菌细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于培养生产蛋白酶的芽孢杆菌细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述芽孢杆菌细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产所述蛋白酶的条件下在生产生物反应器中培养芽孢杆菌细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于培养生产淀粉酶的芽孢杆菌细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述芽孢杆菌细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产所述淀粉酶的条件下在生产生物反应器中培养芽孢杆菌细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于培养生产感兴趣的产物的地衣芽孢杆菌细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述地衣芽孢杆菌细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产感兴趣的产物的条件下在生产生物反应器中培养地衣芽孢杆菌细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于培养生产蛋白酶的地衣芽孢杆菌细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述地衣芽孢杆菌细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产所述蛋白酶的条件下在生产生物反应器中培养地衣芽孢杆菌细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于培养生产淀粉酶的地衣芽孢杆菌细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述地衣芽孢杆菌细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产所述淀粉酶的条件下在生产生物反应器中培养地衣芽孢杆菌细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

在以下实施例中进一步说明本发明，这些实施例无意以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。对本领域技术人员显而易见的许多可能的变化也落在本发明的范围内。

实施例

除非另有说明，以下实验是通过应用如遗传工程和通过微生物培养发酵生产化合物中使用的标准设备、方法、化学品和生物化学品进行的。还参见Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd edition,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)和Chmiel et al.(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik,Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)。

对于以下实施例(实施例1-3)中描述的第一预培养，使用包含表1中描述的复合培养基的摇瓶。从包含编码蛋白酶或淀粉酶的基因的地衣芽孢杆菌的低温储备物接种摇瓶，并且在30℃下以200rpm培养16h。

表1：

在高压灭菌之前，使用NaOH将pH设置为7.5。

对于下文实施例中描述的进一步预培养和生产生物反应器中的主要培养，将来自第一次预培养的地衣芽孢杆菌细胞在发酵过程中培养，使用提供表2和表3中列出的组分的化学成分确定的发酵培养基。

表2：发酵过程中提供的常量元素

表3：发酵过程中提供的微量元素

用包含8g/l葡萄糖的培养基开始发酵。使用包含50％葡萄糖的溶液作为补料溶液。在发酵期间使用氨调整pH。

实施例1

芽孢杆菌细胞用于生产蛋白酶或淀粉酶。各个预培养的种子队列由三个种子发酵罐组成。用如上文所述的复合培养基进行摇瓶中的第一次预培养。种子发酵罐中的第二次预培养用其10％的来自第一次预培养的体积接种，并且在上文描述的化学成分确定的培养基中培养。第二次预培养以分批模式运行16h或直至葡萄糖耗尽，这表现为溶解氧信号的急剧增加和pH升高。包含上文描述的化学成分确定的培养基的第三次预培养用其10％的来自第二次预培养的体积接种。第三次预培养以补料分批模式运行，使用上文描述的化学成分确定的培养基和包含50％葡萄糖的补料溶液。在初始量的8g/l葡萄糖耗尽时开始补料，这表现为培养pH增加0.2pH单位。添加补料22h。

作为对照，使用相同数量的种子发酵罐和相同培养基进行预培养，其中在第二次和第三次预培养中完全以分批模式运行预培养，使用包含20g/L葡萄糖的化学成分确定的培养基。

转移至生产生物反应器的对照预培养物和补料分批预培养物的接种物体积分别为生产生物反应器中最初存在的发酵培养基体积的10％。生产生物反应器中微生物细胞的培养以补料分批模式进行，使用如上文描述的化学成分确定的培养基。在初始量的8g/l葡萄糖耗尽时(表现为培养物pH增加0.2pH单位)开始用包含50％葡萄糖的补料溶液补料，并且添加直至达到10g/kg(对应于10g/升)发酵液的产物浓度。

对连续样品使用蛋白酶和淀粉酶的酶测定来监测直至收获的时间。使用琥珀酰–Ala–Ala–Pro–Phe–p-Nitroanilide(Suc-AAPF-pNA，简称：AAPF)作为底物确定蛋白酶活性。在30℃，pH 8.6TRIS缓冲液中从底物分子切割pNA。通过测量OD₄₀₅，在405nm处的光密度，可以通过溶液中游离pNA的黄色增加来确定切割速率。通过采用底物亚乙基-4-硝基苯基-α-D-maltoheptaoside(EPS)的方法确定α-淀粉酶活性。D-maltoheptaoside是一种可以被内切-淀粉酶切割的封闭寡糖。切割之后，α-葡糖苷酶释放出具有黄色的PNP分子，因此可以通过在405nm处的可见分光光度法进行测量。包含EPS底物和α-葡糖苷酶的试剂盒可获得自Roche Costum Biotech(cat.No.10880078t3)，并且在Lorentz K.et al.(2000)Clin.Chem.46(5):644–649中有所描述。在给定的一组条件下，时间依赖性吸收-曲线的斜率与所讨论的α-淀粉酶的比活性(每mg酶的活性)成正比。

收获时间点定义为生产10g蛋白酶或淀粉酶/kg发酵液的时间点。将直至收获的时间归一化至对照培养物，即如果在接种生产生物反应器之前使用分批预培养所需的时间。

对于蛋白酶的生产，与完全以分批模式运行的预培养相比，当生物反应器之前的预培养以补料分批模式运行时直至收获的时间减少约30％(见图1A)。对于淀粉酶的生产，与完全以分批模式运行的预培养相比，当生物反应器之前的预培养以补料分批模式运行时直至收获的时间减少约20％(见图1B)。

实施例2

地衣芽孢杆菌细胞用于生产蛋白酶。对于补料分批预培养和分批预培养，如实施例1所述进行种子队列。用于生产生物反应器的来自预培养的各接种物的体积是生产生物反应器中最初存在的发酵培养基体积的10％或生产生物反应器中最初存在的发酵培养基体积的1％(图2)。生产生物反应器中微生物细胞的培养以补料分批模式进行。如实施例1所述对连续样品使用蛋白酶的酶测定来监测直至收获的时间。收获时间以及发酵过程的结束时间定义为生产10g蛋白酶/kg发酵液的时间点。将直至收获的时间归一化至对照培养物，即如果使用分批预培养所需的时间。

图2显示当接种物的体积为1％或10％时，在以补料分批模式运行预培养时直至收获的时间减少约20％。

实施例3

地衣芽孢杆菌细胞用于生产蛋白酶。在这个实施例中，在生产生物反应器之前的最后一个种子发酵罐中测试不同培养基。因此，种子队列的最后一个种子发酵罐中的培养基是复合培养基或化学成分确定的培养基。然后将预培养物转移至生产生物反应器。接种物的体积是生产生物反应器中最初存在的发酵培养基体积的10％。

如实施例1和2所述，生产生物反应器中微生物细胞的培养以补料分批模式进行。使用实施例1中描述的测定，对连续样品使用蛋白酶的酶测定来监测直至收获的时间。收获时间以及发酵过程的结束时间定义为生产10g感兴趣的产物/kg发酵液的时间点。将直至收获的时间归一化至用化学成分确定的培养基进行的培养。

图3显示在补料分批预培养中使用化学成分确定的培养基或复合培养基时，直至收获的时间基本上相同。

实施例4

枯草芽孢杆菌细胞用于生产蛋白酶。对于补料分批预培养和分批预培养，如实施例1所述进行种子队列。来自预培养物的生产生物反应器的各接种物的体积是生产生物反应器中最初存在的发酵培养基体积的10％。生产生物反应器中微生物细胞的培养以补料分批模式进行。如实施例1所述对连续样品使用蛋白酶的酶测定来监测直至收获的时间。收获时间以及发酵过程的结束时间定义为生产10g蛋白酶/kg发酵液的时间点。将直至收获的时间归一化至对照培养物，即如果使用分批预培养所需的时间。

与完全以分批模式运行的预培养相比，当生物反应器之前的预培养以补料分批模式运行时直至收获的时间减少约12％(见图4)。

Claims (11)

1.一种培养生产感兴趣的蛋白的芽孢杆菌细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供所述芽孢杆菌细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产所述感兴趣的蛋白的条件下在生产生物反应器中培养芽孢杆菌细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

2.权利要求1的方法，其中用于接种生产生物反应器的预培养物体积不超过生物反应器中存在的发酵培养基体积的15％。

3.权利要求1和2的方法，其中所述预培养包括至少两个阶段，全部以补料分批模式进行。

4.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤c)以分批模式、补料分批模式或连续发酵模式进行。

5.权利要求4的方法，其中所述芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，优选地衣芽孢杆菌的细胞。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述感兴趣的蛋白是酶。

7.权利要求6的发酵方法，其中所述酶选自水解酶、氧化酶、异构酶、淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、蛋白酶、金属蛋白酶、肽酶、脂肪酶、角质酶、酰基转移酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、木聚糖酶、木葡聚糖转移酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、植酸酶、磷酸酶、木糖异构酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶、乙酰乳酸脱羧酶、果胶酶、果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、裂解酶、果胶酸裂解酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、漆酶、过氧化物酶以及天冬酰胺酶。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述感兴趣的蛋白由芽孢杆菌细胞分泌至发酵液中。

9.前述权利要求中任一项的方法，进一步包括步骤(d)：当所述感兴趣的蛋白的浓度为至少10g产物/kg发酵液时收获产物。

10.一种生产感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：

(a)提供生产所述感兴趣的蛋白的芽孢杆菌细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产所述感兴趣的蛋白的条件下在生产生物反应器中培养芽孢杆菌细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

11.一种减少发酵生产感兴趣的蛋白中直至收获的时间的方法，包括以下步骤：

(a)提供生产所述感兴趣的蛋白的芽孢杆菌细胞的预培养物；

(b)用步骤(a)的预培养物接种生产生物反应器；以及

(c)在有利于生产所述感兴趣的蛋白的条件下在生产生物反应器中培养芽孢杆菌细胞，

其中步骤(a)的预培养以补料分批模式进行。

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