CN116157530A - 使用温度变化的芽孢杆菌工业发酵工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及工业发酵领域。特别地，本发明涉及培养芽孢杆菌属宿主细胞的方法，包括以下步骤：(a)用包含编码感兴趣蛋白质的基因的表达构建体的芽孢杆菌属宿主细胞接种发酵培养基，(b)第一培养阶段，在有利于芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣蛋白质表达的条件下，在所述发酵培养基中培养芽孢杆菌属宿主细胞，其中芽孢杆菌属宿主细胞的培养包括加入至少一种进料溶液并且其中在第一培养阶段期间的培养在第一温度进行，和(c)第二培养阶段，在有利于芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣蛋白质表达的条件下培养步骤(b)获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物，其中培养包括加入至少一种进料溶液并且其中在第二培养阶段期间的培养在第二温度进行，所述第二温度高于第一温度。本发明还提供了通过所述方法可获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物。

Description

使用温度变化的芽孢杆菌工业发酵工艺

技术领域

本发明涉及工业发酵领域。特别地，本发明涉及用于培养芽孢杆菌属宿主细胞的方法，包括以下步骤：(a)用芽孢杆菌属宿主细胞接种发酵培养基，所述芽孢杆菌属宿主细胞包含编码感兴趣的蛋白质的基因的表达构建体，(b)第一培养阶段，在有利于芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的条件下，在所述发酵培养基中培养芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞的培养包括加入至少一种进料溶液并且其中在第一培养阶段期间的培养在第一温度进行，及(c)第二培养阶段，在有利于芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的条件下培养在步骤(b)获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物，其中所述培养包括加入至少一种进料溶液并且其中在第二培养阶段期间的培养在第二温度进行，所述第二温度高于第一温度。本发明还提供通过所述方法可获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物。

背景技术

微生物被广泛用作工业主力以生产感兴趣的产物，尤其是蛋白质，特别是酶。感兴趣的产物的生物技术生产通过发酵和随后的产物纯化进行。如芽孢杆菌属物种等微生物能够将大量产物分泌到发酵液中。与细胞内生产相比，这允许简单的产物纯化过程并解释了芽孢杆菌属在工业应用中的成功。

使用微生物的工业生物工艺过程通常在尺寸超过50m³的大规模生产生物反应器中进行。对于在所述大规模生物反应器中的发酵过程，通常在生物反应器中接种发酵液是用芽孢杆菌属细胞的预培养物进行。可以通过在较小的种子发酵罐中培养芽孢杆菌属细胞来获得预培养物。

大规模发酵过程通常包含在允许生长和待生产的感兴趣的蛋白质表达的条件下培养接种的芽孢杆菌属细胞。通常，使芽孢杆菌属细胞在复合或确定的发酵培养基中生长，并且在培养期间以恒定量或不同量补充碳源。

已经报道了不同的方法旨在增加在大规模生物反应器中在所述培养期间由芽孢杆菌属细胞产生的感兴趣的蛋白质的产量。这些方法涉及，例如培养基组成成分的变化。其它方法涉及降低温度，尤其是为了降低包涵体形成的可能性(Hashemi 2012,FoodBioprocess Technol 5:1093-1099；Wenzel 2011,Applied and EnvironmentalMicrobiology 77:6419-6425)。

然而，非常需要在大规模工业发酵过程中进一步提高产量的方法。

发明内容

本发明的技术问题可视为提供满足上述需求的手段和方法。它可以通过权利要求和下文中表征的实施方案来解决。

因此，本发明涉及一种培养芽孢杆菌属宿主细胞的方法，包括以下步骤：

(a)用芽孢杆菌属宿主细胞接种发酵培养基，所述芽孢杆菌属宿主细胞包含编码感兴趣的蛋白质的基因的表达构建体；

(b)第一培养阶段，在有利于芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白表达的条件下在所述发酵培养基中培养芽孢杆菌属宿主细胞，其中芽孢杆菌属宿主细胞的培养包括加入至少一种进料溶液并且其中在第一培养阶段期间的培养在第一温度进行；和

(c)第二个培养阶段，在有利于芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白表达的条件下培养在步骤(b)中获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物，其中所述培养包括加入至少一种进料溶液并且其中在第二培养阶段期间的培养在第二温度进行，所述第二温度高于第一温度。

应当理解，如说明书和权利要求书中所用，“a”或“an”可以表示一或多个，这取决于使用其的语境。因此，例如，提及“一个细胞”可以表示可以使用至少一个细胞。

此外，应当理解，如本文所用的术语“至少一个”是指根据本发明可以使用该术语后面提到的一项或多项。例如，如果该术语表示应使用至少一种进料溶液，则这可以理解为一种进料溶液或多于一种的进料溶液，即两种、三种、四种、五种或任何其它数量的进料溶液。取决于项目，该术语是指本领域技术人员理解该术语可以指代的上限，如果有的话。

本文所用的术语“约”是指该术语之后所列举的任何数字存在能够实现技术效果的区间精度。因此，本文所指的约，优选是指精确数值或围绕所述精确数值±20％、优选±15％、更优选±10％、或甚至更优选±5％的范围。

本文所用的术语“包含”不应理解为限制性意义。术语还表示可能存在比所指的实际项目更多的内容，例如，如果指的是包括某些步骤的方法，则不应排除进一步步骤的存在。然而，该术语还涵盖仅存在所指项目的实施方案，即其具有“由…组成”的意义上限制性含义。

因此，本发明提供了一种可用于在实验室和工业规模发酵过程中培养芽孢杆菌属宿主细胞的方法。本发明所称的“工业发酵”是指其中每升初始发酵培养基至少加入200g碳源的培养方法，通常所述碳源称作主要碳源。优选地，所述主要碳源定义为由所述宿主细胞消耗的碳的主要来源。

“碳的主要来源”或“主要碳源”通常是指代表基于在培养期间存在、通常于进料溶液和/或初始发酵培养基中存在，更通常于第一和/或第二培养阶段和/或随后的培养阶段中存在的碳水化合物和/或碳源的质量比例的碳的主要来源。术语“碳源”通常被理解为由生物体代谢的化合物，作为用于构建其生物量和/或其生长的碳的来源。合适的碳源包括例如有机化合物如碳水化合物。

根据本发明的方法还可以包括进一步的步骤。这些进一步的步骤可以包括终止培养和/或通过适当的纯化技术从芽孢杆菌属宿主细胞培养物中获得如感兴趣的蛋白质等产物。优选地，本发明的方法进一步包括从步骤(c)后获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物中获得感兴趣的蛋白质的步骤。

如本文所用，术语“培养”或“培育”是指使包含在培养物中的芽孢杆菌属细胞保持存活和/或繁殖至少预定的时间。该术语涵盖接种后生长开始时的指数细胞生长阶段以及静止生长阶段。

在本发明的方法中，作为第一步，用芽孢杆菌属宿主细胞接种发酵培养基，所述芽孢杆菌属宿主细胞包含编码感兴趣的蛋白质的基因的表达构建体。

如本文所用，术语“接种”是指将芽孢杆菌属宿主细胞引入培养所用的发酵培养基中。可以通过引入预培养物(起始培养物)的芽孢杆菌属宿主细胞来实现用芽孢杆菌属宿主细胞接种发酵培养基。优选地，所述发酵用已经在本领域技术人员已知的条件下生长的预培养物接种。所述预培养物可以通过在预培养培养基中培养所述细胞而获得，所述预培养培养基可以是化学上确定的预培养基或复合预培养基。所述预培养培养基可以与本发明方法中用于培养的发酵培养基相同或不同。所述复合预培养培养基可含有复合氮源和/或复合碳源。优选地，用于接种的预培养物通过使用复合培养基获得。可以将预培养物全部或部分加入主要发酵培养基中。优选地，所述预培养物中的芽孢杆菌属宿主细胞是活跃生长的细胞，即其处于细胞数量增加的阶段。通常，预培养物中的细胞在接种预培养物后处于迟缓期并随时间切换到指数生长期。优选地，来自预培养物的指数生长期的细胞用于接种发酵培养基。用于接种的预培养物与主要发酵培养基之间的体积比优选在0.1％和30％(v/v)之间。

术语“芽孢杆菌属宿主细胞”是指芽孢杆菌属细胞，其充当编码感兴趣的蛋白质的基因的表达构建体的宿主。所述表达构建体可以是天然存在的表达构建体、重组引入的表达构建体或已经在芽孢杆菌属细胞中遗传修饰的天然存在的表达构建体。芽孢杆菌属宿主细胞可以是来自芽孢杆菌属(Bacillus)的任何成员的宿主细胞，优选地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、Bacillus jautus、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)或贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的宿主细胞。更优选地，芽孢杆菌属宿主细胞是地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌属宿主细胞，甚至更优选地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌属宿主细胞，最优选地衣芽孢杆菌属宿主细胞。特别优选地，地衣芽孢杆菌选自：美国典型培养物保藏中心号ATCC 14580、ATCC 31972、ATCC 53757、ATCC 53926、ATCC 55768和DSMZ号(德国微生物和细胞培养物保藏中心GmbH)DSM 13、DSM 394、DSM 641、DSM 1913、DSM 11259和DSM26543。

通常，所述宿主细胞属于地衣芽孢杆菌物种，例如地衣芽孢杆菌菌株ATCC 14580的宿主细胞(与DSM 13相同，见Veith et al."The complete genome sequence ofBacillus licheniformis DSM 13,an organism with great industrial potential."J.Mol.Microbiol.Biotechnol.(2004)7:204-211)。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株ATCC 53926的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株ATCC 31972的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株ATCC 53757的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株ATCC 53926的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株ATCC 55768的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株DSM 394的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株DSM 641的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株DSM 1913的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株DSM 11259的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株DSM 26543的宿主细胞。

用于本发明方法的芽孢杆菌属宿主细胞应包含编码由所述宿主细胞表达的感兴趣的蛋白质的基因的表达构建体。如本文所用，术语“表达构建体”是指包含编码感兴趣的蛋白质的核酸序列的多核苷酸，该核酸序列可操作地连接于表达控制序列，例如启动子。通常，用于根据本发明的方法的表达构建体可至少包含与启动子可操作连接的编码感兴趣的蛋白质的核酸序列。

如本文所用，启动子是位于基因上游的核苷酸序列，与能够转录所述基因的基因在同一链上。启动子的活性(也称为启动子活性)在本文中被理解为启动子能够并启动所述基因转录的能力，换言之，其被理解为启动子驱动基因表达的能力。启动子之后是基因的转录起始位点。启动子通常与启动转录的所需转录因子一起被RNA聚合酶识别。启动子的功能片段或功能变体是可被RNA聚合酶识别并能够启动转录的核苷酸序列。启动子的功能片段或功能变体也涵盖在本发明意义上的启动子中。

启动子可以是诱导物依赖性启动子，其活性依赖于激活信号分子，即诱导分子的存在，或者可以是诱导物非依赖性启动子，即启动子不依赖于发酵培养基中加入的或存在的诱导分子的存在以及是组成型活性的或可以增加活性而与存在于或加入发酵培养基中的诱导分子的存在无关。优选地，所述启动子是诱导物非依赖性启动子。通常，所述宿主细胞在摄取或代谢诱导分子的能力方面未被遗传修饰，优选其中所述宿主细胞不是manP和/或manA缺陷的。

优选地，启动子选自以下的启动子序列：aprE启动子(来自编码枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因的天然启动子)，来自解淀粉芽孢杆菌的amyQ启动子，来自地衣芽孢杆菌的amyL启动子及其变体(优选如US5698415所述)，噬菌体SPO1启动子，例如启动子PE4、PE5或P15(优选如WO2015118126或Stewart,C.R.,Gaslightwala,I.,Hinata,K.,Krolikowski,K.A.,Needleman,D.S.,Peng,A.S.,Peterman,M.A.,Tobias,A.,and Wei,P.1998,Genes and regulatory sites of the"host-takeover module"in the terminalredundancy of Bacillus subtilis bacteriophage SPO1.Virology 246(2),329-340中所述)，来自苏云金芽孢杆菌的cryIIIA启动子(优选如WO9425612或Agaisse,H.andLereclus,D.1994.Structural and functional analysis of the promoter regioninvolved in full expression of the cryIIIA toxin gene of Bacillusthuringiensis.Mol.Microbiol.13(1).97-107.所述)，及其组合，以及其活性片段或变体。

优选地，所述启动子序列可以与宿主细胞天然或异源的5’-UTR序列组合，如本文所述。优选地，所述启动子是诱导物非依赖性启动子。更优选地，所述启动子选自：veg启动子，lepA启动子，serA启动子，ymdA启动子，fba启动子，aprE启动子，amyQ启动子，amyL启动子，噬菌体SPO1启动子，cryIIIA启动子，其组合，以及其活性片段或变体。甚至更优选地，所述启动子序列选自aprE启动子、amyL启动子、veg启动子、噬菌体SPO1启动子和cryIIIA启动子，及其组合，或其活性片段或变体。甚至更优选地，所述启动子选自：aprE启动子，SPO1启动子例如PE4、PE5或P15(优选如WO15118126所述)，包含启动子序列amyl和amyQ的串联启动子(优选如WO9943835所述)，以及包含启动子序列amyL、amyQ和cryIIIa的三重启动子(优选如WO2005098016所述)。最优选地，所述启动子是aprE启动子，优选来自以下细菌的aprE启动子：解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜盐芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌，更优选来自地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌，最优选来自地衣芽孢杆菌。

使用本文上述诱导物非依赖性启动子可能是有利的，因为其允许在整个发酵过程中持续表达感兴趣的基因，从而导致连续且稳定的蛋白质产生，而不需要诱导分子。因此，使用诱导物非依赖性启动子可能有助于改善感兴趣的蛋白质的产量。

应当理解，根据本发明的方法使用的启动子的活性优选不依赖于热诱导元件。因此，根据本发明用作表达控制序列的启动子优选是温度不敏感启动子和/或缺少热诱导元件。

相反，“诱导物依赖性启动子”在本文中被理解为在将“诱导分子”加入发酵培养基时其活性增加以使得能够转录与该启动子可操作地连接的基因的启动子。因此，对于诱导物依赖性启动子，所述诱导分子的存在通过信号转导触发与所述启动子可操作地连接的基因表达增加。由于存在诱导分子而激活之前的基因表达不需要不存在，但也可以以低水平的基础基因表达存在，在加入诱导分子后增加。“诱导分子”是存在于发酵培养基中的分子，通过增加与基因可操作地连接的诱导物依赖性启动子的活性而能实现所述基因表达的增加。本领域已知的诱导分子包括碳水化合物或其类似物，其可以作为除了主要碳源例如葡萄糖之外的次级碳源。通常，芽孢杆菌属宿主细胞在其摄取或代谢诱导分子的能力方面未被遗传修饰，更通常地，所述芽孢杆菌属宿主细胞不是manP和/或manA缺陷的。

优选地，根据本发明的培养方法在不加入次级碳源如甘露糖、蔗糖、β-葡萄糖苷、低聚-β-葡萄糖苷、果糖、甘露醇、乳糖、异乳糖、异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、L-阿拉伯糖、木糖的条件下进行。甚至更优选地，所述发酵培养基不含任何次级碳源。

此外，所述表达构建体可包含正确终止翻译所需的其它元件或所述表达构建体的插入、稳定、引入宿主细胞或复制所需的元件。这种序列尤其涵盖5’-UTR(也称为前导序列)、核糖体结合位点(RBS，Shine-Dalgarno序列)、3’-UTR、转录起始和终止位点，取决于所述表达构建体的性质，还涵盖复制起点、整合位点等。优选地，所述核酸构建体和/或表达载体包含5’-UTR和RBS。优选地，5’-UTR选自aprE、grpE、ctoG、SP82、gsiB、cryIIa和ribG基因的基因控制序列。

然而，所述表达构建体还应包含编码感兴趣的蛋白质的核酸序列。如本文所用，“感兴趣的蛋白质”是指旨在在芽孢杆菌属宿主细胞中产生的任何蛋白质、肽或其片段。因此，蛋白质包括多肽、肽、其片段以及融合蛋白等。

优选地，所述感兴趣的蛋白质是酶。在一个特定的实施方案中，所述酶被分类为氧化还原酶(EC 1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)、异构酶(EC 5)或连接酶(EC6)(EC-编号根据Enzyme Nomenclature,Recommendations(1992)of the NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology，包括其在1993-1999年公布的增补)。在一个优选的实施方案中，所述感兴趣的蛋白质是适用于洗涤剂中的酶。

更优选地，所述酶是水解酶(EC 3)，甚至更优选是糖苷酶(EC 3.2)，还甚至更优选是糖苷酶(EC 3.2)。特别优选的酶是选自淀粉酶(特别是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1))、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、乳糖酶(EC 3.2.1.108)、甘露聚糖酶(EC 3.2.1.25)、脂肪酶(EC3.1.1.3)、植酸酶(EC 3.1.3.8)和核酸酶(EC 3.1.11至EC 3.1.31)的酶；特别是选自淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、葡糖淀粉酶、核酸酶和纤维素酶的酶，优选淀粉酶或甘露聚糖酶。甚至更优选地，所述酶是选自甘露聚糖酶和淀粉酶的糖苷酶(EC3.2)。

优选地，所述感兴趣的蛋白质被分泌到发酵培养基中。所述感兴趣的蛋白质分泌到发酵培养基中通常可以促进所述感兴趣的蛋白质与发酵培养基的分离。为了使感兴趣的蛋白质分泌到发酵培养基中，所述核酸构建体可以包含编码信号肽的多核苷酸，该信号肽指导感兴趣的蛋白质分泌到发酵培养基中。本领域已知多种信号肽。优选的信号肽选自枯草芽孢杆菌的AprE蛋白的信号肽或枯草芽孢杆菌的YvcE蛋白的信号肽。

特别适合从芽孢杆菌细胞将酶如淀粉酶分泌到发酵培养基中的信号肽是枯草芽孢杆菌的AprE蛋白的信号肽或枯草芽孢杆菌的YvcE蛋白的信号肽。由于YvcE信号肽适于分泌多种不同的酶，包括淀粉酶，因此可以使用这种信号肽，优选与本文所述的发酵过程联合使用。

应当理解，每个表达控制序列、编码感兴趣的蛋白质的核酸序列和/或上述另外的元件可以来自芽孢杆菌属宿主细胞或可以来自另一个物种，即与所述芽孢杆菌属宿主细胞是异源的。

此外，所述表达构建体可以是感兴趣的基因和表达控制序列和/或如前述的其它元件的排列，其是天然的，即内源性存在于芽孢杆菌属宿主细胞的基因组中。此外，该术语还涵盖这种天然表达构建体，其已例如通过基因组编辑和/或诱变技术被遗传操作。

所述表达构建体也可以是外源引入的表达构建体。在外源引入的表达构建体中，所述表达控制序列、编码感兴趣的蛋白质的基因和/或其它元件对于所述宿主细胞可以是天然的或可以源自其它物种，即对于芽孢杆菌属宿主细胞是异源的。根据本发明可以通过本领域已知的任何方法将表达构建体引入芽孢杆菌属宿主细胞，所述方法包括尤其是熟知的转化、转染、转导和接合技术等。优选地，外源引入的表达构建体包含在载体、优选表达载体中。所述表达载体可以优选位于芽孢杆菌属宿主细胞的染色体DNA之外，即以一个或多个拷贝以游离形式存在。然而，所述表达载体也可以优选以一个或多个拷贝整合到芽孢杆菌细胞的染色体DNA中。所述表达载体可以是线性的或环状的。优选地，所述表达载体是病毒载体或质粒。

对于自主复制，所述表达载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点包括但不限于允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pC194、pTB19、pAMβ1和pTA1060(Janniere,L.,Bruand,C.,and Ehrlich,S.D.(1990).Structurally stable Bacillus subtilis cloning vectors.Gene 87,53-6；Ehrlich,S.D.,Bruand,C.,Sozhamannan,S.,Dabert,P.,Gros,M.F.,Janniere,L.,and Gruss,A.(1991).Plasmid replication and structural stability in Bacillussubtilis.Res.Microbiol.142,869-873)和pE194(Dempsey,L.A.and Dubnau,D.A.(1989).Localization of the replication origin of plasmid pE194.J.Bacteriol.171,2866-2869)的复制起点。复制起点可以是具有突变以使其功能在宿主细胞中对温度敏感的复制起点(见例如Ehrlich,1978,Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75:1433-1436)。然而，所述表达载体优选地包含一种或多种允许容易选择转化的芽孢杆菌属宿主细胞的选择标记。选择标记是编码产物的基因，所述产物提供杀生物剂抗性、重金属抗性、原养型至营养缺陷型等。细菌选择标记包括但不限于来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。此外，选择可以通过共转化完成，例如如WO9109129所述，其中选择标记位于单独的载体上。

本发明的方法进一步包括在有利于芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的条件下在所述发酵培养基中培养芽孢杆菌属宿主细胞的第一培养阶段的步骤，其中所述培养芽孢杆菌属宿主细胞包括加入至少一种进料溶液并且其中第一培养阶段期间的培养在第一温度进行。

如本文所用，术语“第一培养阶段”是指在第一温度进行培养的第一时间段。所述时间段可以是预定的或可变的，取决于培养物的参数，例如细菌生长速率、碳源消耗速率、已经提供给发酵培养基的碳源的量等。所述至少一种进料溶液应以增加的速率、优选地以指数增加的速率提供碳源。优选地，所述至少一种进料溶液在发酵期间、通常在第一培养阶段和/或第二培养阶段提供包含碳水化合物的主要碳源。更优选地，所述主要碳源是葡萄糖。所述时间段可以是预定的或可变的，取决于培养参数，例如细菌生长速率、碳源消耗速率、已经提供给发酵培养基的碳源的量等。优选地，所述第一培养阶段进行至少约3小时至约48小时，优选约22小时。或者，所述培养可以一直进行直至至少一种进料溶液提供了预定的碳源总量。优选地，所述至少一种进料溶液以指数增加的速率提供碳源，指数因子为至少约0.13h^-1，起始量为每升每小时至少约1g的所述至少一种碳源。进一步优选地，在第一培养阶段期间加入总量为至少约50g或更多的所述至少一种碳源/kg最初存在于步骤b)中的芽孢杆菌属宿主细胞培养物。进一步的细节见于下文伴随实施例。本领域技术人员熟知如何确定第一培养阶段的时间。在允许芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的条件下，在所述第一培养阶段培养芽孢杆菌属宿主细胞。

如本文所用，术语“发酵培养基”是指含有一种或多种可以支持细胞生长的化合物的水基溶液。优选地，根据本发明的发酵培养基是复合发酵培养基或化学上确定的发酵培养基。

如本文所用，复合发酵培养基是指包含占所述发酵培养基的0.5％至30％(w/v)量的复合营养源的发酵培养基。复合营养源是由化学上不确定的化合物组成的营养源，即化学式未知的化合物，优选包含不确定的有机含氮和/或含碳化合物。与之相反，“化学上确定的营养源”(例如“化学上确定的碳源”或“化学上确定的氮源”)被理解为是指由化学上确定的化合物组成的营养源。化学上确定的组分是通过其化学式已知的组分。复合氮源是由一种或多种化学上不确定的含氮化合物组成的营养源，即化学式未知的含氮化合物，优选包含有机含氮化合物，例如组成成分未知的蛋白质和/或氨基酸。复合碳源是由一种或多种化学上不确定的含碳化合物组成的碳源，即其化学式未知的含碳化合物，优选包含有机含碳化合物，例如组成成分未知的碳水化合物。技术人员清楚的是，复合营养源可以是不同复合营养源的混合物。因此，复合氮源可包含复合碳源，反之亦然，并且复合氮源可被细胞以其作为碳源起作用的方式代谢，反之亦然。

优选地，所述复合营养源是复合氮源。复合氮源包括但不限于含蛋白质的物质，例如微生物、动物或植物细胞的提取物，例如植物蛋白制剂、大豆粉、玉米粉、豌豆粉、玉米麸质、棉粕、花生粉、马铃薯粉、肉、酪蛋白、明胶、乳清、鱼粉、酵母蛋白、酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、细菌胰蛋白胨、细菌蛋白胨、微生物细胞、植物、肉类或动物体加工产生的废物，以及其组合。在一个实施方案中，复合氮源选自植物蛋白，优选马铃薯蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、花生蛋白、棉花蛋白和/或豌豆蛋白、酪蛋白、胰蛋白胨、蛋白胨和酵母提取物及其组合。

优选地，发酵培养基还可以包含确定的培养基组分。优选地，发酵培养基还包含确定的氮源。无机氮源的实例是铵、硝酸盐和亚硝酸盐，以及其组合。在一个优选的实施方案中，发酵培养基包含氮源，其中氮源是复合或确定的氮源或其组合。在一个实施方案中，确定的氮源选自氨、铵、铵盐(例如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵、乙酸铵)、尿素、硝酸、硝酸盐、亚硝酸盐和氨基酸，优选谷氨酸，及其组合。

优选地，复合营养源的量为发酵培养基的2％至15％(v/w)。在另一个实施方案中，复合营养源的量为发酵培养基的3％至10％(v/w)。

还优选地，复合发酵培养基还可以包含碳源。所述碳源优选是复合或确定的碳源或其组合。优选地，复合营养源包含碳水化合物源。各种糖和含糖物质是合适的碳源，并且糖可以存在于聚合的不同阶段。用于本发明的优选复合碳源选自糖蜜、玉米浸浆、蔗糖、糊精、淀粉、淀粉水解产物和纤维素水解产物，以及其组合。优选的确定的碳源选自碳水化合物、有机酸和醇，优选葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、甘油、肌醇、甘露醇和山梨糖醇，以及其组合。优选地，确定的碳源以糖浆的形式提供，其可包含最多20％、优选最多10％、更优选最多5％的杂质。在一个实施方案中，碳源是甜菜糖浆、甘蔗糖浆、玉米糖浆，优选高果糖玉米糖浆。在另一个实施方案中，复合碳源选自糖蜜、玉米浸浆、糊精和淀粉或其组合，并且其中确定的碳源选自葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、乳糖或其组合。

优选地，所述发酵培养基是包含复合氮源和复合碳源的复合培养基。更优选地，所述发酵培养基是包含复合氮源和碳源的复合培养基，其中复合氮源可以如WO 2004/003216所述被部分水解。

然而，所述发酵培养基通常还可以进一步包含在本文别处描述的氢源、氧源、硫源、磷源、镁源、钠源、钾源、微量元素源和维生素源。

在另一个实施方案中，所述发酵培养基可以是化学上确定的发酵培养基。化学上确定的发酵培养基是基本上由已知浓度的化学上确定的组分组成的发酵培养基。化学上确定的组分是通过其化学式已知的组分。基本上由化学上确定的组分组成的发酵培养基包括不含复合营养源、特别是不含复合碳源和/或复合氮源的培养基，即不含具有化学组成不确定的复合原材料。基本上由化学上确定的组分组成的发酵培养基可以进一步包括包含基本上少量复合营养源例如复合氮源和/或碳源的培养基，其量如下所定义，这通常不足以维持芽孢杆菌属宿主细胞的生长和/或保证形成足量的生物质。

在这方面，复合原材料具有不确定的化学组成，由于例如这些原材料含有许多不同的化合物，其中包括复杂的杂聚化合物，并且由于季节变化和地理来源的差异而具有可变的组成。在发酵中起复合碳源和/或氮源作用的复合原料的典型实例是豆粕、棉籽粕、玉米浸浆、酵母提取物、酪蛋白水解物、糖蜜等。基本上少量的复合碳源和/或氮源可以存在于根据本发明的化学上确定的发酵培养基中，例如作为来自用于主要发酵的接种物的遗留物。用于主要发酵的接种物不一定通过在化学上确定的培养基上发酵获得。大多数情况下，通过在主要发酵的化学上确定的发酵培养基中存在少量复合氮源，可以检测到来自接种物的遗留物。少量的复合培养基组分，如复合碳源和/或氮源，也可以通过向发酵培养基中加入少量这些复合组分而被引入发酵培养基中。在用于主要发酵的接种物的发酵过程中使用复合碳源和/或氮源可能是有利的，例如加速生物质的形成即增加微生物的生长速率和/或促进内部pH控制。出于同样原因，在主要发酵起始阶段加入基本少量的复合碳源和/或氮源例如酵母抽提物可能是有利的，特别是在发酵过程的早期阶段可加速生物质形成。可以在根据本发明的发酵过程中加入化学上确定的发酵培养基中的基本少量的复合营养源被定义为是在发酵过程中加入的相应营养物总量的至多10％的量。特别地，可以加入化学上确定的发酵培养基中的基本少量的复合碳源和/或氮源被定义为在发酵过程中加入的导致总碳量的至多10％的复合碳源的量和/或导致总氮量的至多10％的复合氮源的量，优选导致总碳量的至多5％的复合碳源的量和/或导致总氮量的至多5％的复合氮源的量，更优选在发酵过程中加入的导致总碳量的至多1％的复合碳源的量和/或总氮量的至多1％的复合氮源的量。优选地，在发酵过程中加入的总碳量的至多10％和/或总氮量的至多10％、优选总碳量的至多5％和/或总氮量的至多5％、更优选总碳量的至多1％和/或总氮量的至多1％是通过接种物的遗留物加入的。最优选地，在发酵过程中不向所述发酵培养基中加入复合碳源和/或复合氮源。

如本文所指的化学上确定的营养源例如化学上确定的碳源或化学上确定的氮源被理解为是用于由化学上确定的化合物组成的营养源。

在化学上确定的发酵培养基中培养微生物需要细胞在含有多种化学上确定的营养源的培养基中培养，所述营养源选自化学上确定的氢源、化学上确定的氧源、化学上确定的碳源、化学上确定的氮源、化学上确定的硫源、化学上确定的磷源、化学上确定的镁源、化学上确定的钠源、化学上确定的钾源、化学上确定的微量元素源和化学上确定的维生素源。优选地，化学上确定的碳源选自碳水化合物、有机酸、烃、醇及其混合物。优选的碳水化合物选自葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、乳糖、糊精、麦芽糖糊精、淀粉和菊粉及其混合物。优选的醇选自甘油、甲醇和乙醇、肌醇、甘露醇和山梨醇及其混合物。优选的有机酸选自乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸和高级链烷酸及其混合物。优选地，化学上确定的碳源包括葡萄糖或蔗糖。更优选地，化学上确定的碳源包括葡萄糖，甚至更优选地，主要量的化学上确定的碳源作为葡萄糖提供。

最优选地，化学上确定的碳源是葡萄糖。如本文别处所示，葡萄糖可以是优选的主要碳源。应当理解，化学上确定的碳源可以以糖浆的形式提供，优选以葡萄糖浆的形式提供。如本文所理解的，本文所指的葡萄糖应包括葡萄糖浆。葡萄糖浆是具有高浓度糖的粘稠糖溶液。葡萄糖浆中的糖主要是葡萄糖，还有少量的麦芽糖和麦芽三糖，其浓度取决于糖浆的质量等级而变化。优选地，除了葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖之外，糖浆可以包含至多10％、优选至多5％、更优选至多3％的杂质。优选地，所述葡萄糖浆来自玉米。

化学上确定的氮源优选选自尿素、氨、硝酸、硝酸盐、亚硝酸盐、铵盐如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵和硝酸铵，以及氨基酸如谷氨酸或赖氨酸及其组合。更优选地，化学上确定的氮源选自氨、硫酸铵和磷酸铵。最优选地，化学上确定的氮源是氨。使用氨作为化学上确定的氮源的优点是氨还可以充当pH控制剂。

如下所述，可以将其它化合物加入复合和化学上确定的发酵培养基中。

通常在细胞培养期间通过搅拌和/或通气使发酵培养基充气来提供氧气。通常由于水相发酵培养基中存在水而提供氢。然而，氢和氧也包含在碳源和/或氮源中并且可以那样方式提供。

可以通过一种或多种镁盐将镁提供给发酵培养基，所述镁盐优选选自氯化镁、硫酸镁、硝酸镁、磷酸镁及其组合，或通过氢氧化镁、或通过一种或多种镁盐和氢氧化镁的组合提供。

可以通过一种或多种钠盐将钠加入发酵培养基中，所述钠盐优选选自氯化钠、硝酸钠、硫酸钠、磷酸钠、氢氧化钠及其组合。

可以通过一种或多种钙盐将钙加入发酵培养基中，所述钙盐优选选自硫酸钙、氯化钙、硝酸钙、磷酸钙、氢氧化钙及其组合。

可以通过一种或多种钾盐将钾加入化学上确定的形式的发酵培养基中，所述钾盐优选选自氯化钾、硝酸钾、硫酸钾、磷酸钾、氢氧化钾及其组合。

可以通过一种或多种含磷盐将磷加入发酵培养基中，所述含磷盐优选选自磷酸钾、磷酸钠、磷酸镁、磷酸及其组合。优选地，每升初始发酵培养基加入至少1g磷。

可以通过一种或多种含硫盐将硫加入发酵培养基中，所述含硫盐优选选自硫酸钾、硫酸钠、硫酸镁、硫酸及其组合。

优选地，所述发酵培养基和/或初始发酵培养基包含选自以下一组的一或多种组分：

每升发酵培养基0.1至50克氮；

每升发酵培养基1至6克磷；

每升发酵培养基0.15至2克硫；

每升发酵培养基0.4至8克钾；

每升发酵培养基0.01至2克钠；

每升发酵培养基0.01至3克钙；和

每升发酵培养基0.1至10克镁。

通常，进料溶液与发酵培养基和/或初始发酵培养基的不同之处在于上面列出的所述组中的一或多种化合物。甚至更典型地，进料溶液与发酵培养基和/或初始发酵培养基的不同之处在于上面列出的所述组中的一或多种化合物的量。

可以将一种或多种微量元素离子加入发酵培养基，优选每种离子的量低于10mmol/L初始发酵培养基。这些微量元素离子选自铁、铜、锰、锌、钴、镍、钼、硒和硼及其组合。优选地，将微量元素离子铁、铜、锰、锌、钴、镍和钼加入发酵培养基中。优选地，所述一种或多种微量元素离子以选自以下的量加入发酵培养基中：50μmol至5mmol铁/升初始培养基，40μmol至4mmol铜/升初始培养基，30μmol至3mmol锰/升初始培养基，20μmol至2mmol锌/升初始培养基，1μmol至100μmol钴/升初始培养基，2μmol至200μmol镍/升初始培养基，以及0.3μmol至30μmol钼/升初始培养基及其组合。为了加入每种微量元素，优选可以使用选自氯化物、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐的一种或多种。

可任选包括在发酵培养基中的化合物是螯合剂，例如柠檬酸、MGDA、NTA或GLDA，以及缓冲剂，例如磷酸一钾和磷酸二钾、碳酸钙等。当发酵过程没有外部pH控制时，优选加入缓冲剂。此外，可以在发酵过程之前和/或期间加入消泡剂。

维生素是指一组结构上不相关的有机化合物，是细胞正常代谢所需的。众所周知，细胞合成其所需维生素的能力差异很大。应在不能合成所述维生素的芽孢杆菌细胞的发酵培养基中加入维生素。维生素可选自硫胺素、核黄素、吡哆醛、烟酸或烟酰胺、泛酸、氰钴胺、叶酸、生物素、硫辛酸、嘌呤、嘧啶、肌醇、胆碱和氯化血红素。

优选地，所述发酵培养基还包含选择剂，例如抗生素，如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、潮霉素、博来霉素、氯霉素、链霉素或腐草霉素，细胞的选择标记提供对其的抗性。

加入到培养基中的必需化合物的量将主要取决于发酵过程中要形成的生物质的量。形成的生物质的量可以广泛变化，通常生物质的量为约10至约150g干细胞物质/升发酵液。通常，对于蛋白质生产，发酵产生的生物质的量低于约10g干细胞质量/升发酵液被认为不具有工业相关性。

确定的培养基中每种成分的最佳量以及哪些化合物是必需的，哪些是非必需的，将取决于在培养基中发酵的芽孢杆菌细胞的类型、待形成的生物质的量和待形成的产物。通常，为微生物细胞生长所必需的培养基组分的量可以相对于发酵中使用的碳源量而确定，通常相对于主要碳源量，因为形成的生物质的量将主要由使用的碳源量决定。

特别优选的发酵培养基也在下面的实施例中描述。

优选地，将发酵培养基在使用前灭菌以防止或减少发酵过程中不同于接种的微生物细胞的微生物的生长。可以用本领域已知的方法进行灭菌，例如但不限于高压灭菌或无菌过滤。一些或所有培养基组分可以与其它培养基组分分开灭菌以避免培养基组分在灭菌处理期间相互作用或避免培养基组分在灭菌条件下分解。

短语“有利于芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的条件”是指用于培养的温度或发酵培养基以外的条件。这样的条件包括培养期间的pH、通过摇动或搅拌的培养物的物理运动和/或施加于培养物的大气条件。

可以调节或维持培养期间所述发酵培养基的pH。优选地，在接种之前调节所述培养基的pH。为发酵培养基设想的优选pH值在约pH 6.6至约pH 9的范围内，优选在约pH 6.6至约pH 8.5的范围内，更优选在约pH 6.8至约pH 8.5的范围内，最优选在约pH6.8至约pH8.0的范围内。例如，对于芽孢杆菌细胞宿主细胞培养物，优选将pH调节至或高于约pH 6.8、约pH 7.0、约pH 7.2、约pH 7.4或约pH 7.6。优选地，在芽孢杆菌属宿主细胞培养物的培养期间中将发酵培养基的pH调节至约pH 6.8至约pH 9范围内，优选约pH 6.8至约pH 8.5，更优选约pH 7.0至约pH 8.5，最优选约pH 7.2至约pH 8.0。

可以通过搅拌和/或摇动所述发酵培养基来施加物理运动。优选地，所述发酵培养基的搅拌以约50至约2000rpm、优选以约50至约1600rpm、进一步优选以约800至约1400rpm、更优选以约50至约200rpm进行。

除了搅拌，氧气和/或其它气体可以通过调节合适的大气条件施加于培养物中。优选地，氧气以0至3bar的空气或氧气供应。

此外，包括选择合适的生物反应器或容器用于芽孢杆菌属宿主细胞培养的其它条件是本领域众所周知的并且可以由熟练的技术人员不费力地制定。

如本文所用，术语“进料溶液”是指在用芽孢杆菌属宿主细胞接种初始发酵培养基后加入所述发酵培养基中的溶液。所述初始发酵培养基通常是指在接种芽孢杆菌属宿主细胞时存在于发酵罐中的发酵培养基。所述进料溶液包含支持所述细胞生长的化合物。与发酵培养基相比，进料溶液可以富含一种或多种化合物。

例如当培养以分批补料模式运行时，使用的进料培养基或进料溶液可以是任何上述培养基组分或其组合。在本文中应理解，作为进料溶液提供的至少部分化合物在所述化合物进料之前可以已经以一定程度存在于所述发酵培养基中。优选地，所述进料溶液通常在第一培养阶段和/或第二培养阶段提供包含至少一种碳水化合物的主要碳源。更优选地，包含在进料溶液中的碳水化合物代表宿主细胞消耗或代谢的碳的主要来源。还更优选地，进料溶液包含化学上确定的碳源，优选葡萄糖。甚至更优选地，进料溶液包含40％至60％的葡萄糖，优选42％至58％的葡萄糖，更优选45％至55％的葡萄糖，甚至更优选47％至52％的葡萄糖并且最优选50％的葡萄糖。甚至更优选地，葡萄糖是存在于进料溶液和/或发酵培养基中的主要碳源。通常，相同的进料溶液可用于以分批补料模式运行的种子发酵罐和生产生物反应器中。用于以分批补料模式运行的种子发酵罐中的进料溶液可能不同于生产生物反应器中使用的进料溶液。然而，用于以分批补料模式运行的种子发酵罐中的进料溶液和用于生产生物反应器的进料溶液可以具有相同浓度的葡萄糖，但用于生产生物反应器的进料溶液含有在用于以分批补料模式运行的种子发酵罐中的进料溶液中不存在的盐。

本领域已知各种进料模式。在发酵过程期间可以连续或不连续地加入进料溶液。不连续加入进料溶液可以是在发酵过程期间以单次推注的形式加入一次，或者以不同或相同的体积加入多次。连续加入进料溶液可以是在发酵过程期间以相同或不同速率(即体积/时间)加入。也可以在发酵过程期间应用连续和不连续进料模式的组合。可以将作为进料溶液提供的发酵培养基的组分可以在一种进料溶液中加入或作为不同的进料溶液加入。在应用多于一种进料溶液的情况下，所述进料溶液可具有与上述相同或不同的进料模式。

特别优选的进料溶液也在下面的实施例中描述。

如本文所用，术语“第一温度”是指在第一培养阶段期间用于培养芽孢杆菌属宿主细胞培养物的温度。应当理解，在第一培养阶段期间持续应用第一温度。此外，第一温度应当是允许芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的温度。优选地，所述第一温度在约28℃至约32℃、约29℃至约31℃的范围内，优选约30℃。

本发明的方法还包括在有利于芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的条件下培养前一步骤中获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物的第二培养阶段步骤，其中所述培养包括加入至少一种进料溶液并且其中在第二培养阶段期间的培养在第二温度进行，所述第二温度高于第一温度。

如本文所用，术语“第二培养阶段”是指在第二温度进行培养的第二个时间段。所述时间段可以是预定的或可变的，取决于培养参数，例如细菌生长速率、碳源消耗速率、已经提供给发酵培养基的碳源的量等。所述至少一种进料溶液应以恒定速率、渐减的速率或小于在第一培养阶段期间应用的速率的渐增的速率提供碳源。然而，所述恒定速率或所述渐减的速率的起始速率或所述小于步骤(b)中的速率的渐增的速率的起始速率低于第一培养阶段的最大速率。优选地，本文所指的由进料溶液提供的碳源速率的增加程度可以通过比较单独或持续施加的进料溶液量并确定例如所述增加的因子来确定。通过比较进料溶液提供的碳源在第一培养阶段和第二培养阶段的增长因子，可以判断第二培养阶段提供的所述碳源是否以增加小于第一培养阶段的速率提供。所述第二时间段可以是预定的或可变的，取决于培养参数，例如细菌生长速率、碳源消耗速率、已经提供给发酵培养基的碳源的量等。在第二培养阶段，当至少一种补料溶液以恒定速率提供碳源时，芽孢杆菌属宿主细胞培养物应持续生长。优选地，所述第二培养阶段进行至少约3小时直至约120小时、至少约3小时直至约96小时、至少约40小时直至约120小时或优选地至少约40小时直至约96小时。本领域技术人员熟知如何确定第二培养阶段的时间段。优选地，所述至少一种进料溶液以恒定速率提供碳源，该速率优选为在第一培养阶段中应用的至少一种碳源的最大进料速率的约70％至约20％的范围内，优选在约50％至约30％的范围内，或更优选为约35％。在允许芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的条件下，在所述第二培养阶段培养芽孢杆菌属宿主细胞。

如本文所用，术语“第二温度”是指在第二培养阶段期间用于培养芽孢杆菌属宿主细胞培养物的温度。应当理解，在第二培养阶段期间持续应用第二温度。此外，第二温度应当是允许芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的温度。优选地，所述第二温度在约33℃至约37℃、约34℃至约36℃的范围内，或优选为约35℃。

所述第二温度应高于第一温度。优选地，所述第一温度和第二温度相差约3℃至约7℃、约4℃至约6℃，或优选相差约5℃。

优选地，第二培养阶段相对于第一培养阶段的温度升高导致感兴趣的蛋白质产量增加。更优选地，与通过实施根据本发明的其中所述第一温度和第二温度相同的方法获得的对照相比，在步骤c)之后获得的感兴趣的蛋白质的产量显著增加。更优选地，所述产量增加至少40％、至少60％、至少80％、至少100％、至少200％、至少300％或至少400％。

产量的增加可以根据感兴趣的蛋白质通过允许对感兴趣的蛋白质进行特定量化的任何技术来确定。一些技术在本文别处被提及。如本文所指，所述增加是与对照相比的增加。所述对照优选地是通过具有本发明方法步骤的方法培养的芽孢杆菌属宿主细胞培养物，并且其中所述第一温度和所述第二温度相同，即在步骤b)和步骤c)之间没有提高温度的方法。因此，为了确定产量的增加，在已经根据本发明的方法培养的芽孢杆菌属宿主细胞培养物和对照芽孢杆菌属宿主细胞培养物中测定感兴趣的蛋白质的量。将两个确定的量相互比较以计算产量的增加。这种产量增加是否具有统计学显著性可以通过本领域技术人员熟知的各种统计检验确定。典型的检验是Student’s t-检验或Mann-Whitney U检验。

在第二培养阶段完成后，即在步骤c)之后，可以进一步处理所述芽孢杆菌属宿主细胞培养物。优选地，感兴趣的蛋白质从所述芽孢杆菌属宿主细胞培养物中获得。更优选地，感兴趣的蛋白质通过纯化从芽孢杆菌属宿主细胞培养物中获得。

根据感兴趣的蛋白质的性质，可以选择合适的技术。例如，如果感兴趣的蛋白质被分泌到发酵液中，则可以从培养物中分离芽孢杆菌细胞并且可以从发酵液的液体部分中纯化感兴趣的蛋白质。如果感兴趣的蛋白质是细胞蛋白质，即存在于芽孢杆菌属宿主细胞内，则可以通过将芽孢杆菌属宿主细胞与发酵液分离，随后裂解所述宿主细胞并从裂解的芽孢杆菌属宿主细胞培养物中纯化感兴趣的蛋白质来纯化。或者，可裂解在步骤c)后存在于培养物中的芽孢杆菌属宿主细胞并且可在发酵液中从裂解的芽孢杆菌属宿主细胞中纯化感兴趣的蛋白质。

感兴趣的蛋白质的纯化可取决于所选择的技术，包括物理分离步骤，例如离心、蒸发、冷冻干燥、过滤(特别是超滤)、电泳(制备型SDS PAGE或等电聚焦电泳)、超声，和/或压力或化学处理，例如化学沉淀、结晶、提取和/或酶处理。也可以应用色谱法(例如离子交换色谱法、疏水色谱法、色谱聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)。也可以使用亲和层析，包括基于抗体的亲和层析或使用纯化标签的技术。合适的技术是本领域熟知的并且技术人员可以根据感兴趣的蛋白质来应用而无需进一步的劳动。

此外，本发明的方法还可以包括进一步的处理，包括处理如前所述纯化的感兴趣的蛋白质。这样的处理可以包括改进纯化的化学和/或物理处理，例如针对感兴趣的蛋白质添加消泡剂或稳定剂。本发明的方法还可以包括获得包含感兴趣的蛋白质的商业产品或制品特别是胶囊、颗粒、粉末、液体等的生产步骤。

优选地，本发明的方法可用于制备包含感兴趣的蛋白质的纯化或部分纯化的组合物。更优选地，本发明的方法提供纯化或部分纯化形式的感兴趣的蛋白质。

有利地，在基于本发明的实验中已经发现，当培养芽孢杆菌属宿主细胞生产感兴趣的蛋白质时，在第二阶段使用提高的培养温度的两阶段培养增加在所述培养的芽孢杆菌细胞中感兴趣蛋白质的生产。特别地，发现在所述第一培养阶段和所述第二培养阶段之间约5℃的温度变化能够显著增加芽孢杆菌属宿主细胞产生的感兴趣的蛋白质的产量，并且通常且依赖于芽孢杆菌属细胞和感兴趣的蛋白质，与未经历温度变化的对照培养相比产量增加在至少40％直至至少400％的范围内。这种通过温度变化实现的效果应是对培养的芽孢杆菌属宿主细胞中基因表达的一般效果并且应与特定表达控制序列的使用无关。因此，由于本发明，针对微生物生产感兴趣的蛋白质的发酵过程的产量可以通过普遍适用的培养方法提高。所述方法可以很容易地包括到现有的生产方案中并且只需要改变单个参数，即在培养过程期间应用的温度。

上述术语的解释和阐述经过必要的修正适用于下文描述的实施方案。

以下实施方案是本发明方法的优选实施方案。

在本发明方法的一个优选实施方案中，所述方法进一步包括从步骤(c)之后获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物中获得感兴趣的蛋白质。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述第一培养阶段进行至少约3小时直至约48小时的时间。

在本发明方法的一个优选实施方案中，在第一培养阶段期间，至少一种进料溶液以增加的速率、优选指数增加的速率提供碳源。优选地，在第一培养阶段期间，所述至少一种进料溶液以至少约0.13h^-1的指数因子和至少约1g的所述至少一种碳源的起始量以指数增加的速率提供碳源。

在本发明方法的一个优选实施方案中，所述第一培养阶段加入了总量为至少约50g的所述至少一种碳源/kg最初存在于步骤b)中的芽孢杆菌属宿主细胞培养物。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述第二培养阶段进行至少约3小时直至约120小时、至少约3小时直至约96小时、至少约40小时直至约120小时，或优选至少约40小时直至约96小时的时间。

在本发明方法的又一个优选实施方案中，在第二培养阶段期间，所述至少一种进料溶液以恒定速率、渐减的速率或小于步骤(b)中的速率的渐增的速率提供碳源，其中所述恒定速率或所述渐减的速率的起始速率或所述小于步骤(b)中的速率的渐增的速率的起始速率低于第一培养阶段的最大速率。

在本发明方法的一个优选实施方案中，步骤(c)中的所述至少一种进料溶液以恒定速率提供所述碳源。优选地，所述恒定速率低于第一培养阶段的进料速率的最大速率。更优选地，所述恒定速率是在第一培养阶段应用的至少一种碳源的最大进料速率的约70％至约20％的范围内，优选在约50％至约30％的范围内，或更优选约35％。

在本发明方法的优选实施方案中，所述第一温度和所述第二温度相差约3℃至约7℃、约4℃至约6℃或优选相差约5℃。

在本发明方法的一个优选实施方案中，所述第一温度在约28℃至约32℃、约29℃至约31℃的范围内，或优选为约30℃。

在本发明方法的进一步优选的实施方案中，所述第二温度在约33℃至约37℃、约34℃至约36℃的范围内，或优选为约35℃。

在本发明方法的又一个优选实施方案中，与通过实施根据本发明的其中所述第一温度和第二温度是相同的方法获得的对照相比，在步骤c)之后获得的感兴趣的蛋白质的产量显著增加。更优选地，所述产量增加至少40％、至少60％、至少80％、至少100％、至少200％、至少300％或至少400％。

在本发明方法的一个优选实施方案中，所述芽孢杆菌选自：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、Bacillus jautus、迟缓芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌。更优选地，所述芽孢杆菌是地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌，甚至更优选所述芽孢杆菌是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌，并且甚至更优选是地衣芽孢杆菌。

在甚至更优选的实施方案中，所述宿主细胞属于地衣芽孢杆物种，例如地衣芽孢杆菌菌株ATCC 14580的宿主细胞(与DSM 13相同，参见Veith et al."The completegenome sequence of Bacillus licheniformis DSM 13,an organism with greatindustrial potential."J.Mol.Microbiol.Biotechnol.(2004)7:204-211)。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株ATCC 53926的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株ATCC 31972的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株ATCC53757的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株ATCC 53926的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株ATCC 55768的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株DSM 394的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株DSM 641的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株DSM 1913的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株DSM 11259的宿主细胞。或者，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株DSM 26543的宿主细胞。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述编码感兴趣的蛋白质的基因的表达构建体已通过遗传修饰引入芽孢杆菌属宿主细胞中。优选地，所述表达构建体包含一或多个异源核酸。更优选地，所述表达构建体包含在载体、优选表达载体中。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述表达构建体包含内源性存在于所述芽孢杆菌属宿主细胞中的核酸序列。优选地，所述表达构建体包含在芽孢杆菌属宿主细胞的基因组中。更优选地，存在于所述基因组中的所述表达构建体已被遗传修饰。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述表达构建体包含表达控制序列，例如启动子，其控制编码感兴趣的蛋白质的基因在所述芽孢杆菌属宿主细胞中的表达。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述表达构建体至少包含编码感兴趣的蛋白质的核酸序列，其可操作地连接于表达控制序列例如启动子。优选地，所述表达控制序列是温度不敏感启动子。优选地，所述启动子是诱导物非依赖性启动子，或优选是组成型活性启动子。更优选地，所述启动子选自：veg启动子，lepA启动子，serA启动子，ymdA启动子，fba启动子，aprE启动子，amyQ启动子，amyL启动子，噬菌体SPO1启动子和cryIIIA启动子或这类启动子的组合和/或其活性片段或变体。

在优选的实施方案中，所述诱导物非依赖性启动子是aprE启动子。

在本发明方法的一个优选实施方案中，所述发酵培养基是化学上确定的发酵培养基。

在本发明方法的一个优选实施方案中，所述发酵培养基包含预定量的常量元素和微量元素。

在本发明方法的进一步优选的实施方案中，所述至少一种进料溶液提供至少一种化学上确定的碳源，优选包含碳水化合物；更优选所述碳水化合物是葡萄糖。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，感兴趣的蛋白质被分泌到发酵培养基中。

在本发明方法的进一步优选的实施方案中，所述感兴趣的蛋白质是酶。优选地，所述酶是水解酶(EC 3)，优选或是糖苷酶(EC 3.2)。更优选地，所述酶选自：淀粉酶，特别是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，纤维素酶(EC 3.2.1.4)，乳糖酶(EC 3.2.1.108)，甘露聚糖酶(EC3.2.1.25)，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，植酸酶(EC 3.1.3.8)和核酸酶(EC 3.1.11至EC3.1.31)。甚至更优选地，所述酶是选自甘露聚糖酶和淀粉酶的糖苷酶(EC 3.2)。

本发明还提供了一种生产感兴趣的蛋白质的方法，包括根据本发明的上述方法培养芽孢杆菌属宿主细胞的步骤和从培养的芽孢杆菌属宿主细胞获得感兴趣的蛋白质的进一步步骤。

本发明还涉及通过本发明任一项的方法可获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物。应当理解，所述芽孢杆菌属宿主细胞培养物包含通过本发明的方法产生的感兴趣的蛋白质，优选以增加的量产生的感兴趣的蛋白质。

本发明还涉及包含通过本发明的方法可获得的感兴趣的蛋白质的组合物。

在本说明书中引用的所有参考文献都通过引用将具体提及的公开内容完整地并入本文。

附图简述

图1：在30℃和35℃的恒定温度与发酵期间从30℃到35℃的温度改变相比，来自地衣芽孢杆菌补料分批发酵的淀粉酶的相对产量。示出了两个示例性补料分批发酵淀粉酶1(A)和淀粉酶2(B)。

图2：在恒定温度和使用温度改变的补料分批发酵的相对酶产量。(A)枯草芽孢杆菌在30℃恒定温度与在发酵期间从30℃至35℃的温度改变下的补料分批发酵相比，淀粉酶1的相对产量。(B)地衣芽孢杆菌在30℃恒定温度与在发酵期间从30℃至35℃的温度改变下的补料分批发酵相比，甘露聚糖酶的相对产量。

图3：通过将温度改变与降低比底物吸收率q_s相组合，优化从30℃到35℃的温度变化的时间点。(A)示出了随进料时间的葡萄糖进料速率。总进料时间为70小时(相当于100％)。(B)描述了相对于加入的葡萄糖量的葡萄糖进料速率。(C)描述了相对于加入的葡萄糖量的比葡萄糖摄取率(qs)。(D)描述了淀粉酶产量取决于温度变化前加入的总葡萄糖量。箭头指示代表组合温度变化和进料速率变化的条形。

实施例

现在将通过工作实施例来示例说明本发明。无论如何，这些工作实施例不得解释为对本发明范围的限制。

实施例1：发酵期间改变温度增加地衣芽孢杆菌中淀粉酶生产

除非另有说明，否则以下实验是通过应用在遗传工程和通过培养微生物发酵生产化合物中使用的标准设备、方法、化学品和生物化学品进行的。也见Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd edition,Cold Spring HarborLaboratory,Cold20Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)和Chmiel et al.(Bioprocesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik,Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)所述。

α-淀粉酶活性通过使用底物亚乙基-4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷(EPS)的方法测定。D-麦芽七糖苷是一种封闭的寡糖，可以被内切淀粉酶切割。切割后，α-葡萄糖苷酶释放出黄色的PNP分子，因此可以在405nm通过可见分光光度法测量。含有EPS底物和α-葡萄糖苷酶的试剂盒可得自Roche Costum Biotech(目录号10880078t3)并在Lorentz K.etal.(2000),Clin.Chem.,46/5:644-649中描述。时间依赖性吸收曲线的斜率与在给定条件下所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。

将表达淀粉酶1或淀粉酶2的地衣芽孢杆菌菌株使用提供表1和表2所列组分的化学上确定的发酵培养基在发酵过程中培养。

表1：发酵过程中提供的常量元素

表2：发酵过程中提供的微量元素

发酵是用含有8g/l葡萄糖的培养基开始。含有50％葡萄糖的溶液用作进料溶液。在发酵期间使用氨调节pH。

在由培养物pH值增加而指示的8g/l葡萄糖的初始量耗尽时开始进料，并且加入葡萄糖直至向生物反应器中加入了>200g葡萄糖/kg初始发酵体积。葡萄糖补料策略包括初始指数进料阶段，指数因子为0.13h^-1，起始值为每升初始体积和每小时1克葡萄糖，其中将总葡萄糖的28％加入生物反应器中。随后是第二阶段的恒定葡萄糖补料，速率对应于最大葡萄糖进料速率的35％。在这个第二阶段，加入了剩余的葡萄糖(总葡萄糖的72％)。通过加入NH₄OH将pH值保持在7.0以上。

将培养温度保持恒定在30℃或35℃，导致淀粉酶1的相对淀粉酶产量分别为100％和229％，淀粉酶2的相对淀粉酶产量分别为100％和143％。在30℃的较低温度开始发酵，然后在指数进料阶段结束后将温度升高到35℃，淀粉酶1和淀粉酶2的产量分别增加到451％和723％。因此，与温度保持恒定在较低温度(30℃)或较高温度(35℃)的发酵相比，在发酵过程中进行温度从较低温度到较高温度的转变显著提高了生产率。结果如图1所示。

实施例2：发酵期间改变温度增加枯草芽孢杆菌中淀粉酶生产

如实施例1所述测定酶活性。如实施例1所述，将表达淀粉酶1的枯草芽孢杆菌菌株在以葡萄糖作为碳源的补料分批发酵中在无机盐培养基中生长。

将培养温度保持恒定在30℃或在30℃开始发酵，然后在指数进料阶段结束后将温度升高到35℃。与温度保持恒定在30℃的发酵相比，在发酵期间将温度从较低设定点转变为较高设定点显著提高生产率(提高49％)。结果如图2(A)所示。

实施例3：发酵期间改变温度增加地衣芽孢杆菌中甘露聚糖酶生产

将如WO2021/058453(Seq ID No:1)所述的甘露聚糖酶分子在地衣芽孢杆菌中表达。然后，如实施例1所述，将地衣芽孢杆菌菌株在以葡萄糖作为碳源的补料分批发酵中在无机盐培养基中生长。将培养温度保持恒定在30℃，或者在30℃开始发酵，然后在指数进料结束后将温度升至35℃。根据本领域技术人员已知的标准测试程序，通过CE-SDS电泳测定发酵过程中的培养样品中甘露聚糖酶滴度。与温度保持恒定在30℃的发酵相比，在发酵期间将温度从较低设定点转变为较高设定点显著提高生产率(提高33％)。结果如图2(B)所示。

实施例4：温度变化与降低比底物吸收率q_s的组合增加淀粉酶产量

如实施例1所述测定酶活性。如实施例1所述，将表达淀粉酶1的地衣芽孢杆菌菌株在以葡萄糖作为碳源进行补料分批发酵中在无机盐培养基中生长。

在葡萄糖进料开始后，在加入不同量的葡萄糖后，将温度从30℃转变为35℃(0％＝进料开始)。在加入葡萄糖总量的28％后，进料模式从指数进料转变为恒定进料，导致比底物吸收率q_s[克葡萄糖/克细胞和小时]降低至在培养期间观察到的最大值的35％。

最大淀粉酶产量是通过在切换到恒定进料速率的同时改变温度实现的(在发酵期间加入的葡萄糖占加入的葡萄糖总量的28％)，即比底物吸收率降低至其最大值的35％。在q_s降低之前或之后进行温度改变导致较低的产物滴度。因此，通过同时改变培养温度和q_s实现了协同效应。结果如图3所示。

Claims (17)

1.一种培养芽孢杆菌属宿主细胞的方法，包括以下步骤：

(a)用芽孢杆菌属宿主细胞接种发酵培养基，所述芽孢杆菌属宿主细胞包含编码感兴趣的蛋白质的基因的表达构建体；

(b)第一培养阶段，在有利于所述芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的条件下在所述发酵培养基中培养所述芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞的培养包括加入至少一种进料溶液并且其中在第一培养阶段期间的培养在第一温度进行；和

(c)第二培养阶段，在有利于所述芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的条件下培养在步骤(b)中获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物，其中所述培养包括加入至少一种进料溶液并且其中第二培养阶段的培养在第二温度进行，所述第二温度高于第一温度。

2.根据权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括从步骤(c)后获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物获得所述感兴趣的蛋白质。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是酶。

4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中所述表达构建体包含与启动子可操作连接的编码感兴趣的蛋白质的核酸序列；所述启动子优选诱导物非依赖性或组成型活性启动子。

5.根据权利要求1至4任一项的方法，其中所述第一培养阶段进行至少约3小时直至约48小时的时间。

6.根据权利要求1至5任一项的方法，其中在第一培养阶段期间，所述至少一种进料溶液以渐增的速率提供碳源。

7.根据权利要求1至6任一项的方法，其中所述第二培养阶段进行至少约3小时直至约96小时的时间。

8.根据权利要求1至7任一项的方法，其中在第二培养阶段期间，所述至少一种进料溶液以恒定速率、渐减的速率或低于步骤(b)中的速率的渐增的速率提供碳源，其中所述恒定速率或所述渐减的速率的起始速率或所述低于步骤(b)中的速率的渐增的速率的起始速率低于第一培养阶段的最大速率。

9.根据权利要求1至8任一项的方法，其中所述第一温度和所述第二温度相差约3℃至约7℃、约4℃至约6℃，或优选地相差约5℃。

10.根据权利要求1至9任一项的方法，其中所述第一温度在约28℃至约32℃、约29℃至约31℃的范围内，或优选为约30℃。

11.根据权利要求1至10任一项的方法，其中所述第二温度在约33℃至约37℃、约34℃至约36℃的范围内，或优选为约35℃。

12.根据权利要求1至11任一项的方法，其中与通过实施根据权利要求1至9任一项的其中所述第一温度和第二温度相同的方法获得的对照相比，在步骤c)之后获得的感兴趣的蛋白质的产量显著增加。

13.根据权利要求12的方法，其中所述产量增加至少40％、至少60％、至少80％、至少100％、至少200％、至少300％或至少400％。

14.根据权利要求1至13任一项的方法，其中所述芽孢杆菌选自：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，Bacillus jautus，迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

15.根据权利要求1至14任一项的方法，其中所述编码感兴趣的蛋白质的基因的表达构建体已经通过遗传修饰引入所述芽孢杆菌属宿主细胞中。

16.根据权利要求1至15任一项的方法，其中所述至少一种进料溶液包含至少一种碳源，优选葡萄糖。

17.通过权利要求1至16任一项的方法可获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物。

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