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CN113736743A - 一株分泌抗双酰胺类化合物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一株分泌抗双酰胺类化合物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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CN113736743A CN202111082512.3A CN202111082512A CN113736743A CN 113736743 A CN113736743 A CN 113736743A CN 202111082512 A CN202111082512 A CN 202111082512A CN 113736743 A CN113736743 A CN 113736743A
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Abstract

本发明提供了一株分泌抗双酰胺类化合物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫化学技术领域。所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.22322。本发明将完全抗原与弗氏佐剂混合乳化，将小鼠进行皮下免疫，将高效价，低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，采用选择培养基，筛选出两种细胞融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺具有较好的检测灵敏度，可以用于食品中这四种农药的残留检测。

Description

一株分泌抗双酰胺类化合物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其 应用
技术领域
本发明属于免疫化学技术领域，尤其是指一株分泌抗双酰胺类化合物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
环溴虫酰胺(cyclaniliprole)、溴氰虫酰胺(cyantraniliprole)、氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole)、四氯虫酰胺(tetrachlorantraniliprole)均属于双酰胺类杀虫剂。双酰胺类杀虫剂属于鱼尼丁受体激活剂，对水稻等作物上的鳞翅目害虫等具有优异防效，并对非靶标生物安全，与现有的其他作用方式的杀虫剂无交互抗性。目前有4个品种商品化，分别是2006年上市的氟苯虫酰胺，2007年上市的氯虫苯甲酰胺，2013年上市的溴氰虫酰胺，以及2014年上市的四氯虫酰胺。
氯虫苯甲酰胺是杜邦公司以氟苯虫酰胺为先导化合物，经过深入先导优化研究发现的，具有一定的内吸传导性，杀虫谱更广，氯虫苯甲酰胺已经取得了农药登记销售应用的所有证书，可以大面积推广应用。由于氯虫苯甲酰胺的化学结构具有其他任何杀虫剂不具备的全新杀虫原理，能高效激活昆虫鱼尼丁(肌肉)受体。过度释放细胞内钙库中的钙离子，导致昆虫瘫痪死亡,对鳞翅目害虫的幼虫活性高，杀虫谱广，持效性好。根据目前的试验结果对靶标害虫的活性比其它产品高出10-100倍，并且可以导致某些鳞翅目昆虫交配过程紊乱，研究证明其能降低多种夜蛾科害虫的产卵率，由于其持效性好和耐雨水冲刷的生物学特性，这些特性实际上是渗透性、传导性、化学稳定性、高杀虫活性和导致害虫立即停止取食等作用的综合体现。因此决定了其比目前绝大多数在用的其他杀虫剂有更长和更稳定的和对作物的保护作用。目前登记在防治水稻主要害虫上，能迅速保护水稻生长，尤其对其他水稻杀虫剂已经有抗性的害虫更有特效，如稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟、大螟，对稻瘿蚊、稻象甲、稻水象甲也有很好的防治效果。该农药属微毒级，对施药人员非常安全，对稻田有益昆虫、鱼虾也非常安全。持效期可以达到15天以上，对农产品无残留影响，同其他农药混和性能好。
溴氰虫酰胺，是杜邦公司继氯虫酰胺之后成功开发的第二代鱼尼丁受体抑制剂类杀虫剂，它是通过改变苯环上的各种极性基团而成，具有更高效，适用作物更广泛，可有效防治鳞翅目、半翅目和鞘翅目害虫。
沈阳化工研究院有限公司以氯虫苯甲酰胺为先导化合物，通过对其结构中的苯环取代基、吡唑取代基进行结构修饰，发现具有高杀虫活性的化合物四氯虫酰胺。其可用于防治水稻上的二化螟、稻纵卷叶螟等，以及蔬菜上的小菜蛾、菜青虫等鳞翅目害虫。
环溴虫酰胺为日本石原产业公司开发的具双酰胺结构的杀虫剂，具有广谱的杀虫活性，可用于果树、蔬菜、马铃薯、茶树、大豆和棉花等众多作物，防治鳞翅目、鞘翅目、缨翅目、双翅目和同翅目害虫。根据国际杀虫剂抗性行动委员会(IRAC)的作用机制分类，环溴虫酰胺的主要作用位点为鱼尼汀受体变构体，与其他双酰胺类杀虫剂不同，该剂并非完全为鱼尼丁受体作用剂。
目前，环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简单的分析环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺残留物的方法。
酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在农药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测的前提是得到对目标检测物具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。在制备能分泌抗环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备半抗原和完全抗原，如何使小鼠产生强免疫，如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出抗环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺单克隆抗体，如何使得分泌出的单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一株分泌抗双酰胺类化合物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
一株分泌抗双酰胺类化合物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22322。
一种分泌抗双酰胺类化合物单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备双酰胺类化合物半抗原，利用所得双酰胺类化合物半抗原制备双酰胺类化合物完全抗原，将所得双酰胺类化合物完全抗原与完全弗氏佐剂制备得到免疫原1，所得双酰胺类化合物完全抗原和不完全弗氏佐剂乳化得到免疫原2；
S2：将S1中所得免疫原1对小鼠进行皮下免疫；
S3：将S2中免疫后的小鼠使用S1中免疫原2再进行加强免疫，并使用双酰胺类化合物完全抗原进行冲刺免疫；
S4：在细胞融合前三天进行冲刺免疫，通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的完全抗原进行；
S5：取S4中冲刺免疫后的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞，并进行细胞融合实验，将融合的细胞通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌抗环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，得到所述杂交瘤细胞株。
在本发明的一个实施例中，S1中所述双酰胺类化合物半抗原结构式为：
Figure BDA0003264480610000041
本发明还提供了一种双酰胺类化合物半抗原的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取2-氨基-3-溴-5-氯苯甲酸、亚硫酰氯在有机溶剂中混合回流反应得到反应液；
步骤2：取三乙胺和4-氨基丁酸叔丁酯在有机溶剂中混合得到混合物；
步骤3：将步骤1中所得反应液加入步骤2中混合物中混合搅拌均匀，进行反应，分离纯化得到所述双酰胺类化合物半抗原。
在本发明的一个实施例中，S1中所述双酰胺类化合物完全抗原结构式为：
Figure BDA0003264480610000042
本发明还提供了一种双酰胺类化合物完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
将双酰胺类化合物半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在有机溶剂中搅拌反应，之后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液加入，搅拌进行反应，得到A液；将牛血清蛋白用碳酸盐缓冲溶液(CBS)稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用磷酸盐缓冲液(PBS)透析反应液，得到所述双酰胺类化合物完全抗原。
在本发明的一种实施方式中，S2和S4中所述首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。
在本发明的一种实施方式中，S2和S4中所述首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。
在本发明的一种实施方式中，S2和S4中所述免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG4000)法进行的。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的培养基为RPMI-1640培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的亚克隆次数为3次。
一种双酰胺类化合物单克隆抗体，是由所述的杂交瘤细胞株分泌所得。
在本发明的一个实施例中，所述双酰胺类化合物为环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺。
一种抗双酰胺类化合物单克隆抗体的制备方法，取小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射所述杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，得到所述双酰胺类化合物单克隆抗体，将获得的双酰胺类化合物单克隆抗体低温保存。
在本发明的一种实施方式中，抗双酰胺类化合物单克隆抗体的制备方法为取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×106所述杂交瘤细胞株，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的抗双酰胺类化合物单克隆抗体置于-20℃保存。
所述的抗双酰胺类化合物单克隆抗体在识别环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺中的应用。
一种组合物，所述组合物包括所述的抗双酰胺类化合物单克隆抗体。
所述的组合物在检测环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺中的应用。
一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的抗双酰胺类化合物单克隆抗体。
所述试剂盒在检测环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明所述杂交瘤细胞株分泌的抗环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺单克隆抗体对环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺具有较好的检测灵敏度(IC50值分别0.137ng/mL、0.137ng/mL、0.11ng/mL、0.165ng/mL)，可以用于建立环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺的免疫学检测方法，检测食品中环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺的残留。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明为本发明抗环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺单克隆抗体对环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺抑制标准曲线。
图2是本发明实施例1中双酰胺类化合物半抗原Hapten 1的核磁氢谱图。
图3是本发明实施例1中双酰胺类化合物半抗原Hapten 1的质谱图。
图4是本发明实施例1中双酰胺类化合物半抗原Hapten 2的核磁氢谱图。
图5是本发明实施例1中双酰胺类化合物半抗原Hapten 2的质谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中涉及的培养基如下：
RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B120.005、碳酸氢钠2000。
下述实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％吐温20的PBS；
抗体稀释液：含0.1％明胶的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4.12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.01,0.03,0.1和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.01,0.03,0.1和0.3μg/mL。选择最佳工作点后，将环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺标准品均稀释为8个浓度(0，0.006，0.02，0.06，0.2，0.6，1.8，5.4ng/mL)，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro8.5做图(结果如图1所示)，获得环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺标准抑制曲线，计算IC50。
实施例1：半抗原(Hapten 1)的合成
由于小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将小分子偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，为了得到能够特异性识别环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺的单克隆抗体，因此需要设计并衍生一个好的半抗原，具体衍生步骤如下所示。
步骤一：4-(2-氨基-3-溴-5-氯苯甲酰氨基)丁酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003264480610000081
在反应烧瓶中加入1.0g(4.0mmol)2-氨基-3-溴-5-氯苯甲酸、10毫升甲苯和0.80mL(12.0mmol)亚硫酰氯，回流3小时，除去溶剂，加四氢呋喃5mL待用；将上述备用溶液滴入含有10mL四氢呋喃、1.7mL(12.0mmol)三乙胺和2.3g(12.0mmol)4-氨基丁酸叔丁酯的反应瓶中，室温搅拌0.5小时，TLC显示反应完成。除去溶剂后，加入50mL水和200mL乙酸乙酯进行分离萃取。有机相用100mL饱和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，减压除去。残渣经柱层析纯化得白色固体(4-(2-氨基-3-溴-5-氯苯甲酰氨基)丁酸叔丁酯)1.4g。
步骤二：半抗原Hapten 1的合成
Figure BDA0003264480610000091
将1.0g(3.3mmol)的3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-羧酸、10mL甲苯和0.68mL(10mmol)的亚硫酰氯加入反应烧瓶，回流3h，除去溶剂，加四氢呋喃5mL备用；将上述备用溶液滴入含有10mL四氢呋喃、1.39mL(10mmol)三乙胺和480mg(1.1mmol)4-(2-氨基-5-氯苯甲酰氨基)丁酸叔丁酯的反应瓶中，室温搅拌0.5小时，TLC显示反应完成。除去溶剂后，加入50mL水和200mL乙酸乙酯进行分离萃取；有机相用100mL饱和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，减压除去。残余物通过柱色谱纯化以获得粗产物，将粗品溶于5mLTFA和DCM混合溶液(V/V＝1:1)，室温搅拌0.5h。减压除去溶剂，残留物经柱层析纯化得到190mg产物。表征结果为：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.44(dd,J＝4.7,1.6Hz,1H),8.03(dd,J＝8.1,1.6Hz,1H),7.75(d,J＝2.3Hz,1H),7.52(dd,J＝8.1,4.7Hz,1H),7.48(d,J＝2.3Hz,1H),7.32(s,1H),3.28-3.24(m,2H),2.29(t,J＝7.3Hz,2H),1.84-1.71(m,2H).ESI-MS:C20H15Br2Cl2N5O4+Na+required 639.8766,found 639.76.(核磁谱图见图2-图3)
实施例2：完全抗原的合成
称取2.8mg半抗原(Hapten 1)，1.6mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于300μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min；再称取2.6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到半抗原溶液中，室温搅拌反应6-8h(称为A液)。取10mg BSA，用0.01M碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至5mg/mL(称为B液)，再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
实施例3：包被原的合成
为提高灵敏度，设计一个新的包被用半抗原(Hapten2)结构如下所示：
Figure BDA0003264480610000101
半抗原(Hapten2)的合成方法与半抗原(Hapten1)类似。包被原合成具体步骤为：将3.6mg半抗原(Hapten2)、2.3mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min，得到半抗原溶液；将3.8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于100μL无水DMF后，加入到半抗原溶液中，室温搅拌进行反应6-8h，得到A液；将10mg鸡卵白蛋白(OVA)用1mL浓度为0.01mol/L的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到包被原。其中半抗原(Hapten2)的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.52(s,1H),12.13(s,1H),9.02(s,1H),8.54(dd,J＝4.7,1.6Hz,1H),8.30–8.15(m,2H),7.93(d,J＝2.4Hz,1H),7.67(dd,J＝8.1,4.7Hz,1H),7.55(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),7.19(s,1H),3.33(q,J＝6.0Hz,2H),2.32(t,J＝7.3Hz,2H),1.79(p,J＝7.2Hz,2H).ESI-MS:C20H16BrCl2N5O4+H+required 539.9841,found 539.89.(核磁表征见图4-图5)。
实施例4：分泌抗环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
1、动物免疫的获得
将完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50ug/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25ug/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。
2、细胞融合
在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mLRPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3、细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。
选择对环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。
按上述方法进行三次亚克隆，最终获得能够分泌特异性识别环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺单克隆抗体的细胞株。
实施例5：单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。
在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA，测得单克隆抗体对环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺的IC500.137 ng/mL、0.137ng/mL、0.11ng/mL、0.165ng/mL，说明有很好的灵敏度，同时对其他酰胺类化合物进行了检测，IC50均大于5ppb,具有良好的特异性，见表1，可用于免疫分析检测。
表1单克隆抗体交叉反应率
Figure BDA0003264480610000121
Figure BDA0003264480610000131
实施例6：单克隆抗体的应用
将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于ELISA试验，具体步骤如下：
将用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的浓度为0.1μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置系列梯度的标准溶液，将标准溶液分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，做三个平行，再每孔加入50μL稀释至0.03μg/mL的单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS以1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL2M的H2SO4终止液，450nm测吸光值。
以450nm测得吸光值为纵坐标以标准品浓度为横坐标用OriginPro 8.5做图(结果如图1所示)，获得环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺标准抑制曲线，其对应的IC50值分别为0.137ng/mL、0.137ng/mL、0.11ng/mL、0.165ng/mL，说明有很好的灵敏度。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一株分泌抗双酰胺类化合物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22322。
2.一种分泌抗双酰胺类化合物单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：制备双酰胺类化合物半抗原，利用所得双酰胺类化合物半抗原制备双酰胺类化合物完全抗原，将所得双酰胺类化合物完全抗原与完全弗氏佐剂制备得到免疫原1，所得双酰胺类化合物完全抗原和不完全弗氏佐剂乳化得到免疫原2；
S2：将S1中所得免疫原1对小鼠进行皮下免疫；
S3：将S2中免疫后的小鼠使用S1中免疫原2再进行加强免疫，并使用双酰胺类化合物完全抗原进行冲刺免疫；
S4：取S3中冲刺免疫后的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞，进行细胞融合，得到所述杂交瘤细胞株。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S1中所述双酰胺类化合物半抗原结构式为：
Figure FDA0003264480600000011
4.一种抗双酰胺类化合物单克隆抗体，其特征在于，所述抗双酰胺类化合物单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌所得。
5.根据权利要求4所述的抗双酰胺化合物类单克隆抗体，其特征在于，所述双酰胺类化合物为环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺或四氯虫酰胺。
6.如权利要求4所述的抗双酰胺类化合物单克隆抗体在识别环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺或四氯虫酰胺中的应用。
7.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求5中所述的抗双酰胺类化合物单克隆抗体。
8.如权利要求7所述的组合物在检测环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺中的应用。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5中所述的抗双酰胺类化合物单克隆抗体。
10.如权利要求9所述的试剂盒在检测环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺中的应用。
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