CN113717950B - 一株分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫化学技术领域，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.22333。本发明将戊菌唑的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂进行乳化，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，最后一次用戊菌唑完全抗原冲刺免疫。将高效价和高灵敏度小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择培养基，筛选出两种细胞融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞，并进行多次亚克隆，得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对戊菌唑具有较好的检测灵敏度，IC50值为0.426ng/mL。
Description
技术领域
本发明属于食品安全免疫检测领域，具体涉及一种分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
戊菌唑的英文通用名为：Penconazole，化学名称：1-[2-(2，4-二氯苯基)戊基]-1H-1，2，4-三唑。作用机理：戊菌唑是目前活性最高的三氮杂环类杀菌剂，是甾醇脱甲基化抑制剂，可由作物根、茎、叶等组织吸收，并向上传导抑制甾醇脱甲基化，在真菌孢子萌发和侵入期间起作用。主要用途：用于防治白粉菌科，黑星菌属及其他疾病的孢菌纲、担子菌纲和半知菌类的致病菌，对叶斑病、黑星病、炭疽病、白粉病有很好的防治效果，尤其是对南瓜、葡萄、仁果、观赏植物和蔬菜的上述病原菌效果显著，对葡萄白腐病特效。
目前，戊菌唑检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简便的检测戊菌唑残留物的方法。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种极为高效、灵敏、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在药物残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测戊菌唑的前提是得到对戊菌唑具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对戊菌唑具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株能分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，此杂交瘤细胞株可用于分泌戊菌唑单克隆抗体，戊菌唑单克隆抗体对戊菌唑具有较好的检测灵敏度(IC50值为0.426ng/mL)，可以用于建立戊菌唑的免疫学检测方法，检测食品中戊菌唑的残留。
本发明的另一目的是提供一种用于制备杂交瘤细胞株的戊菌唑半抗原及其制备方法，用于制备完全抗原，进而应用在制备分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株、戊菌唑单克隆抗体方面。
本发明的又一目的是提供一种试剂盒，包含本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.22333的杂交瘤细胞株，或者通过本发明提供的戊菌唑半抗原获得的单克隆细胞株，或本发明提供的戊菌唑单克隆抗体，用于检测戊菌唑。
具体技术方案：
本发明提供了一种分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22333，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供一种戊菌唑半抗原，其分子式如下：
在本发明的实施案例中，所述戊菌唑半抗原的制备方法，具体步骤为：
将1-(2，4-二氯苯基)-2-(1，2，4-三唑-1-基)乙醇，用吡啶溶解，再加入丁二酸酐，搅拌溶解后，再加入4-二甲氨基吡啶，密封后，放入水浴锅中，搅拌至反应完全，反应物氮气吹干；加入水，以盐酸调节pH值为3～4，再加入二氯甲烷萃取，收集有机相，提取液经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，得少量白色粘稠液体，吹干后即得到戊菌唑半抗原。
本发明还提供一种戊菌唑完全抗原，由所述半抗原获得，其分子式如下：
本发明还提供所述半抗原、半抗原的制备方法以及完全抗原在制备分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株、戊菌唑单克隆抗体方面的应用。
本发明还提供一种戊菌唑单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.22333的杂交瘤细胞株分泌产生的。
本发明还提供一种戊菌唑单克隆抗体的制备方法，所述方法为取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再向腹腔注射保藏编号为CGMCC No.22333的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单克隆抗体低温保存。
在一种可选的实施方式中，所述方法为取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×106个细胞/mL保藏编号为CGMCC No.22333的杂交瘤细胞株，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸.硫酸铵法纯化，获得的单克隆抗体置于-20℃保存。
在本发明的实施案例中，还提供了所述戊菌唑单克隆抗体和戊菌唑单克隆抗体的制备方法在检测戊菌唑含量中的应用。
在一种可选的实施案例中，所述戊菌唑单克隆抗体和戊菌唑单克隆抗体的制备方法用于食品安全免疫检测中戊菌唑残留的分析检测。
在本发明的实施案例中，所述一种分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：
步骤1：制备戊菌唑半抗原及戊菌唑完全抗原，将获得的戊菌唑完全抗原与弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂乳化，制备成免疫原；
步骤2：将得到的免疫原通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
步骤3：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中戊菌唑抗体灵敏度高的小鼠；
步骤4：将筛选出的小鼠通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的戊菌唑完全抗原；
步骤5：将冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，融合后的细胞通过HAT培养基筛选培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌高灵敏度戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫；
在本发明的一种实施方式中，所述步骤3中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG4000)法进行的。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的培养基为RPMI-1640培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的亚克隆次数为4次。
本发明的有益效果：
1、本发明探索了利用一种能分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备戊菌唑单克隆抗体的新方法，为动物性组织中戊菌唑的残留检测提供了免疫学方法。
2、本发明获得的戊菌唑单克隆抗体，特异性强，对戊菌唑有较好的检测灵敏度(IC50值为0.426ng/mL)。
3、本发明获得的戊菌唑单克隆抗体细胞株及分泌的戊菌唑单克隆抗体可制成用于免疫分析检测、食品中戊菌唑残留的检测的试剂盒，有很好的实际应用价值。
生物材料保藏
一株分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为：单克隆细胞株SXC，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.22333，保藏日期为：2021年05月13日。
附图说明
图1为本发明戊菌唑单克隆抗体对戊菌唑的抑制标准曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中涉及的培养基如下：
RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B120.005、碳酸氢钠2000。
下述实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％吐温20的PBS；
抗体稀释液：含0.1％明胶的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按5∶1混合即为TMB显色液，使用时再进行混合。
1-(2，4-二氯苯基)-2-(1，2，4-三唑-1-基)乙醇，简称戊菌唑类似物，购置于江苏艾康生物医药研发有限公司。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
戊菌唑抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将戊菌唑标准品稀释为8个浓度(0，0.019，0.056，0.167，0.5，1.5，4.5，13.5ng/mL)，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro8.5做图(结果如图1所示)，获得戊菌唑标准抑制曲线，计算IC50。
实施例1：戊菌唑半抗原的合成
由于戊菌唑小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将戊菌唑偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于戊菌唑分子结构式中不含有这些活泼基团，因此购买类似物进行衍生。
称取戊菌唑类似物206mg(200mmoL)于10ml反应瓶中，用4mL吡啶溶解，加入95mg(240mmoL)丁二酸酐，搅拌溶解后，再加入0.1eq的4-二甲氨基吡啶。密封后，放入50℃水浴锅中，搅拌5h，反应物氮气吹干。加入10mL水，以6mol·L-1 HCl溶液调节pH值为3。再加入10mL二氯甲烷萃取3次，收集有机相。提取液经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，得少量白色粘稠液体，吹干后即得到戊菌唑半抗原。
实施例2：戊菌唑完全抗原的合成
称取5.5mg戊菌唑半抗原，4.6mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于200μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min；再称取7.7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，加入到戊菌唑半抗原溶液中，室温搅拌反应6-8h，进行活化。取6mg钥孔血蓝蛋白(KLH)，加入到3mL0.01M碳酸盐缓冲液(CBS)，充分溶解，将活化的半抗原缓慢加入到溶解了KLH的稀释液中，室温搅拌8～12小时。然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子物质，得到较为纯净的完全抗原，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
实施例3：戊菌唑包被原的合成
将3.0mg戊菌唑半抗原、2.7mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于200μL无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min；将4.6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于上述溶液中，室温搅拌进行反应6-8h，得到半抗原活化液；将6mg鸡卵白蛋白(OVA)溶解于碳酸盐缓冲液(CBS)中；将半抗原活化液缓慢加入到蛋白稀释液中，室温搅拌过夜。然后，用0.01M PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子物质，得到包被原。
实施例4：分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
1、动物免疫的获得
将戊菌唑完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
2、细胞融合
在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中进行扩增，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。除第2min，其他时间不短晃动溶液。然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50xHAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3、细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合后的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用戊菌唑为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。
选择对戊菌唑标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。
按上述方法进行三次亚克隆，最终获得戊菌唑单克隆抗体细胞株。
实施例5：戊菌唑单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106戊菌唑杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。
在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA，测得戊菌唑单克隆抗体的IC50值为0.426ng/mL，说明对戊菌唑有很好的灵敏度，可用于戊菌唑免疫分析检测。
实施例6：戊菌唑细胞株及戊菌唑单克隆抗体的应用
将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于戊菌唑的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
(1)将用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃烘2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃烘2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，0.019，0.056，0.167，0.5，1.5，4.5，13.5ng/mL的戊菌唑标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL稀释至0.3μg/mL的戊菌唑单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS以1∶3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
(5)每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H2SO4终止液，450nm测吸光值；
(6)添加回收及样品前处理：
选择黄瓜为检测样品。
待测样品洗净、切碎，在捣碎机中搅碎、混匀。分别称取三份样品匀浆，每份5g，向样品中分别添加10ppb、50ppb、200ppb的戊菌唑标准品(根据抗体线性范围及IC50设定添加浓度)，剧烈振荡2min。加入10mL丙酮，1g NaCl，5g无水NaSO4，超声波振荡15min，4000rpm离心10min，收集上清液，取上清液1mL，氮气吹干，用5mL PBS复溶，即稀释了五倍以减少样品基质的影响。
采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为96％，88％，102％。
以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。
Claims (6)
1.一株分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已于2021年05月13日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22333，保藏名称为单克隆细胞株SXC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种戊菌唑单克隆抗体，其特征在于，是由保藏编号为CGMCC No.22333的杂交瘤细胞株分泌产生的。
3.如权利要求2所述的戊菌唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法为取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再向腹腔注射保藏编号为CGMCCNo.22333的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单克隆抗体低温保存。
4.如权利要求2所述的戊菌唑单克隆抗体或权利要求3所述的戊菌唑单克隆抗体的制备方法，在检测戊菌唑含量中的应用。
5.如权利要求2所述的戊菌唑单克隆抗体或权利要求3所述的戊菌唑单克隆抗体的制备方法，用于食品安全免疫检测中戊菌唑残留的分析检测。
6.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的戊菌唑单克隆抗体，或权利要求3所述的戊菌唑单克隆抗体的制备方法制得的戊菌唑单克隆抗体，用于识别检测戊菌唑。
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