CN110607283A - 一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株cbc及其应用 - Google Patents
一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株cbc及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明细胞株CBC，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17398。将三氯杀螨醇的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。经首免、多次加强免疫、及冲刺免疫。将高效价，低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经选择培养，再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到细胞株CBC，其分泌的单克隆抗体，对三氯杀螨醇具有较好的检测灵敏度（IC50值为19.09 ng/mL），可以用于食品中三氯杀螨醇的残留检测。
Description
技术领域
本发明涉及一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
三氯杀螨醇 [2,2,2-三氯-1,1-双(4-氯苯基)乙醇]，英文名称dicofol（以下简写为DCF），是农牧业生产中常用的一种广谱、低毒有机氯杀螨剂，对螨类有触杀和胃毒作用，对成螨、幼螨及卵均有效。三氯杀螨醇的生产与合成以滴滴涕为原料，在生产过程中氯化工段的转化率一般为 70%左右，若后续未进行提纯或提纯不彻底，则成品中就不同程度地含有滴滴涕。
三氯杀螨醇的大量使用将导致残留量超标，近些年来已有越来越多的证据表明，其在环境中的暴露对鱼类、爬行类、鸟类、哺乳类和人类有毒性和雌激素效应，对水生生物有极高毒性。给人类的健康带来危害。世界上部分国家已禁止在茶树上使用三氯杀螨醇农药，部分国家也严格限制使用高残留的三氯杀螨醇农药。我国国标GB 2763-2016中规定水果中三氯杀螨醇最大残留限量为1mg/kg，茶叶中最大残留限量为0.2mg/kg。
目前，三氯杀螨醇检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，但存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简单的分析三氯杀螨醇残留物的方法。
酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在农药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测三氯杀螨醇的前提是得到对三氯杀螨醇具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对三氯杀螨醇具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。发明人尝试通过杂交瘤细胞制备三氯杀螨醇单克隆抗体，但在制备能分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备三氯杀螨醇半抗原和三氯杀螨醇完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出三氯杀螨醇单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的三氯杀螨醇单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC及其应用，此杂交瘤细胞株分泌的三氯杀螨醇单克隆抗体对三氯杀螨醇具有较好的检测灵敏度（IC50值为19.09ng/mL），可以用于建立三氯杀螨醇的免疫学检测方法，检测食品中三氯杀螨醇的残留。
本发明的技术方案，一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17398。
本发明提供了上述一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC的制备方法，包含如下步骤：
（1）制备三氯杀螨醇半抗原及三氯杀螨醇完全抗原，将获得的三氯杀螨醇完全抗原制备成完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；
（2）将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
（3）将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中三氯杀螨醇抗体含量高的获得免疫的小鼠；
（4）将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的三氯杀螨醇完全抗原进行；
（5）将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
所述步骤（1）中的三氯杀螨醇半抗原的分子式如下：
；
所述步骤（1）中的三氯杀螨醇完全抗原的分子式如下：
。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（2）、（4）中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18~21天。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（2）、（4）中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg /只，冲刺免疫剂量为25μg /只。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（2）、（4）中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（3）中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（5）中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（5）中的细胞融合是通过聚乙二醇（PEG4000）法进行的。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（5）中的培养基为RPMI-1640培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（5）中的亚克隆次数为3次。
本发明提供了上述一种分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC或上述一种分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC的制备方法在制备三氯杀螨醇单克隆抗体方面的应用。
本发明提供了一种三氯杀螨醇单克隆抗体，所述三氯杀螨醇单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.17398的杂交瘤细胞株CBC分泌获得的。
本发明提供了上述一种三氯杀螨醇单克隆抗体的制备方法，所述方法为取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.17398的杂交瘤细胞株CBC，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单抗低温保存。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×106保藏编号为CGMCC No.17398的杂交瘤细胞株CBC，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
本发明提供了上述一种三氯杀螨醇单克隆抗体或上述一种三氯杀螨醇单克隆抗体的制备方法在识别三氯杀螨醇方面的应用。
本发明的有益效果：本发明获得的三氯杀螨醇单克隆抗体，对三氯杀螨醇有较好的检测灵敏度（IC50值为19.09ng/mL）；本发明获得的三氯杀螨醇单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测。
生物材料样品保藏：一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17398。
附图说明
图1本发明三氯杀螨醇单克隆抗体对三氯杀螨醇的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中涉及的培养基如下：
RPMI-1640培养基（mg/L）：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B12 0.005、碳酸氢钠2000。
下述实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；
抗体稀释液：含 0.1%明胶的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4 .12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mgTMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
三氯杀螨醇抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液（CBS）将抗原稀释至0.01，0.03，0.1，0.3μg/ mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3，1μg/ mL。选择最佳工作点后，将三氯杀螨醇标准品稀释为8个浓度（0，1，3，10，30，90，270，810ng/mL），按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图（结果如图1所示），获得三氯杀螨醇标准抑制曲线，计算IC50。
实施例1：三氯杀螨醇半抗原的合成
由于三氯杀螨醇小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将三氯杀螨醇偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于三氯杀螨醇分子结构式中不含有这些活泼基团，因此需要衍生。
将三氯杀螨醇（250 mg，0.67 mmol），氰基乙酸乙酯（1 mL）和乙酸（1 mL）一起放入圆底烧瓶中，并缓慢添加96％的硫酸（4 mL）。添加完成后，将混合物在50℃水浴加热15min。混合物变为深红色，然后在室温下搅拌反应20h。将混合物用乙醚萃取。用水和碳酸氢钠溶液洗涤醚相，干燥并浓缩。在硅胶制备板上使用己烷/ CH 2Cl 2（1:1）作为洗脱剂将粗产物纯化，收集产品部分，旋干收集液，得到的产品即为三氯杀螨醇半抗原，其化学结构式如下式所示：
。
实施例2：三氯杀螨醇完全抗原的合成
称取5.5mg 三氯杀螨醇半抗原（DCF-COOH），4.2mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min；再称取6.9mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到DCF-COOH溶液中，室温搅拌反应6-8 h(称为A液)。取8mg KLH，用0.01M碳酸盐缓冲液（CBS）稀释至4mg/mL（称为B液），再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原DCF-COOH-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
实施例3：三氯杀螨醇包被原的合成
将3.0mg三氯杀螨醇半抗原（DCF-COOH）、2.3mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min，得到三氯杀螨醇半抗原（DCF-COOH）溶液；将3.8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶解于100μL无水DMF后，加入到DCF-COOH溶液中，室温搅拌进行反应6-8h，得到A液；将10mg鸡卵白蛋白（OVA）用1mL浓度为0.01mmol/L的碳酸盐缓冲液（CBS）稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到包被原（DCF-COOH-OVA）。
实施例4：分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC的制备
（1）动物免疫的获得：将三氯杀螨醇完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50ug/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25ug/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
（2）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640培养基在5% CO2培养箱中，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到﹙1~4﹚×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mLRPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心（800rpm，8min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。
（3）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用三氯杀螨醇为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。
选择对三氯杀螨醇标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。
按上述方法进行三次亚克隆，最终获得三氯杀螨醇单克隆抗体细胞株CBC。
实施例5：三氯杀螨醇单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106三氯杀螨醇杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。
在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA，测得三氯杀螨醇单克隆抗体的IC50值为19.09ng/mL，说明对三氯杀螨醇有很好的灵敏度，可用于三氯杀螨醇免疫分析检测。
实施例6：三氯杀螨醇单克隆抗体的应用
将杂交瘤细胞株CBC通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于三氯杀螨醇的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
（1）将用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
（2）用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
（3）用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，1，3，10，30，90，270，810 ng/mL的三氯杀螨醇标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL稀释至0.3μg/mL的抗DCF单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
（4）每孔加入100μL用含0.1%明胶的PBS以1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
（5）每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H2SO4终止液，450nm测吸光值；
（6）添加回收及样品前处理：选择苹果为检测样品。待测样品洗净、切碎，在捣碎机中搅碎、混匀。分别称取三份样品匀浆，每份5g，向样品中分别添加20 ppb、100 ppb、250 ppb的三氯杀螨醇标准品（根据抗体线性范围及IC50设定添加浓度），剧烈振荡2min。加入10mL丙酮，1g NaCl，5g无水NaSO4，超声波振荡15min，4000rpm离心10min，收集上清液，取上清液1mL，氮气吹干，用5mL PBS复溶（即稀释了五倍以减少样品基质的影响）。
采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为92%，93%，89%。
Claims (7)
1.一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17398。
2.三氯杀螨醇单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.17398的杂交瘤细胞株CBC分泌产生。
3.权利要求2所述三氯杀螨醇单克隆抗体的应用，其特征在于：建立一种三氯杀螨醇的酶联免疫法ELISA检测方法，用于识别食品检测中的三氯杀螨醇。
4.权利要求2所述三氯杀螨醇单克隆抗体的制备方法，其特征在于：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.17398的杂交瘤细胞株CBC，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单克隆抗体低温保存。
5.用于制备权利要求1所述杂交瘤细胞株CBC的三氯杀螨醇完全抗原，其特征在于，所述完全抗原DCF-COOH-KLH的分子式如下：
。
6.权利要求5所述三氯杀螨醇完全抗原的制备方法，其特征在于：将三氯杀螨醇半抗原DCF-COOH、N-羟基琥珀酰亚胺NHS及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，搅拌进行反应，得到三氯杀螨醇半抗原DCF-COOH溶液，即A液；将钥孔血蓝蛋白KLH用碳酸盐缓冲溶液CBS稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用磷酸盐缓冲液PBS透析反应液，得到完全抗原DCF-COOH-KLH。
7.根据权利要求6三氯杀螨醇完全抗原的制备方法，其特征在于，所述三氯杀螨醇半抗原DCF-COOH的分子式如下：
。
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