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CN114395534A - 一株分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一株分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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CN114395534A CN202210087710.7A CN202210087710A CN114395534A CN 114395534 A CN114395534 A CN 114395534A CN 202210087710 A CN202210087710 A CN 202210087710A CN 114395534 A CN114395534 A CN 114395534A
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Abstract

本发明公开了食品安全免疫检测领域的一株分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。该分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株CPZ，保藏编号为CGMCC NO.45022，分泌产生的扑草净单克隆抗体具有较好亲和力、较高的特异性和较高灵敏度(IC50值为0.65ng/mL)，可用于制备脱落酸的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，建立扑草净的免疫学检测方法，为食品中扑草净残留的检测提供有力的检测方法。

Description

一株分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于食品安全免疫检测领域，具体涉及一株分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
扑草净为水旱地两用的选择性均三嗪类除草剂，具有内吸传导作用。可从根部吸收，也可从茎叶渗入植株，运输至绿色叶片内抑制光合作用，杂草失绿干枯死亡。持效期长达20～70d，适用于水稻、小麦、大豆、棉花、甘蔗、果树、蔬菜等作物，防除一年生阔叶杂草、禾草、莎草及某些多年生杂草，如马唐、狗尾草、稗草、鸭舌草、节节草、看麦娘等及多年生眼子菜、牛毛草等。
目前，扑草净检测方法主要为仪器检测，常用的有高效液相色谱法和气相色谱-质谱法等。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，但存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要开发一种快速，简单的分析扑草净残留物的方法。
酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测扑草净的前提是得到对扑草净具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对扑草净具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。发明人尝试通过杂交瘤细胞制备扑草净单克隆抗体，但在制备能分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备扑草净半抗原和扑草净完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出扑草净单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的扑草净单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一株分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
本发明第一方面提供一株分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株CPZ，其保藏编号为CGMCC NO.45022。
本发明第二方面提供一种扑草净单克隆抗体，其由所述的杂交瘤细胞株CPZ分泌产生。
本发明第三方面提供所述杂交瘤细胞株CPZ或所述扑草净单克隆抗体在扑草净检测中的应用、在制备扑草净免疫检测试剂盒中的应用或在制备扑草净检测胶体金试纸条中的应用。
本发明第四方面提供一种扑草净免疫检测试剂盒，其包含所述杂交瘤细胞株CPZ或所述扑草净单克隆抗体。
进一步地，所述扑草净免疫检测试剂盒还包含酶标板、扑草净包被抗原、扑草净标准液、酶标记二抗和底物反应液。
进一步地，所述扑草净包被抗原具有如下所示结构：
Figure BDA0003487705470000021
本发明第五方面提供一种扑草净检测胶体金试纸条，其包括样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，所述胶体金结合垫上包被所述扑草净单克隆抗体。
进一步地，所述检测线由扑草净包被抗原印制得到。
进一步地，所述扑草净包被抗原具有如下所示结构：
Figure BDA0003487705470000022
本发明第六方面提供所述扑草净免疫检测试剂盒或所述扑草净检测胶体金试纸条在扑草净检测中的应用。
本发明分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：
(1)设计制备扑草净半抗原；
(2)制备扑草净完全抗原，将获得的扑草净完全抗原配制弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；
(3)将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
(4)将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中扑草净抗体含量高的获得免疫的小鼠；
(5)将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的扑草净完全抗原进行；
(6)将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
在本发明的上述制备方法中，所述步骤(2)、(4)中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。
在本发明的上述制备方法中，所述步骤(3)、(5)中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。
在本发明的上述制备方法中，所述步骤(3)、(5)中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫；
在本发明的上述制备方法中，所述步骤(4)中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
在本发明的上述制备方法中，所述步骤(6)中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。
在本发明的上述制备方法中，所述步骤(6)中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG1450)法进行的。
在本发明的上述制备方法中，所述步骤(6)中的培养基为RPMI-1640培养基。
在本发明的上述制备方法中，所述步骤(6)中的亚克隆次数为3次。
本发明的有益效果为：
本发明提供分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株CPZ，该杂交瘤细胞株分泌产生的扑草净单克隆抗体具有较好亲和力、较高的特异性和较高灵敏度(IC50值为0.65ng/mL)，可用于制备脱落酸的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，建立扑草净的免疫学检测方法，为食品中扑草净残留的检测提供有力的检测方法。
附图说明
图1扑草净单克隆抗体的标准抑制曲线；
图2为扑草净半抗原进行LC-MS鉴定结果。
保藏说明
分泌扑草净单克隆抗体杂交瘤细胞株CPZ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名单克隆细胞株，保藏编号CGMCC No.45022，保藏日期2021年12月16日。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
本发明实施例中涉及的培养基如下：
RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B12 0.005、碳酸氢钠2000。
本发明实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％吐温20的PBS；
抗体稀释液：含0.1％明胶的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
本发明实施例中涉及的检测方法如下：
扑草净抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/mL。选择最佳工作点后，将扑草净标准品稀释为8个浓度(0，0.03，0.1，0.3，0.9，2.7，8.1，24.3ng/mL)，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro8.5做图，获得扑草净标准抑制曲线，计算IC50。
实施例1：扑草净半抗原的合成
将三聚氯氰(10g，54.2mmoL)溶解于溶剂四氢呋喃(350mL)中，加入N,N-二异丙基乙胺(24.5g，189.8mmoL)和异丙胺(8.05g，135.6mmoL)，室温搅拌反应72小时，后向反应混合物中加入水，沉淀出所需产物，抽滤收集得到8.5g灰白色固体(化合物1)。取化合物1(2.3g，10.0mmoL)和乙醇(60mL)于150mL烧瓶中混匀，缓慢加入KOH(2.8g，50.1mmoL)和3-巯基丙酸(1.5g，15.0mmoL)，加热回流反应3小时；反应完成后，减压蒸馏除去溶剂；取5％NaOH溶液完全溶解残渣，用氯仿(10mL)萃取3次；取水相，用1M的HCl水溶液酸化至pH 4-5，用乙酸乙酯(3*15mL)萃取三次，合并后的有机层用Na2SO4干燥，过滤并浓缩滤液，从己烷中结晶得到1.1g白色固体状化合物2，即扑草净半抗原。采用负离子模式对扑草净半抗原进行LC-MS鉴定。目标物的保留时间在2.80min，在该保留时间下对应的质谱图(图2)中，质荷比(m/z)298.1时的峰对应于扑草净半抗原(相对分子质量299.1)减氢的实际相对分子质量，证明扑草净半抗原衍生成功。
Figure BDA0003487705470000061
实施例2：扑草净完全抗原的合成
称取2.7mg扑草净半抗原，3.1mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺DMF中，室温搅拌反应5min；再加入5.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，室温搅拌反应6-8h，称为A液；取6mg血蓝蛋白KLH，用0.01M碳酸盐缓冲液CBS稀释至3mg/mL，称为B液；逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应12h；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到扑草净完全抗原-免疫原(如下式)。
Figure BDA0003487705470000062
实施例3：扑草净包被抗原的合成
称取1.3mg扑草净半抗原，1.5mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺DMF中，室温搅拌反应5min；再加入2.6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，室温搅拌反应6-8h，称为A液；取10mg BSA，用0.01M碳酸盐缓冲液CBS稀释至3mg/mL，称为B液；逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应12h；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到扑草净包被抗原(如下式)。
Figure BDA0003487705470000063
实施例4：分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
(1)动物免疫的获得：将扑草净完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；第3次加强免疫结束后第7天进行采血，通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制，筛选出血清中扑草净抗体含量高的获得免疫的小鼠；将筛选出的小鼠再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫。整个免疫过程包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫。
(2)细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为1450)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中培养，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到(1～4)×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：将SP2/0细胞和脾细胞按照2～5:10的计数比例混合，离心后用PEG融合。第1min，将1mL的PEG 1450由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用扑草净为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。
选择对扑草净标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。
按上述方法进行三次亚克隆，最终获得扑草净单克隆抗体细胞株CPZ。
实施例5：扑草净单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106扑草净杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。
在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA，测得扑草净单克隆抗体的IC50值为0.65ng/mL，并验证了其对扑草净类似物的IC50及交叉反应率，结果如表1，说明对扑草净有很好的灵敏度和特异性，可用于扑草净免疫分析检测。
表1：抗体特异性鉴定
Figure BDA0003487705470000081
Figure BDA0003487705470000091
Figure BDA0003487705470000101
实施例6：扑草净单克隆抗体的应用
将杂交瘤细胞株CPZ通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于扑草净的ELISA检测试验，具体步骤如下：
(1)将用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的浓度为0.01μg/mL的包被抗原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，0.03，0.1，0.3，0.9，2.7，8.1，24.3ng/mL的扑草净标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL稀释至0.01μg/mL的抗扑草净单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS以1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
(5)每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H2SO4终止液，450nm测吸光值。
用OriginPro 8.5做图，获得扑草净标准抑制曲线(结果如图1所示)，扑草净单克隆抗体对扑草净的IC50为0.65ng/mL，说明对扑草净有很好的灵敏度，可用于扑草净免疫分析检测。根据扑草净标准抑制曲线和待检测样品的OD450nm值，确定待检测样品中的扑草净含量。
实施例7：扑草净免疫检测试剂盒
本实施例提供一种扑草净免疫检测试剂盒，其包含实施例5制备的扑草净单克隆抗体、酶标板、扑草净包被抗原、扑草净标准液、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗和TMB显色液。
扑草净免疫检测试剂盒检测扑草净的原理为：采用间接竞争ELISA法检测待测样本中扑草净的含量。酶标板微孔内预先包被扑草净包被抗原，加入扑草净标准液或待测样品、扑草净单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗和TMB显色液，制作扑草净标准抑制曲线，根据扑草净标准抑制曲线和待检测样品的吸光度值，确定待检测样品中的扑草净含量。采用本领域常用方法进行操作即可实现扑草净的检测。
实施例8：扑草净检测胶体金试纸条
本实施例提供一种胶体金试纸条，其包括样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，所述胶体金结合垫上包被实施例5制备的扑草净单克隆抗体。所述检测线由扑草净包被抗原印制得到。所述质控线由羊抗鼠IgG二抗印制得到。胶体金试纸条的组装方式采用本领域常用方式即可。
扑草净检测胶体金试纸条检测扑草净的原理为：利用间接竞争法原理检测待测样品中是否含有扑草净。如果待测样品中含有扑草净，则检测线不显色，质控线显色。如果待测样品中不含有扑草净，则检测线和质控线均显色。采用本领域常用方法进行操作即可实现扑草净的检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一株分泌扑草净单克隆抗体的杂交瘤细胞株CPZ，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNO.45022。
2.一种扑草净单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株CPZ分泌产生。
3.权利要求1所述杂交瘤细胞株CPZ或权利要求2所述扑草净单克隆抗体在扑草净检测中的应用、在制备扑草净免疫检测试剂盒中的应用或在制备扑草净检测胶体金试纸条中的应用。
4.一种扑草净免疫检测试剂盒，其特征在于，所述扑草净免疫检测试剂盒包含权利要求1所述杂交瘤细胞株CPZ或权利要求2所述扑草净单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的扑草净免疫检测试剂盒，其特征在于，所述扑草净免疫检测试剂盒还包含酶标板、扑草净包被抗原、扑草净标准液、酶标记二抗和底物反应液。
6.根据权利要求5所述的扑草净免疫检测试剂盒，其特征在于，所述扑草净包被抗原具有如下所示结构：
Figure FDA0003487705460000011
7.一种扑草净检测胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金试纸条包括样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，所述胶体金结合垫上包被权利要求2所述扑草净单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的扑草净检测胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线由扑草净包被抗原印制得到。
9.根据权利要求8所述的扑草净检测胶体金试纸条，其特征在于，所述扑草净包被抗原具有如下所示结构：
Figure FDA0003487705460000021
10.权利要求4所述扑草净免疫检测试剂盒或权利要求7所述扑草净检测胶体金试纸条在扑草净检测中的应用。
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