CN113490680A

CN113490680A - 用于化妆品的肽和组合物

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Publication number: CN113490680A
Application number: CN202080014900.5A
Authority: CN
Inventors: A·格鲁-卡普斯坦尼; S·巴斯特; P·卡鲁亚; J·C·埃斯古德罗; J·A·波拉斯; M·J·克雷恩
Original assignee: Lipotrue SL
Current assignee: Lipotrue SL
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2040-03-26
Also published as: CN113490680B; KR20210145158A; AU2020247128A1; AU2020247128B2; WO2020193673A1; US12161745B2; JP2022531076A; EP3894425A1; US20220142899A1

Abstract

本发明涉及能够增加同源域蛋白Mohawk的合成并因此可用作抗老化剂和嫩化剂的肽家族。

Description

用于化妆品的肽和组合物

本发明涉及分子生物学领域，更准确地说，涉及应用于化妆品的分子生物学，甚至更准确地说，涉及能够增加Mohawk的表达和合成的肽和包含所述肽的组合物。

在过去的几十年中，人群的预期寿命显著增加。此外，人们也越来越关注个人美学，并试图延迟或尽量减少与老化相关的迹象的出现。

皮肤是人类最大的器官，并且由于其在身体界面中的位置，经受内在(按时间)老化和外在老化。皮肤老化是一个复杂的生物过程，其受内源性和外源性因素(内源性：遗传、细胞代谢、激素和代谢过程；外源性：慢性光照暴露、污染、电离辐射、化学物、毒素)的组合的影响，并因此导致皮肤中的变化和其中缺陷的出现(例如，丧失紧致度、皱纹、粗糙和/或松弛)。

这些因素在皮肤的不同层引起累积性结构和生理变化以及整体皮肤外观的变化(Ganceviciene,R.,Liakou,A.I.,Theodoridis,A.,等人(2012)Skin Anti-AgingStrategies.Dermato-Endocrinology,4,308-319)。

真皮的三个主要结构成分是胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖(GAG)，它们一直是大多数抗老化研究以及与皮肤有关的美学抗老化策略(其范围从“抗皱纹霜”到各种填充剂)的尝试的对象(Baumann,L.(2007),Skin ageing and its treatment.J.Pathol.,211,241-251)。

胶原蛋白构成一个大家族的细胞外基质(ECM)蛋白，其在支持多细胞动物的各种组织的结构方面发挥着重要作用。纤维状胶原蛋白的机械强度高度依赖于个体原纤维之间共价交联的形成，这是由赖氨酰氧化酶(LOX)家族成员的酶促作用引发的过程。胶原蛋白的生物合成是一个高度复杂的过程，涉及许多步骤，包括链缔合和折叠、分泌、原胶原蛋白加工和交联。以人I型胶原蛋白(其是一种由两条α1和一条α2链组成的异源三聚体分子)为例，在核糖体上合成并将它们运输到粗面内质网中后，胶原蛋白链经受一系列翻译后修饰，导致原胶原蛋白链的组装(Rodriguez-Pascual,F.,Slatter,D.A.(2016)Collagen cross-linking:insights on the evolution of metazoan extracellular matrix.ScientificReports,6,37374)。

此外，胶原蛋白是人体最丰富的蛋白质(按干重计70％)，并主要由纤维状I型胶原蛋白和III型胶原蛋白组成，它们共同提供了组织的大部分强度和刚度。虽然次要胶原蛋白占总胶原蛋白含量的不到10％，但它们在ECM组织中起着关键作用(Lovell,C.,Smolenski,K.,Duance,V.,Light,N.,Young,S.,Dyson,M.(1987)Type I and III collagen contentand fibre distribution in normal human skin during ageing.British Journal ofDermatology,117,419-428；和Theocharidis,G.,Connelly,J.T.(2017)Minor collagensof the skin with not so minor functions.J.Anat.)。事实上，已经证明胶原蛋白VI有助于胶原蛋白I的适当结合和结构(Bonaldo,P等人(1990)Structural and FunctionalFeatures of theα3Chain Indicate a Bridging Role for Chicken Collagen VI inConnective Tissues.Biochemistry,29,1245-1254)。除了其基本的结构功能外，胶原蛋白还参与细胞粘附、趋化和迁移。它们与细胞、生长因子和细胞因子动态相互作用，以在细胞生长、分化、形态发生和伤口修复过程中调节组织重塑(van der Rest,M.,Garrone,R.(1991)Collagen family of proteins.FASEB J.,13,2814-23.；Singer,A.J.,Clark,R.A.(1999)Cutaneous wound healing.NEngl J Med.,341(10),738-46；Gelse,K.,

E.,Aigner,T.(2003)Collagens—structure,function,and biosynthesis.AdvancedDrug Delivery Reviews,55(12),1531-1546；和Ricard-Blum S.(2011).The collagenfamily.Cold Spring Harbor perspectives in biology,3(1),a004978)。

胶原蛋白破坏以及对皮肤其他结构成分(即弹性和网状纤维)的损害被认为是老化皮肤外观的特征变化的基础(Bailey,A.J.(2001).Molecular mechanisms of ageingin connective tissue.Mech Ageing Dev,122pp.735-755；Schwartz,E.,Cruickshank,F.A.,Perlish,J.S.,Fleischmajer,R.(1989)Alterations in dermal collagen inultraviolet irradiated hairless mice.J Invest Dermatol,93,pp.142-146；Schwartz,E.,Cruickshank,F.A.,Christensen,C.C.,Perlish,J.S.,Lebwohl,M.(1993)Collagen alterations in chronically sun-damaged human skin.PhotochemPhotobiol,58,pp.841-844；Smith,J.G.,Davidson,E.A.,Sams,W.M.,Clark,R.D.(1962)Alterations in human dermal connective tissue with age and chronic sundamage.J Invest Dermatol,39,pp.347-350；Maloney,S.J.,Edmonds,S.H.,Giddens,L.D.,Learn,D.B.(1992)The hairless mouse model of photoaging:Evaluation of therelationship between dermal elastin,collagen,skin thickness andwrinkles.Photochem Photobiol,56,pp.505-511；Fligiel,S.E.G.,Varani,J.,Datta,S.C.,Kang,S.,Fisher,G.J.,Voorhees,J.J.(2003)Collagen Degradation in Aged/Photodamaged Skin in Vivo and after Exposure to Matrix Metalloproteinase-1inVitro.J.Invest.Dermatol.,120,pp.842-848；和Marks,R.(Ed.)(1992)Sun-DamagedSkin.Martin Dunitz,London)。

此外，已经描述了同源域蛋白Mohawk(Mkx)在皮肤中大量表达(Uhlen,M.等人(2015)Proteomics.Tissue-based map of the human proteome.Science 347,1260419)，并且所述蛋白质与胶原蛋白的合成增加和胶原蛋白原纤维形成增加以及与细胞外基质的生成相关的其他基因的适当调节有关(Nakamichi,R.等人(2016)Mohawk promotes themaintenance and regeneration of the outer annulus fibrosus of intervertebraldiscs.nature communications,7:12503；Nakahara,H.(2013)Transcription FactorMohawk and the Pthogenesis of Human Anterior Criciate LigamentDegradation.arthritis&rheumatism,vol.65,8,2081-2089)。

近年来，用于改善皮肤老化的迹象(例如丧失紧致度、皮肤肌理和皱纹)的活性成分的数量显著增加。此类活性成分的例子是类视黄醇类物质、维生素或植物提取物(Bradley E.J.,Griffiths C.E.M.,Sherratt M.J.,Bell M.和Watson R.E.B.(2015),Over-the-counter anti-ageing topical agents and their ability to protect andrepair photoaged skin.Maturitas,80,265-272)。

在类视黄醇类物质的情况下，值得注意的是视黄酸，它是当今诱导ECM的多种分子(例如，胶原蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白；Varani J.,Mitra R.S.,Gibbs D.,Phan S.H.,Dixit V.M.,Mitra R.,Wang T.,Siebert K.J.,Nickoloff B.J.,Voorhees J.J.(1990),All-Trans Retinoic Acid Stimulates Growth and Extracellular Matrix Productionin Growth-Inhibited Cultured Human Skin Fibroblasts.The Journal ofInvestigative Dermatology,94,717-723)的合成的“金标准”。因此，视黄酸被认为是治疗老化迹象最强大的化合物之一，因为它可以通过上调ECM的蛋白质(例如胶原蛋白和纤连蛋白)的转录和合成和基质金属蛋白酶(以下简称MMP)的抑制来显著改善面部皱纹的临床外观(Varani J.,Mitra R.S.,Gibbs D.,Phan S.H.,Dixit V.M.,Mitra R.,Wang T.,Siebert K.J.,Nickoloff B.J.,Voorhees J.J.(1990),All-Trans Retinoic AcidStimulates Growth and Extracellular Matrix Production in Growth-InhibitedCultured Human Skin Fibroblasts.The Journal of Investigative Dermatology,94,717-723)。然而，使用视黄酸有几个缺点，例如：必须谨慎使用视黄酸，因为它可能容易产生皮肤刺激，并且不建议将视黄酸和日光暴露结合。使用类视黄醇类物质时的另一个主要问题是它们的不稳定性，尤其是在氧和光存在的情况下(Sorg O.,Antille C.,Kaya G.和Saurat J-H.(2006),Retinoids in cosmeceuticals.Dermatologic Therapy,19,289-296)。

还使用抗氧化剂以降低皮肤中自由基的浓度，从而抵消胶原蛋白降解。所述抗氧化剂的一个例子是抗坏血酸(也称为维生素C)。除了其抗氧化作用外，抗坏血酸还诱导来自ECM的蛋白质(胶原蛋白I和III以及弹性蛋白)的合成，同时促进表皮分化并抑制基质金属蛋白酶-1(MMP1)等。不幸的是，抗坏血酸极其不稳定，并且尤其是在高温、有氧条件、高pH和/或在暴露于光时发生氧化(Manela-Azulay M.,Azulay V.,Aguinaga F.,Issa M.C.(2017),Vitamins and other Antioxidants.Daily Routine in Cosmetic Dermatology,1-13)。

除了化学合成的化合物外，市场上还存在具有多种应用的范围广泛的植物提取物和植物衍生化合物，例如包含白藜芦醇(一种抗氧化剂)的葡萄提取物；包含多酚的绿茶；或含有异黄酮的大豆。然而，这些成分的体内功效和组成没有得到充分的科学验证。

透明质酸由于其粘弹性和保水能力也被用于化妆品行业以保持皮肤水分、保持弹性和通过改善粗糙度处理皱纹，或甚至用作真皮填充剂。然而，目前透明质酸获自几种来源，例如鸡冠或细菌提取物，因此这些产品可能含有杂质并且需要经过彻底表征(KoganG.,Soltés L.,Stern R.和Gemeiner P.(2007),Hyaluronic acid:a natural biopolymerwith a broad range of biomedical and industrial applications.BiotechnologicalLetters 29,17-25)。

另一方面，肽也可以掺入化妆品配方中，以改善皮肤老化的迹象。生物活性肽可以模仿身体自身的分子并影响过程例如胶原蛋白合成，其优点是具有好得多的耐受性和稳定性。此外，还可以针对它们开发广泛的活性、化学物质和适应证(Zhang L.和Falla T.J.(2009),Cosmeceuticals and peptides.Clinics in dermatology,27,485-494)。

尽管本领域中有多种化合物和/或提取物，但仍然需要具有新作用机制的替代组合物，其允许预防、减少和/或消除皮肤老化的迹象(随时间和/或环境老化)和/或提供皮肤嫩化(skin rejuvenation)。

本发明的发明人经过广泛和详尽的研究，惊奇地发现了提供同源域蛋白Mohawk的增加的表达和合成和因此增加的胶原蛋白表达和合成的肽。此外，本发明的发明人发现的肽调节基因表达，从而有利于或上调负责合成和构建细胞外基质的基因，同时抑制或下调负责降解所述细胞外基质的基因。本发明的肽还增加胶原蛋白合成并改善皮肤外植体中的胶原蛋白密度和厚度。此外，它们的皮肤平滑特性以及抗皱和抗老化作用已在体内得到证实。因此，本发明的肽显示出抗老化和嫩化活性，因此解决了现有技术中存在的和上文所述的问题。

发明人不知晓提供具有上述作用机制和因此具有上述活性的肽的任何现有技术。

在第一方面，本发明涉及能够增加同源域蛋白Mohawk的肽。

在第二个方面，本发明涉及包含本发明的肽的组合物。

此外，本发明在第三方面涉及本发明的肽或组合物在有此需要的受试者中用作化妆品的用途。

在第四个方面，本发明涉及本发明的肽或组合物在有此需要的受试者中的美容用途。

在第五方面，本发明涉及一种美容方法，其特征在于它包括在有此需要的受试者中使用本发明的肽或组合物。

如本文所用，术语“非环状脂族基团”(non-cyclic aliphatic group)及其复数具有现有技术中所述术语的一般含义。因此，这些术语指的是，例如且不限于，直链或支链烷基、烯基和炔基基团。

如本文所用，术语“烷基基团”及其复数是指饱和的直链或支链基团，其具有1至24个，优选1至16个，更优选1至14个，甚至更优选1至12个，甚至仍更优选1、2、3、4、5或6个碳原子，并且通过简单键与分子的其余部分键合，包括例如且不限于，甲基，乙基，异丙基(isopropyl)，正丙基，异丙基(i-propyl)，异丁基，叔丁基，正丁基，仲丁基，正戊基，正己基，庚基，辛基，癸基，十二烷基，月桂基，十六烷基，十八烷基，戊基，2-乙基己基，2-甲基丁基，5-甲基己基和类似基团。烷基基团可以任选地被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。

如本文所用，术语“烯基基团”及其复数是指以下直链或支链基团，其具有2至24个，优选2至16个，更优选2至14个，甚至更优选2至12个，甚至仍更优选地2、3、4、5或6个碳原子，具有一个或多个碳-碳双键，优选具有1、2或3个碳-碳双键(共轭或非共轭的)，其通过单键与分子的其余部分结合，包括例如且不限于乙烯基、油烯基、亚油基和类似基团。烯基基团可以任选地被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。

如本文所用，术语“炔基基团”及其复数是指以下直链或支链基团，其具有2至24个，优选2至16个，更优选2至14个，甚至更优选2至12个，甚至仍更优选地2、3、4、5或6个碳原子，具有一个或多个碳-碳三键，优选具有1、2或3个碳-碳三键(共轭或非共轭的)，其通过单键与分子的其余部分结合，包括例如且不限于乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，3-丁炔基，戊炔基(pentinyl)例如1-戊炔基，和类似基团。炔基基团可任选被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。

如本文所用，术语“脂环族基团”及其复数具有现有技术中所述术语的一般含义。因此，这些术语用于指例如且不限于环烷基或环烯基或环炔基基团。

如本文所用，术语“环烷基”及其复数是指饱和的单环或多环脂肪族基团，其具有3至24个，优选3至16个，更优选3至14个，甚至更优选3至12个，甚至仍更优选3、4、5或6个碳原子，并且其通过单键与分子的其余部分结合，包括例如且不限于环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，甲基环己基，二甲基环己基，八氢茚(octahydroindene)，十氢萘，十二氢-非那烯(phenalene)，金刚烷基(adamantyl)和类似基团，并且可以任选地被一个或多个基团取代，例如烷基，卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。

如本文所用，术语“环烯基”及其复数是指以下非芳族单环或多环脂肪族基团，其具有5至24个，优选5至16个，更优选5至14个，甚至更优选5至12个，甚至仍更优选5或6个碳原子，具有一个或多个碳-碳双键，优选具有1、2或3个碳-碳双键(共轭或非共轭的)，其通过单键与分子的其余部分结合，包括例如且不限于环戊-1-烯-1-基和类似基团，并且其可以任选地被一个或多个基团取代例如烷基，卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。

如本文所用，术语“环炔基”及其复数是指以下非芳族单环或多环脂肪族基团，其具有8至24个，优选地8至16个，更优选地8至14个，甚至更优选地8至12个，甚至仍更优选8或9个碳原子，具有一个或多个碳-碳三键，优选具有1、2或3个碳-碳三键(共轭或非共轭的)，并且其通过单键与分子的其余部分结合，包括例如且不限于环辛-2-炔-1-基和类似基团，并且其可以任选地被一个或多个基团取代，例如烷基，卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。

如本文所用，术语“芳基基团”及其复数是指芳香族基团，其具有6至30个，优选6至18个，更优选6至10个，甚至更优选6或10个碳原子，其包括1、2、3或4个芳香环，由碳-碳键结合或稠合，并通过单键与分子的其余部分结合，包括例如且不限于苯基，萘基，二苯基，茚基，菲基或蒽基等。芳基基团可任选地被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。

如本文所用，术语“芳烷基基团”及其复数是指被芳基基团取代的烷基，其具有7至24个碳原子且包括例如且不限于-(CH₂)1-6-苯基、-(CH₂)1-6-(1-萘基)、-(CH₂)1-6-(2-萘基)、-(CH₂)1-6-CH(苯基)₂和类似基团。芳烷基可任选地被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。

如本文所用，术语“杂环基”及其复数是指3-10元杂环或烃环，其中一个或多个环原子，优选1、2或3个环原子是不同于碳的元素，比如氮、氧或硫，且可以是饱和或不饱和的。为了本发明的目的，杂环基可以是环状，单环，双环或三环系统，其可以包括稠合环系；且氮、碳或硫原子可任选地在杂环基中被氧化；氮原子可任选被季铵化；且杂环基可以是部分或全部饱和的，或者可以是芳香族的。逐渐优选地，术语杂环涉及5或6元环。杂环基团可以任选地被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。

如本文所用，术语“杂芳基烷基基团”及其复数是指被经取代或未取代的芳香族杂环基取代的烷基基团，该烷基基团具有1至6个碳原子，并且该芳香族杂环基具有2至24个碳原子和1-3个碳原子以外的原子，且包括例如且不限于-(CH₂)1-6-咪唑基、-(CH₂)1-6-三唑基、-(CH₂)1-6-噻吩基、-(CH₂)1-6-呋喃基、-(CH₂)1-6-吡咯烷基和类似基团。杂芳基烷基基团可任选地被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。

如本文件所用，术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘，并且其阴离子称为卤化物。

如本文所用，术语“衍生物”及其复数是指化妆品上可接受的化合物(即可用于化妆品制备的衍生自目标化合物的)以及化妆品上不可接受的衍生物(因为这些可能用于制备化妆品上可接受的衍生物)两者。

如本文件中所用，术语“盐”及其复数是指现有技术中已知那些中的任何类型的盐，例如卤化物盐，羟基酸盐(例如含氧酸盐，酸盐，碱性盐和复盐)，羟基盐，混合盐，含氧盐或其他水合盐。该术语包括化妆品和化妆品不可接受的盐，因为后者可能可用于制备化妆品可接受的盐。

如本文件中所用，术语“异构体”及其复数是指光学异构体，对映异构体，立体异构体或非对映异构体。单独的对映异构体或非对映异构体以及其混合物可以通过现有技术中已知的常规技术来分离。

如本文所用，术语“溶剂化物”及其复数是指现有技术中已知的任意溶剂化物，例如极性、非极性或两亲性溶剂化物，并且包括当施用或应用于目标受试者(直接或间接)时提供目标化合物(本发明的一种或多种肽)的任何化妆品可接受的溶剂化物。优选地，溶剂化物是水合物，与醇例如甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇的溶剂化物，与酯例如乙酸乙酯的溶剂化物，与醚例如甲醚、乙醚或THF(四氢呋喃)的溶剂化物，或与DMF(二甲基甲酰胺)的溶剂化物，更优选地是水合物或与醇如乙醇的溶剂化物。

另外，如本文所用，术语“氨基酸”及其复数包括通过遗传密码编码的氨基酸以及非编码的氨基酸，无论它们是否为天然的以及它们是否为D-和L-氨基酸。非编码的氨基酸的实例是但不限于瓜氨酸，鸟氨酸，肌氨酸，锁链素，正缬氨酸，4-氨基丁酸，2-氨基丁酸，2-氨基异丁酸，6-氨基己酸，1-萘基丙氨酸，2-萘基丙氨酸，2-氨基苯甲酸，4-氨基苯甲酸，4-氯苯丙氨酸，2,3-二氨基丙酸，2,4-二氨基丁酸，环丝氨酸，肉碱，半胱氨酸，青霉胺，焦谷氨酸，噻吩基丙氨酸，羟脯氨酸，别-异亮氨酸，别-苏氨酸，异哌啶酸(isonipecotic acid)，异丝氨酸，苯甘氨酸，他汀类，β-丙氨酸，正亮氨酸，N-甲基氨基酸，α-氨基酸和β-氨基酸等及其衍生物。然而，其他非天然氨基酸在现有技术中是已知的(例如，参见D.C.Roberts和F.Vellaccio的“Unusual amino acids in peptide synthesis”,The Peptides,Vol.5(1983),Chapter VI,Gross E.和Meienhofer J.编,Academic Press,New York,USA)。

如本文所用，关于肽、多肽和蛋白质的“同一性百分比”具有现有技术中通常所属的含义，并因此涉及两个氨基酸序列(其在这些序列的最佳比对之后进行比较)之间相同的氨基酸的百分比，其中所述百分比仅仅是统计的并且两个氨基酸序列之间的差异在整个序列中随机分布。“最佳比对”被理解为产生更大百分比同一性的氨基酸序列比对。同一性百分比是通过确定两个比较的序列中氨基酸相同的相同位置的数量、将相同位置的数量除以比较的位置的数量并将所得结果乘以100以获得两个序列之间的同一性百分比来计算的。两个氨基酸序列之间的序列比较可以手动或通过本领域已知的计算机程序(例如BLAST(基本局部比对搜索工具)算法)进行。

如本文所用，“同源域蛋白Mohawk”、“Mohawk”和“Mkx”是等同的，可互换使用并且是指被称为同源域蛋白Mohawk的蛋白质，除非另有明确说明。

如前所述，在第一方面，本发明涉及能够增加Mohawk(以下称为Mkx)的肽、其可接受的异构体、盐、溶剂化物和/或衍生物和/或其混合物。

Mohawk在施加肽的受试者中增加。更优选地，在哺乳动物中，甚至更优选地在人中。

优选地，Mohawk的增加是Mohawk的基因表达和蛋白质合成的增加。

涵盖本发明的肽中使用或存在的氨基酸是L-氨基酸、D-氨基酸或其组合。在一个优选的实施方案中，本发明的肽中使用或存在的氨基酸是L-氨基酸。

优选地，上述异构体是立体异构体。涵盖所述立体异构体是对映异构体或非对映异构体。因此，在本发明的优选实施方案中，该肽是外消旋混合物、非对映异构混合物、纯的对映异构体或纯的非对映异构体。

优选地，本发明的肽包含2至50个氨基酸，更优选地，4至10个氨基酸，更优选地，4至6个氨基酸，甚至更优选地，4个氨基酸。

涵盖本发明的肽包含在其N末端和/或其C末端结合的至少一个部分。所述至少一个部分可以通过现有技术中已知的任何方式，优选共价地与肽结合。在一个优选的实施方案中，该肽包含一个与其N末端共价结合的部分和一个与其C末端共价结合的部分。

在一个实施方案中，至少一个N末端部分(优选地，一个N末端部分)选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基和R₅-CO-，其中R₅选自由以下形成的基团：取代或未取代的C₁-C₂₄烷基，取代或未取代的C₂-C₂₄烯基，取代或未取代的C₂-C₂₄炔基，取代或未取代的C₃-C₂₄环烷基，取代或未取代的C₅-C₂₄环烯基，取代或未取代的C₈-C₂₄环炔基，取代或未取代的C₆-C₃₀芳基，取代或未取代的C₇-C₂₄芳烷基，取代或未取代的3至10元的杂环基，以及取代或未取代的具有2到24个碳原子和1-3个碳原子以外的原子和1-6个碳原子的烷基链的杂芳基烷基。甚至更优选地，至少一个N末端部分(优选地，一个N末端部分)选自乙酰基(下文中为Ac)或棕榈酰基(以下称为Pal)。在最优选的实施方案中，至少一个N末端部分(优选地，一个N末端部分)是Pal。

在一个实施方案中，至少一个C末端部分(优选地，一个C末端部分)选自H，-NR₃R₄-，-OR₃和-SR₃，其中R₃和R₄独立地选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基团，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基以及取代或未取代的芳烷基。甚至更优选地，至少一个C末端部分(优选地，一个C末端部分)选自H或NH₂。在最优选的实施方案中，至少一个C末端部分(优选一个C末端部分)是NH₂。

因此，更优选地，本发明的肽包含一个与N末端结合的部分和一个与C末端结合的部分，其中与N末端结合的部分为Pal且与C末端结合的部分是NH₂。

在一个优选的实施方案中，本发明的肽的序列依照式(I)：

R₁-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-R₂

(I)

其化妆品可接受的异构体、盐、溶剂化物和/或衍生物和其混合物，其中：

AA₁是His；

AA₂选自具有芳香族侧链的氨基酸组；

AA₃选自Lys或Arg；

AA₄选自具有脂肪族非极性侧链的氨基酸组。

R₁选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基和R₅-CO-，其中R₅选自以下形成的组：取代或未取代的C₁-C₂₄烷基，取代或未取代的C₂-C₂₄烯基，取代或未取代的C₂-C₂₄炔基，取代或未取代的C₃-C₂₄环烷基，取代或未取代的C₅-C₂₄环烯基，取代或未取代的C₈-C₂₄环炔基，取代或未取代的C₆-C₃₀芳基，取代或未取代的C₇-C₂₄芳烷基，取代或未取代的3至10元的杂环基环，以及取代或未取代的具有2至24个碳原子和1至3个碳以外的原子和1至6个碳原子的烷基链的杂芳基烷基；和

R₂选自H、-NR₃R₄-、-OR₃和-SR₃，其中R₃和R₄独立地选自H、取代或未取代的非环状脂肪族基团、取代或未取代的脂环基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂芳烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的芳烷基。

如上所述，涵盖在本发明的肽中使用或存在的氨基酸是L-氨基酸、D-氨基酸或其组合。在一个优选的实施方案中，本发明的肽中使用或存在的氨基酸是L-氨基酸。

同样如上所述，优选地，上述异构体是立体异构体。涵盖所述立体异构体是对映异构体或非对映异构体。因此，在本发明的优选实施方案中，肽是外消旋混合物、非对映异构混合物、纯对映异构体或纯非对映异构体。

R₁优选地选自Pal或Ac，甚至更优选地，R₁是Pal。

优选地，R₂选自H或NH₂，甚至更优选地，R₂是NH₂。

因此，更优选地，R₁是Pal并且R₂是NH₂。

优选地，在式(I)中，AA₂选自Phe、Tyr和Trp，更优选AA₂为Tyr。

优选地，在式(I)中，AA₃是Arg。

还优选地，在式(I)中，AA₄选自Ala、Val、Leu和Ile，更优选地AA₄是Ala。

因此，在一个优选的实施方案中，在式(I)中：

AA₁是His；

AA₂选自Phe、Tyr和Trp；

AA₃选自Lys或Arg；

AA₄选自Ala、Val、Leu和Ile；

更优选地，在式(I)中：

AA₁是His；

AA₂选自Phe、Tyr和Trp；

AA₃为Arg；

AA₄选自Ala、Val、Leu和Ile。

甚至更优选地，根据本发明的肽(即，式(I)的肽)的序列是：

-R₁-His-Tyr-Arg-Ala-R₂(R₁-SEQ ID NO：1-R₂)；

在最优选的实施方案中，本发明的肽的序列(即根据式(I))是：

-Pal-His-Tyr-Arg-Ala-NH₂(Pal-SEQ ID NO：1-NH₂)；

本发明的肽可以通过本领域已知的任何方式合成和生产。例如，它们可以通过化学合成(优选通过固相肽合成)、在细胞培养物中表达所述肽或通过在植物或动物中转基因生产肽来合成和生产。此外，本发明的肽可以通过本领域已知的任何方式纯化。

从下文包括的实施例可以明显看出，本发明的肽提供Mohawk以及胶原蛋白VI的增加的表达和合成。此外，它们调节基因表达从而有利于或上调负责合成和构建细胞外基质的基因，同时抑制或下调负责降解所述细胞外基质的基因。本发明的肽还增加胶原蛋白合成并改善皮肤外植体中的胶原蛋白密度和厚度。此外，当局部应用于女性受试者的面部时，它们具有皮肤平滑、抗皱和抗老化作用。

因此，本发明的肽解决了上文所述的问题并提供了具有美容活性(例如抗老化和嫩化活性)的另外的或替代的肽，其能够改善与老化相关的皮肤的迹象，例如，皱纹、粗糙和/或松弛；或提供皮肤嫩化和/或改善皮肤缺陷，例如身体紧致、塑身、面部复位、皮肤收紧和/或毛孔细致。

还在本发明的范围内的是这样的肽，其纳入了关于如上所述的本发明的任何肽的保守氨基酸取代并且仍然显示本发明的肽的本文所述的活性。

此外，还在本发明的范围内的是这样的肽，其与肽R₁-His-Tyr-Arg-Ala-R₂(优选地，Pal-His-Tyr-Arg-Ala-NH₂)具有70％同一性百分比，优选80％、更优选90％、更优选95％、甚至更优选99％同一性百分比并且仍然显示本发明的肽的本文所述的活性。

在一个优选的实施方案中，本发明的肽适合于或适应于通过离子电渗疗法应用，更优选地，应用于受试者的面部和/或身体，更优选地，应用于受试者的面部、颈部、手、臂、腿、乳房和/或臀部，甚至更优选应用于受试者(优选人)的面部和/或颈部。

在最优选的实施方案中，本发明的组合物适合于或适应于局部应用，更优选地，应用于受试者的面部和/或身体，更优选地，应用于受试者的面部、颈部、手、臂、腿、乳房和/或臀部，甚至更优选应用于受试者(优选人)的面部和/或颈部。

在第二个方面，本发明涉及包含至少一种根据本发明的肽的组合物。

涵盖本发明的组合物包含本发明的一种类型的肽或本发明的不同肽的组合或混合物，优选地，包含本发明的一种类型的肽。

在一个优选的实施方案中，本发明的组合物是化妆品组合物。

本发明的组合物包含化妆品有效量的本发明的至少一种肽。更优选地，本发明的组合物包含0.0001％(以g/100mL计的质量/体积，下文中称为m/v)至0.05％(m/v)的本发明的至少一种肽。在一个最优选的实施方案中，本发明的组合物包含0.0001％(m/v)至0.001％(m/v)，更优选0.0005％(m/v)的本发明的至少一种肽。在另一个最优选的实施方案中，本发明的组合物包含0.05％(m/v)至0.001％(m/v)的本发明的至少一种肽。

由于本发明的肽的活性，本发明的组合物提供了与老化相关的皮肤的迹象例如皱纹、粗糙和/或松弛的改善；或提供皮肤嫩化和/或改善皮肤缺陷，例如身体紧致、塑身、面部复位、皮肤收紧和/或毛孔细致。

涵盖本发明的组合物还包含至少一种另外的化妆品成分。所述另外的化妆品成分可以是至少一种赋形剂和/或至少一种另外的化妆品活性成分。

另外的化妆品成分包括在现有技术中通常使用的那些，如例如，佐剂例如稳定剂，增溶剂，维生素，着色剂和香料；载体；和/或其他化妆品活性成分。

所述另外的化妆品成分必须与其余的组合物组分，特别是与本发明的组合物中包含的本发明的肽在物理和化学上相容。同样，所述另外的化妆品成分的性质不能不可接受地改变本发明的肽和组合物的益处。所述另外的化妆品成分可以是合成或天然来源的，如例如植物提取物，或者它们可以源自生物发酵工艺(参见，例如CTFA Cosmetic IngredientHandbook，第11版(2006))。

涵盖上述另外的化妆品成分包括通常在组合物中用于以下的那些成分：护理；清洁皮肤和/或头发；和/或除臭剂和/或乳膏以防止多汗症；如例如，抑制黑色素合成的试剂，增白剂或脱色剂，抗老化剂，抑制NO-合酶的试剂，抗氧化剂，抗大气污染剂和/或自由基捕获剂，抗糖化剂，乳化剂，润肤剂，有机溶剂，液体推进剂，皮肤调理剂(如例如润湿剂)，保湿物质，α羟基酸，增湿剂，维生素，色素或着色剂，染料，胶凝聚合物，增稠剂，表面活性剂，柔软剂，其他抗皱剂，能够减少或消除眼袋的试剂，去角质剂，抗微生物剂，抗真菌剂，杀菌剂，刺激真皮或表皮大分子合成的试剂和/或能够防止或抑制其降解的试剂，如例如刺激胶原蛋白合成的试剂，刺激弹性蛋白合成的试剂，促进层粘连蛋白合成的试剂，抑制胶原蛋白降解的试剂，抑制弹性蛋白降解的试剂，刺激成纤维细胞增殖的试剂，刺激角质形成细胞增殖的试剂，刺激角质形成细胞分化的试剂，刺激脂质合成和角质层成分(神经酰胺、脂肪酸等)合成的试剂，真皮松弛(dermorelaxing)剂，刺激糖胺聚糖合成的试剂，DNA修复剂，DNA保护剂，刺激蛋白体活性的试剂，抗瘙痒剂，治疗敏感性皮肤的试剂，重紧致(reaffirming)剂，收敛剂，皮脂产生调节剂，刺激脂肪分解的试剂，抗脂肪团剂，镇静剂(calming agent)，消炎剂，作用于毛细血管循环和/或微循环的试剂，作用于细胞线粒体的试剂，旨在改善真皮-表皮连接的试剂，防腐剂，香料，螯合剂，植物提取物，精油，海洋提取物，源自生物发酵工艺的试剂，矿物盐，细胞提取物和/或太阳过滤性物质(有活性地抗紫外线A和B的有机或矿物光防护剂)，等等。

在一个实施方案中，至少一种另外的化妆品成分是化妆品活性成分或物质，其可以发挥与上文针对本发明的肽所公开的相同、相似、互补或不同的化妆品活性。涵盖本发明的组合物包含其他抗皱或抗老化剂，例如胶原蛋白，弹性蛋白，生长因子，透明质酸增强剂，屏障功能剂，提亮剂，刺激胶原蛋白I、III、IV和/或VI和层粘连蛋白的表达和/或合成的试剂；刺激糖胺聚糖或透明质酸合成的试剂；刺激弹性蛋白和其他弹性纤维相关蛋白的表达和/或合成的试剂；抑制胶原蛋白和/或弹性纤维降解的试剂；刺激线粒体相关蛋白(例如sirtuins和顺乌头酸酶)表达和/或合成的试剂；刺激粘着斑蛋白表达和/或合成的试剂；刺激角质形成细胞和/或成纤维细胞增殖和/或分化的试剂；抗氧化剂；抗大气污染剂和/或自由基捕获剂；抗糖化剂；排毒剂；减少时间老化、环境老化和炎症老化的试剂；以及降低黑色素生成和/或抑制酪氨酸酶的试剂和/或刺激脂质合成和表皮成分(角蛋白)更特别是角质层成分(角蛋白、神经酰胺、丝聚蛋白、兜甲蛋白(loricrin)和SPRR1B)的合成的试剂。更优选地，至少一种另外的化妆品成分是

(乙酰六肽-8)，

(五肽-3)，

(乙酰六肽-30)，

(三肽-3)或其组合。

另外，本发明的组合物(或本发明的肽)可以以现有技术中通常使用的任何形式配制，例如配制为溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、凝胶、乳膏、粉末、喷雾剂、洗剂、油、搽剂、精华液(serum)、摩丝(mousse)、软膏、棒或笔状，包括“免洗”和“冲洗”配方。本发明的组合物还可以通过现有技术中已知的技术掺入不同类型的固体附件中，例如小毛巾、水凝胶、粘合性(或非粘合性)贴剂或面膜，或者它可以掺入不同的化妆系列产品中，例如遮瑕膏，化妆粉底液，乳液(lotion)或卸妆乳液等。

还涵盖如本文所公开的本发明的组合物或本发明的肽也可以掺入化妆品持续释放系统和/或载体中，例如脂质体，毫米颗粒，微米颗粒和纳米颗粒，以及在海绵，囊泡，胶束，毫米球，微米球，纳米球，脂质球，毫米胶囊，微米胶囊和纳米胶囊中，以及在微乳剂和纳米乳剂中，目的是使活性成分具有更大的穿透性。

在一个优选的实施方案中，本发明的组合物适合于或适应于通过离子电渗疗法应用，更优选地，应用于受试者的面部和/或身体，更优选地，应用于受试者的面部、颈部、手、臂、腿、乳房和/或臀部，甚至更优选应用于受试者(优选人)的面部和/或颈部。

在最优选的实施方案中，本发明的组合物适合于或适应于局部应用(更优选地，以乳膏的形式)，更优选地，应用于受试者的面部和/或身体，更优选地，应用于受试者的面部、颈部、手、臂、腿、乳房和/或臀部，甚至更优选应用于受试者(优选人)的面部和/或颈部。

如上所述，在第三个方面，本发明涉及本发明的肽或组合物在有此需要的受试者中用作化妆品的用途。

如上所述，优选地，本发明的组合物是化妆品组合物。

在一个优选的实施方案中，用作化妆品的用途是减少、预防和/或消除皮肤老化的迹象。

很明显的是，上文所述的皮肤老化的迹象是皮肤老化的美容上的迹象。

皮肤老化是由于时间和/或环境老化。

皮肤老化的美容上的迹象优选为皱纹、粗糙和/或松弛，更优选为面部皱纹、面部松弛和/或面部粗糙，甚至更优选为面部皱纹。

在另一个优选的实施方案中，用作化妆品的用途是用于皮肤嫩化和/或减少、预防和/或消除皮肤缺陷，更优选用于皮肤紧致、塑身、面部复位、皮肤收紧和/或毛孔细致，更优选地，用于身体紧致、塑身、面部复位、面部皮肤收紧和/或面部毛孔细致，甚至更优选地，用于面部复位和/或面部皮肤收紧。

身体紧致和/或塑身优选地是指臀部、乳房、臂和/或腿的紧致和/或塑型。

因此，本发明的肽和组合物还可用于处理/治疗皮肤紧致度或收紧度的丧失，优选皮肤收紧度的丧失，甚至更优选面部皮肤的收紧度的丧失。

如上所述，本发明的肽还可用于处理/治疗有组织的胶原蛋白纤维的丧失，因此优选用于处理/治疗面部复位。对有组织的胶原蛋白纤维丧失进行这种处理/治疗(如直接源自下文的实施例)至少改善了同源域蛋白Mohawk和胶原蛋白VI的产生。

还有，在优选的实施方案中，受试者是哺乳动物，甚至更优选地是人。

在一个优选的实施方案中，本发明的肽或组合物通过离子电渗疗法应用，更优选地，应用于受试者的面部和/或身体，更优选地，应用于受试者的面部、颈部、手、臂、腿、乳房和/或臀部，甚至更优选应用于受试者(优选人)的面部和/或颈部。

在最优选的实施方案中，本发明的肽或组合物局部应用(更优选以乳膏的形式)，更优选地，应用于受试者的面部和/或身体，更优选地，应用于受试者的面部、颈部、手、臂、腿、乳房和/或臀部，甚至更优选应用于受试者(优选人)的面部和/或颈部。

此外，在用作本发明的化妆品的用途中，本发明的肽或组合物以化妆品有效量使用。更优选地，本发明的肽以0.0001％(m/v)至0.05％(m/v)的浓度使用。在一个最优选的实施方案中，本发明的肽以0.0001％(m/v)至0.001％(m/v)，更优选0.0005％(m/v)的浓度使用。在另一个最优选的实施方案中，本发明的肽以0.05％(m/v)至0.001％(m/v)的浓度使用。

涵盖如上所述的本发明的组合物还包含至少一种另外的化妆品成分。所述另外的化妆品成分可以是至少一种赋形剂和/或至少一种另外的化妆品活性成分，其可以是如上所说明的。还涵盖将本发明的肽与至少一种根据上文所述的另外的化妆品成分组合使用。

另外，本发明的肽和本发明的组合物可以以现有技术中通常使用的任何形式配制，例如配制为溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、凝胶、乳膏、粉剂、喷雾剂、洗剂、油剂、搽剂、精华液、摩丝、软膏、棒或笔状，包括“免洗”和“冲洗”的配方。本发明的肽和组合物还可以通过现有技术中已知的技术掺入不同类型的固体附件，例如小毛巾，水凝胶，粘合性(或非粘合性)贴剂或面膜中，或它可以掺入不同的化妆系列产品，例如遮瑕膏、化妆粉底液、乳液或卸妆乳液等中。

还涵盖如本文所公开的本发明的组合物或本发明的肽也可以掺入化妆品持续释放系统和/或载体中，例如脂质体，毫米颗粒、微米颗粒和纳米颗粒，以及海绵，囊泡，胶束，毫米球、微米球、纳米球，脂质球，毫米胶囊、微米胶囊和纳米胶囊中，以及在微乳剂和纳米乳剂中，目的是使活性成分具有更大的穿透性。

在第四个方面，本发明涉及本发明的肽或组合物(即，如上文所解释的)在有此需要的受试者中的美容用途。

如上所述，优选地，本发明的组合物是化妆品组合物。

在一个优选的实施方案中，美容用途是减少、预防和/或消除皮肤老化的迹象。

皮肤老化是由于时间和/或环境老化。

在另一个优选的实施方案中，美容用途是用于皮肤嫩化和/或减少、预防和/或消除皮肤缺陷，更优选用于皮肤紧致、塑身、面部复位、皮肤收紧和/或毛孔细致，更优选地，用于身体紧致、塑身、面部复位、面部皮肤收紧和/或面部毛孔细致，甚至更优选地，用于面部复位和/或面部皮肤收紧。

此外，在优选的实施方案中，受试者是哺乳动物，甚至更优选地，人。

在一个优选的实施方案中，本发明的肽或组合物通过离子电渗疗法应用，更优选地，应用于受试者的面部和/或身体，更优选地，应用于受试者的面部、颈部、手、腿、臂、乳房和/或臀部，甚至更优选应用于受试者的面部和/或颈部。

在一些实施方案中，本发明的肽或组合物局部应用(更优选以乳膏的形式)，更优选地，应用于受试者的面部和/或身体，更优选地，应用于受试者的面部、颈部、手、臂、腿、乳房和/或臀部，甚至更优选应用于受试者(优选人)的面部和/或颈部。

此外，在本发明的美容用途中，本发明的肽或组合物以化妆品有效量使用。更优选地，本发明的肽以0.0001％(m/v)至0.05％(m/v)的浓度使用，更优选。在一个最优选的实施方案中，本发明的肽以0.0001％(m/v)至0.001％(m/v)，更优选0.0005％(m/v)的浓度使用。在另一个最优选的实施方案中，本发明的肽以0.05％(m/v)至0.001％(m/v)的浓度使用。

另外，本发明的肽和本发明的组合物可以以现有技术中通常使用的任何形式配制，例如配制为溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、凝胶、乳膏、粉剂、喷雾剂、洗剂、油剂、搽剂、精华液、摩丝、软膏、棒或笔状，包括“免洗”和“冲洗”的制剂。本发明的肽和组合物还可以通过现有技术中已知的技术掺入不同类型的固体附件，例如小毛巾，水凝胶，粘性(或非粘性)贴剂或面膜中，或它可以掺入不同的化妆系列产品，例如遮瑕膏、化妆粉底液、乳液或卸妆乳液等中。

还涵盖如本文所公开的本发明的组合物或本发明的肽也可以掺入化妆品持续释放系统和/或载体中，例如脂质体、毫米颗粒、微米颗粒和纳米颗粒，以及海绵、囊泡、胶束、毫米球、微米球、纳米球、脂质球、毫米胶囊、微米胶囊和纳米胶囊中，以及在微乳剂和纳米乳剂中，目的是使活性成分具有更大的穿透性。

如上所述，在第五方面，本发明涉及一种美容方法，其特征在于它包括在有此需要的受试者中使用根据本发明的肽或组合物。

如上所述，优选地，本发明的组合物是化妆品组合物。

由上文可知，根据本发明的肽或组合物在本发明的美容方法中的使用是用作化妆品。

在优选的实施方案中，美容方法是用以减少、预防和/或消除有此需要的受试者的皮肤老化的迹象。

皮肤老化是由于时间和/或环境老化。

在另一个优选的实施方案中，美容方法是用于有此需要的受试者中的皮肤嫩化和/或减少、预防和/或消除皮肤缺陷，更优选用于皮肤紧致、塑身、面部复位、皮肤收紧和/或毛孔细致，更优选地，用于身体紧致、塑身、面部复位、面部皮肤收紧和/或面部毛孔细致，甚至更优选地，用于面部复位和/或面部皮肤收紧。

优选地，受试者是哺乳动物，甚至更优选地是人。

此外，在本发明的美容方法中，本发明的肽或组合物以化妆品有效量使用。更优选地，本发明的肽以0.0001％(m/v)至0.05％(m/v)的浓度使用。在一个最优选的实施方案中，本发明的肽以0.0001％(m/v)至0.001％(m/v)，更优选0.0005％(m/v)的浓度使用。在另一个最优选的实施方案中，本发明的肽以0.05％(m/v)至0.001％(m/v)的浓度使用。

为了允许更好的理解，下面参考以示例的方式给出的附图并参考举例说明性和非限制性示例更详细地描述本发明。

图1显示了与基础状态相比(即，将基础状态的细胞活力建立为100％，然后进行与其余测试样品的比较)，在用递增浓度的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理后的HEKa细胞活力百分比。对于图1，x轴中从左到右的列对应于：基础状态(未处理的细胞)和分别用0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.05mg/mL和0.1mg/mL的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理的细胞。y轴显示细胞活力的百分比(相对于基础状态)。

图2显示了与基础状态相比(即，将基础状态的细胞活力建立为100％，然后进行与其余测试样品的比较)，在用肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理后的HDFa细胞活力百分比。对于图2，x轴中从左到右的列对应于：基础状态(未处理的细胞)和分别用0.001mg/mL、0.005mg/mL和0.01mg/mL的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理的细胞。y轴显示细胞活力的百分比(相对于基础状态)。**是指p<0.01；***是指p<0.001。

图3显示了相对于未处理的原代人真皮成纤维细胞并通过管家基因GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)标准化的通过使用肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的处理诱导的原代人真皮成纤维细胞中基因表达谱的调节。图3显示了用上述肽处理(浓度为0.005mg/mL，所有基因在6小时内)获得的结果，其中的条形从上到下分别是指以下基因：MMP3(基质金属蛋白酶-3)、MMP1(基质金属蛋白酶-1)、COL14A1(胶原蛋白XIV型α1链)、COL12A1(胶原蛋白XII型α1链)、COL7A1(胶原蛋白VII型α1链)、COL6A1(胶原蛋白VI型α1链)、COL5A1(胶原蛋白V型α1链)、COL4A5(胶原蛋白IV型α5链)、COL3A1(胶原蛋白III型α1链)、MKX(Mohawk同源框)和ZEB2(锌指E盒结合性同源框2)。x轴是指相对于基础状态的倍数变化。负倍数变化是指基因表达的下调，而正倍数变化是指上调。

图4显示了相对于未处理的原代人真皮成纤维细胞并通过管家基因GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)标准化的通过使用肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的处理诱导的原代人真皮成纤维细胞中基因表达谱的调节。图4显示了用上述肽处理(浓度为0.005mg/mL，24小时期间)获得的结果，其中的条形对应于基因：COL13A1(胶原蛋白XIII型α1链)。x轴是指相对于基础状态的倍数变化。负倍数变化是指基因表达的下调，而正倍数变化是指上调。

图5显示了相对于未处理的原代人真皮成纤维细胞并通过管家基因GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)标准化的通过使用肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的处理诱导的原代人真皮成纤维细胞中基因表达谱的调节。图5显示了用上述肽处理(浓度为0.005mg/mL，所有基因在6小时内)获得的结果，其中的条形从上到下分别是指以下基因：TGFB1(转化生长因子β-1)、FN1(纤连蛋白1)、LOXL3(赖氨酰氧化酶样3)、LOXL2(赖氨酰氧化酶样2)和HSP47(Serpin H1)。x轴是指相对于基础状态的倍数变化。负倍数变化是指基因表达的下调，而正倍数变化是指上调。

图6显示了与阴性对照(用二甲亚砜处理)相比(即，将阴性对照的胶原蛋白VI合成建立为100％，然后进行与其余测试样品的胶原蛋白VI合成的比较)，用递增浓度的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理的人真皮成纤维细胞的胶原蛋白VI合成的增加百分比。对于图6，x轴中从左到右的列对应于：阴性对照(用二甲亚砜处理的细胞)和分别用0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理的细胞。y轴显示胶原蛋白VI合成的百分比(相对于阴性对照)。**是指p<0.01；***是指p<0.001。

图7显示了与阴性对照(用二甲亚砜处理)相比(即，将阴性对照的Mohawk合成建立为100％，然后进行与其余测试样品的Mohawk合成的比较)，用递增浓度的肽Pal-SEQ IDNO：1-NH₂处理的人真皮成纤维细胞的Mohawk合成的增加百分比。对于图7，黑色列是指处理24小时，白色列是指处理48小时。此外，该图中x轴中从左到右的两列(一黑一白)的每个组对应于：阴性对照(用二甲亚砜处理的细胞)、未处理的细胞和分别用0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理的细胞。y轴显示Mohawk合成百分比(相对于阴性对照)。**是指p<0.01；***是指p<0.001。

图8显示了胶原蛋白的交联。用“a”标注的线是指用0.04mg/mL浓度的肽Pal-SEQID NO：1-NH₂处理的细胞；用“b”标注的线是指用0.02mg/mL浓度的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理的细胞；用“c”标注的线是指用二甲亚砜处理的细胞(阴性对照)。x轴显示以秒为单位的时间，y轴显示450nm处的以吸光度单位计的光密度。

图9显示了与阴性对照(未处理的hOSEC)相比(即，将阴性对照的释放的LDH建立为100％，然后进行与在实施例11中测试的其余样品中释放的LDH的比较)，通过释放的LDH(乳酸脱氢酶)的百分比测定的组织活力。带菱形的线是指未处理的hOSEC(阴性对照)；带正方形的线是指老化的hOSEC；带三角形的线是指老化的hOSEC+产品A(乳膏)；带十字的线是指老化的hOSEC+产品B(具有0.005mg/mL的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)。x轴是指以天为单位的时间；y轴是指相对于阴性对照(未处理的hOSEC)的释放的LDH的％。

图10显示了与阴性对照(未处理的hOSEC)相比(即，将阴性对照的试卤灵建立为100％，然后进行与在实施例11中测试的其余样品中的试卤灵的比较)，通过试卤灵的百分比测定的代谢活性。分别地，带菱形的线是指未处理的hOSEC(阴性对照)；带正方形的线是指老化的hOSEC；带三角形的线是指老化的hOSEC+产品A(乳膏)；带十字的线是指老化的hOSEC+产品B(具有0.005mg/mL的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)。x轴是指以天为单位的时间；y轴是指相对于阴性对照(未处理的hOSEC)的试卤灵的％。

图11显示了与阴性对照(未处理的hOSEC)相比(即，将阴性对照的胶原蛋白量建立为100％，然后进行与其余测试样品的胶原蛋白量的比较)，实施例11的不同实验组中的胶原蛋白定量。x轴中从左到右的列分别对应于：未处理的hOSEC(阴性对照)；老化的hOSEC；老化的hOSEC+产品A(乳膏)；和老化的hOSEC+产品B(具有0.005mg/mL的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)。y轴是指相对于阴性对照的胶原蛋白量的百分比。*是指p<0.05；**是指p<0.01。

图12显示了实施例11的不同实验组的透射电子显微术图像。更准确地说，图12A对应于未处理的hOSEC；图12B对应于老化的hOSEC；图12C对应于用产品A(乳膏)处理的老化的hOSEC；并且图12D对应于用产品B(具有0.005mg/mL的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)处理的老化的hOSEC。

图13显示了与阴性对照(未处理的hOSEC)相比(即，将阴性对照的胶原蛋白密度建立为100％，然后进行与其余测试样品的胶原蛋白密度的比较)，实施例11的不同实验组中的胶原蛋白密度。x轴中从左到右的列分别对应于：未处理的hOSEC(阴性对照)；老化的hOSEC；老化的hOSEC+产品A(乳膏)；和老化的hOSEC+产品B(具有0.005mg/mL的肽Pal-SEQID NO：1-NH₂的乳膏)。y轴是指相对于阴性对照的胶原蛋白密度的百分比。*是指p<0.05。

图14显示了与阴性对照(未处理的hOSEC)相比(即，将阴性对照的胶原蛋白纤维厚度建立为100％，然后进行与其余测试样品的胶原蛋白纤维厚度的比较)，实施例11的不同实验组中的胶原蛋白纤维厚度。x轴中从左到右的列分别对应于：未处理的hOSEC(阴性对照)；老化的hOSEC；老化的hOSEC+产品A(乳膏)；和老化的hOSEC+产品B(具有0.005mg/mL的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)。y轴是指相对于阴性对照的胶原蛋白纤维厚度百分比。*是指p<0.05。

图15显示了Pal-SEQ ID NO：1-NH₂在其对44名女性志愿者(50％浅肤色(光型II-III)和50％深肤色(光型V-VI))局部应用后的功效。将包含2％(m/v)的Pal-SEQ ID NO：1-NH₂肽(来自0.05％(m/v)储备液)的化妆品制剂(cosmetic formulation comprising 2％(m/v)of Pal-SEQ ID NO:1-NH2 peptide from a stock at 0.05％(m/v))或安慰剂各自施用于志愿者的整个面部，持续56天。图15(A)显示了通过AEVA(Eotech,France)测定的志愿者的脸颊的粗糙度改善。AEVA评估基于通过与边缘投影系统结合的立体相机获得的皮肤形貌的3D图像。在x轴中，从左到右，六个列的组各自对应于：分别地，所有志愿者第28天的平均值，V-VI光型志愿者的第28天，II-III光型志愿者的第28天，所有志愿者的第56天的平均值，V-VI光型志愿者的第58天和II-III光型志愿者的第56天，其均从处理/治疗开始算起。同样在x轴中，在列的每组中，从左到右的列对应于：用化妆品制剂(安慰剂)和用相同但还包含Pal-SEQ ID NO：1-NH₂肽的制剂处理的志愿者。y轴显示粗糙度参数(Ra)相对初始时间的变化百分比。图15(B)显示了通过AEVA测定的志愿者的脸颊的缓解度改善。在x轴中，从左到右，六个列的组各自对应于：分别地，所有志愿者第28天的平均值，V-VI光型志愿者的第28天，II-III光型志愿者的第28天，所有志愿者的第56天的平均值，V-VI光型志愿者的第58天和II-III光型志愿者的第56天，其均从处理/治疗开始算起。同样在x轴中，在列的每组中，从左到右的列对应于：用化妆品制剂(安慰剂)和用相同但还包含Pal-SEQ ID NO：1-NH₂肽的制剂处理的志愿者。y轴显示了缓解度参数(relief parameter)(Rz)相对于初始时间的变化百分比。图15(C)显示了鱼尾纹区域的皱纹深度变化(％)。在x轴中，从左到右，六个列的组各自对应于：分别地，所有志愿者第28天的平均值，所有志愿者第56天的平均值，V-VI光型志愿者的第28天，V-VI光型志愿者的第56天，II-III光型志愿者的第28天和II-III光型志愿者的第56天，其均从处理/治疗开始算起。同样在x轴中，在列的每组中，从左到右的列对应于：用化妆品制剂(安慰剂)和用相同但还包含Pal-SEQ ID NO：1-NH₂肽的制剂处理的志愿者。y轴显示鱼尾纹区域中的皱纹深度相对初始时间的变化百分比。

实施例

缩写：

用于氨基酸的缩写遵循Eur.J.Biochem.(1984)138:937中列出的1983IUPAC-IUB生化命名联合委员会的建议。

Ac，乙酰基；Ala，丙氨酸；Arg，精氨酸；C-末端，羧基末端；DCM，二氯甲烷；DIEA，N,N'-二异丙基乙胺；DIPCDI，N,N'-二异丙基碳二亚胺；DMF，N,N-二甲基甲酰胺；EDGS，EpiLife定义的生长补充剂；equiv，当量；ESI-MS，电喷雾电离质谱；Fmoc，9-芴基甲氧基羰基；His，组氨酸；HOBt，1-羟基苯并三唑；hOSEC，人类器官典型皮肤外植体培养物；HPLC，高效液相色谱；HRP，辣根过氧化物酶；Ile，异亮氨酸；LSGS，低血清生长补充剂；MBHA，对甲基二苯甲基胺；Leu，亮氨酸；Lys，赖氨酸；Me，甲基；MeCN，乙腈；MeOH，甲醇；Met，甲硫氨酸；N-末端，氨基末端；Pal，棕榈酰；Pbf，2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；Phe，苯丙氨酸；rpm，每分钟转数；RT，室温；tBu，叔丁基；TFA，三氟乙酸；TIS，三异丙基硅烷；TMB，3,3',5,5'-四甲基联苯胺；Trt，三苯基甲基或三苯甲基；Trp，色氨酸；Tyr，酪氨酸；Val，缬氨酸。

关于实施例中包括的化学合成程序，应注意的是，所有合成过程均在装有多孔聚乙烯盘的聚丙烯注射器或装有多孔板的

反应器中进行。所有试剂和溶剂均为合成质量，并且无任何其他处理地使用。通过抽吸除去溶剂和可溶性试剂。用哌啶-DMF(2:8，v/v)(至少1×1分钟，2×10分钟，5mL/g树脂)除去Fmoc基团(Lloyd Williams P.等人,(1997)Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,CRC,Boca Raton(Fla.,USA))。脱保护、偶联和再次脱保护阶段之间的洗涤用DMF(3×1分钟)和DCM(3×1分钟)每次使用10ml溶剂/g树脂进行。用3ml溶剂/g树脂进行偶联反应。通过进行茚三酮测试来进行偶联的控制(Kaiser E.等人,Anal.Biochem.,1970,34:595598)。所有合成反应和洗涤均在室温进行。

实施例1.肽的合成和制备。

-获得Fmoc-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-Rink-MBHA-树脂，其中AA₁为L-His；AA₂是L-Tyr；AA₃ 是L-Arg；AA₄是L-Ala。

将重量标准化。根据现有技术中已知的描述的通用方案，用哌啶-DMF处理4.8g(2.5mmol)的官能度为0.52mmol/g的Fmoc-Rink-MBHA树脂，以除去Fmoc基团。在DIPCDI(1.17mL；7.5mmol；3当量)和HOBt(1.01g；7.5mmol；和3当量)的存在下，用DMF作为溶剂将2.33g的Fmoc-L-Ala-OH(7.5mmol；3当量)掺入脱保护的树脂上达1小时。

然后如现有技术中已知的一般方法中描述的洗涤所述树脂，并重复Fmoc基团的脱保护处理以偶联下一个氨基酸。按照先前描述的方案，将4.87g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(7.5mmol；3当量)；随后3.45gFmoc-L-Tyr(tBu)-OH(7.5mmol；3当量)；以及随后4.65gFmoc-L-His(Trt)-OH(7.5mmol；3当量)顺序地偶联，每次偶联在1.01gHOBt(7.5mmol；3当量)和1.17mL DIPCDI(7.5mmol；3当量)的存在下进行。如上所述，在每个氨基酸添加步骤之间，进行Fmoc基团的脱保护处理。

合成后，将肽树脂用DCM洗涤(5次，每次3分钟)，并在真空下干燥。

使用上述合成程序，合成了以下序列：

His-Tyr-Arg-Ala(SEQ ID NO：1)。

实施例2.去除根据实施例1合成的肽的Fmoc N-末端保护基团。

肽基树脂的N末端Fmoc基团在DMF中用20％(体积/体积，下文中称为v/v)哌啶脱保护(1×1分钟+2×10分钟)(Lloyd Williams P.等人(1997)Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins CRC,Boca Raton(Fla.,USA))。用DMF(5×1分钟)、DCM(4×1分钟)洗涤肽基树脂，并在真空下干燥。

实施例3.将R₁棕榈酰基引入到根据实施例2获得的肽基树脂上的过程。

在10当量DIEA和10当量HOBt存在下，使用5mL的DMF作为溶剂，用10当量的十六烯酸(棕榈酸)处理根据实施例2获得的1mmol(1当量)的肽基树脂。将它们留置反应30分钟，然后将肽基树脂用DMF(5×1分钟)、DCM(4×1分钟)洗涤，并在真空下干燥。

实施例4.从根据实施例2和3获得的肽基树脂的聚合支持物的切割过程。

将重量标准化。在室温将200mg从实施例2或3中任一获得的干燥的肽基树脂用5mL的TFA/TIS/H₂O(90∶5∶5)搅拌处理2小时。收集滤液，并用50mL(8至10倍)冷二乙醚沉淀。在减压和室温下将醚溶液蒸发至干燥，将沉淀物重新溶解在水溶50％(v/v)MeCN中并冻干。

实施例5.根据实施例4合成和制备的肽的表征。

用Shimadzu设备(日本京都)，使用反相柱(150x4.6mm，XBridge Peptide BEHC18，3.5μm，Waters，USA)、H₂O中(+0.045％(v/v)TFA)的MeCN梯度(+0.036％(v/v)TFA)中，以1.25mL/min的流速进行按照实施例4获得的肽的HPLC分析，并在220nm进行检测。所有肽均显示超过80％的纯度。通过ESI-MS在Water ZQ 4000检测器中使用MeOH作为流动相，以流速为0.2mL/min来确认获得的肽的身份。获得的结果证明肽Pal-His-Tyr-Arg-Ala-NH₂(Pal-SEQ ID NO：1-NH₂)被正确且有效地合成。

实施例6.肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂在HEKa和HDFa细胞中的细胞毒性分析。

肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的细胞毒性通过在HEKa(人表皮角质形成细胞，成人)和HDFa(人真皮成纤维细胞，成人)细胞中的活力测定进行分析。

根据实施例1至5制备肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂。

细胞毒性通过MTT测定评估。简而言之，将HEKa和HDFa细胞以1x10⁵个细胞/mL的浓度接种在96孔板中，并在补充有1％(v/v)EDGS和1％(v/v)青霉素/链霉素的Epilife培养基(用于HEKa细胞)和补充有2％(v/v)低血清生长补充剂(LSGS)的培养基106(用于HDFa细胞)中，在37℃、5％CO₂和饱和湿度下孵育24小时。然后用不同浓度的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂(对于HEKa细胞0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.05mg/mL和0.1mg/mL；和对于HDFa细胞0.001mg/mL、0.005mg/mL和0.01mg/mL)以一式三份处理细胞以用于MTT评估。用相应浓度的肽处理24小时后，将10μL黄色四唑(MTT)添加到每个孔中，并将细胞在37℃下再孵育4小时。在与MTT一起孵育后，吸出每孔的培养基，并加入150μL二甲基亚砜(以下简称DMSO)(100％)以溶解形成的甲臜晶体。将板置于振荡器上5分钟以完全溶解晶体，然后使用酶标仪Multiskan FC测定每个孔在450nm处的吸光度，该吸光度与培养物中的活细胞数量直接成比例。使用对于未处理的细胞(基础状态)获得的数据对吸光度值进行标准化。

结果汇总在图1和图2中。

如可直接从所述图得出的，本发明的肽(如通过Pal-SEQ ID NO：1-NH₂举例说明的)在测试浓度下不改变HEKa和HDFa细胞的活力，并因此不是细胞毒性的。

实施例7.分析原代人真皮成纤维细胞中的基因表达调节。

分析肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的调节与胶原蛋白和细胞外基质产生相关的基因的表达的能力(分析的基因见表1)。

根据实施例1至5制备肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂。

制备在DMSO中12.5mg/mL的肽储备溶液。工作溶液是在相应补充培养基中从储备溶液以指定浓度新鲜制备的。

未处理的细胞用作阴性对照样品。

进行了RNA(核糖核酸)提取和RT-qPCR(逆转录定量聚合酶链反应)。简而言之，将HDFa细胞一式两份(n＝2)以4x10⁵个细胞/孔的密度接种在6孔板中，并保持在标准培养条件(补充有1％(v/v)LSGS的106培养基；37℃，95％室内湿度，5％CO₂)下24小时。然后，将细胞用0.005mg/mL浓度的肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理另外6小时(或对于COL13A1，24小时)。未处理的细胞用作基础对照。

最后裂解细胞，并按照制造商的说明使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒将重复样品汇集在一起用于RNA提取。使用纯化的RNA通过使用商业试剂盒高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)的逆转录生成相应的cDNA(互补脱氧核糖核酸)作为扩增的模板。使用针对表1中显示的基因(加上GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)用作管家基因)的合适TaqMan测定探针组和2x基因表达Master Mix，使用StepOne plus Real-Time PCR仪进行RT-qPCR。扩增包括以下的40个循环：95℃ 15秒(变性)和60℃ 1分钟(退火和延伸)(Arya,M.,Shergill,I.S.,Williamson,M.,Gommersall,L.,Arya,N.,Patel,H.R.(2005)Basicprinciples of real-time quantitative PCR.Expert Rev.Mol.Diagn.；5(2):209-19；以及Jozefczuk,J.和Adjaye,J.(2011)Quantitative real-time PCR-based analysis ofgene expression.Methods Enzymol.500；99-109)。

表1.实施例7中分析的基因。

使用ΔΔCt方法分析获得的数据，其将靶基因表达值提供为处理的样品与未处理的基础样品相比的倍数变化。将两种样品均用管家基因GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)的相对表达进行标准化。

分析步骤包括：

1.计算每个条件的平均Ct

2.计算ΔCT测试样品和ΔCT未处理的样品

3.计算ΔΔCT:ΔΔCT＝ΔCT测试样品–ΔCT未处理的样品

4.通过2^-ΔΔCT得到比率

该测定的结果总结在图3到5中。

从所述图可以容易地推导出肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂：

-在处理6小时后：下调基因MMP1和MMP3，众所周知，这两种基因降解细胞外基质蛋白。

-在处理6小时后：上调胶原蛋白结构体系和细胞外结构中的几个关键基因：COL3A1、COL4A5、COL5A1、COL6A1、COL7A1、COL12A1、COL14A1、COL13A1(处理24小时后)、MKXy ZEB2。

-处理6小时后上调几个胶原蛋白交联相关基因：TGFB1、FN1、LOXL3、LOXL2和HSP47。

因此，本发明的肽(如通过Pal-SEQ ID NO：1-NH₂举例说明的)避免或防止细胞外基质降解，同时有助于增加胶原蛋白的合成和交联，因此显示出抗老化活性和嫩化活性。

实施例8.人真皮成纤维细胞中胶原蛋白VI合成的分析。

分析肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂在人真皮成纤维细胞中诱导合成胶原蛋白VI的能力。

根据实施例1至5制备肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂。

在该测定中，在体外评估了测试的肽增加人真皮成纤维细胞中胶原蛋白VI合成的能力。该评估通过在用Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理细胞后测定胶原蛋白VI的量来进行。

为以下实验组提供实验方案：

-阴性对照：仅用增溶媒介物(DMSO)处理的细胞培养物；

-用肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂以三种浓度(0.01mg/mL、0.005mg/mL和0.001mg/mL)处理的细胞培养物。

制备肽在DMSO中的储备溶液，然后制备细胞培养基中0.01mg/mL、0.005mg/mL和0.001mg/mL的三个系列稀释液。

在这种情况下使用的生物模型由正常人真皮成纤维细胞组成。将细胞以1x10⁴个细胞/孔接种在96孔板中，并在标准培养条件(37℃、95％室内湿度、5％CO₂)下保持24小时。

孵育24小时后，去除培养基并将含有处理物(DMSO或Pal-SEQ ID NO：1-NH₂)的新培养基加入孔中。样品处理持续48小时，并在处理结束时收集细胞培养基。用DMSO处理的细胞用作阴性对照。

对于测试执行，用上述三种浓度的Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理人真皮成纤维细胞的细胞培养物。

处理48小时后，通过ELISA测定在细胞培养基中测量细胞产生和释放的胶原蛋白VI的量(从头胶原蛋白VI合成)。将结果与阴性对照(用DMSO处理的细胞)的结果进行比较。处理一式三份并在三个不同的实验阶段进行。

胶原蛋白VI合成的测定通过ELISA方法进行。为此目的使用商业试剂盒。测试试剂盒采用夹心ELISA法检测人胶原蛋白VI的含量。试剂盒中提供的微量ELISA板预先涂有胶原蛋白VI特异性抗体。将标准品或样品添加到适当的微量ELISA板孔中并与特异性抗体结合。然后，将胶原蛋白VI特异性生物素化检测抗体和抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物依次加入每个微孔板中并孵育。洗掉游离的成分。将底物溶液(TMB)添加到每个孔中。只有含有胶原蛋白VI的那些孔呈蓝色。通过加入硫酸溶液终止酶-底物反应，颜色变为黄色。通过酶标仪在450nm波长下测量光密度(OD)。OD值与胶原蛋白VI的浓度成比例。

定量测定使用由已知和递增浓度的标准胶原蛋白VI组成的校准曲线。计算阴性对照(DMSO)和样品之间胶原蛋白VI含量的百分比变化，这是Pal-SEQ ID NO：1-NH₂增加胶原蛋白VI合成的功效的直接指标。

在该实验中获得的结果总结在表2和图6中。

表2.实施例8中不同组的胶原蛋白VI含量的平均结果以及所述含量相对于阴性对照组的百分比变化。

从表2和图6可以直接推导出，在所有情况下(即，对于所有测试的浓度)，都观察到了胶原蛋白VI合成的统计上显著增加，此外，这可以描述为剂量依赖性的：0.001mg/mL时增加11％，0.005mg/mL时增加16％，0.01mg/mL时增加40％。如图6所示，处理组中胶原蛋白VI含量相对于阴性对照的所看到的差异是统计上显著的。

上述结果证明本发明的肽(如Pal-SEQ ID NO：1-NH₂所例示)增加蛋白质胶原蛋白VI的合成，因此有助于改善细胞外基质组装。因此，所述肽可以预防或处理皮肤老化和/或所述老化的皮肤迹象，例如皱纹、粗糙和/或松弛。

此外，本实施例的结果还证明本发明的肽(如Pal-SEQ ID NO：1-NH₂所例示)能够提供皮肤嫩化和/或减少、预防和/或消除皮肤缺陷，更准确地说，本发明的肽(如Pal-SEQID NO：1-NH₂所示例)能够提供面部复位和/或面部皮肤收紧。

实施例9.人真皮成纤维细胞中Mohawk合成的分析。

分析肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂在人真皮成纤维细胞中诱导Mohawk合成的能力。

根据实施例1至5制备肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂。

该测定涉及肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂在人真皮成纤维细胞中增加同源域蛋白Mohawk合成的能力的体外评估。该评估通过在用所述肽处理细胞后测定Mohawk量来进行。

为以下实验组提供实验方案：

-未处理的细胞培养物；

-仅用增溶媒介物(DMSO)处理的细胞培养物(阴性对照)；

-用三种浓度(0.01mg/mL、0.005mg/mL和0.001mg/mL)的Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理的细胞培养物。

如上所述，所使用的生物模型由正常人真皮成纤维细胞组成。

将细胞以1x10⁴个细胞/孔接种在96孔板中，并在标准培养条件(37℃、95％室内湿度、5％CO₂)下保持24小时。孵育24小时后，去除培养基并将含有测试产品的新培养基加入孔中。

样品处理持续24h和48h，然后裂解细胞以通过ELISA测定法测定细胞内Mohawk的浓度。将结果与阴性对照(用DMSO处理的细胞)进行比较。

处理在三个不同的实验阶段一式三份进行。

如上所述，Mohawk合成的测定是通过ELISA方法进行的。为此目的使用商业试剂盒。该测试试剂盒采用双位点夹心ELISA法检测人同源域蛋白Mohawk的含量。对Mohawk特异的抗体已预先包被到微孔板上。标准品和样品被吸移入孔中，并且任何存在的Mohawk都被固定的抗体结合。去除任何未结合的物质后，将HRP-缀合的人Mohawk检测抗体加入孔中。在洗涤以去除任何未结合的HRP试剂后，将色原溶液加入孔中(底物为TMB)，并且显色与初始步骤中结合的Mohawk的量成比例。停止显色并在450nm处比色测定浓度。

定量测定使用由已知和递增浓度的标准Mohawk组成的校准曲线。计算阴性对照(DMSO)和用Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理的组之间Mohawk含量的百分比变化，其是肽Pal-SEQID NO：1-NH₂增加Mohawk合成的功效的直接指标。

获得的结果总结在表3和图7中。

表3.实施例9中不同组的Mohawk含量的平均结果以及所述含量相对于阴性对照组的百分比变化。

从表3和图7可以直接推导出，在所有情况下(即，对于所有测试浓度和持续时间)，观察到同源域蛋白Mohawk合成的统计上显著增加，此外，这可以描述为剂量和依赖性的：在24小时，0.001mg/mL时增加9％，0.005mg/mL时增加21％，0.01mg/mL时增加43％；而且在48小时，0.001mg/mL时增加31％，0.005mg/mL时增加51％，0.01mg/mL时增加81％。如图7所示，在每个测试时间范围内，处理组中Mohawk含量相对于阴性对照所看到的差异是统计上显著的。

上述结果表明，本发明的肽(如Pal-SEQ ID NO：1-NH₂所示例)增加了Mohawk的合成，因此证明了其预防或处理皮肤老化和/或与老化相关的皮肤迹象例如皱纹、粗糙和/或松弛的潜力。

实施例10.胶原蛋白交联的分析。

分析肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂诱导或改善胶原蛋白交联的能力。

根据实施例1至5制备肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂。

该测定涉及肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂增加和加速胶原蛋白原纤维形成/胶原蛋白交联的能力的管内(in tubo)评估。该评估通过在室温下用溶液(0.02M乙酸、0.125M NaCl和1/10磷酸缓冲盐水(pH＝7.4))中的所述肽处理胶原蛋白后测定胶原蛋白原纤维形成来进行。

为以下实验组提供实验方案：

-用两种浓度(0.02或0.04mg/mL)的Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理的胶原蛋白溶液。

-仅用与上述处理组相同但不含肽的溶液处理的胶原蛋白溶液(阴性对照)，因此具有与含有肽的样品相同体积的DMSO；

制备肽在DMSO中的储备溶液，然后制备两个系列稀释液，使得胶原蛋白溶液中肽的最终浓度为0.02mg/mL或0.04mg/mL。

在向对照(与处理组相同但不含肽，因此具有与含有肽的样品相同体积的DMSO的溶液)和处理组中含有肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的溶液中加入胶原蛋白后，立即跟踪胶原蛋白交联和原纤维形成。

将结果与阴性对照(含有DMSO但不含Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的溶液)进行比较。

实验在四个不同的实验阶段进行。

胶原蛋白交联的测定是通过测量450nm处的吸光度来进行的。

将样品吸移入孔中，并使用酶标仪Multiskan FC在100分钟的时间段内每2分钟测定每孔在450nm处的吸光度。

计算阴性对照(仅用DMSO处理的组)和用Pal-SEQ ID NO：1-NH₂处理的组之间胶原蛋白原纤维形成的百分比变化，并且其是肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂增加胶原蛋白原纤维形成功效的直接指标，此外，这可以被描述为剂量依赖性：在0.02mg/mL时增加59％，在0.04mg/mL时增加111％。

获得的结果总结在图8中。

从图8可以看出，肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂在两种测试浓度下增加并加速胶原蛋白的交联：0.02(b)和0.04(a)mg/mL。

以上支持了本发明的肽(如通过Pal-SEQ ID NO：1-NH₂举例说明的)的抗老化活性，和因此它们在预防或处理与老化相关的皮肤迹象例如皱纹、粗糙和/或松弛中的效用。

实施例11.人器官典型皮肤外植体培养物中肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的细胞毒性和胶原蛋白产生的分析。

通过LDH细胞毒性测定和用于细胞毒性的刃天青测定；和关于胶原蛋白产生的胶原蛋白含量分析和组织学分析来分析肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的细胞毒性和胶原蛋白产生。

根据实施例1至5制备肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂。

在这种情况下，健康和老化的人类器官典型皮肤外植体培养物(hOSEC)被用作实验系统。

在研究的前五天，通过将健康的hOSEC暴露于氢化可的松(5μg/mL)来获得老化的hOSEC。

处理组的总数如下：

1.对照组(阴性对照)：未处理的hOSEC。

2.老化的hOSEC：用5μg/mL氢化可的松处理的hOSEC(Abraham A,Roga G.(2014)Topical steroid-damaged skin.Indian JDermatol.59(5),456-9.)

3.老化的hOSEC+产品A(乳膏，这是安慰剂)：用5μg/mL氢化可的松处理，并与产品A(10μL)一起孵育的hOSEC。

4.老化的hOSEC+产品B(含有浓度为0.005mg/mL的Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)：用5μg/mL氢化可的松处理并与产品B(10μL)一起孵育的hOSEC。

每个实验组一式四份地进行，并进行一次独立实验。

测定的总持续时间为10天(第1天至第10天)。在第1至第5天每天在适当或相应的组中应用氢化可的松。另一方面，在第2天到第9天每天在相应或适当的组中应用产品B或产品A。

在第0天(研究开始前)、第1、3、5、8和10天进行细胞毒性测定。

在第10天测量胶原蛋白的产生。

LDH细胞毒性测定

LDH细胞毒性测试是一种比色测定，其定量测量乳酸脱氢酶(LDH)，这是一种在细胞质膜受损时会释放到培养基上清液中的稳定的细胞溶质酶。对于30分钟偶联酶促反应测量培养基上清液中的释放的LDH：LDH将乳酸氧化为丙酮酸，其然后与四唑盐WST-1反应以形成甲臜。在培养上清液中测量的甲臜量的增加与皮肤外植体中裂解细胞(损伤)数量的增加直接相关。

移出每个样品的100μL上清液并转移到96孔微孔板中。培养基上清液中释放的LDH通过偶联酶促反应测量：LDH将乳酸氧化为丙酮酸，其然后与四唑盐WST-1反应以形成甲臜。甲臜量的增加与裂解细胞(损坏)数量的增加直接相关，因为当细胞质膜受损时，LDH酶会被释放到培养基上清液中。甲臜染料是水溶性的，并且可以使用标准ELISA酶标仪在500nm处测量。

通过将阴性对照即未处理的hOSEC视为LDH正常浓度的100％，计算该测定的结果。获得的结果总结在图9中。

从图9可以推导出，在所有组中发现的LDH值与对照组(阴性对照)相似。这一事实表明氢化可的松在测定条件下未对hOSEC产生任何不利影响(不产生质膜损伤)。同样，用产品B(即，含有Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)或产品A以及用5μg/mL的氢化可的松处理与对照组相比没有显示LDH值的差异。这些数据意味着氢化可的松孵育和两种化合物在测定条件下没有对hOSEC产生不利影响(质膜损伤)。

刃天青测定

刃天青染料(7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮10-氧化物)已被广泛用作增殖和细胞毒性测定中细胞活力的指标。该测定基于代谢活跃的活细胞将刃天青还原为试卤灵和二氢试卤灵的能力。这种转化是细胞内的，由线粒体、微粒体和细胞溶质氧化还原酶促进。刃天青对细胞无毒，并且在培养基中稳定。因此，它允许在体外连续测量细胞增殖，作为动力学或终点测定。

因此，刃天青染料已被广泛用作几种细胞毒性测定中细胞活力的指标。它也是一种代谢活性指标，因为该测定基于代谢活性细胞通过线粒体、微粒体和细胞溶质氧化还原酶将刃天青还原为试卤灵和二氢试卤灵的能力。

损害细胞活力和增殖的毒性损伤也会影响培养物还原刃天青的能力，并且染料还原的速度与存在的活细胞数量成正比。因此，由于刃天青的还原是细胞培养物的代谢能力的直接量度，它提供了一个方便的细胞活力指标。hOSEC还原的刃天青的量的减少也与死细胞数量的增加直接相关。

对于刃天青测定，将皮肤外植体用6μM刃天青的NaCl溶液处理1小时。随后，取出100μL体积的每个样品并转移到96孔微孔板中。形成的试卤灵在荧光计读板器中定量。

使用530-560nm激发波长和590nm发射波长监测荧光信号。

通过将阴性对照(未处理的健康hOSEC)考虑作为100％活力来计算刃天青测定的结果。得到的结果如图10所示。

当hOSEC用5μg/mL氢化可的松处理时，与对照组(阴性对照)相比，观察到试卤灵百分比降低了10％。用产品B(含有Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)或产品A和用5μg/mL氢化可的松处理的hOSEC相对于对照组(阴性对照)没有显示试卤灵值的降低。

这些数据支持产品B或产品A在测定条件下在hOSEC中产生代谢激活的想法。由于试卤灵是细胞代谢能力的直接量度，试卤灵的增加可能表明hOSEC暴露于两种化合物后氧化还原酶的代谢激活。

因此，根据LDH细胞毒性测定和刃天青测定中获得的结果，可以推断出Pal-SEQ IDNO：1-NH₂没有毒性，并且实际上逆转了氢化可的松产生的负面影响。

胶原蛋白生产

-胶原蛋白含量分析：

胶原蛋白测定是一种染料结合方法，用于分析酸和胃蛋白酶可溶性胶原蛋白(主要是I型，但也有II、III、IV和V型)。该测定可以评估在快速生长和发育期间产生新合成胶原蛋白的速率。

将胶原蛋白染料试剂(1mL)添加到每个样品(试管)中并摇动30分钟。将管以12,000rpm离心10分钟。随后，将750μL冰冷的酸盐洗涤试剂添加到胶原蛋白-染料沉淀物中，以从沉淀物表面和从微量离心管的内表面去除未结合的染料。将管再次以12,000rpm离心10分钟。最后加入250μL碱性试剂。当所有结合的染料溶解时(5分钟)，样品被准备好用于测量。使用标准ELISA酶标仪在550nm处测量溶解的染料(96微孔板中每个样品200μL)。

如上所述，胶原蛋白含量分析在研究的第10天进行。计算每毫克新鲜真皮组织的胶原蛋白含量(微克)测定的结果。获得的结果总结在图11和表4中。

表4.实施例11中分析的不同组中的胶原蛋白量。

如图11和表4所示，观察到用产品B(含有0.005mg/mL Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)处理的老化的hOSEC中与其余的老化的hOSEC组(仅用5μg/mL的氢化可的松处理或用氢化可的松和产品A处理)相比胶原蛋白产生的增加。

老化的hOSEc+产品B的组呈现与未处理的hOSEC相似的胶原蛋白量。

如图11所示，未处理的hOSEC和老化的hOSEC+产品B的组与老化的hOSEC和老化的hOSEC+产品A的组之间观察到的胶原蛋白量的差异是统计上显著的。未处理的hOSEC和老化的hOSEC+产品B之间没有统计上显著的差异。

这些结果证明Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的局部应用逆转了氢化可的松老化效应，并因此证明了本发明的肽(如通过Pal-SEQ ID NO：1-NH₂示例)作为抗老化产品并防止、减少和/或消除老化迹象例如皱纹、粗糙和/或松弛的潜力。

此外，这些结果还证明本发明的肽(如Pal-SEQ ID NO：1-NH₂所示例)能够提供皮肤嫩化和/或减少、预防和/或消除皮肤缺陷，更准确地说，本发明的肽(如Pal-SEQ ID NO：1-NH₂所示例)能够提供面部复位和/或面部皮肤收紧。

-用于TEM分析的组织收集和处理：

处理皮肤样品用于透射电子显微术分析。简而言之，将皮肤样品固定在4％(v/v)甲醛和1％(v/v)戊二醛中。随后，将皮肤样品在0.1M蔗糖中孵育过夜，并在0.1M的1％(v/v)四氧化锇中孵育。最后，样品用系列化的乙醇溶液脱水并嵌入光束胶囊中。

超薄切片(60-90nm厚)用醋酸双氧铀染色15分钟，然后用柠檬酸铅染色5分钟。随后样品被准备好用于在电子显微镜下分析。

进行透射电子显微术研究以观察经处理的皮肤外植体中胶原蛋白纤维的状态。

结果汇总在图12A至12D中。图12A对应于未处理的hOSEC，它显示了正确的真皮结构(真皮中完整且结构化的真皮纤维)。类似地，图12B表示具有非结构化的胶原蛋白纤维(弥散的、非致密的纤维)的老化的hOSEC。该图像证实了氢化可的松对皮肤的不利影响，这与胶原蛋白定量(包括在上文中)一致。对于用产品A处理的老化皮肤获得了类似的非致密胶原蛋白纤维的图像(图12C)。然而，如图12D所示，当老化的hOSEC用产品B(含有0.005mg/mL肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)孵育时，实现了胶原蛋白纤维的良好再生(完整且不弥散的纤维)。该图像证实了通过ELISA方法获得并在上文中提到的胶原蛋白值。

同样，通过图像分析(见下表5和6)分析胶原蛋白纤维厚度和胶原蛋白密度，并且获得的值证实了视觉观察结果。

胶原蛋白密度表示在TEM图像上观察到的每个胶原蛋白纤维的密实度。为此，通过GIMP2分析光学图像。反事实分析证实，健康和老化的hOSEC+产品B组呈现高于在老化的hOSEC和老化的hOSEC+产品A组中观察到的值的密度值(见下表5和图13)。

老化的hOSEC+产品B(含有0.005mg/mL肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)的组(其中如上所述，观察到胶原蛋白生成增加)表现出与未处理的hOSEC相似的胶原蛋白密度(参见下表5和图13)。

表5.实施例11中分析的不同组中的胶原蛋白密度。

如图13所示，未处理的hOSEC和老化的hOSEC+产品B的组与老化的hOSEC和老化的hOSEC+产品A的组之间观察到的胶原蛋白密度的差异是统计上显著的。未处理的hOSEC和老化的hOSEC+产品B(具有0.005mg/mL肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)之间没有统计上显著的差异。

还通过GIMP2分析了胶原蛋白纤维厚度。纤维厚度分析证实，健康和老化的hOSEC+产品B(含有0.005mg/mL肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)组由于更好的致密性和结构化(完整且未弥散的纤维)呈现的纤维厚度值低于在老化的hOSEC和老化的hOSEC+产品A组中观察到的值。施加在老化的hOSEC上的Pal-SEQ ID NO：1-NH₂肽呈现出与未处理的hOSEC相似的胶原蛋白纤维厚度(参见表6和图14)。

老化的hOSEC和老化的hOSEC+产品A组中较高的纤维厚度表明纤维中胶原蛋白的异常积累，这是描述为在老化皮肤中体内发生的现象。

未处理的hOSEC和老化的hOSEC+产品B显示出相似的胶原蛋白纤维厚度。

表6.实施例11中分析的不同组中的胶原蛋白纤维厚度。

如图14所示，未处理的hOSEC和老化的hOSEC+产品B的组与老化的hOSEC的组之间观察到的胶原蛋白纤维厚度的差异是统计上显著的。未处理的hOSEC组和老化的hOSEC+产品B的组与老化的hOSEC+产品A的组之间观察到的胶原蛋白纤维厚度的差异是近似统计上显著的。未处理的hOSEC和老化的hOSEC+产品B(具有0.005mg/mL肽Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的乳膏)之间没有统计上显著的差异。

实施例12.对具有不同光型的女性志愿者的皮肤和皱纹平滑和抗老化功效的临床评估

对44名女性志愿者(50％浅肤色(光型II-III)和50％深肤色(光型V-VI))评估Pal-SEQ ID NO：1-NH₂肽(根据实施例1至5合成)在面部皮肤抗老化方面的效果。

简而言之，志愿者应用含0.05％(m/v)的Pal-SEQ ID NO：1-NH₂(来自2％(m/v)储备液)的化妆品制剂或不含Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的化妆品制剂(安慰剂)。施加方案为在56天内，每天早上和睡前施用两次。化妆品制剂被应用于整个面部，以比较安慰剂和活性剂在志愿者之间以及不同光型志愿者之间的效果。

在第28天和第56天，每个志愿者都使用AEVA系统来评估皱纹深度和脸颊粗糙度。在处理/治疗天数期间参数的降低表明皮肤的平滑化，因此表明抗皱和抗老化益处。

得到的结果如图15所示。

从图15(A)至(C)中可以容易地看出，与初始时间相比，包含Pal-SEQ ID NO：1-NH₂的化妆品制剂在所有研究时间中以及对于所有研究的皮肤光型，在研究的面部皮肤区域上显示粗糙度(Ra)和缓解度(Rz)以及皱纹深度中任一项的降低(部分或所有这些参数的降低显示平滑效果以及抗皱和抗老化效果)。处理/治疗56天后，观察到脸颊粗糙度降低多达4％(与安慰剂相比平均为5％)，脸颊缓解度降低7％(与安慰剂相比平均为10％)。对于皱纹深度，观察到更显著的效果，达到平均9％的降低，特别是对于具有光型V-VI皮肤的志愿者观察到皱纹深度降低12％(与安慰剂相比为20％)，而具有光型II-III皮肤的志愿者随着时间的推移经历6-7％的皱纹深度降低。

序列表

<110> Lipotrue S.L.

<120> 用于化妆品的肽和组合物

<130> 2020/10156

<150> EP19382222.8

<151> 2019-03-28

<160> 1

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 1

His Tyr Arg Ala

1

Claims

1.能够增加Mohawk的肽、其可接受的异构体、盐、溶剂化物和/或衍生物和/或其混合物。

2.根据权利要求1的肽，其特征在于它具有根据式(I)的序列：

R₁-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-R₂

(I)

AA₁是His；

AA₂选自具有芳香族侧链的氨基酸组；

AA₃选自Lys或Arg；

AA₄选自具有脂肪族非极性侧链的氨基酸组，

R₁选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基和R₅-CO-，其中R₅选自以下形成的组：取代或未取代的C₁-C₂₄烷基，取代或未取代的C₂-C₂₄烯基，取代或未取代的C₂-C₂₄炔基，取代或未取代的C₃-C₂₄环烷基，取代或未取代的C₅-C₂₄环烯基，取代或未取代的C₈-C₂₄环炔基，取代或未取代的C₆-C₃₀芳基，取代或未取代的C₇-C₂₄芳烷基，取代或未取代的3至10元的杂环基环，以及取代或未取代的具有2至24个碳原子和1-3个碳以外的原子和1至6个碳原子的烷基链的杂芳基烷基；和

3.根据权利要求2的肽，其特征在于：

AA₁是His；

AA₂选自Phe、Tyr和Trp；

AA₃选自Lys或Arg；

AA₄选自Ala、Val、Leu和Ile。

4.根据权利要求2或3任一项的肽，其特征在于式(I)的肽是：

R₁-His-Tyr-Arg-Ala-R₂(R₁-SEQ ID NO：1-R₂)。

5.根据权利要求2至4中任一项的肽，其特征在于R₁选自Pal或Ac。

6.根据权利要求2至5中任一项的肽，其特征在于R₂选自H或NH₂。

7.根据权利要求2至6中任一项的肽，其特征在于R₁是Pal并且R₂是NH₂。

8.根据权利要求4的肽，其特征在于式(I)的肽是：

Pal-His-Tyr-Arg-Ala-NH₂(Pal-SEQ ID NO：1-NH₂)。

9.包含根据权利要求1至8中任一项的肽的组合物。

10.根据权利要求1至8中任一项的肽或根据权利要求9的组合物在有需要的受试者中用作化妆品的用途。

11.根据权利要求10的用作化妆品的用途，其特征在于用作化妆品的用途是减少、预防和/或消除皮肤老化的迹象，用于皮肤嫩化，和/或减少、预防和/或消除皮肤缺陷。

12.根据权利要求11的用作化妆品的用途，其特征在于皮肤老化的迹象是皱纹、粗糙和/或松弛。

13.根据权利要求11的用作化妆品的用途，其特征在于用作化妆品用于皮肤嫩化和/或减少、预防和/或消除皮肤缺陷的用途是用于皮肤紧致、塑身、面部复位、皮肤收紧和/或毛孔细致。

14.根据权利要求1至8中任一项的肽或根据权利要求9的组合物在有需要的受试者中的美容用途。

15.根据权利要求14的美容用途，其特征在于所述美容用途是减少、预防和/或消除皮肤老化的迹象，用于皮肤嫩化，和/或减少、预防和/或消除皮肤缺陷。