JP2022531076A - 化粧品における使用のためのペプチドおよび組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ホメオドメインタンパク質Ｍｏｈａｗｋの合成を増加させることができ、したがって、老化防止剤として、および若返り剤として有効である、ペプチドのファミリーに関する。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、分子生物学の分野に関し、より正確には化粧品に適用される分子生物学に関し、さらに正確にはＭｏｈａｗｋの発現および合成を増加させることができるペプチドおよび前記ペプチドを含む組成物に関する。

過去数十年間に、人々の平均余命は著しく増加した。さらに、容貌の美しさに関する人々の関心も高まっており、老化に関連する徴候の出現を遅らせる、または最小限に抑えようとしている。

皮膚は、ヒトにおける最大の器官であり、身体の境界面という、その位置に起因して、内因性（経時的）老化および外因性老化の影響を受けやすい。皮膚の老化は、内因性および外因性因子（内因性：遺伝学、細胞代謝、ホルモンおよび代謝プロセス；外因性：慢性的光曝露、汚染、電離放射線、化学物質、毒素）の組み合わせによって影響される複雑な生物学的プロセスであり、したがって、皮膚の変化およびその中の欠陥の出現（例えば、引き締まりの喪失、しわ、荒れ、および／または弛み）に繋がる。

これらの因子は、皮膚の種々の層における累積的な構造的変化および生理学的変化、ならびに全体的な皮膚の外観の変化を誘導する（Ganceviciene, R., Liakou, A.I., Theodoridis, A., et al. (2012) Skin Anti-Aging Strategies. Dermato-Endocrinology, 4, 308-319）。

真皮の３つの主要な構造成分は、コラーゲン、エラスチンおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、これらが、「しわ防止クリーム」から様々な充填剤にまで及ぶ、皮膚に関連する美的老化防止戦略のための老化防止の研究および努力の大部分の対象である（Baumann, L. (2007), Skin ageing and its treatment. J. Pathol., 211, 241-251.）。

コラーゲンは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の大きなファミリーを構成し、多細胞動物の様々な組織の構造を支持する必須の役割を果たす。原線維コラーゲンの機械的強度は、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）ファミリーのメンバーの酵素作用によって開始されるプロセスである、個々の原線維間の共有的架橋の形成に大きく依存している。コラーゲンの生合成は、鎖会合およびフォールディング、分泌、プロコラーゲンプロセシング、ならびに架橋を含む、多数のプロセスを包含する非常に複雑なプロセスである。ヒトＩ型コラーゲンに例示されるように、２本のα１鎖および１本のα２鎖からなるヘテロトリマー分子は、リボソーム上で合成され、粗面小胞体に取り込まれた後、コラーゲン鎖は一連の翻訳後修飾を受け、プロコラーゲン鎖の集合体となる（Rodriguez-Pascual, F., Slatter, D.A. (2016) Collagen cross-linking: insights on the evolution of metazoan extracellular matrix. Scientific Reports, 6, 37374.）。

さらに、コラーゲンは、身体で最も豊富なタンパク質（乾燥重量で７０％）であり、主に、原線維Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンからなる。これらは共に、組織の強度および剛性の大部分を提供する。少量のコラーゲンは全コラーゲン含有量の１０％未満を構成するが、それらはＥＣＭ組織化において重要な役割を果たす（Lovell, C., Smolenski, K., Duance, V., Light, N., Young, S., Dyson, M. (1987) Type I and III collagen content and fibre distribution in normal human skin during ageing. British Journal of Dermatology, 117, 419-428; and Theocharidis, G., Connelly, J.T. (2017) Minor collagens of the skin with not so minor functions. J. Anat.）。実際に、コラーゲンＶＩがコラーゲンＩの適切な結合および構造に寄与することが証明されている（Bonaldo, P et.al. (1990) Structural and Functional Features of the α3 Chain Indicate a Bridging Role for Chicken Collagen VI in Connective Tissues. Biochemistry, 29, 1245-1254）。それらの必須の構造的機能に加えて、コラーゲンはまた、細胞接着、走化性および遊走にも関与する。それらは、細胞、増殖因子およびサイトカインと動的に相互作用して、細胞増殖、分化、形態形成および創傷修復の過程における組織リモデリングを調節する（van der Rest, M., Garrone, R. (1991) Collagen family of proteins. FASEB J., 13, 2814-23.; Singer, A.J., Clark, R.A. (1999) Cutaneous wound healing. N Engl J Med., 341(10), 738-46; Gelse, K., Poschl, E.,Aigner, T. (2003) Collagens-structure, function, and biosynthesis. Advanced Drug Delivery Reviews, 55(12), 1531-1546; and Ricard-Blum S. (2011). The collagen family. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 3(1), a004978）。

コラーゲン破壊は、皮膚の他の構造成分（すなわち、弾性線維および網状線維）へのダメージと共に、老化した皮膚の外見における特徴的な変化の根底にあると考えられている（Bailey, A.J. (2001). Molecular mechanisms of ageing in connective tissue. Mech Ageing Dev, 122 pp. 735-755; Schwartz, E., Cruickshank, F.A., Perlish, J.S., Fleischmajer, R. (1989) Alterations in dermal collagen in ultraviolet irradiated hairless mice. J Invest Dermatol, 93, pp. 142-146; Schwartz, E., Cruickshank, F.A., Christensen, C.C., Perlish, J.S., Lebwohl, M. (1993) Collagen alterations in chronically sun-damaged human skin. Photochem Photobiol, 58, pp. 841-844; Smith, J.G., Davidson, E.A., Sams, W.M., Clark, R.D. (1962) Alterations in human dermal connective tissue with age and chronic sun damage. J Invest Dermatol, 39, pp. 347-350; Maloney, S.J., Edmonds, S.H., Giddens, L.D., Learn, D.B. (1992) The hairless mouse model of photoaging: Evaluation of the relationship between dermal elastin, collagen, skin thickness and wrinkles. Photochem Photobiol, 56, pp. 505-511; Fligiel, S.E.G., Varani, J., Datta, S.C., Kang, S., Fisher, G.J., Voorhees, J.J. (2003) Collagen Degradation in Aged/Photodamaged Skin in Vivo and after Exposure to Matrix Metalloproteinase-1 in Vitro. J. Invest. Dermatol., 120, pp. 842-848; and Marks, R. (Ed.) (1992) Sun-Damaged Skin. Martin Dunitz, London）。

さらに、ホメオドメインタンパク質であるＭｏｈａｗｋ（Ｍｋｘ）が皮膚において豊富に発現されることが記載されており（Uhlen, M. et al. (2015) Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science 347, 1260419）、前記タンパク質は、増加したコラーゲンの合成および増加したコラーゲン原線維形成の増加、ならびに細胞外マトリックスの生成に関連する他の遺伝子の適切な調節と関連づけられている（Nakamichi, R. et.al. (2016) Mohawk promotes the maintenance and regeneration of the outer annulus fibrosus of intervertebral discs. nature communications, 7:12503; Nakahara, H. (2013) Transcription Factor Mohawk and the Pthogenesis of Human Anterior Criciate Ligament Degradation. arthritis & rheumatism, vol. 65, 8, 2081-2089）。

近年、皮膚の老化の徴候、例えば、引き締まりの喪失、皮膚テクスチャーおよびしわを改善するための活性成分の数は、かなり増加している。そのような活性成分の例は、レチノイド、ビタミンまたは植物抽出物である（Bradley E.J., Griffiths C.E.M., Sherratt M.J., Bell M. and Watson R.E.B. (2015), Over-the-counter anti-ageing topical agents and their ability to protect and repair photoaged skin. Maturitas, 80, 265-272）。

レチノイドの場合において、注目すべきはレチノイン酸であり、これは昨今、ＥＣＭのいくつかの分子の合成の誘導のための「ゴールドスタンダード」である（例えば、コラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニン；Varani J., Mitra R.S., Gibbs D., Phan S.H., Dixit V.M., Mitra R., Wang T., Siebert K.J., Nickoloff B.J., Voorhees J.J. (1990), All-Trans Retinoic Acid Stimulates Growth and Extracellular Matrix Production in Growth-Inhibited Cultured Human Skin Fibroblasts. The Journal of Investigative Dermatology, 94, 717-723）。したがって、レチノイン酸は、コラーゲンおよびフィブロネクチンなどのＥＣＭのタンパク質の転写および合成、ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼ（以下、ＭＭＰ）の阻害をアップレギュレートすることによって、顔面のしわの臨床的外見を有意に改善することができるので、老化の徴候を治療するための最も強力な化合物の１つと考えられている（Varani J., Mitra R.S., Gibbs D., Phan S.H., Dixit V.M., Mitra R., Wang T., Siebert K.J., Nickoloff B.J., Voorhees J.J. (1990), All-Trans Retinoic Acid Stimulates Growth and Extracellular Matrix Production in Growth-Inhibited Cultured Human Skin Fibroblasts. The Journal of Investigative Dermatology, 94, 717-723）。しかしながら、レチノイン酸の使用にはいくつかの難点があり、例えば、レチノイン酸は容易に皮膚の炎症を生じさせ得るので慎重に使用されなければならず、また、レチノイン酸と日光曝露とを組み合わせることは推奨されない。レチノイドを使用する場合の別の主要な問題は、特に酸素および光の存在下での、それらの不安定性である（Sorg O., Antille C., Kaya G. and Saurat J-H. (2006), Retinoids in cosmeceuticals. Dermatologic Therapy, 19, 289-296）。

抗酸化剤もまた、皮膚中のフリーラジカルの濃度を減少させるために、したがって、コラーゲンの分解を妨げるために使用される。前記抗酸化剤の一例は、アスコルビン酸（ビタミンＣとしても知られる）である。アスコルビン酸は、その抗酸化作用に加えて、とりわけ、表皮の分化を促進し、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１（ＭＭＰ１）を阻害しながら、ＥＣＭ（コラーゲンＩおよびＩＩＩならびにエラスチン）からのタンパク質の合成を誘導する。残念ながら、アスコルビン酸は、特に高温、好気性条件、高ｐＨにおいて、および／または光曝露時に、極めて不安定であり、酸化を受ける（Manela-Azulay M., Azulay V., Aguinaga F., Issa M.C. (2017), Vitamins and other Antioxidants. Daily Routine in Cosmetic Dermatology, 1-13）。

化学的に合成された化合物に加えて、例えば、レスベラトロール（抗酸化剤）を含むブドウ抽出物；ポリフェノールを含む緑茶；またはイソフラボンを含む大豆など、幅広い植物抽出物および植物由来化合物が多様な用途で市販されている。しかしながら、これらの成分のインビボでの有効性および組成物は、十分には科学的に検証されていない。

ヒアルロン酸は、その粘弾性特性および水を保持するその能力に由来して、皮膚を水和状態に保ち、弾性を維持し、荒れを改善することによってしわを治療するために化粧品産業においても使用されているか、または皮膚充填剤としても使用されている。しかしながら、現在、ヒアルロン酸は、ニワトリのトサカ（rooster comb）または細菌抽出物などの複数の供給源から得られ、その結果、これらの生成物は、不純物を含み得、十分に特性付けられる必要がある（Kogan G., Soltes L., Stern R. and Gemeiner P. (2007), Hyaluronic acid: a natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial applications. Biotechnological Letters 29, 17-25）。

他方、ペプチドは、皮膚の老化の徴候を改善するために化粧品製剤に組み込むこともできる。生物活性ペプチドは、身体自身の分子を模倣し、コラーゲン合成などのプロセスに影響を及ぼすことができ、はるかに優れた耐性および安定性を有するという長所を有する。さらに、それらのために、幅広い活性、化学的性質および適応を開発することができる（Zhang L. and Falla T.J. (2009), Cosmeceuticals and peptides. Clinics in dermatology, 27, 485-494）。

当技術分野における広範な種々の化合物および／または抽出物にもかかわらず、皮膚の老化（経時的および／または環境上の老化）の徴候の予防、減少および／もしくは排除を可能にし、ならびに／または皮膚の若返りを提供する、新規なメカニズムを有する代替組成物が依然として必要とされている。

本発明の発明者らは、広範かつ徹底的な調査を経て、驚くべきことに、ホメオドメインタンパク質Ｍｏｈａｗｋの発現および合成の増加、ならびに、結果としてコラーゲンの発現および合成の増加を提供するペプチドを見出した。さらに、本発明の発明者らによって見出されたペプチドは、細胞外マトリックスの合成および構造化を司る遺伝子に有利に働くかまたはアップレギュレートする一方で、前記細胞外マトリックスの分解を司る遺伝子を阻害またはダウンレギュレートする遺伝子の発現を調節する。本発明のペプチドはまた、コラーゲン合成を増大させ、皮膚外植片におけるコラーゲン密度および厚さを改善する。さらに、それらの皮膚平滑化特性、ならびにしわ防止効果および老化防止効果が、インビボにおいて実証されている。したがって、本発明のペプチドは、老化防止活性および若返り活性を示し、したがって、当技術分野に存在する上述した問題を解決する。

本発明者らは、上述の作用メカニズム、したがって上述の活性を有するペプチドを提供するいかなる従来技術も知らない。

第１の態様において、本発明は、ホメオドメインタンパク質Ｍｏｈａｗｋを増加させることができるペプチドに言及する。

第２の態様において、本発明は、本発明のペプチドを含む組成物に言及する。

さらに、第３の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは組成物の、それを必要とする対象における、化粧品としての使用に言及する。

第４の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは組成物の、それを必要とする対象における、化粧品用途に言及する。

第５の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは組成物の、それを必要とする対象における使用を含むことを特徴とする、化粧方法に言及する。

本明細書中で使用される場合、用語「非環状脂肪族基」およびその複数形は、当技術分野で前記用語に与えられている一般的な意味を有する。したがって、これらの用語は、例えば、直鎖状または分岐状のアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基を指すが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される場合、用語「アルキル基」およびその複数形は、１～２４個、好ましくは１～１６個、より好ましくは１～１４個、さらにより好ましくは１～１２個、さらによりなお好ましくは１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有する、飽和した直鎖状または分岐状の基を指す。アルキル基は、単純な結合によって、分子の残部に結合している。アルキル基には、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、ラウリル、ヘキサデシル、オクタデシル、アミル、２－エチルヘキシル、２－メチルブチル、５－メチルヘキシル、および類似物が含まれるが、これらに限定されない。アルキル基は、任意に、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つ以上の置換基によって、置換されていてもよい。

本明細書中で使用される場合、用語「アルケニル基」およびその複数形は、２～２４個、好ましくは２～１６個、より好ましくは２～１４個、さらにより好ましくは２～１２個、さらによりなお好ましくは２、３、４、５または６個の炭素原子を有し、１つ以上の炭素－炭素二重結合、好ましくは１、２または３個の炭素－炭素二重結合（共役または非共役）を有する、直鎖状または分岐状の基を指す。アルケニル基は、単結合を介して、分子の残部に結合している。アルケニル基には、例えば、ビニル、オレイル、リノレイル、および類似の基が含まれるが、これらに限定されない。アルケニル基は、任意に、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つ以上の置換基によって、置換されていてもよい。

本明細書中で使用される場合、用語「アルキニル基」およびその複数形は、２～２４個、好ましくは２～１６個、より好ましくは２～１４個、さらにより好ましくは２～１２個、さらによりなお好ましくは２、３、４、５または６個の炭素原子を有し、１つ以上の炭素－炭素三重結合、好ましくは１、２または３個の炭素－炭素三重結合（共役または非共役）を有する、直鎖状または分岐状の基を指す。アルキニル基は、単結合を介して、分子の残部に結合している。アルキニル基には、例えば、エチニル基、１－プロピニル、２－プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、３－ブチニル、１－ペンチニルなどのペンチニル、および類似の基が含まれるが、これらに限定されない。アルキニル基は、任意に、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つ以上の置換基によって、置換されていてもよい。

本明細書中で使用される場合、用語「アリシクリル基」およびその複数形は、当技術分野で前記用語に与えられている一般的な意味を有する。したがって、これらの用語は、例えば、シクロアルキル基またはシクロアルケニル基またはシクロアルキニル基を指すために使用されるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される場合、用語「シクロアルキル」およびその複数形は、３～２４個、好ましくは３～１６個、より好ましくは３～１４個、さらにより好ましくは３～１２個、さらによりなお好ましくは３、４、５または６個の炭素原子を有する、飽和した単環式または多環式脂肪族基を指す。シクロアルキルは、単結合を介して、分子の残部に結合している。シクロアルキルには、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、メチルシクロヘキシル、ジメチルシクロヘキシル、オクタヒドロインデン、デカヒドロナフタレン、ドデカヒドロフェナレン、アダマンチル、および類似物が含まれるが、これらに限定されない。シクロアルキルは、任意に、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つ以上の基によって、置換されていてもよい。

本明細書中で使用される場合、用語「シクロアルケニル」およびその複数形は、５～２４個、好ましくは５～１６個、より好ましくは５～１４個、さらにより好ましくは５～１２個、さらによりなお好ましくは５または６個の炭素原子を有し、１つ以上の炭素－炭素二重結合、好ましくは１、２または３個の炭素－炭素二重結合（共役または非共役）を有する、非芳香族の単環式または多環式脂肪族基を指す。シクロアルケニルは、単結合を介して、分子の残部に結合している。シクロアルケニルには、例えば、シクロペント－１－エン－１－イル基、および類似の基が含まれるが、これらに限定されない。シクロアルケニルは、任意に、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つ以上の基によって、置換されていてもよい。

本明細書中で使用される場合、用語「シクロアルキニル」およびその複数形は、８～２４個、好ましくは８～１６個、より好ましくは８～１４個、さらにより好ましくは８～１２個、さらによりなお好ましくは８または９個の炭素原子を有し、１つ以上の炭素－炭素三重結合、好ましくは１、２または３個の炭素－炭素三重結合（共役または非共役）を有する、非芳香族の単環式または多環式脂肪族基を指す。シクロアルキニルは、単結合を介して、分子の残部に結合している。シクロアルキニルには、例えば、シクロオクト－２－イン－１－イル基、および類似物が含まれるが、これらに限定されない。シクロアルキニルは、任意に、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つ以上の基によって、置換されていてもよい。

本明細書中で使用される場合、用語「アリール基」およびその複数形は、６～３０個、好ましくは６～１８個、より好ましくは６～１０個、さらにより好ましくは６または１０個の炭素原子を有し、炭素－炭素結合によって結合または縮合した１、２、３または４個の芳香環を含む、芳香族基を指す。アリール基は、単結合を介して、分子の残部に結合している。アリール基には、例えばとりわけ、フェニル、ナフチル、ジフェニル、インデニル、フェナントリルまたはアントラニルが含まれるが、これらに限定されない。アリール基は、任意に、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つ以上の置換基によって、置換されていてもよい。

本明細書中で使用される場合、用語「アラルキル基」およびその複数形は、７～２４個の炭素原子を有する、芳香族基によって置換されたアルキル基を指す。アラルキル基には、例えば、－（ＣＨ_２）１～６－フェニル、－（ＣＨ_２）１～６－（１－ナフチル）、－（ＣＨ_２）１～６－（２－ナフチル）、－（ＣＨ_２）１～６－ＣＨ（フェニル）_２、および類似物が含まれるが、これらに限定されない。アラルキル基は、任意に、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つ以上の置換基によって、置換されていてもよい。

本明細書中で使用される場合、用語「ヘテロシクリル基」およびその複数形は、３～１０員のヘテロシクリルまたは炭化水素環を指す。ここで、環原子の１つ以上、好ましくは環原子の１、２または３個は、窒素、酸素または硫黄などの、炭素とは異なる元素である。ヘテロシクリル基は、飽和または不飽和であり得る。本発明の目的のために、ヘテロシクリルは、縮合環系を含み得る環系、単環系、二環系または三環系であり得；窒素、炭素または硫黄原子は、任意に、ヘテロシクリルラジカル中で酸化され得；窒素原子は、任意に、四級化され得；ヘテロシクリルラジカルは、部分的または完全に飽和であり得るか、または芳香族であり得る。好ましくは、ヘテロシクリルという用語は、５または６員環に関する。ヘテロシクリル基は、任意に、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つ以上の置換基によって、置換されていてもよい。

本明細書中で使用される場合、用語「ヘテロアリールアルキル基」およびその複数形は、置換または非置換の芳香族ヘテロシクリル基で置換されたアルキル基を指し、当該アルキル基は、１～６個の炭素原子を有し、当該芳香族ヘテロシクリル基は、２～２４個の炭素原子および１～３個の炭素以外の原子を有する。ヘテロアリールアルキル基には、例えば、－（ＣＨ_２）１～６－イミダゾリル、－（ＣＨ_２）１～６－トリアゾリル、－（ＣＨ_２）１～６－チエニル、－（ＣＨ_２）１～６－フリル、－（ＣＨ_２）１～６－ピロリジニル、および類似物が含まれるが、これらに限定されない。ヘテロアリールアルキル基は、任意に、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つ以上の置換基によって、置換されていてもよい。

本明細書中で使用される場合、用語「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指す。そのアニオンは、ハロゲン化物と呼ばれる。

本明細書中で使用される場合、用語「誘導体」およびその複数形は、化粧品として許容可能な化合物、すなわち、化粧品の調製において使用することができる目的の化合物に由来する化合物と、化粧品として許容可能でない誘導体と、の両方を指す。なぜなら、化粧品として許容可能でない誘導体は、化粧品として許容可能な誘導体の調製において有用であり得るためである。

本明細書中で使用される場合、用語「塩」およびその複数形は、当技術分野で公知のものからの任意の種類の塩、例えば、ハロゲン化物塩、ヒドロキシ酸塩（オキシ酸塩、酸塩、塩基性塩、および複塩など）、ヒドロキソ塩、混合塩、オキシ塩、または他の水和塩を指す。この用語は、化粧品としての塩、および化粧品として許容可能でない塩の両方を含む。なぜなら、後者は、化粧品として許容可能な塩の調製において有用であり得るためである。

本明細書中で使用される場合、用語「異性体」およびその複数形は、光学異性体、エナンチオマー、立体異性体またはジアステレオ異性体を指す。個々のエナンチオマーまたはジアステレオ異性体、ならびにそれらの混合物は、当技術分野で公知の従来の技術によって、分離することができる。

本明細書中で使用される場合、用語「溶媒和物」およびその複数形は、極性、無極性または両親媒性溶媒和物などの、当技術分野で公知の任意の溶媒和物を指す。溶媒和物には、目的の対象に（直接的または間接的に）投与または適用された場合に、目的の化合物（本発明のペプチド）を提供する、化粧品として許容可能な任意の溶媒和物が含まれる。好ましくは、溶媒和物は：水和物；メタノール、エタノール、プロパノールまたはイソプロパノールなどのアルコールとの溶媒和物；酢酸エチルなどのエステルとの溶媒和物；メチルエーテル、エチルエーテルまたはＴＨＦ（テトラヒドロフラン）などのエーテルとの溶媒和物；または、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）との溶媒和物であり、より好ましくは：水和物；または、エタノールなどのアルコールとの溶媒和物である。

さらに、本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」およびその複数形は、それらが天然であるか否かにかかわらず、そして、それらがＤ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸であるかどうかにかかわらず、遺伝子コードによってコード化されたアミノ酸、ならびにコード化されていないアミノ酸を含む。コード化されていないアミノ酸の例は、限定されないが、とりわけ、シトルリン、オルニチン、サルコシン、デスモシン、ノルバリン、４－アミノ酪酸、２－アミノ酪酸、２－アミノイソ酪酸、６－アミノヘキサン酸、１－ナフチルアラニン、２－ナフチルアラニン、２－アミノ安息香酸、４－アミノ安息香酸、４－クロロフェニルアラニン、２，３－ジアミノプロピオン酸、２，４－ジアミノ酪酸、サイクロセリン、カルニチン、システイン、ペニシラミン、ピログルタミン酸、チエニルアラニン、ヒドロキシプロリン、アロ－イソロイシン、アロ－スレオニン、イソニペコチン酸、イソセリン、フェニルグリシン、スタチン、β－アラニン、ノルロイシン、Ｎ－メチルアミノ酸、α－アミノ酸およびβ－アミノ酸、ならびに、それらの誘導体である。それでもなお、さらなる非天然アミノ酸が当技術分野で公知である（例えば、"Unusual amino acids in peptide synthesis" by D. C. Roberts and F. Vellaccio, The Peptides, Vol. 5 (1983), Chapter VI, Gross E. and Meienhofer J., Eds., Academic Press, New York, USAを参照のこと）。

本明細書中で使用される場合、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に関する「同一性の割合」は、当技術分野で一般的に帰属される意味を有し、したがって、２つのアミノ酸配列の最適なアラインメント後に比較される、当該２つのアミノ酸配列間で同一であるアミノ酸の割合に関する。ここで、前記割合は、単に統計的なものであり、２つのアミノ酸配列間の差異は、配列全体にわたってランダムに分布する。「最適なアラインメント」とは、より大きな同一性の割合を生じるアミノ酸配列のアラインメントとして理解される。同一性の割合は、２つの比較される配列においてアミノ酸が同一である、同一位置の数を決定し、同一位置の数を比較された位置の数で除算し、得られた結果に１００を乗算することによって計算され、２つの配列間の同一性の割合を得る。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、手動で、または、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）アルゴリズムなどの、当技術分野で公知のコンピュータプログラムによって、行うことができる。

本明細書中で使用される場合、「ホメオドメインタンパク質Ｍｏｈａｗｋ」、「Ｍｏｈａｗｋ」および「Ｍｋｘ」は同義であり、交換可能に使用され、特に明記しない限り、ホメオドメインタンパク質Ｍｏｈａｗｋとして公知であるタンパク質を指す。

上述したように、第１の態様において、本発明は、Ｍｏｈａｗｋ（以下、Ｍｋｘ）を増加させることができるペプチド、その許容可能な異性体、塩、溶媒和物および／もしくは誘導体、ならびに／またはそれらの混合物に言及する。

Ｍｏｈａｗｋは、ペプチドが適用される対象において、増加される。より好ましくは、哺乳動物において、さらにより好ましくはヒトにおいて。

好ましくは、Ｍｏｈａｗｋの増加は、Ｍｏｈａｗｋの遺伝子発現およびタンパク質合成の増加である。

本発明のペプチドにおいて使用される、または存在するアミノ酸は、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはそれらの組み合わせであることが意図される。好ましい実施形態において、本発明のペプチドにおいて使用される、または存在するアミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。

好ましくは、上記の異性体は、立体異性体である。前記立体異性体は、エナンチオマーまたはジアステレオ異性体であることが意図される。したがって、本発明の好ましい実施形態において、ペプチドは、ラセミ混合物、ジアステレオマー混合物、純粋なエナンチオマー、または純粋なジアステレオ異性体である。

好ましくは、本発明のペプチドは、２～５０個のアミノ酸、より好ましくは４～１０個のアミノ酸、より好ましくは４～６個のアミノ酸、さらにより好ましくは４個のアミノ酸を含む。

本発明のペプチドは、そのＮ末端および／またはそのＣ末端に結合している少なくとも１つの部分を含むことが意図される。前記少なくとも１つの部分は、当技術分野で公知の任意の手段によって、好ましくは共有結合的に、ペプチドに結合していてもよい。好ましい実施形態において、ペプチドは、そのＮ末端に共有結合した１つの部分、およびそのＣ末端に共有結合した１つの部分を含む。

一実施形態において、少なくとも１つのＮ末端部分（好ましくは１つのＮ末端部分）は、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアラルキル、およびＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここで、Ｒ_５は、置換または非置換のＣ_１～Ｃ_２４アルキルラジカル、置換または非置換のＣ_２～Ｃ_２４アルケニル、置換または非置換のＣ_２～Ｃ_２４アルキニル、置換または非置換のＣ_３～Ｃ_２４シクロアルキル、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_２４シクロアルケニル、置換または非置換のＣ_８～Ｃ_２４シクロアルキニル、置換または非置換のＣ_６～Ｃ_３０アリール、置換または非置換のＣ_７～Ｃ_２４アラルキル、３～１０員の置換または非置換のヘテロシクリル環、および、２～２４個の炭素原子と１～３個の炭素以外の原子と１～６個の炭素原子のアルキル鎖との置換または非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択される。さらにより好ましくは、少なくとも１つのＮ末端部分（好ましくは１つのＮ末端部分）は、アセチル（以下、Ａｃ）またはパルミトイル（以下、Ｐａｌ）から選択される。最も好ましい実施形態において、少なくとも１つのＮ末端部分（好ましくは１つのＮ末端部分）はＰａｌである。

一実施形態において、少なくとも１つのＣ末端部分（好ましくは１つのＣ末端部分）は、Ｈ、－ＮＲ_３Ｒ_４－、－ＯＲ_３および－ＳＲ_３から選択され、ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族基、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキルから選択される。さらにより好ましくは、少なくとも１つのＣ末端部分（好ましくは１つのＣ末端部分）は、ＨまたはＮＨ_２から選択される。最も好ましい実施形態において、少なくとも１つのＣ末端部分（好ましくは１つのＣ末端部分）は、ＮＨ_２である。

したがって、より好ましくは、本発明のペプチドは、Ｎ末端に結合している１つの部分およびＣ末端に結合している１つの部分を含み、ここで、Ｎ末端に結合している部分はＰａｌであり、Ｃ末端に結合している部分はＮＨ_２である。

好ましい実施形態において、本発明のペプチドの配列は、式（Ｉ）に記載のもの：
Ｒ_１－ＡＡ_１－ＡＡ_２－ＡＡ_３－ＡＡ_４－Ｒ_２ （Ｉ）
その化粧品として許容可能な異性体、塩、溶媒和物および／または誘導体、ならびにそれらの混合物である：
式中、
ＡＡ_１は、Ｈｉｓであり；
ＡＡ_２は、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ_３は、ＬｙｓまたはＡｒｇから選択され；
ＡＡ_４は、脂肪族非極性側鎖を有するアミノ酸の群から選択される。

Ｒ_１は、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアラルキル、およびＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここで、Ｒ_５は、置換または非置換のＣ_１～Ｃ_２４アルキルラジカル、置換または非置換のＣ_２～Ｃ_２４アルケニル、置換または非置換のＣ_２～Ｃ_２４アルキニル、置換または非置換のＣ_３～Ｃ_２４シクロアルキル、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_２４シクロアルケニル、置換または非置換のＣ_８～Ｃ_２４シクロアルキニル、置換または非置換のＣ_６～Ｃ_３０アリール、置換または非置換のＣ_７～Ｃ_２４アラルキル、３～１０員の置換または非置換のヘテロシクリル環、および、２～２４個の炭素原子と１～３個の炭素以外の原子と１～６個の炭素原子のアルキル鎖との置換または非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され；
Ｒ_２は、Ｈ、－ＮＲ_３Ｒ_４－、－ＯＲ_３および－ＳＲ_３から選択され、ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族基、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキルから選択される。

上述したように、本発明のペプチドにおいて使用される、または存在するアミノ酸は、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはそれらの組み合わせであることが意図される。好ましい実施形態において、本発明のペプチドにおいて使用される、または存在するアミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。

また、上述したように、好ましくは、上記の異性体は、立体異性体である。前記立体異性体は、エナンチオマーまたはジアステレオ異性体であることが意図される。したがって、本発明の好ましい実施形態において、ペプチドは、ラセミ混合物、ジアステレオマー混合物、純粋なエナンチオマー、または純粋なジアステレオ異性体である。

好ましくは、Ｒ_１はＰａｌまたはＡｃから選択され、さらにより好ましくは、Ｒ_１はＰａｌである。

好ましくは、Ｒ_２はＨまたはＮＨ_２から選択され、さらにより好ましくは、Ｒ_２はＮＨ_２である。

したがって、より好ましくは、Ｒ_１はＰａｌであり、Ｒ_２はＮＨ_２である。

好ましくは、式（Ｉ）において、ＡＡ_２は、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの群から選択され、より好ましくは、ＡＡ_２はＴｙｒである。

好ましくは、式（Ｉ）において、ＡＡ_３は、Ａｒｇである。

また、好ましくは、式（Ｉ）において、ＡＡ_４は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの群から選択され、より好ましくは、ＡＡ_４はＡｌａである。

したがって、好ましい実施形態において、式（Ｉ）において：
ＡＡ_１は、Ｈｉｓであり；
ＡＡ_２は、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの群から選択され；
ＡＡ_３は、ＬｙｓまたはＡｒｇから選択され；
ＡＡ_４は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの群から選択され；
より好ましくは、式（Ｉ）において：
ＡＡ_１は、Ｈｉｓであり；
ＡＡ_２は、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの群から選択され；
ＡＡ_３は、Ａｒｇであり；
ＡＡ_４は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの群から選択される。

さらにより好ましくは、本発明に係るペプチド（すなわち、式（Ｉ）のペプチド）の配列は、
Ｒ_１－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｒ_２ （Ｒ_１－配列番号１－Ｒ_２）
である。

最も好ましい実施形態において、本発明のペプチド（すなわち、式（Ｉ）に記載）の配列は、
Ｐａｌ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ａｌａ－ＮＨ_２ （Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２）
である。

本発明のペプチドは、当技術分野で公知の任意の手段によって、合成し、生成することができる。例えば、それらは、化学的合成によって（好ましくは、固相ペプチド合成によって）、細胞培養において前記ペプチドを発現することによって、または、植物もしくは動物におけるペプチドのトランスジェニック産生によって、合成され、生成され得る。さらに、本発明のペプチドは、当技術分野で公知の任意の手段によって、精製することができる。

後述する実施例から明らかであるように、本発明のペプチドは、ＭｏｈａｗｋおよびコラーゲンＶＩの発現および合成の増加を提供する。さらに、本発明のペプチドは、細胞外マトリックスの合成および構造化を司る遺伝子に有利に働くかまたはアップレギュレートする一方で、前記細胞外マトリックスの分解を司る遺伝子を阻害またはダウンレギュレートする遺伝子の発現を調節する。本発明のペプチドはまた、コラーゲン合成を増大させ、そして皮膚外植片におけるコラーゲン密度および厚さを改善する。さらに、それらは、女性対象の顔面に局所的に適用された場合、皮膚平滑化効果、しわ防止効果、および老化防止効果を有する。

したがって、本発明のペプチドは、上述の問題を解決し、化粧品活性（例えば、老化防止活性および若返り活性）を有する、追加のまたは代替のペプチドを提供する。本発明のペプチドは、例えば、しわ、荒れおよび／もしくは弛みなどの老化に関連する皮膚の徴候を改善することができるか、または、例えば、身体の引き締め、身体の彫り込み、顔面の整復、皮膚の締め付け、および／もしくは毛穴の洗練などの、皮膚の若返りならびに／または皮膚の欠陥の改善を提供することができる。

また、上述した本発明のペプチドのうちのいずれかに関して保存的アミノ酸置換を組み込み、本発明のペプチドについて本明細書中に記載される活性を依然として示すペプチドもまた、本発明の範囲内である。

さらに、ペプチドＲ_１－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｒ_２（好ましくは、Ｐａｌ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ａｌａ－ＮＨ_２）と７０％の同一性割合、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９９％の同一性割合を有し、本発明のペプチドについて本明細書中に記載される活性を依然として示すペプチドもまた、本発明の範囲内に含まれる。

好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、イオン導入によって、より好ましくは対象の顔面および／または身体に対して、より好ましくは対象の顔面、首、手、腕、脚、胸および／または臀部に対して、さらにより好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面および／または首に対して、適用されることに適しているか、または適用されるように適合されている。

最も好ましい実施形態において、本発明の組成物は、局所的に、より好ましくは対象の顔面および／または身体に対して、より好ましくは対象の顔面、首、手、腕、脚、胸および／または臀部に対して、さらにより好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面および／または首に対して、適用されることに適しているか、または適用されるように適合されている。

第２の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明に係るペプチドを含む組成物に言及する。

本発明の組成物は、本発明の１種類のペプチド、または本発明の種々のペプチドの組み合わせもしくは混合物を含むことが意図され、好ましくは、本発明の１種類のペプチドを含むことが意図される。

好ましい実施形態において、本発明の組成物は、化粧品組成物である。

本発明の組成物は、化粧品として有効な量の、少なくとも１つの本発明のペプチドを含む。より好ましくは、本発明の組成物は、０．０００１％（ｇ／１００ｍＬでの質量／体積、以下、ｍ／ｖ）～０．０５％（ｍ／ｖ）の少なくとも１つの本発明のペプチドを含む。最も好ましい実施形態において、本発明の組成物は、０．０００１％（ｍ／ｖ）～０．００１％（ｍ／ｖ）、より好ましくは０．０００５％（ｍ／ｖ）の少なくとも１つの本発明のペプチドを含む。別の最も好ましい実施形態において、本発明の組成物は、０．０５％（ｍ／ｖ）～０．００１％（ｍ／ｖ）の少なくとも１つの本発明のペプチドを含む。

本発明の組成物は、本発明のペプチドの活性の結果として、例えば、しわ、荒れおよび／または弛みなどの老化に関連する皮膚の徴候の改善を提供し；または、例えば、身体の引き締め、身体の彫り込み、顔面の整復、皮膚の締め付け、および／もしくは毛穴の洗練などの、皮膚の若返りならびに／または皮膚の欠陥の改善を提供する。

本発明の組成物はまた、少なくとも１つの追加の化粧品成分を含むことが意図される。前記追加の化粧品成分は、少なくとも１つの賦形剤および／または少なくとも１つの追加の化粧品活性成分であり得る。

追加の化粧品成分は、例えば、安定剤、可溶化剤、ビタミン、着色料および香料などの補助剤；担体；ならびに／または他の化粧品活性成分として、当技術分野で通常使用されるものを含む。

前記追加の化粧品成分は、組成物の他の成分と、特に本発明の組成物に含まれる本発明のペプチドと、物理的および化学的に適合性でなければならない。同様に、前記追加の化粧品成分の性質は、本発明のペプチドおよび組成物の利点を、許容不可能なほど変えてはならない。前記追加の化粧品成分は、合成物もしくは例えば植物抽出物などの天然起源物であってもよく、または、前記追加の化粧品成分は、生物発酵プロセス由来であってもよい（例えば、CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Eleventh Edition (2006)を参照のこと）。

上述した追加の化粧品成分は、ケア、皮膚および／もしくは毛髪の洗浄のためのケア用の組成物において、ならびに／または多汗を防止するための防臭剤および／もしくはクリームにおいて、一般的に使用されるそれらの成分を含むことが意図される。これらは、なかでも、例えば、以下のものである：メラニン合成阻害剤、美白剤または脱色剤、老化防止剤、ＮＯシンターゼ阻害剤、抗酸化剤、大気汚染防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤、抗グリカチオン剤、乳化剤、皮膚軟化剤、有機溶剤、液体推進剤、例えば湿潤剤などのスキンコンディショナー、保湿物質、アルファヒドロキシ酸、保湿剤、ビタミン、顔料または着色料、染料、ゲル化ポリマー、増粘剤、界面活性剤、軟化剤、他のしわ防止剤、眼の下の隈を減少または排除することができる薬剤、剥脱剤、抗菌剤、抗真菌剤、殺菌剤、真皮もしくは表皮の高分子合成を促進する薬剤および／またはその分解を予防もしくは阻害することができる薬剤、例えば、コラーゲン合成促進剤、エラスチン合成促進剤、ラミニン合成促進剤、コラーゲン分解阻害剤、エラスチン分解阻害剤、線維芽細胞増殖促進剤、ケラチノサイト増殖促進剤、ケラチノサイト分化促進剤、脂質合成および角質層成分（セラミド、脂肪酸など）合成の促進剤、皮膚弛緩剤、グリコサミノグリカン合成促進剤、ＤＮＡ修復剤、ＤＮＡ保護剤、プロテオソーム活性促進剤、抗掻痒剤、敏感皮膚治療剤、再確認剤、収斂剤、皮脂産生調節剤、脂肪分解促進剤、抗セルライト剤、鎮静剤、抗炎症剤、毛細血管循環および／または微小循環に作用する薬剤、細胞ミトコンドリアに作用する薬剤、真皮－表皮接合部を改善することを目的とした薬剤、防腐剤、香料、キレート剤、植物抽出物、精油、海洋抽出物、生物発酵プロセス由来の薬剤、鉱塩、細胞抽出物、および／または太陽フィルタ（紫外線ＡおよびＢに対して活性な有機または無機の光保護剤）。

一実施形態において、追加の化粧品成分のうちの少なくとも１つは、本発明のペプチドについて上記にて開示された化粧品活性と同一、類似、相補的または異なる化粧品活性を発揮し得る化粧品活性成分もしくは物質である。本発明の組成物は、以下のものを含むことが意図される：他のしわ防止剤または老化防止剤、例えば、コラーゲン、エラスチン、増殖因子、ヒアルロン酸ブースター、バリア機能剤、照明剤、コラーゲンＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよび／もしくはＶＩならびにラミニンの発現ならびに／または合成の促進剤；グリコサミノグリカンまたはヒアルロン酸合成の促進剤；エラスチンおよび他の弾性線維関連タンパク質の発現ならびに／または合成の促進剤；コラーゲンおよび／または弾性線維分解の阻害剤；ミトコンドリア関連タンパク質（例えば、サーチュインおよびアコニターゼ）の発現および／または合成の促進剤；接着斑タンパク質の発現および／または合成の促進剤；ケラチノサイトおよび／または線維芽細胞の増殖および／または分化の促進剤；抗酸化剤；大気汚染防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤；抗グリカチオン剤；解毒剤；経時的老化、環境上の老化および炎症老化を減少させる薬剤；ならびに、メラニン産生を減少させる、および／もしくはチロシナーゼを阻害する薬剤、ならびに／または脂質合成および表皮成分（ケラチン）の合成、より具体的には角質層（ケラチン、セラミド、フィラグリン、ロリクリンおよびＳＰＲＲ１Ｂ）の合成の促進剤。より好ましくは、追加の化粧品成分のうちの少なくとも１つは、Ａｒｇｉｒｅｌｉｎｅ（登録商標）（アセチルヘキサペプチド－８）、Ｌｅｕｐｈａｓｙｌ（登録商標）（ペンタペプチド－３）、Ｉｎｙｌｉｎｅ（登録商標）（アセチルヘキサペプチド－３０）、Ｓｙｎ－Ａｋｅ（登録商標）（トリペプチド－３）、またはそれらの組み合わせである。

さらに、本発明の組成物（または本発明のペプチド）は、当技術分野で通常使用される任意の形態、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、ペースト、ゲル、クリーム、粉末、スプレー、ローション、油、リニメント、血清、ムース、軟膏、棒または筆など、「リーブオン」および「リンスオフ」製剤を含む形態、で製剤化することができる。また、本発明の組成物は、当技術分野で公知の技術によって、ぬれナプキン、ヒドロゲル、接着性（もしくは非接着性）パッチまたはフェイスマスクなどの様々なタイプの固形アクセサリに対して、組み込むこともでき、または、本発明の組成物は、とりわけ、コンシーラー、メイクアップファンデーション、ローションまたはメイクアップ除去ローションなどの様々なメイクアップ系製品に対して、組み込むことができる。

また、共に本明細書中に開示される、本発明の組成物または本発明のペプチドは、活性成分のより大きな浸透を得るために、化粧品徐放系および／または担体に対して、組み込むことができることも意図される。化粧品徐放系および／または担体は、リポソーム、ミリ粒子、マイクロ粒子およびナノ粒子、ならびに、スポンジ、ベシクル、ミセル、ミリスフィア、マイクロスフィア、ナノスフィア、リポスフィア、ミリカプセル、マイクロカプセルおよびナノカプセル、ならびに、マイクロエマルジョンおよびナノエマルジョンなどである。

好ましい実施形態において、本発明の組成物は、イオン導入によって、より好ましくは対象の顔面および／または身体に対して、より好ましくは対象の顔面、首、手、腕、脚、胸および／または臀部に対して、さらにより好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面および／または首に対して、適用されることに適しているか、または適用されるように適合されている。

最も好ましい実施形態において、本発明の組成物は、局所的に（より好ましくはクリームの形態で）、より好ましくは対象の顔面および／または身体に対して、より好ましくは対象の顔面、首、手、腕、脚、胸および／または臀部に対して、さらにより好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面および／または首に対して、適用されることに適しているか、または適用されるように適合されている。

すでに上述したように、第３の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは組成物の、それを必要とする対象における、化粧品としての使用に言及する。

上述したように、好ましくは、本発明の組成物は、化粧品組成物である。

好ましい実施形態において、化粧品としての使用は、皮膚の老化の徴候を低減、予防および／または排除することである。

明らかであるように、上述した皮膚の老化の徴候は、皮膚の老化の美容上の徴候である。

皮膚の老化は、経時的老化および／または環境上の老化によるものである。

皮膚の老化の美容上の徴候は、好ましくはしわ、荒れおよび／または弛み、より好ましくは顔面のしわ、顔面の弛みおよび／または顔面の荒れ、さらにより好ましくは顔面のしわである。

別の好ましい実施形態において、化粧品としての使用は、皮膚の若返りのため、ならびに／または、皮膚の欠陥を低減、予防および／もしくは排除することであり、より好ましくは、皮膚の引き締め、身体の彫り込み、顔面の整復、皮膚の締め付け、および／または毛穴の洗練のためであり、より好ましくは、身体の引き締め、身体の彫り込み、顔面の整復、顔面の皮膚の締め付け、および／または顔面の毛穴の洗練のためであり、さらにより好ましくは、顔面の整復および／または顔面の皮膚の締め付けのためである。

身体の引き締め、および／または身体の彫り込みは、好ましくは臀部、胸、腕ならびに／または脚の引き締めおよび／もしくは彫り込みを指す。

したがって、本発明のペプチドおよび組成物はまた、皮膚の引き締まりまたは締め付けの喪失、好ましくは皮膚の締め付けの喪失、さらにより好ましくは顔面の皮膚の締め付けの喪失を治療するために使用することができる。

上述したように、本発明のペプチドはまた、組織化したコラーゲン線維の喪失の治療のために、したがって、好ましくは顔面の整復の治療のために、使用することができる。後述する実施例からそのまま導き出されるように、組織化したコラーゲン線維の喪失のこの治療は、少なくとも、ホメオドメインタンパク質ＭｏｈａｗｋおよびコラーゲンＶＩの産生を改善して、行われる。

また、好ましい実施形態において、対象は哺乳動物であり、さらにより好ましくはヒトである。

好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物は、イオン導入によって、より好ましくは対象の顔面および／または身体に対して、より好ましくは対象の顔面、首、手、腕、脚、胸および／または臀部に対して、さらにより好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面および／または首に対して、適用される。

最も好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物は、局所的に（より好ましくはクリームの形態で）、より好ましくは対象の顔面および／または身体に対して、より好ましくは対象の顔面、首、手、腕、脚、胸および／または臀部に対して、さらにより好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面および／または首に対して、適用される。

また、本発明の化粧品としての使用において、本発明のペプチドまたは組成物は、化粧品として有効な量で使用される。より好ましくは、本発明のペプチドは、０．０００１％（ｍ／ｖ）～０．０５％（ｍ／ｖ）の濃度で使用される。最も好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、０．０００１％（ｍ／ｖ）～０．００１％（ｍ／ｖ）、より好ましくは０．０００５％（ｍ／ｖ）の濃度で使用される。別の最も好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、０．０５％（ｍ／ｖ）～０．００１％（ｍ／ｖ）の濃度で使用される。

すでに上述したように、本発明の組成物はまた、少なくとも１つの追加の化粧品成分を含むことが意図される。前記追加の化粧品成分は、少なくとも１つの賦形剤および／または少なくとも１つの追加の化粧品活性成分であり得、当該化粧品活性成分は、上記で説明したものであり得る。また、本発明のペプチドは、上述した事項に記載の少なくとも１つの追加の化粧品成分と組み合わせて、使用されることも意図される。

さらに、本発明のペプチドおよび本発明の組成物は、当技術分野で通常使用される任意の形態、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、ペースト、ゲル、クリーム、粉末、スプレー、ローション、油、リニメント、血清、ムース、軟膏、棒または筆など、「リーブオン」および「リンスオフ」製剤を含む形態、で製剤化することができる。また、本発明のペプチドおよび組成物は、当技術分野で公知の技術によって、ぬれナプキン、ヒドロゲル、接着性（もしくは非接着性）パッチまたはフェイスマスクなどの様々なタイプの固形アクセサリに組み込むこともでき、または、本発明のペプチドおよび組成物は、とりわけ、コンシーラー、メイクアップファンデーション、ローションまたはメイクアップ除去ローションなどの様々なメイクアップ系製品に組み込むことができる。

また、共に本明細書中に開示される、本発明の組成物または本発明のペプチドは、活性成分のより大きな浸透を得るために、リポソーム、ミリ粒子、マイクロ粒子およびナノ粒子等の化粧品徐放系および／または担体に、ならびに、スポンジ、ベシクル、ミセル、ミリスフィア、マイクロスフィア、ナノスフィア、リポスフィア、ミリカプセル、マイクロカプセルおよびナノカプセルに、ならびに、マイクロエマルジョンおよびナノエマルジョンに、組み込むことができることも意図される。

第４の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは組成物（すなわち、上述したもの）の、それを必要とする対象における、化粧品用途に言及する。

上述したように、好ましくは、本発明の組成物は、化粧品組成物である。

好ましい実施形態において、化粧品用途は、皮膚の老化の徴候を低減、予防および／または排除することである。

明らかであるように、上述した皮膚の老化の徴候は、皮膚の老化の美容上の徴候である。

皮膚の老化は、経時的老化および／または環境上の老化によるものである。

皮膚の老化の美容上の徴候は、好ましくはしわ、荒れおよび／または弛み、より好ましくは顔面のしわ、顔面の弛みおよび／または顔面の荒れ、さらにより好ましくは顔面のしわである。

別の好ましい実施形態において、化粧品用途は、皮膚の若返りのため、ならびに／または、皮膚の欠陥を低減、予防および／もしくは排除することであり、より好ましくは、皮膚の引き締め、身体の彫り込み、顔面の整復、皮膚の締め付け、および／または毛穴の洗練のためであり、より好ましくは、身体の引き締め、身体の彫り込み、顔面の整復、顔面の皮膚の締め付け、および／または顔面の毛穴の洗練のためであり、さらにより好ましくは、顔面の整復および／または顔面の皮膚の締め付けのためである。

身体の引き締め、および／または身体の彫り込みは、好ましくは臀部、胸、腕ならびに／または脚の引き締めおよび／もしくは彫り込みを指す。

したがって、本発明のペプチドおよび組成物はまた、皮膚の引き締まりまたは締め付けの喪失、好ましくは皮膚の締め付けの喪失、さらにより好ましくは顔面の皮膚の締め付けの喪失を治療するために使用することができる。

上述したように、本発明のペプチドはまた、組織化したコラーゲン線維の喪失の治療のために、したがって、好ましくは顔面の整復の治療のために、使用することができる。後述する実施例からそのまま導き出されるように、組織化したコラーゲン線維の喪失のこの治療は、少なくとも、ホメオドメインタンパク質ＭｏｈａｗｋおよびコラーゲンＶＩの産生を改善して、行われる。

また、好ましい実施形態において、対象は哺乳動物であり、さらにより好ましくはヒトである。

好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物は、イオン導入によって、より好ましくは対象の顔面および／または身体に対して、より好ましくは対象の顔面、首、手、脚、腕、胸および／または臀部に対して、さらにより好ましくは対象の顔面および／または首に対して、適用される。

大部分の実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物は、局所的に（より好ましくはクリームの形態で）、より好ましくは対象の顔面および／または身体に対して、より好ましくは対象の顔面、首、手、腕、脚、胸および／または臀部に対して、さらにより好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面および／または首に対して、適用される。

また、本発明の化粧品用途において、本発明のペプチドまたは組成物は、化粧品として有効な量で使用される。より好ましくは、より好ましくは、本発明のペプチドは、０．０００１％（ｍ／ｖ）～０．０５％（ｍ／ｖ）の濃度で使用される。最も好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、０．０００１％（ｍ／ｖ）～０．００１％（ｍ／ｖ）、より好ましくは０．０００５％（ｍ／ｖ）の濃度で使用される。別の最も好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、０．０５％（ｍ／ｖ）～０．００１％（ｍ／ｖ）の濃度で使用される。

すでに上述したように、本発明の組成物はまた、少なくとも１つの追加の化粧品成分を含むことが意図される。前記追加の化粧品成分は、少なくとも１つの賦形剤および／または少なくとも１つの追加の化粧品活性成分であり得、当該化粧品活性成分は、上記で説明したものであり得る。また、本発明のペプチドは、上述した事項に記載の少なくとも１つの追加の化粧品成分と組み合わせて、使用されることも意図される。

さらに、本発明のペプチドおよび本発明の組成物は、当技術分野で通常使用される任意の形態、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、ペースト、ゲル、クリーム、粉末、スプレー、ローション、油、リニメント、血清、ムース、軟膏、棒または筆など、「リーブオン」および「リンスオフ」製剤を含む形態、で製剤化することができる。また、本発明のペプチドおよび組成物は、当技術分野で公知の技術によって、ぬれナプキン、ヒドロゲル、接着性（もしくは非接着性）パッチまたはフェイスマスクなどの様々なタイプの固形アクセサリに組み込むこともでき、または、本発明のペプチドおよび組成物は、とりわけ、コンシーラー、メイクアップファンデーション、ローションまたはメイクアップ除去ローションなどの様々なメイクアップ系製品に組み込むことができる。

また、共に本明細書中に開示される、本発明の組成物または本発明のペプチドは、活性成分のより大きな浸透を得るために、リポソーム、ミリ粒子、マイクロ粒子およびナノ粒子等の化粧品徐放系および／または担体に、ならびに、スポンジ、ベシクル、ミセル、ミリスフィア、マイクロスフィア、ナノスフィア、リポスフィア、ミリカプセル、マイクロカプセルおよびナノカプセルに、ならびに、マイクロエマルジョンおよびナノエマルジョンに、組み込むことができることも意図される。

上述したように、第５の態様において、本発明は、本発明に係るペプチドまたは組成物の、それを必要とする対象における使用を含むことを特徴とする、化粧方法に言及する。

上述したように、好ましくは、本発明の組成物は、化粧品組成物である。

上記から導き出されるように、本発明の化粧方法における本発明に係るペプチドまたは組成物の使用は、化粧品としての使用である。

好ましい実施形態において、化粧方法は、それを必要とする対象において、皮膚の老化の徴候を低減、予防および／または排除することである。

明らかであるように、上述した皮膚の老化の徴候は、皮膚の老化の美容上の徴候である。

皮膚の老化は、経時的老化および／または環境上の老化によるものである。

皮膚の老化の美容上の徴候は、好ましくはしわ、荒れおよび／または弛み、より好ましくは顔面のしわ、顔面の弛みおよび／または顔面の荒れ、さらにより好ましくは顔面のしわである。

別の好ましい実施形態において、化粧方法は、皮膚の若返りのため、ならびに／または、それを必要とする対象において、皮膚の欠陥を低減、予防および／もしくは排除することであり、より好ましくは、皮膚の引き締め、身体の彫り込み、顔面の整復、皮膚の締め付け、および／または毛穴の洗練のためであり、より好ましくは、身体の引き締め、身体の彫り込み、顔面の整復、顔面の皮膚の締め付け、および／または顔面の毛穴の洗練のためであり、さらにより好ましくは、顔面の整復および／または顔面の皮膚の締め付けのためである。

身体の引き締め、および／または身体の彫り込みは、好ましくは臀部、胸、腕ならびに／または脚の引き締めおよび／もしくは彫り込みを指す。

したがって、本発明のペプチドおよび組成物はまた、皮膚の引き締まりまたは締め付けの喪失、好ましくは皮膚の締め付けの喪失、さらにより好ましくは顔面の皮膚の締め付けの喪失を治療するために使用することができる。

上述したように、本発明のペプチドはまた、組織化したコラーゲン線維の喪失の治療のために、したがって、好ましくは顔面の整復の治療のために、使用することができる。後述する実施例からそのまま導き出されるように、組織化したコラーゲン線維の喪失のこの治療は、少なくとも、ホメオドメインタンパク質ＭｏｈａｗｋおよびコラーゲンＶＩの産生を改善して、行われる。

また、好ましい実施形態において、対象は哺乳動物であり、さらにより好ましくはヒトである。

好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物は、イオン導入によって、より好ましくは対象の顔面および／または身体に対して、より好ましくは対象の顔面、首、手、腕、脚、胸および／または臀部に対して、さらにより好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面および／または首に対して、適用される。

最も好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物は、局所的に（より好ましくはクリームの形態で）、より好ましくは対象の顔面および／または身体に対して、より好ましくは対象の顔面、首、手、腕、脚、胸および／または臀部に対して、さらにより好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面および／または首に対して、適用される。

好ましくは、対象は哺乳動物であり、さらにより好ましくはヒトである。

また、本発明の化粧方法において、本発明のペプチドまたは組成物は、化粧品として有効な量で使用される。より好ましくは、本発明のペプチドは、０．０００１％（ｍ／ｖ）～０．０５％（ｍ／ｖ）の濃度で使用される。最も好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、０．０００１％（ｍ／ｖ）～０．００１％（ｍ／ｖ）、より好ましくは０．０００５％（ｍ／ｖ）の濃度で使用される。別の最も好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、０．０５％（ｍ／ｖ）～０．００１％（ｍ／ｖ）の濃度で使用される。

すでに上述したように、本発明の組成物はまた、少なくとも１つの追加の化粧品成分を含むことが意図される。前記追加の化粧品成分は、少なくとも１つの賦形剤および／または少なくとも１つの追加の化粧品活性成分であり得、当該化粧品活性成分は、上記で説明したものであり得る。また、本発明のペプチドは、上述した事項に記載の少なくとも１つの追加の化粧品成分と組み合わせて、使用されることも意図される。

さらに、本発明のペプチドおよび本発明の組成物は、当技術分野で通常使用される任意の形態、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、ペースト、ゲル、クリーム、粉末、スプレー、ローション、油、リニメント、血清、ムース、軟膏、棒または筆など、「リーブオン」および「リンスオフ」製剤を含む形態、で製剤化することができる。また、本発明のペプチドおよび組成物は、当技術分野で公知の技術によって、ぬれナプキン、ヒドロゲル、接着性（もしくは非接着性）パッチまたはフェイスマスクなどの様々なタイプの固形アクセサリに組み込むこともでき、または、本発明のペプチドおよび組成物は、とりわけ、コンシーラー、メイクアップファンデーション、ローションまたはメイクアップ除去ローションなどの様々なメイクアップ系製品に組み込むことができる。

また、共に本明細書中に開示される、本発明の組成物または本発明のペプチドは、活性成分のより大きな浸透を得るために、リポソーム、ミリ粒子、マイクロ粒子およびナノ粒子等の化粧品徐放系および／または担体に、ならびに、スポンジ、ベシクル、ミセル、ミリスフィア、マイクロスフィア、ナノスフィア、リポスフィア、ミリカプセル、マイクロカプセルおよびナノカプセルに、ならびに、マイクロエマルジョンおよびナノエマルジョンに、組み込むことができることも意図される。

より良い理解を可能にするために、本発明は、添付の図面を参照して、以下でより詳細に説明される。これらは、一例として、例示的および非限定的な実施例を参照して、提示される。

図１は、基準状態と比較して、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の濃度を増加させて処理した後のＨＥＫａ細胞生存率の割合を示す（すなわち、基準状態の細胞生存率を１００％と設定し、次いで、試験した残りのサンプルと比較する）。図１について、列は、ｘ軸において左から右へ向かって、それぞれ以下に対応する：基準状態（処理なしの細胞）、ならびに、０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、および０．１ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理した細胞。ｙ軸は、（基準状態に対する）細胞生存率の割合を示す。

図２は、基準状態と比較して、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理した後のＨＤＦａ細胞生存率の割合を示す（すなわち、基準状態の細胞生存率を１００％と設定し、次いで、試験した残りのサンプルと比較する）。図２について、列は、ｘ軸において左から右へ向かって、それぞれ以下に対応する：基準状態（処理なしの細胞）、ならびに、０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、および０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理した細胞。ｙ軸は、（基準状態に対する）細胞生存率の割合を示す。＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。

図３は、未処理の初期ヒト真皮線維芽細胞に対する、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を用いた処理によって誘導された初期ヒト真皮線維芽細胞における遺伝子発現プロファイルの変調を示す。遺伝子発現プロファイルは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）によって正規化された。図３は、上記ペプチドを用いた処理（０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度で、すべての遺伝子について６時間）について得られた結果を示す。ここで、バーは、上から下へ向かって、それぞれ以下の遺伝子を指す：ＭＭＰ３（マトリックスメタロプロテイナーゼ－３）、ＭＭＰ１（マトリックスメタロプロテイナーゼ－１）、ＣＯＬ１４Ａ１（コラーゲンタイプＸＩＶ アルファ１鎖）、ＣＯＬ１２Ａ１（コラーゲンタイプＸＩＩ アルファ１鎖）、ＣＯＬ７Ａ１（コラーゲンタイプＶＩＩ アルファ１鎖）、ＣＯＬ６Ａ１（コラーゲンタイプＶＩ アルファ１鎖）、ＣＯＬ５Ａ１（コラーゲンタイプＶ アルファ１鎖）、ＣＯＬ４Ａ５（コラーゲンタイプＩＶ アルファ５鎖）、ＣＯＬ３Ａ１（コラーゲンタイプＩＩＩ アルファ１鎖）、ＭＫＸ（Ｍｏｈａｗｋホメオボックス）、およびＺＥＢ２（ジンクフィンガーＥ－Ｂｏｘ結合ホメオボックス２）。ｘ軸は、基準状態に対する変化倍率を指す。負の変化倍率は遺伝子発現のダウンレギュレーションを指し、正の変化倍率はアップレギュレーションを指す。

図４は、未処理の初期ヒト真皮線維芽細胞に対する、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を用いた処理によって誘導された初期ヒト真皮線維芽細胞における遺伝子発現プロファイルの変調を示す。遺伝子発現プロファイルは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）によって正規化された。図４は、上記ペプチドを用いた処理（０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度で、２４時間）について得られた結果を示す。ここで、バーは、以下の遺伝子に対応する：ＣＯＬ１３Ａ１（コラーゲンタイプＸＩＩＩ アルファ１鎖）。ｘ軸は、基準状態に対する変化倍率を指す。負の変化倍率は遺伝子発現のダウンレギュレーションを指し、正の変化倍率はアップレギュレーションを指す。

図５は、未処理の初期ヒト真皮線維芽細胞に対する、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を用いた処理によって誘導された初期ヒト真皮線維芽細胞における遺伝子発現プロファイルの変調を示す。遺伝子発現プロファイルは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）によって正規化された。図５は、上記ペプチドを用いた処理（０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度で、すべての遺伝子について６時間）について得られた結果を示す。ここで、バーは、上から下へ向かって、それぞれ以下の遺伝子を指す：ＴＧＦＢ１（形質転換増殖因子ベータ－１）、ＦＮ１（フィブロネクチン１）、ＬＯＸＬ３（リシルオキシダーゼ３様）、ＬＯＸＬ２（リシルオキシダーゼ２様）、およびＨＳＰ４７（セルピンＨ１）。ｘ軸は、基準状態に対する変化倍率を指す。負の変化倍率は遺伝子発現のダウンレギュレーションを指し、正の変化倍率はアップレギュレーションを指す。

図６は、ネガティブコントロール（ジメチルスルホキシドで処理）と比較した、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の濃度を増加させて処理したヒト真皮線維芽細胞によるコラーゲンＶＩ合成の増加率を示す（すなわち、ネガティブコントロールのコラーゲンＶＩ合成を１００％と設定し、次いで、試験した残りのサンプルのコラーゲンＶＩ合成と比較する）。図６について、列は、ｘ軸において左から右へ向かって、それぞれ以下に対応する：ネガティブコントロール（ジメチルスルホキシドで処理した細胞）、ならびに０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理した細胞。ｙ軸は、（ネガティブコントロールに対する）コラーゲンＶＩ合成の割合を示す。＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。

図７は、ネガティブコントロール（ジメチルスルホキシドで処理）と比較した、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の濃度を増加させて処理したヒト真皮線維芽細胞によるＭｏｈａｗｋ合成の増加率を示す（すなわち、ネガティブコントロールのＭｏｈａｗｋ合成を１００％と設定し、次いで、試験した残りのサンプルのＭｏｈａｗｋ合成と比較する）。図７について、黒色の列は２４時間の処理を指し、白色の列は４８時間の処理を指す。さらに、２本（１本の黒色、および１本の白色）の列のそれぞれの群は、この図におけるｘ軸において左から右へ向かって、それぞれ以下に対応する：ネガティブコントロール（ジメチルスルホキシドで処理した細胞）、未処理細胞、ならびに０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理した細胞。ｙ軸は、（ネガティブコントロールに対する）Ｍｏｈａｗｋ合成の割合を示す。＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。

図８は、コラーゲンの架橋を示す。「ａ」で示される線は、０．０４ｍｇ／ｍＬの濃度でペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理された細胞を指し；「ｂ」で示される線は、０．０２ｍｇ／ｍＬの濃度でペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理された細胞を指し；「ｃ」で示される線は、ジメチルスルホキシドで処理された細胞（ネガティブコントロール）を指す。ｘ軸は秒単位の時間を示し、ｙ軸は４５０ｎｍでの吸光度単位の光学密度を示す。

図９は、ネガティブコントロール（未処理ｈＯＳＥＣ）と比較した、放出ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の割合による組織生存率を示す（すなわち、ネガティブコントロールの放出ＬＤＨを１００％と設定し、次いで、実施例１１において試験した残りのサンプル中の放出ＬＤＨと比較する）。菱形を伴う線は、未処理ｈＯＳＥＣ（ネガティブコントロール）を指し；正方形を伴う線は、老化ｈＯＳＥＣを指し；三角を伴う線は、老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ａ（クリーム）を指し；十字を伴う線は、老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂ（０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）を指す。ｘ軸は日単位の時間を表し、ｙ軸はネガティブコントロール（未処理ｈＯＳＥＣ）に対する放出ＬＤＨの％を表す。

図１０は、ネガティブコントロール（未処理ｈＯＳＥＣ）と比較した、レゾルフィンの割合による代謝活性を示す（すなわち、ネガティブコントロールのレゾルフィンを１００％と設定し、次いで、実施例１１において試験した残りのサンプル中のレゾルフィンと比較する）。それぞれ、菱形を伴う線は、未処理ｈＯＳＥＣ（ネガティブコントロール）を指し；正方形を伴う線は、老化ｈＯＳＥＣを指し；三角を伴う線は、老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ａ（クリーム）を指し；十字を伴う線は、老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂ（０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）を指す。ｘ軸は日単位の時間を表し、ｙ軸はネガティブコントロール（未処理ｈＯＳＥＣ）に対するレゾルフィンの％を表す。

図１１は、ネガティブコントロール（未処理ｈＯＳＥＣ）と比較した、実施例１１の種々の実験群におけるコラーゲンの定量を示す（すなわち、ネガティブコントロールのコラーゲン量を１００％と設定し、次いで、試験した残りのサンプルのコラーゲン量と比較する）。列は、ｘ軸において左から右へ向かって、それぞれ以下に対応する：未処理ｈＯＳＥＣ（ネガティブコントロール）；老化ｈＯＳＥＣ；老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ａ（クリーム）；および、老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂ（０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）。ｙ軸は、ネガティブコントロールに対する、コラーゲン量の割合を指す。＊はｐ＜０．０５を表し；＊＊はｐ＜０．０１を表す。

図１２は、実施例１１の種々の実験群の透過型電子顕微鏡画像を示す。より正確には、図１２Ａは未処理ｈＯＳＥＣに対応し；図１２Ｂは老化ｈＯＳＥＣに対応し；図１２Ｃは製品Ａ（クリーム）で処理した老化ｈＯＳＥＣに対応し；図１２Ｄは製品Ｂ（０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）で処理した老化ｈＯＳＥＣに対応する。

図１３は、ネガティブコントロール（未処理ｈＯＳＥＣ）と比較した、実施例１１の種々の実験群におけるコラーゲンの密度を示す（すなわち、ネガティブコントロールのコラーゲン密度を１００％と設定し、次いで、試験した残りのサンプルのコラーゲン密度と比較する）。列は、ｘ軸において左から右へ向かって、それぞれ以下に対応する：未処理ｈＯＳＥＣ（ネガティブコントロール）；老化ｈＯＳＥＣ；老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ａ（クリーム）；および、老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂ（０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）。ｙ軸は、ネガティブコントロールに対する、コラーゲン密度の割合を指す。＊はｐ＜０．０５を表す。

図１４は、ネガティブコントロール（未処理ｈＯＳＥＣ）と比較した、実施例１１の種々の実験群におけるコラーゲン線維の厚さを示す（すなわち、ネガティブコントロールのコラーゲン線維厚さを１００％と設定し、次いで、試験した残りのサンプルのコラーゲン線維厚さと比較する）。列は、ｘ軸において左から右へ向かって、それぞれ以下に対応する：未処理ｈＯＳＥＣ（ネガティブコントロール）；老化ｈＯＳＥＣ；老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ａ（クリーム）；および、老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂ（０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）。ｙ軸は、ネガティブコントロールに対する、コラーゲン線維厚さの割合を指す。＊はｐ＜０．０５を表す。

図１５は、４４人の女性ボランティア（５０％は明色素性（フォトタイプＩＩ～ＩＩＩ）、および５０％は暗色素性（フォトタイプＶ～ＶＩ））に対する、Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の局所適用後の効力を示す。０．０５％（ｍ／ｖ）のストックからの２％（ｍ／ｖ）のＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２ペプチドを含む化粧品製剤または偽薬を、５６日間、ボランティアの顔面全体にそれぞれ適用した。図１５（Ａ）は、ＡＥＶＡ（Eotech, France）によるボランティアの頬の荒れ改善を示す。ＡＥＶＡ評価は、干渉縞投影システムと組み合わせたステレオカメラによって得られた皮膚トポグラフィーの３Ｄ画像に基づいている。ｘ軸において、左から右へ向かって、６個の列の群は、それぞれ以下に対応する：すべて処置開始から数えて、全ボランティアの２８日目の平均、フォトタイプＶ～ＶＩのボランティアの２８日目の平均、フォトタイプＩＩ～ＩＩＩのボランティアの２８日目の平均、全ボランティアの５６日目の平均、フォトタイプＶ～ＶＩのボランティアの５８日目の平均、フォトタイプＩＩ～ＩＩＩボランティアの５６日目の平均。また、ｘ軸において、列の群それぞれにおいて、左から右へ向かって、列は、以下に対応する：化粧品製剤（偽薬）で処置したボランティア、同じ製剤だがＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２ペプチドも含む製剤で処置したボランティア。ｙ軸は、開始時に対する、荒れパラメータ（Ｒａ）の変化の割合を示す。図１５（Ｂ）は、ＡＥＶＡによるボランティアの頬の彫り込みの改善を示す。ｘ軸において、左から右へ向かって、６個の列の群は、それぞれ以下に対応する：すべて処置開始から数えて、全ボランティアの２８日目の平均、フォトタイプＶ～ＶＩのボランティアの２８日目の平均、フォトタイプＩＩ～ＩＩＩのボランティアの２８日目の平均、全ボランティアの５６日目の平均、フォトタイプＶ～ＶＩのボランティアの５８日目の平均、フォトタイプＩＩ～ＩＩＩボランティアの５６日目の平均。また、ｘ軸において、列の群それぞれにおいて、左から右へ向かって、列は、以下に対応する：化粧品製剤（偽薬）で処置したボランティア、同じ製剤だがＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２ペプチドも含む製剤で処置したボランティア。ｙ軸は、開始時に対する、彫り込みパラメータ（Ｒｚ）の変化の割合を示す。図１５（Ｃ）は、目じりのしわ領域のしわ深さの変化（％）を示す。ｘ軸において、左から右へ向かって、６個の列の群は、それぞれ以下に対応する：すべて処置開始から数えて、全ボランティアの２８日目の平均、全ボランティアの５６日目の平均、フォトタイプＶ～ＶＩのボランティアの２８日目の平均、フォトタイプＶ～ＶＩのボランティアの５６日目の平均、フォトタイプＩＩ～ＩＩＩのボランティアの２８日目の平均、フォトタイプＩＩ～ＩＩＩボランティアの５６日目の平均。また、ｘ軸において、列の群それぞれにおいて、左から右へ向かって、列は、以下に対応する：化粧品製剤（偽薬）で処置したボランティア、同じ製剤だがＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２ペプチドも含む製剤で処置したボランティア。ｙ軸は、開始時に対する、目じりのしわ領域のしわ深さの変化の割合を示す。

〔実施例〕
〔略語〕
アミノ酸について使用される略語は、Eur. J. Biochem. (1984)に概説されている、生物化学の命名法に関するＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ共同委員会勧告１９８３に従う。

Ａｃ、アセチル；Ａｌａ、アラニン；Ａｒｇ、アルギニン；Ｃ末端、カルボキシ末端；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＤＩＥＡ、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン；ＤＩＰＣＤＩ、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；ＥＤＧＳ、ＥｐｉＬｉｆｅ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；ｅｑｕｉｖ、当量；ＥＳＩ－ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化質量分析；Ｆｍｏｃ、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル；Ｈｉｓ、ヒスチジン；ＨＯＢｔ、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール；ｈＯＳＥＣ、ヒト器官型皮膚外植片培養物；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＨＲＰ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ；Ｉｌｅ、イソロイシン；ＬＳＧＳ、Ｌｏｗ Ｓｅｒｕｍ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；ＭＢＨＡ、ｐ－メチルベンズヒドリルアミン；Ｌｅｕ、ロイシン；Ｌｙｓ、リジン；Ｍｅ、メチル；ＭｅＣＮ、アセトニトリル；ＭｅＯＨ、メタノール；Ｍｅｔ、メチオニン；Ｎ末端、アミノ末端；Ｐａｌ、パルミトイル；Ｐｂｆ、２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル；Ｐｈｅ、フェニルアラニン；ｒｐｍ、回転数毎分；ＲＴ、室温；ｔＢｕ、ｔｅｒｔ－ブチル；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＩＳ、トリイソプロピルシラン；ＴＭＢ、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン；Ｔｒｔ、トリフェニルメチルまたはトリチル；Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｔｙｒ、チロシン；Ｖａｌ、バリン。

本実施例に含まれる化学合成手順に関して、すべての合成プロセスは、多孔質ポリエチレンディスクを取り付けたポリプロピレンシリンジ中、または多孔質プレートを取り付けたＰｙｒｅｘ（登録商標）反応器中で実施したことに留意されたい。すべての試薬および溶媒は合成品質であり、いかなる追加の処理も行わずに使用した。溶媒および可溶性試薬は、吸引により除去した。Ｆｍｏｃ基を、ピペリジン－ＤＭＦ（２：８、ｖ／ｖ）（少なくとも１×１分、２×１０分、５ｍＬ／ｇ樹脂）で除去した（Lloyd Williams P. et al, (1997), Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC, Boca Raton (Fla., USA)）。脱保護と、カップリングと、再度の脱保護との段階の間の洗浄は、１０ｍｌ溶媒／ｇ樹脂を使用して、毎回、ＤＭＦ（３×１分）およびＤＣＭ（３×１分）を用いて行った。カップリング反応は、３ｍｌ溶媒／ｇ樹脂で行った。カップリングの制御は、ニンヒドリン試験を実施することによって、行った（Kaiser E. et al., Anal. Biochem., 1970, 34: 595598）。すべての合成反応および洗浄は、室温で行った。

〔実施例１．ペプチドの合成および調製〕
〔Ｆｍｏｃ－ＡＡ_１－ＡＡ_２－ＡＡ_３－ＡＡ_４－Ｒｉｎｋ－ＭＢＨＡ－樹脂を得る（式中、ＡＡ_１はＬ－Ｈｉｓであり；ＡＡ_２はＬ－Ｔｙｒであり；ＡＡ_３はＬ－Ａｒｇであり；ＡＡ_４はＬ－Ａｌａである）〕
重量を標準化した。Ｆｍｏｃ基を除去するために、０．５２ｍｍｏｌ／ｇの官能基化を有する４．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ＭＢＨＡ樹脂を、当技術分野で公知の一般的なプロトコルに記載されるようにして、ピペリジン－ＤＭＦを用いて処理した。ＤＩＰＣＤＩ（１．１７ｍＬ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）およびＨＯＢｔ（１．０１ｇ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で、２．３３ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、ＤＭＦを溶媒として使用して、１時間、脱保護された樹脂上に組み込んだ。

次いで、樹脂を、当技術分野で公知の一般的な方法に記載されているように洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を繰り返し、次のアミノ酸をカップリングした。先に記載されたプロトコルに従って、４．８７ｇのＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて３．４５ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；および、続いて４．６５ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、それぞれ、１．０１ｇのＨＯＢｔ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）および１．１７ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で、順にカップリングした。既に上述したように、それぞれのアミノ酸付加工程間に、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を行った。

合成後、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し（それぞれ３分間で５回）、真空下で乾燥させた。

上述の合成手順を用いて、以下の配列を合成した：
Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ａｌａ（配列番号１）。

〔実施例２．実施例１により合成されたペプチドのＦｍｏｃ Ｎ末端保護基の除去〕
ペプチジル樹脂のＮ末端Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の２０％（体積／体積、以下、ｖ／ｖ）ピペリジンで脱保護した（１×１分＋２×１０分）（Lloyd Williams P. et al. (1997) Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC, Boca Raton (Fla., USA)）。ペプチジル樹脂をＤＭＦ（５×１分）、ＤＣＭ（４×１分）で洗浄し、真空下で乾燥させた。

〔実施例３．実施例２により得られたペプチジル樹脂上にＲ_１パルミトイル基を導入するプロセス〕
実施例２により得られたペプチジル樹脂１ｍｍｏｌ（１当量）を、１０当量のＤＩＥＡおよび１０当量のＨＯＢｔの存在下で、溶媒として５ｍＬのＤＭＦを用いて、１０当量のヘキサデセン酸（パルミチン酸）で処理した。それらを３０分間反応させた後、ペプチジル樹脂をＤＭＦ（５×１分）、ＤＣＭ（４×１分）で洗浄し、真空下で乾燥させた。

〔実施例４．実施例２および３により得られたペプチジル樹脂のポリマー支持体からの切断プロセス〕
重量を標準化した。実施例２または３のいずれかにおいて得られた乾燥ペプチジル樹脂２００ｍｇを、撹拌しながら室温で２時間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ（９０：５：５）で処理した。濾液を回収し、５０ｍＬ（８～１０倍）の冷ジエチルエーテルを用いて沈殿させた。エーテル溶液を減圧下および室温で蒸発乾固させ、沈殿物をＨ_２Ｏ中の５０％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮに再溶解し、凍結乾燥させた。

〔実施例５．実施例４により合成および調製されたペプチドの特性付け〕
実施例４により得られたペプチドのＨＰＬＣ分析は、島津製の装置（Kyoto, Japan）を用いて行った。ここでは、逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８、３．５μｍ、Waters, USA）を、Ｈ_２Ｏ（＋０．０４５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）中のＭｅＣＮ（＋０．０３６％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）の勾配中、流速１．２５ｍＬ／分で使用し、検出は２２０ｎｍで行った。すべてのペプチドは、８０％を超える純度を示した。得られたペプチドの同一性は、移動相としてＭｅＯＨを使用し、流速０．２ｍＬ／分のＷａｔｅｒ ＺＱ ４０００検出器中でのＥＳＩ－ＭＳによって、確認した。得られた結果は、ペプチドＰａｌ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ａｌａ－ＮＨ_２（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２）が正確かつ効果的に合成されたことを実証した。

〔実施例６．ＨＥＫａおよびＨＤＦａ細胞におけるペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の細胞毒性の分析〕
ＨＥＫａ（ヒト表皮ケラチノサイト、成体）およびＨＤＦａ（ヒト真皮線維芽細胞、成体）細胞における生存率アッセイによって、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の細胞毒性を分析した。

ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２は、実施例１～５によって調製した。

細胞毒性は、ＭＴＴアッセイによって評価した。簡単に説明すると、ＨＥＫａおよびＨＤＦａ細胞を、１×１０^５細胞／ｍＬの濃度で９６ウェルプレートに播種し、インキュベートした。当該インキュベートは、１％（ｖ／ｖ）のＥＤＧＳおよび１％（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＥｐｉｌｉｆｅ培地（ＨＥＫａ細胞の場合）、ならびに、２％（ｖ／ｖ）のＬｏｗ Ｓｅｒｕｍ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＬＳＧＳ）を補充した培地１０６（ＨＤＦａ細胞の場合）中で、３７℃、５％のＣＯ_２および飽和湿度で、２４時間であった。次いで、ＭＴＴ評価のために、細胞を、種々の濃度のペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２（ＨＥＫａ細胞の場合は０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬ；ならびに、ＨＤＦａ細胞の場合は０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．０１ｍｇ／ｍＬ）で、３回繰り返し処理した。対応する濃度のペプチドを用いた２４時間の処理後、１０μＬの黄色テトラゾリウム（ＭＴＴ）を各ウェルに添加し、３７℃でさらに４時間、細胞をインキュベートした。ＭＴＴと共にインキュベートした後、各ウェルの培地を吸引し、１５０μＬのジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）（１００％）を添加し、形成されたホルマザン結晶を可溶化した。結晶の可溶化を完了するために、プレートを振盪機上に５分間置き、次いで、マイクロプレートリーダーＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣを使用して、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を決定した。吸光度は、培養物中の生きている細胞の数に正比例する。吸光度の値は、処理されていない細胞（基準状態）について得られたデータを用いて、正規化した。

結果は、図１および２に要約される。

前記図からそのまま導き出すことができるように、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、試験した濃度ではＨＥＫａおよびＨＤＦａ細胞の生存率を変化させなかった。したがって、細胞毒性ではない。

〔実施例７．初期ヒト真皮線維芽細胞における遺伝子発現調節の分析〕
ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２について、コラーゲンおよび細胞外マトリックスの産生に関連する遺伝子の発現を調節する能力を分析した（分析した遺伝子については、表１を参照のこと）。

ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２は、実施例１～５によって調製した。

ペプチドのストック溶液をＤＭＳＯ中で１２．５ｍｇ／ｍＬに調製した。検量線用溶液は、ストック溶液から、対応する補充培地中で特定の濃度に新たに調製した。

未処理細胞をネガティブコントロールサンプルとして使用した。

ＲＮＡ（リボ核酸）抽出およびＲＴ－ｑＰＣＲ（逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。簡単に説明すると、６ウェルプレート中に４×１０^５細胞／ウェルの密度でＨＤＦａ細胞を２回反復（ｎ＝２）で播種し、標準的な培養条件下（１％（ｖ／ｖ）ＬＳＧＳを補充した１０６培地；３７℃、９５％室内湿度、５％のＣＯ_２）で、２４時間維持した。次いで、濃度０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で、さらに６時間（または、ＣＯＬ１３Ａ１の場合は２４時間）、細胞を処理した。未処理細胞を基準コントロールとして使用した。

最後に細胞を溶解し、ＲＮＡ抽出のために、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを使用して、製造業者の説明書に従って、複製物を一緒にプールした。精製したＲＮＡを用いて、増幅のための鋳型として働く市販のキットである高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems）を用いた逆転写によって、対応するｃＤＮＡ（相補的デオキシリボ核酸）を生成した。ＳｔｅｐＯｎｅ＋Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置を使用して、表１に示す遺伝子（ハウスキーピング遺伝子として使用した、ＧＡＰＤＨ－グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼを加えたもの）に対しての適切なＴａｑＭａｎアッセイプローブのパネル、および２ｘ遺伝子発現マスターミックスを用いて、ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。増幅は：９５℃で１５秒（変性）および６０℃で１分（アニールおよび伸長）；を４０サイクル含んだ（Arya, M., Shergill, I.S., Williamson, M., Gommersall, L., Arya, N., Patel, H.R. (2005) Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Rev. Mol. Diagn.; 5(2):209-19; and Jozefczuk, J. and Adjaye, J. (2011) Quantitative real-time PCR-based analysis of gene expression. Methods Enzymol. 500; 99-109）。

得られたデータを、ΔΔＣｔ法を用いて分析した。この方法は、未処理の基準サンプルと比較した、処理サンプルにおける変化倍率として、標的遺伝子の発現値を提供する。両方のサンプルを、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）の相対的な発現を用いて、正規化した。

分析のための工程には、以下が含まれる：
１．各条件について、平均Ｃｔを算出する、
２．ΔＣＴ試験サンプルおよびΔＣＴ未処理サンプルを算出する、
３．ΔΔＣＴを算出する（ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ試験サンプル－ΔＣＴ未処理サンプル）、
４．２^ΔΔＣＴによって、比率を得る。

このアッセイの結果は、図３～５に要約される。

前記図から容易に導き出すことができるように、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２は：
－６時間の処理後：遺伝子ＭＭＰ１およびＭＭＰ３をダウンレギュレートし、これは広く知られているように、細胞外マトリックスタンパク質を分解する。
－６時間の処理後：コラーゲンアーキテクチャおよび細胞外アーキテクチャにおけるいくつかの重要な遺伝子：ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１３Ａ１（２４時間の処理後）、ＭＫＸ ｙ ＺＥＢ２；をアップレギュレートする。
－６時間の処理後、いくつかのコラーゲン架橋に関連する遺伝子：ＴＧＦＢ１、ＦＮ１、ＬＯＸＬ３、ＬＯＸＬ２およびＨＳＰ４７；をアップレギュレートする。

したがって、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、コラーゲンの合成および架橋の増加に寄与しながら、細胞外マトリックス分解を回避または予防し、したがって、老化予防活性および若返り活性を示す。

〔実施例８．ヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲンＶＩの分析〕
ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２について、ヒト真皮線維芽細胞においてコラーゲンＶＩの合成を誘導する能力を分析した。

ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２は、実施例１～５によって調製した。

このアッセイでは、ヒト真皮線維芽細胞においてコラーゲンＶＩ合成を増加させる試験ペプチドの能力をインビトロで評価した。Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で細胞を処理した後のコラーゲンＶＩの量を測定することによって、この評価を行った。

実験プロトコルは、以下の実験群を規定した：
－ネガティブコントロール：可溶化ビヒクル（ＤＭＳＯ）のみで処理した細胞培養物；
－３つの濃度（０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．００１ｍｇ／ｍＬ）のペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理した細胞培養物。

ＤＭＳＯ中でペプチドのストック溶液を調製し、次いで、細胞培養培地中で０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．００１ｍｇ／ｍＬの３段階の希釈溶液を調製した。

この場合に使用された生物学的モデルは、正常なヒト真皮線維芽細胞からなっていた。細胞を９６ウェルプレートに１×１０^４細胞／ウェルで播種し、標準的な培養条件下（３７℃、９５％室内湿度、５％のＣＯ_２）で、２４時間維持した。

２４時間インキュベートした後、培地を除去し、処理を包含する新しい培地（ＤＭＳＯまたはＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２）をウェルに添加した。サンプル処理を４８時間続け、処理の終わりに、細胞培養培地を回収した。ＤＭＳＯで処理した細胞をネガティブコントロールとして使用した。

試験実施のために、ヒト真皮線維芽細胞の細胞培養物を、上記の３つの濃度のＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理した。

４８時間の処理後、細胞によって産生され放出されたコラーゲンＶＩ（エキソノボコラーゲンＶＩ合成）の量を、ＥＬＩＳＡアッセイによって、細胞培養培地中で測定した。結果を、ネガティブコントロール（ＤＭＳＯで処理した細胞）の結果と比較した。処理は、３回反復で、３つの異なる実験セッションで行った。

コラーゲンＶＩの定量は、ＥＬＩＳＡ法によって行った。この目的のために、市販のキットを使用した。試験キットは、サンドイッチＥＬＩＳＡ方法を用いてヒトコラーゲンＶＩの含有量を検出した。キットに備え付けられたマイクロＥＬＩＳＡプレートは、コラーゲンＶＩに特異的な抗体でプレコートされた。標準物またはサンプルを、適切なマイクロＥＬＩＳＡプレートウェルに添加し、特異的抗体と結合させた。次いで、コラーゲンＶＩに特異的なビオチン化検出抗体、およびアビジン－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体を、それぞれマイクロプレートウェルに連続的に添加し、インキュベートした。遊離成分は洗い流した。基質溶液（ＴＭＢ）を各ウェルに添加した。コラーゲンＶＩを含有するウェルのみが青色を発色した。酵素－基質反応は、硫酸溶液の添加によって停止され、色は黄色に変わった。光学密度（ＯＤ）を、４５０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーによって測定した。ＯＤ値は、コラーゲンＶＩの濃度に比例した。

定量的な測定は、既知の増加していく濃度の標準コラーゲンＶＩから構成される検量線を用いた。ネガティブコントロール（ＤＭＳＯ）とサンプルとの間のコラーゲンＶＩ含有量の％変動を計算した。これは、Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の、コラーゲンＶＩ合成を増加させる効果の直接的な指標である。

この実験で得られた結果は、表２および図６に要約される。

表２および図６からそのまま導き出すことができるように、すべての場合において（すなわち、試験したすべての濃度について）、コラーゲンＶＩの合成における統計的に有意な増加が観察された。これはさらに、用量依存性として記載することができた：０．００１ｍｇ／ｍＬでは１１％増加、０．００５ｍｇ／ｍＬでは１６％増加、および０．０１ｍｇ／ｍＬでは４０％増加。図６に示したように、処理群において認められた、ネガティブコントロールに対するコラーゲンＶＩ含有量の差は、統計学的に有意である。

上述した結果は、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、タンパク質コラーゲンＶＩの合成を増加させ、したがって、細胞外マトリックス集合体の改善に寄与することを実証する。したがって、前記ペプチドは、皮膚の老化、ならびに／または前記老化の皮膚の徴候、例えば、しわ、荒れおよび／もしくは弛み、を予防または治療することができる。

さらに、本実施例の結果はまた、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、皮膚の若返りを提供することができること、ならびに／または、皮膚の欠陥を低減、予防および／もしくは排除することができること、より正確には、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、顔面の整復および／または顔の皮膚の締め付けを提供することができることを実証する。

〔実施例９．ヒト真皮線維芽細胞におけるＭｏｈａｗｋ合成の分析〕
ヒト真皮線維芽細胞におけるＭｏｈａｗｋ合成を誘導するその能力について、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を分析した。

ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２は、実施例１～５によって調製した。

このアッセイは、ヒト真皮線維芽細胞におけるホメオドメインタンパク質Ｍｏｈａｗｋ合成を増加させる、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の能力のインビトロ評価に関する。前記ペプチドで細胞処理した後のＭｏｈａｗｋ量を測定することによって、この評価を行った。

実験プロトコルは、以下の実験群を規定した：
－未処理細胞培養物；
－可溶化ビヒクル（ＤＭＳＯ）のみで処理した細胞培養物（ネガティブコントロール）；
－３つの濃度（０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．００１ｍｇ／ｍＬ）のＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理した細胞培養物。

ＤＭＳＯ中でペプチドのストック溶液を調製し、次いで、細胞培養培地中で０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．００１ｍｇ／ｍＬの３段階の希釈溶液を調製した。

使用された生物学的モデルは、上記のように、正常なヒト真皮線維芽細胞からなる。

細胞を９６ウェルプレートに１×１０^４細胞／ウェルで播種し、標準的な培養条件下（３７℃、９５％室内湿度、５％のＣＯ_２）で、２４時間維持した。２４時間インキュベートした後、培地を除去し、試験生成物を含有する新しい培地をウェルに添加した。

サンプル処理は、２４時間および４８時間継続し、次いで細胞を溶解して、ＥＬＩＳＡ法によって細胞内のＭｏｈａｗｋ濃度を決定した。結果を、ネガティブコントロール（ＤＭＳＯで処理した細胞）と比較した。

処理は、３回反復で、３つの異なる実験セッションで行った。

Ｍｏｈａｗｋ合成の測定は、上記のように、ＥＬＩＳＡ法によって行った。この目的のために、市販のキットを使用した。試験キットは、２サイトサンドイッチＥＬＩＳＡ法を適用して、ヒトホメオドメインタンパク質Ｍｏｈａｗｋの含有量を検出した。Ｍｏｈａｗｋに特異的な抗体をマイクロプレート上にプレコートした。標準物およびサンプルをピペットでウェルに移し、存在するＭｏｈａｗｋを固定化抗体に結合させた。結合していない物質を除去した後、ＨＲＰ複合ヒトＭｏｈａｗｋ検出抗体をウェルに添加した。洗浄し、結合していないＨＲＰ試薬をいずれも除去した後、色素原溶液をウェルに添加し（基質はＴＭＢであった）、最初の工程で結合したＭｏｈａｗｋの量に比例して発色させた。発色を停止させ、濃度を４５０ｎｍで比色定量した。

定量的な測定は、既知の増加していく濃度の標準Ｍｏｈａｗｋから構成される検量線を用いた。ネガティブコントロール（ＤＭＳＯ）とＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理した群との間のＭｏｈａｗｋ含有量の％変動を計算した。これは、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の、Ｍｏｈａｗｋ合成を増加させる効果の直接的な指標であった。

得られた結果は、表３および図７に要約される。

表３および図７からそのまま導き出すことができるように、すべての場合において（すなわち、試験したすべての濃度および持続時間について）、ホメオドメインタンパク質Ｍｏｈａｗｋの合成における統計的に有意な増加が観察された。これはさらに、用量および依存性として記載することができる：２４時間では、０．００１ｍｇ／ｍＬでは９％増加、０．００５ｍｇ／ｍＬでは２１％増加、および０．０１ｍｇ／ｍＬでは４３％増加；ならびに、４８時間では、０．００１ｍｇ／ｍＬでは３１％増加、０．００５ｍｇ／ｍＬでは５１％増加、および０．０１ｍｇ／ｍＬでは８１％増加。図７に示したように、処理群において認められた、試験した各時間枠におけるネガティブコントロールに対するＭｏｈａｗｋ含有量の差は、統計学的に有意である。

上述した結果は、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、Ｍｏｈａｗｋの合成を増加させることを実証し、したがって、皮膚の老化、ならびに／または老化に関連する皮膚の徴候、例えば、しわ、荒れおよび／または弛みなど、を予防または治療することについての潜在能力を実証する。

さらに、本実施例の結果はまた、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、皮膚の若返りを提供することができること、ならびに／または、皮膚の欠陥を低減、予防および／もしくは排除することができること、より正確には、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、顔面の整復および／または顔の皮膚の締め付けを提供することができることを実証する。

〔実施例１０．コラーゲン架橋の分析〕
コラーゲン架橋を誘導または改善するその能力について、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を分析した。

ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２は、実施例１～５によって調製した。

このアッセイは、コラーゲン原線維形成／コラーゲン架橋を増加および促進する、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の能力のチューブ内評価に関する。室温での前記ペプチドの溶液（０．０２Ｍの酢酸、０．１２５ＭのＮａＣｌおよび１／１０リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７．４））を用いたコラーゲン処理後にコラーゲン原線維形成を測定することによって、この評価を行った。

実験プロトコルは、以下の実験群を規定した：
－２つの濃度（０．０２または０．０４ｍｇ／ｍＬ）のＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理したコラーゲン溶液；
－上述した処理群と同じだが、ペプチドを含まず、ペプチドを含有するサンプルと同じ体積のＤＭＳＯを含む溶液で処理された、コラーゲン溶液（ネガティブコントロール）。

ＤＭＳＯ中でペプチドのストック溶液を調製し、次いで、コラーゲン溶液中のペプチドの最終濃度が０．０２ｍｇ／ｍＬまたは０．０４ｍｇ／ｍＬとなるように、２段階の希釈溶液を調製した。

コントロール（処理群と同じだが、ペプチドを含まず、ペプチドを含有するサンプルと同じ体積のＤＭＳＯを含む溶液）および処理群のＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含む溶液に対して、コラーゲンを加えた直後に、コラーゲン架橋および原線維形成を追跡した。

結果を、ネガティブコントロール（ＤＭＳＯを含有し、Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含有しない溶液）と比較した。

実験は、４つの異なる実験セッションで行った。

４５０ｎｍでの吸光度の測定によって、コラーゲン架橋の決定を行った。

サンプルをピペットでウェルに移し、マイクロプレートリーダーＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣを用いて、１００分間の間で２分毎に、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定した。

ネガティブコントロール（ＤＭＳＯのみで処置した群）とＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処置した群との間のコラーゲン原線維形成の％変動を計算した。これは、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の、コラーゲン原線維形成を増加させる効果の直接的な指標であり、さらに、用量依存性として記載することができた：０．０２ｍｇ／ｍＬでは５９％増加、および０．０４ｍｇ／ｍＬでは１１１％増加。

得られた結果は、図８に要約される。

図８から導き出すことができるように、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２は、試験した２つの濃度：０．０２（ｂ）および０．０４（ａ）ｍｇ／ｍＬで、コラーゲンの架橋を増加させ、かつ促進する。

上記は、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）の老化防止活性を支持し、したがって、老化に関連する皮膚の徴候、例えば、しわ、荒れおよび／または弛みなど、の予防または治療における前記ペプチドの有用性を支持する。

さらに、本実施例の結果はまた、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、皮膚の若返りを提供することができること、ならびに／または、皮膚の欠陥を低減、予防および／もしくは排除することができること、より正確には、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、顔面の整復および／または顔の皮膚の締め付けを提供することができることを実証する。

〔実施例１１．ヒト器官型皮膚外植片培養物におけるペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の細胞毒性およびコラーゲン産生の分析〕
細胞毒性については、ＬＤＨ細胞毒性アッセイおよびレサズリンアッセイによって；ならびに、コラーゲン産生に関しては、コラーゲン含有量分析および組織学的分析によって、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の細胞毒性およびコラーゲン産生を分析した。

ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２は、実施例１～５によって調製した。

この場合においては、健康で、かつ老化したヒト器官型皮膚外植片培養物（ｈＯＳＥＣ）を実験系として使用した。

試験の最初の５日間、健康なｈＯＳＥＣをヒドロコルチゾン（５μｇ／ｍＬ）に曝露することによって、老化ｈＯＳＥＣを得た。

処置群の総数は以下の通りであった：
１．コントロール群（ネガティブコントロール）：未処理ｈＯＳＥＣ。

２．老化ｈＯＳＥＣ：５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンで処理したｈＯＳＥＣ（Abraham A, Roga G. (2014) Topical steroid-damaged skin. Indian J Dermatol. 59(5),456-9.）。

３．老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ａ（クリーム、すなわち、偽薬）：５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンで処理し、製品Ａ（１０μＬ）とインキュベートしたｈＯＳＥＣ。

４．老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂ（濃度０．００５ｍｇ／ｍＬのＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）：５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンで処理し、製品Ｂ（１０μＬ）とインキュベートしたｈＯＳＥＣ。

各実験群の４回の反復を行い、１つの独立した実験を行った。

アッセイの期間全体は１０日間（１日目～１０日目）であった。ヒドロコルチゾンを、１～５日目に毎日、適切な、または対応する群に適用した。その側で、製品Ｂまたは製品Ａを、２～９日目に毎日、対応する、または適切な群に適用した。

細胞毒性アッセイは、０日目（試験開始前）、１、３、５、８および１０日目に実施した。

コラーゲン産生を１０日目に測定した。

〔ＬＤＨ細胞毒性アッセイ〕
ＬＤＨ細胞毒性試験は、比色分析アッセイであり、細胞質膜の損傷時に培養培地の上清中に放出される安定なサイトゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量的に測定する。培養培地の上清中に放出されたＬＤＨを３０分間、酵素反応と共役させて測定する：ＬＤＨは乳酸をピルビン酸へと酸化し、次いで、ピルビン酸はテトラゾリウム塩ＷＳＴ－１と反応してホルマザンを形成する。培養上清中で測定されたホルマザンの量の増加は、皮膚外植片中の溶解細胞（損傷）の数の増加と直接的に相関する。

各サンプルの上清を１００μＬ取り出し、９６ウェルマイクロプレートに移した。共役酵素反応によって、培養培地の上清中に放出されたＬＤＨを測定した：ＬＤＨは乳酸をピルビン酸へと酸化し、次いで、ピルビン酸はテトラゾリウム塩ＷＳＴ－１と反応してホルマザンを形成する。ＬＤＨ酵素は細胞質膜が損傷を受けたときに培養培地の上清中に放出されるので、ホルマザンの量の増加は溶解細胞（損傷）の数の増加と直接的に相関する。ホルマザン染料は水溶性であり、標準的なＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５００ｎｍにて測定することができた。

このアッセイの結果は、ネガティブコントロールを考慮して（すなわち、未処理ｈＯＳＥＣを１００％のＬＤＨ標準濃度とする）計算した。得られた結果は、図９に要約される。

図９から導き出すことができるように、すべての群において見られたＬＤＨの値は、コントロール群（ネガティブコントロール）と同様であった。この事実は、前記アッセイの条件にあるｈＯＳＥＣにおいて、ヒドロコルチゾンがいかなる悪影響も生じなかった（細胞膜の損傷を生じない）ことを示す。同様に、製品Ｂ（すなわち、Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）または製品Ａ、および、５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンでの処理は、コントロール群と比べてＬＤＨ値の差を示さなかった。これらのデータは、前記アッセイの条件にあるｈＯＳＥＣにおいて、ヒドロコルチゾンとのインキュベーションおよび両方の化合物が悪影響、細胞質膜の損傷を生じなかったことを示唆する。

〔レサズリンアッセイ〕
レサズリン色素（７－ヒドロキシ－３Ｈ－フェノキサジン－３－オン １０－オキシド）は、増殖および細胞毒性アッセイにおける細胞生存率のインジケータとして、広く使用されている。本アッセイは、生存能力がある、代謝活性な細胞がレサズリンをレゾルフィンおよびジヒドロレゾルフィンへと還元する能力に基づいている。この変換は細胞内で行われ、ミトコンドリア、ミクロソームおよびサイトゾルの酸化還元酵素によって促進される。レサズリンは、細胞に対して非毒性であり、培養培地中で安定である。したがって、レサズリンは、動的アッセイまたはエンドポイントアッセイのいずれかとして、インビトロでの細胞増殖の連続的な測定を可能にする。

したがって、レサズリン色素は、いくつかの細胞毒性アッセイにおける細胞生存率のインジケータとして広く使用されてきた。また、本アッセイはミトコンドリア、ミクロソームおよびサイトゾルの酸化還元酵素によってレサズリンをレゾルフィンおよびジヒドロレゾルフィンへと還元する代謝的に活性のある細胞の能力に基づいているため、レサズリン色素は代謝活性の指標でもある。

細胞生存率および増殖を悪化させる毒性傷害はまた、レサズリンを還元する培養物の能力にも影響を与える。色素還元の速度は、存在している生存細胞の数に正比例する。したがって、レサズリンの還元は、細胞培養物の代謝能力の直接的な尺度であるので、細胞生存率の簡便な指標を提供する。ｈＯＳＥＣによって還元されるレサズリンの量の低下はまた、死細胞の数の増加にも直接相関する。

レサズリンアッセイのために、皮膚外植片を、ＮａＣｌ溶液中の６μＭのレサズリンで１時間、処理した。その後、体積１００μＬの各サンプルを取り出し、９６ウェルマイクロプレートに移した。形成されたレゾルフィンを蛍光光度計プレートリーダーで定量した。

蛍光シグナルを、５３０～５６０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長を用いてモニターした。

レサズリンアッセイの結果は、ネガティブコントロールである未処理の健康なｈＯＳＥＣを１００％の生存率として考慮して、計算した。得られた結果を図１０に示す。

ｈＯＳＥＣを５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンで処理した場合、コントロール群（ネガティブコントロール）と比べて、レゾルフィンの割合が１０％低下することが観察された。製品Ｂ（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）または製品Ａ、および、５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンで処理したｈＯＳＥＣは、コントロール群（ネガティブコントロール）と比べてレゾルフィン値の低下を示さなかった。

これらのデータは、前記アッセイの条件にあるｈＯＳＥＣにおいて、製品Ｂまたは製品Ａの両方が代謝の活性化を引き起こしたという考えを支持する。レゾルフィンは細胞の代謝能力の直接的な尺度であるので、レゾルフィンの増加は、両方の化合物へのｈＯＳＥＣの曝露後の酸化還元酵素の代謝活性化を示唆している可能性がある。

したがって、ＬＤＨ細胞毒性アッセイおよびレサズリンアッセイにおいて得られた結果からは、Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２が、毒性ではなく、実際にはヒドロコルチゾンによって引き起こされる負の影響を逆転させるということを推定することができる。

〔コラーゲン産生〕
コラーゲン含有量の分析：
コラーゲンアッセイは、酸性およびペプシン溶解性のコラーゲン（主にＩタイプであるが、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶタイプでもある）の分析のための色素結合法である。このアッセイは、急速な成長および発達の期間中に産生された、新たに合成されたコラーゲンの割合を評価し得る。

コラーゲン色素試薬（１ｍＬ）を各サンプル（チューブ）に添加し、３０分間振盪した。チューブを１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。続いて、７５０μＬの氷冷した酸－塩洗浄試薬をコラーゲン－色素ペレットに添加して、ペレットの表面およびマイクロ遠心分離管の内側表面から、未結合の色素を除去した。チューブを再び１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。最後に、２５０μＬのアルカリ試薬を添加した。すべての結合色素が溶解した時に（５分）、サンプルは測定の準備を完了した。溶解した色素（９６マイクロウェルプレート中、各サンプル２００μＬ）を、標準的なＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５５０ｎｍにて測定した。

上述のように、コラーゲン含有量の分析は、試験の１０日目に実施した。コラーゲン含有量（マイクログラム）アッセイの結果を、新鮮な真皮組織１ミリグラム当たりで計算した。得られた結果は、図１１および表４に要約される。

図１１および表４に示すように、残りの老化ｈＯＳＥＣ群（５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンのみで処理した、またはヒドロコルチゾンおよび製品Ａで処理した）と比べて、製品Ｂ（０．００５ｍｇ／ｍＬのＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）で処理した老化ｈＯＳＥＣにおけるコラーゲン産生の増加が観察された。

老化ｈＯＳＥｃ＋製品Ｂの群は、未処理ｈＯＳＥＣと同等のコラーゲン量を示した。

図１１に示すように、未処理ｈＯＳＥＣおよび老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂの群と、老化ｈＯＳＥＣおよび老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ａの群との間でコラーゲン量に見られる差は、統計的に有意である。未処理ｈＯＳＥＣと老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂとの間には、統計的に有意な差はなかった。

これらの結果は、Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の局所的な適用がヒドロコルチゾンの老化効果を逆転させることを実証し、したがって、老化予防生成物として、老化の徴候、例えば、しわ、荒れおよび／または弛みなど、を予防、低減および／または排除する、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）の潜在能力を実証する。

さらに、これらの結果はまた、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、皮膚の若返りを提供することができること、ならびに／または、皮膚の欠陥を低減、予防および／もしくは排除することができること、より正確には、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、顔面の整復および／または顔の皮膚の締め付けを提供することができることを実証する。

ＴＥＭ分析のための組織収集とプロセシング：
皮膚サンプルを透過型電子顕微鏡分析のために処理した。簡単に説明すると、４％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドおよび１％の（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド中で、皮膚サンプルを固定した。続いて、皮膚サンプルを、０．１Ｍのスクロース中で一晩インキュベートし、０．１Ｍの１％（ｖ／ｖ）のオスミウムテトロキシド中でインキュベートした。最後に、サンプルをシリアライズしたエタノール溶液で脱水し、ビームカプセル中に包埋した。

超薄切片（厚さ６０～９０ｎｍ）を、酢酸ウラニルで１５分間、クエン酸鉛で５分間、染色した。その後、サンプルは、電子顕微鏡下で分析する準備を完了した。

透過型電子顕微鏡試験を行い、処理した皮膚外植片中のコラーゲン線維の状態を観察した。

結果は、図１２Ａ～１２Ｄに要約される。図１２Ａは、未処理ｈＯＳＥＣに対応しており、正しい真皮構造（真皮中の完全で構造化された真皮線維）を示した。同様に、図１２Ｂは、構造化されていないコラーゲン線維（拡散し、圧縮されていない線維）を有する老化ｈＯＳＥＣを表す。この画像は、皮膚におけるヒドロコルチゾンの悪影響を裏付けるものであり、これはコラーゲン定量（上記に含まれる）と一致する。製品Ａで処理した老化皮膚については、同様の圧縮されていないコラーゲン線維の像が得られた（図１２Ｃ）。しかしながら、図１２Ｄに見られるように、老化ｈＯＳＥＣを製品Ｂ（０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）とインキュベートした場合、コラーゲン線維（完全で拡散していない線維）の良好な再生が達成された。この画像は、上述した、ＥＬＩＳＡ法によって得られたコラーゲン値を裏付ける。

同様に、画像解析によって、コラーゲン線維の厚さおよびコラーゲン密度を分析した（下記の表５および６を参照のこと）。得られた値は、視覚的な評価を裏付ける。

コラーゲン密度は、ＴＥＭ画像上で観察されるコラーゲン線維それぞれの緻密さを示す。この目的のために、ＧＩＭＰ２によって光学画像を分析した。反事実分析は、健康な老化したｈＯＳＥＣ＋製品Ｂの群が、老化ｈＯＳＥＣおよび老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ａの群において観察された値よりも高い密度値を示したことを裏付けた（下記の表５および図１３を参照のこと）。

老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂ（０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）の群は、コラーゲン産生の増加が認められ、上述したように、未処理ｈＯＳＥＣと同等のコラーゲン密度を示した（下記の表５および図１３を参照のこと）。

図１３に示すように、未処理ｈＯＳＥＣおよび老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂの群と、老化ｈＯＳＥＣおよび老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ａの群との間でコラーゲン密度に見られる差は、統計的に有意であった。未処理ｈＯＳＥＣと老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂ（０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）との間には、統計的に有意な差はなかった。

これらの結果は、Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の局所的な適用がヒドロコルチゾンの老化効果を逆転させることを実証し、したがって、老化予防生成物として、老化の徴候、例えば、しわ、荒れおよび／または弛みなど、を予防、低減および／または排除する、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）の潜在能力を実証する。

さらに、これらの結果はまた、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、皮膚の若返りを提供することができること、ならびに／または、皮膚の欠陥を低減、予防および／もしくは排除することができること、より正確には、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、顔面の整復および／または顔の皮膚の締め付けを提供することができることを実証する。

コラーゲン線維の厚さもまた、ＧＩＭＰ２によって分析した。健康な老化したｈＯＳＥＣ＋製品Ｂ（０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）の群は、より良好な緻密さおよび構造化（完全で拡散していない線維）に起因して、老化ｈＯＳＥＣおよび老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ａの群で観察された値よりも低い線維厚さ値を示したことが、線維厚さ分析によって裏付けられた。老化ｈＯＳＥＣに適用されたＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２ペプチドは、未処理ｈＯＳＥＣと同等のコラーゲン線維厚さを示した（表６および図１４を参照のこと）。

老化ｈＯＳＥＣおよび老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ａの群における、より高い線維厚さは、線維におけるコラーゲンの異常な蓄積を示した。この異常な蓄積は、インビボにおいて老化皮膚中で生じると記載されている。

未処理ｈＯＳＥＣおよび老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂは、同等のコラーゲン線維厚さを示した。

図１４に示すように、未処理ｈＯＳＥＣおよび老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂの群と、老化ｈＯＳＥＣの群との間でコラーゲン線維厚さに見られる差は、統計的に有意であった。未処理ｈＯＳＥＣおよび老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂの群と、老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ａの群との間でコラーゲン線維厚さに見られる差は、統計的におおよそ有意であった。未処理ｈＯＳＥＣと老化ｈＯＳＥＣ＋製品Ｂ（０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含むクリーム）との間に統計的には、有意な差はなかった。

これらの結果は、Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の局所的な適用がヒドロコルチゾンの老化効果を逆転させることを実証し、したがって、老化予防生成物として、老化の徴候、例えば、しわ、荒れおよび／または弛みなど、を予防、低減および／または排除する、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）の潜在能力を実証する。

さらに、これらの結果はまた、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、皮膚の若返りを提供することができること、ならびに／または、皮膚の欠陥を低減、予防および／もしくは排除することができること、より正確には、本発明のペプチド（Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２によって例示される）は、顔面の整復および／または顔の皮膚の締め付けを提供することができることを実証する。

〔実施例１２．フォトタイプが異なる女性ボランティアに対する、皮膚およびしわの平滑化および老化防止効果の臨床評価〕
４４人の女性ボランティア（５０％は明色素性（フォトタイプＩＩ～ＩＩＩ）、および５０％は暗色素性（フォトタイプＶ～ＶＩ））について、顔面皮膚の老化防止に対するＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２ペプチド（実施例１～５によって合成されたもの）の影響を評価した。

簡単に説明すると、ボランティアは、０．０５％（ｍ／ｖ）のＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２のストックからの２％（ｍ／ｖ）の化粧品製剤、またはＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含まない化粧品製剤（偽薬）を適用した。適用レジームは、５６日間、早朝および就寝前の１日２回であった。化粧品製剤を顔面全体に適用し、ボランティア間で、またフォトタイプが異なるボランティア間でも、偽薬および活性の効果を比較した。

２８日目および５６日目に、各ボランティアに対してＡＥＶＡシステムを使用し、しわの深さおよび頬の荒れを評価した。処置期間内のパラメータの低下は、皮膚の平滑化を示唆し、したがって、しわ防止および老化防止の恩恵を示唆した。

得られた結果を図１５に示す。

図１５（Ａ）～（Ｃ）から容易に分かるように、Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を含む化粧品製剤は、開始時と比較した場合、すべての試験された皮膚フォトタイプについて、すべての試験された時期における、試験された顔面皮膚の領域において、荒れ（Ｒａ）および彫り込み（Ｒｚ）およびしわの深さのいずれかの低下を示した（これらのパラメータのいくつかまたはすべての低下が平滑化効果ならびにしわ防止および老化防止効果を示す）。５６日間の処置後には、頬の荒れが４％低下し（偽薬に対して平均５％）、頬の彫り込みが７％低下した（偽薬に対して平均１０％）ことが観察された。しわの深さについては、より顕著な効果が観察され、平均で９％の低下に達した。特にフォトタイプＶ～ＶＩの皮膚のボランティアについては、しわの深さが１２％低下したこと（偽薬に対して２０％）が観察された一方、フォトタイプＩＩ～ＩＩＩの皮膚のボランティアでは経時的にしわの深さが６～７％低下した。

図１は、基準状態と比較して、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を増加させて処理した後のＨＥＫａ細胞生存率の割合を示す（すなわち、基準状態の細胞生存率を１００％と設けて、次いで、試験した残りのサンプルと比較する）。 図２は、基準状態と比較して、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２で処理した後のＨＤＦａ細胞生存率の割合を示す（すなわち、基準状態の細胞生存率を１００％と設けて、次いで、試験した残りのサンプルと比較する）。 図３は、未処理の初期ヒト真皮線維芽細胞に対する、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を用いた処理によって誘導された初期ヒト真皮線維芽細胞における遺伝子発現プロファイルの変調を示す。 図４は、未処理の初期ヒト真皮線維芽細胞に対する、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を用いた処理によって誘導された初期ヒト真皮線維芽細胞における遺伝子発現プロファイルの変調を示す。 図５は、未処理の初期ヒト真皮線維芽細胞に対する、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を用いた処理によって誘導された初期ヒト真皮線維芽細胞における遺伝子発現プロファイルの変調を示す。 図６は、ネガティブコントロール（ジメチルスルホキシドで処理）と比較した、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を増加させて処理したヒト真皮線維芽細胞によるコラーゲンＶＩ合成の増加率を示す（すなわち、ネガティブコントロールのコラーゲンＶＩ合成を１００％と設けて、次いで、試験した残りのサンプルのコラーゲンＶＩ合成と比較する）。 図７は、ネガティブコントロール（ジメチルスルホキシドで処理）と比較した、ペプチドＰａｌ－配列番号１－ＮＨ_２を増加させて処理したヒト真皮線維芽細胞によるＭｏｈａｗｋ合成の増加率を示す（すなわち、ネガティブコントロールのＭｏｈａｗｋ合成を１００％と設けて、次いで、試験した残りのサンプルのＭｏｈａｗｋ合成と比較する）。 図８は、コラーゲンの架橋を示す。 図９は、ネガティブコントロール（未処理ｈＯＳＥＣ）と比較した、放出ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の割合による組織生存率を示す（すなわち、ネガティブコントロールの放出ＬＤＨを１００％と設けて、次いで、実施例１１において試験した残りのサンプル中の放出ＬＤＨと比較する）。 図１０は、ネガティブコントロール（未処理ｈＯＳＥＣ）と比較した、レゾルフィンの割合による代謝活性を示す（すなわち、ネガティブコントロールのレゾルフィンを１００％と設けて、次いで、実施例１１において試験した残りのサンプル中のレゾルフィンと比較する）。 図１１は、ネガティブコントロール（未処理ｈＯＳＥＣ）と比較した、実施例１１の種々の実験群におけるコラーゲン定量を示す（すなわち、ネガティブコントロールのコラーゲン量を１００％と設けて、次いで、試験した残りのサンプルのコラーゲン量と比較する）。 図１２は、実施例１１の種々の実験群の透過型電子顕微鏡画像を示す。 図１３は、ネガティブコントロール（未処理ｈＯＳＥＣ）と比較した、実施例１１の種々の実験群におけるコラーゲン密度を示す（すなわち、ネガティブコントロールのコラーゲン密度を１００％と設けて、次いで、試験した残りのサンプルのコラーゲン密度と比較する）。 図１４は、ネガティブコントロール（未処理ｈＯＳＥＣ）と比較した、実施例１１の種々の実験群におけるコラーゲン線維厚さを示す（すなわち、ネガティブコントロールのコラーゲン線維厚さを１００％と設けて、次いで、試験した残りのサンプルのコラーゲン線維厚さと比較する）。 図１５は、４４人の女性ボランティア（５０％は明色素性（フォトタイプＩＩ～ＩＩＩ）、および５０％は暗色素性（フォトタイプＶ～ＶＩ））に対する、Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２の、その局所適用後の効力を示す。

Claims (15)

1. Ｍｏｈａｗｋを増加させることができるペプチド、その許容可能な異性体、塩、溶媒和物および／もしくは誘導体、ならびに／またはそれらの混合物。
2. 式（Ｉ）に記載の配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド、
   Ｒ_１－ＡＡ_１－ＡＡ_２－ＡＡ_３－ＡＡ_４－Ｒ_２ （Ｉ）
   その化粧品として許容可能な異性体、塩、溶媒和物および／または誘導体、ならびにそれらの混合物：
   式中、
   ＡＡ_１は、Ｈｉｓであり；
   ＡＡ_２は、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
   ＡＡ_３は、ＬｙｓまたはＡｒｇから選択され；
   ＡＡ_４は、脂肪族非極性側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
   Ｒ_１は、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアラルキル、およびＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここで、Ｒ_５は、置換または非置換のＣ_１～Ｃ_２４アルキルラジカル、置換または非置換のＣ_２～Ｃ_２４アルケニル、置換または非置換のＣ_２～Ｃ_２４アルキニル、置換または非置換のＣ_３～Ｃ_２４シクロアルキル、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_２４シクロアルケニル、置換または非置換のＣ_８～Ｃ_２４シクロアルキニル、置換または非置換のＣ_６～Ｃ_３０アリール、置換または非置換のＣ_７～Ｃ_２４アラルキル、３～１０員の置換または非置換のヘテロシクリル環、および、２～２４個の炭素原子と１～３個の炭素以外の原子と１～６個の炭素原子のアルキル鎖との置換または非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され；
   Ｒ_２は、Ｈ、－ＮＲ_３Ｒ_４－、－ＯＲ_３および－ＳＲ_３から選択され、ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族基、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキルから選択される。
3. ＡＡ_１は、Ｈｉｓであり；
   ＡＡ_２は、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの群から選択され；
   ＡＡ_３は、ＬｙｓまたはＡｒｇから選択され；
   ＡＡ_４は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの群から選択されることを特徴とする、
   請求項２に記載のペプチド。
4. 式（Ｉ）の前記ペプチドは、
   Ｒ_１－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｒ_２ （Ｒ_１－配列番号１－Ｒ_２）
   であることを特徴とする、
   請求項２または３に記載のペプチド。
5. Ｒ_１は、ＰａｌまたはＡｃから選択されることを特徴とする、
   請求項２～４のいずれか１項に記載のペプチド。
6. Ｒ_２は、ＨまたはＮＨ_２から選択されることを特徴とする、
   請求項２～５のいずれか１項に記載のペプチド。
7. Ｒ_１はＰａｌであり、Ｒ_２はＮＨ_２であることを特徴とする、
   請求項２～６のいずれか１項に記載のペプチド。
8. 式（Ｉ）の前記ペプチドは、
   Ｐａｌ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ａｌａ－ＮＨ_２ （Ｐａｌ－配列番号１－ＮＨ_２）
   であることを特徴とする、
   請求項４に記載のペプチド。
9. 請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物。
10. 請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチドの、または、請求項９に記載の組成物の、それを必要とする対象における、化粧品としての使用。
11. 化粧品としての前記使用は、皮膚の老化の徴候を低減、予防および／もしくは排除すること、皮膚の若返りのため、ならびに／または、皮膚の欠陥を低減、予防および／もしくは排除することであることを特徴とする、
    請求項１０に記載の化粧品としての使用。
12. 皮膚の老化の前記徴候は、しわ、荒れおよび／または弛みであることを特徴とする、
    請求項１１に記載の化粧品としての使用。
13. 皮膚の若返りのための、ならびに／または、皮膚の欠陥を低減、予防および／もしくは排除する、化粧品としての前記使用は、皮膚の引き締め、身体の彫り込み、顔面の整復、皮膚の締め付け、および／または毛穴の洗練のためであることを特徴とする、
    請求項１１に記載の化粧品としての使用。
14. 請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチドの、または、請求項９に記載の組成物の、それを必要とする対象における、化粧品用途。
15. 前記化粧品用途は、皮膚の老化の徴候を低減、予防および／もしくは排除すること、皮膚の若返りのため、ならびに／または、皮膚の欠陥を低減、予防および／もしくは排除することであることを特徴とする、
    請求項１４に記載の化粧品用途。

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