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CN1134156A - 合成和筛选多种分子 - Google Patents

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CN1134156A
CN1134156A CN 94193984 CN94193984A CN1134156A CN 1134156 A CN1134156 A CN 1134156A CN 94193984 CN94193984 CN 94193984 CN 94193984 A CN94193984 A CN 94193984A CN 1134156 A CN1134156 A CN 1134156A
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CN
China
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bead
reactor
synthetic
mark
storehouse
Prior art date
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Pending
Application number
CN 94193984
Other languages
English (en)
Inventor
杰弗瑞·H·苏格曼
理查德·P·拉瓦
海姆·凯答耳
威廉·J·都瓦尔
罗纳德·W·贝瑞特
马克·A·盖罗普
米歇尔·C·尼德尔斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Affymax Technologies NV
Original Assignee
Affymax Technologies NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority claimed from US08/146,886 external-priority patent/US5639603A/en
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Abstract

有效地在底物上合成不同分子产物的设备和方法。一透明容器(200)含有底物的悬浮体。将底物用氩气加压并转移至发生单体反应的一个或多个反应容器库的多个反应容器中(201-209)。选择性地，底物可用一标记单体标记。在单体加成反应期间，用旋涡马达旋流反应容器(201-209)中的内含物以促进合成。在期望的单体和/或标记单体加成反应之后，将悬浮体用氩气加压，转移回到透明容器(200)中混合。此后，可将悬浮浮体用氩气加压，并被再分配在反应容器中(201-209)用于进一步的合成。

Description

合成和筛选多种分子
本申请是1993年11月2日申请的美国专利系列号为08/146,886和08/149,675的部分继续申请，每一篇均被本文引作参考。
本专利文件公开的部分包含受版权保护的内容。版权拥有者不反对任何人的专利文件或专利公开的传真复制，因为它出现在专利和商标局的专利文件或记录中，但在其它方面无论如何保护所有版权权利。
本发明一般涉及合成大量不同分子和从中鉴定和分离具有用和所需活性的化合物的方法和设备。本发明还涉及将识别标记掺入这些化合物中以便于具有所需特性的化合物的识别。
大分子受体的配体可通过筛选经分子生物学或合成化学技术制备的大量不同的肽来鉴定。重组肽库已通过将简并寡核苷酸插入到编码丝状噬菌体壳蛋白和DNA-结合蛋白LacI.的基团中而被建立。见于Cwirla et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87：6378-6382；Scott & Smith，1990，Science 249：386-390；Devlin et al.1990，Science 249：404-406；Cull et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869；和PCT公开号WO 91/17271，WO 91/19818，WO 93/08278，每一篇均被本文引作参考。这些随机库可包含大于109的不同肽，其中每一种肽融合到与编码它的遗传物理性连接的大的蛋白质序列中。这些库与受体的相互作用，通过几次亲和纯化，选择性曝光或显示在E.Coli和DNA单克隆中被扩增以定序揭示负责与受体结合的肽的同一性的载体而被有效地筛选。还可见于PCT公开号WO 91/05058和WO 92/02536。
建立肽或其它分子库的化学方法不限于使用仅20种基团编码的氨基酸的合成。通过扩增结构单元组使其包括非天然氨基酸和其它分子结构单元，大大地增加了可达到的序列和结构的差异。在一些描述作为产生合成分子库的方法中，这些反应产物被立体地分离，各库成员的同一性通过合成的性质而被明确地确定，这些合成见于Geysen et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002；Geysen et al.，1986，in Synthetic Peptides as Antigens；Ciba Foundation Sympo-sium 119，eds.Porer，R. & Wheelan，J.(Wiley，New York)PP.134-146；Fodor et al.，1991，Science 251：767-773；美国专利号5,143,854和PCT专利公开号WO84/03564；86/00991；86/06478；90/15070；和92/10092，每一篇均被本文引作参考。
通过“茶袋”(tea-bag)多肽合成法已制备出具有大于3千万溶性肽的库。见于Houghten，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5131-5135和美国专利4,631,211，每一篇被本文引作参考。每一个库被合成和筛选为简并肽混合物，其中此序列中的各氨基酸被清楚地定义。迭代法筛选(如在竞争结合分析中)和再合成被用于分馏这些混合物以及确定库中最具活性的肽。见Houghten et al.，1991，Nature 354：84-86；Pinilla et al.，1992，Peptide Research 5：351-358；Blake，J.& Litzi-Davis，1992，Bioconjugate Chem.3：510-513；和PCT专利公开号WO92/09300，每一篇均被本文引作参考。
运用FurKa等的裂解合成协议，见于第十四届国际生物化学大会(1988年)摘要，Prague，Czech.5：47(还见于FurKaet al.，1991，肽蛋白质研究国际杂志37：487-493；和Sebestyen et al.，1993，Bioorg.Med.Chem.Lett.3：413-4187，Lam和他的同事们制备出了包含106个与100-200μm直径的树脂小球相连的肽的库。见Lam et al.，1991，Nature 354：82-84；Lam et al.，1993，Bioorg.Med.Chem.Lett.3：419-424；和PCT专利公开号WO92/00091中，每一篇均被本文引作参考。这些小球通过与一标记的受体一起温育而被筛选：与受体结合的小球通过肉眼观察被确定并在显微操纵器的帮助下被选择出来。每一个小球包含50-200Pmol可通过埃德曼降解或质谱分析直接确定的单肽序列。原则上，可用这种方法通过降低这些珠的大小来产生具有极大不同的库。肽序列测定技术的灵敏度限于1Pmole，然而对直接肽序列测定分析的范围有明显的限制。然而，当库的结构单元组被扩展至包括D-或其它非天然氨基酸或其它化学结构单元时，没有分析方法提供直接和明显的序列分析。
一批化学合成分子和天然产物(如微生物发酵液体培养基)的高效率筛选在新的药理试剂的引线化合物的研究中传统地起着关键的作用。对制造和估算分子差异的组合化学以及相关技术的兴趣的显著高涨意味着在药物发现paradigm的发展中一个重要的里程碑。见于被本文引用的Pavia etal.，1993 Bioorg.Med.Chem.Lett.3：387-396。今天，肽化学已成为开发组合方法在配体识别中运用的主要工具。见于被本文引用的Jung & Beck-Sickinger，1992，Angew.ChemInt.Ed.Engl.31：367-383。这归结于大量结构不同的氨基酸单体的有效性，相对种属的高产率固相偶合化学以及与制造重组肽库的生物学方法的协同作用。而且，许多低分子量的肽的潜在和特殊的生物学活性使这些分子成为治疗药物发现的有吸引力的起点。见于Hirschmann，1991，Angew.Chem Int.Ed.Engl.30：1278-1301和Wiley & Rich，1993，Med.Res.Rev.13：327-384，每一篇均被本文引作参考。不利的药物动力学特性如差的口服生物利用率和在体内被迅速解除，制约了肽化合物作为药物的更广泛的开发。最近这种认识激起了研究人员将肽化学之外的组合有机合成概念扩展到制造已知的药品如苯并二氮杂(见本文引用的Bunin & Ellman，1992，J.Amer.Chem.Soc.114：10997-10998)和聚合分子如寡N-取代的甘氨酸(“肽”)和寡氨基甲酸酯。见于Simon et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：9367-9371；ZucKermann et al.，1992，J.Amer.Chem.Soc.114：10646--10647：和Cho et al..1993.Science261.1303-1305，每一篇均被本文引作参考。
虽然分子的大型库在识别有用化合物或提高引线化合物的性能可具有大的值，但筛选这些库，特别是大型库的困难制约了这些库在降低如药物发现和开发的成本中应取得的效果。结果，对制造和筛选分子库的方法的开发成为热衷研究的对象，其中库中的每一个分子用一个专门的标志符来标记以便于化合物的鉴定。(见本文引用的PCT专利公开号WO93/06121；还见美国专利申请系列号946,239,1992年9月16日提出和762,522,1991年9月18日提出，supra)。在此方法中，化学合成方法典型地为树脂小球上的组合合成的产物通过与合成中每一偶合或其它产物产生反应步骤一致将标志符标记与这些小球连接而被清楚地确定。每一标记规定了感兴趣的反应步骤中发生的，例如哪一个氨基酸单体在肽合成方法中的某一特定的步骤中被偶合。在任意珠上的一个化合物的结构和鉴定，例如肽的序列可通过阅读小球上的标记组来推出。理想地，这些标记具有高信息含量，适合于非常高的灵敏度检测和译码以及对合成中采用的试剂稳定。寡核苷酸编码的化学合成的概念还由Brenner和Lerner提出过。见于本文所引用的1992，Proc.Natl.Acad.USA 89：5181-5183。
采用编码方法表明首先从正交分化的二胺衍接物开始，平行组合合成法可用来产生一包括“粘合的”线和“编码”线的可溶性嵌合肽的库。见于本文引作参考的Kerr et al.，1993，J.Amer.Chem.Soc.115：2529-2531。通过建立“编码”线上的四个L-氨基酸组成的氨基酸编码记录天然或天然氨基单体与粘合线的偶合。通过受体亲和纯化从等摩尔的肽混合物中选择化合物，并通过HPLC进行分辨。通过爱德曼降解揭示粘合线的结构确定各纯化分子的编码线的序列。类似的肽编码方法最近也由NiKolaiev等报道在1993年的肽研究6：161-170中。
对爱德曼方法的灵敏度和效率的限定将最终限制分析具有限差异的库的编码方法的这方面的范围。寡核苷酸的利用提供了较大的希望，但仍需合成寡核苷酸标记分子库的改进方法。而且，仍需要合成和筛选非常大量的被标记分子库的替换方法。
期望在大量固体支持物如小球上合成一批不同的分子时，可出现另外的问题。使用带有在其上合成的不同的分子产物的小球的例子公开在被本文引作参考的例如下面的申请中，它们是1992年4月29日提出的美国申请系列号为07/876,792；1991年9月18日提出的申请系列号为07/762,522和1992年9月16日提出的申请系列号为07/946,239中。
虽然获得了相当大的成功，上述技术仍遇到了一定的限制。例如，不同产物的合成在小球上开始时，对这些小球的许多人工控制变为必需。例如在1992年4月29日提出的被本文引作参考的美国申请系列号07/876,792中，必须在载体中悬挂一批小球将小球分开，完成分开组的小球上的单体添加反应，有时再分开和有选择性重组如此合成的小球混合这些重组的小球，并且重复此过程。当包括大量单体和反应包括许多单体添加步骤时，人工操作变得极为乏味。除此，“计量”合成的许多产物成为一使人胆怯的任务。
从上可见，合成和筛选非常大量的标记的分子库的改进方法和设备为人们期望。本发明满足了这些以及其它的需要。
本发明提供了制备和筛选分子库的改进方法，其中库中各分子用特定的，容易译码的标定符标记。还提供了一种快速有效地合成不同分子产物的设备和方法。
在一个实施例中，本发明提供了将组合化学方法的产物标记到结构被编码的合成化学库上的方法和试剂。在一个重要的实施例中，本发明提供了一种通过交替和相容的合成方法在细微的小球上完成肽和寡核苷酸的合成的方法。由这种组合合成方法制备的大量寡核苷酸编码的合成肽库由许多小球组成，每个库中包含简单肽(具确定顺序)和序列人为明显地编码关联肽的结构的单链DNA标记的许多拷贝。可有效地提出有关库与通过流动血细胞计数得到的荧光标记的生物受体和通过利用FACS设备分类单个小球的能而选择出来的各小球之间的相互作用的问题。在分类的小球上的DNA标记通过PCR技术放大和测序来确定被编码的肽配体的结构。这些库可用来，例如寻找受体的高亲和性(毫微克分子)配体如抗-肽单克隆。
本发明的合成分子库可通过在大量固体载体的每一个上合成化合物来制备，该化合物由于不同的固体载体而不同。用包括下列步骤的方法制备化合物：(a)在多种反应容器中以随机方式均分载体；(b)将每一反应容器中的载体暴露于第一化学结构单元中；(c)将载体汇集起来；(d)在许多反应容器中以随机方式均分载体；(e)将每一容器中的载体暴露于化学结构单元中；和(f)至少重复步骤(a)至(e)1至20次。典型地，大体上等量的固体载体将被均分至每一反应容器。在本方法的一个实施例中，化学结构单元从氨基酸组中选择，得到的化合物为肽低聚物。
更具体地，本发明涉及对与这些方法相关的偶合化学一些改进。其中之一的改进涉及用于从这些合成中的小球，接头或生长肽链的α-氨基中去除Fmoc保护基的化学。优选地，该去除作用通过用5％一15％，优选为10％的哌啶处理5至60分钟，优选为5至10分钟的而变得有效，虽然可采用其它条件如15％至30％的哌啶处理5至30分钟。其它改进涉及肽偶合反应的活性化学，因为当某些自动化设备被用于完成寡核苷酸标记的肽库的合成时，本发明提供了一减少试剂供应瓶的HoBt/HBTU的简单混合物。
在其它方面，本发明涉及合成标记的分子库的方法，其中库中的每一分子与固体载体共价连接并用一个或多个不同化学惰性烃标记物标记。其中所述标记物包括可变烃区域和分子钩。优选地，该标记物包括将该标记物与固体载体相连的可裂解的接头，分子钩和将分子钩与可裂解接头相连的具可变长度的烃链。更优选为其中所述标记物包括下式的那些例子：
Figure A9419398400181
其中n为1至10或更大，x为可裂解的接头，R为分子钩。这些分子钩优选地选自生物素，高缔合肽对的补体和被保护的能被活化的基团，如能被光活化的基团。优选的可裂解的接头可被光裂解的接头。
还提供了检测这些化学惰性烃标记物存在的方法。该方法包括从固体载体中裂解出一个或多个不同标记物，接着将标记物固定在第二固体载体上。接着将寡核苷酸序列放大，检测它的存在，其中寡核苷酸序列的出现与否是标记物出现与否的标志。
本发明的另一实施方案提供了一种确定了被标记分子库中的固体载体相连的合成分子的合成步骤的顺序的方法，其中库中的分子用惰性烃标签通过化学方法标记。该方法包括分别检测所述固体载体上的一个或多个不同标记的存在和作为所述分子合成中的出现特殊合成步骤的标志的所述各标记的存在或不存在情况。
另一方面，本发明涉及在小球上合成太小不能在常规流动血细胞计数设备上分离的被编码的合成化学库的方法和设备。这些小球使得到的库的大小从没有小球的库的109个增至1013，对于有小球的库可达1018大小。本发明还涉及筛选这些库的方法。
本发明还涉及筛选被编码的合成库以确定有用化合物的方法。一个重要的方面，本发明提供了与制备，标记，筛选自然产物库以区别和鉴定具有用活性的化合物的方法有关在自然产物筛选领域中的重要改进。
另一方面，本发明涉及一种从本发明的分子库快速有效鉴定库中化合物的改进方法。在该方法中，将显示所需特性(如与受体结合)来自被标记化合物库的寡核苷酸标记连环和克隆以便于简单序列测定反应中的大量标记的序列测定。如果被标记的化合物是肽，采用了建立在遗传密码基础上的编码图，那么为了对肽进一步地分析可将来自多联体的各标记亚克隆至其它选择和表达系统如在上述背景部分描述的质粒和噬菌体系统。
在另一实施方案中，本发明提供了快速有效合成不同分子产物的装置和方法。根据本发明的特殊方面，在如小球的底物中合成不同的聚合物。选择性地，这些小球在与分子标记的合成反应中同时被“标记”，仅通过实施例，在小球上的合成分子可包括肽，而分子标记可包括寡核苷酸。当然，无论何时分子具有与其它有关分子一致的基本“结构单元”，其它分子产物同样可用本文描述的方法合成。实施例包括2，3-苯并二嗪，前列腺素和β-转角拟晶。
根据本发明的一个实施方案，用透明容器混合小球悬浮体。通过普通的多歧管将混合的小球分配于多个独立的反应容器中，在这些反应容器中，将小球暴露于不同的被选择的单体之中，这些单体在小球上反应并优选地通过共价键偶合至其上。这些小球可选择性地暴露于同样共价或通其他方法与这些小球偶合的化学“标记物”之中。接着通过多歧管将这些小球重新组合至透明容器中并混合。接着在多个反应容器中将混合小球悬浮体再分开，继续添加单体，混合小球和重新分配等过程。这个方法导致了一批带有在其表面形成的不同组分子的小球或其它底物的形成。
根据本发明的一个方面，本发明包括一种在底物上合成不同分子的设备和方法。底物被从一透明容器中分配至选择的反应容器中。接着将试剂加入至反应容器中以合成一部分分子。接着将底物移至透明容器中混合。为了进一步合成，将底物重新分配至反应容器中。继续这个操作过程直到合成了所需一组的分子。在合成期间，整个合成器与外界环境密封。
广义上来说，本发明提供了制备和筛选分子库的设备和方法，其中库中的各分子用特定，容易译码的识别标记物。
对本发明实质和优点的进一步理解可参考下面的描述和图。
图1表示本发明合成器的示意图；
图2表示试剂储蓄器的示意图；
图3表示用于合成器中的3-汽门阀；
图4表示用于合成器中的2-汽门阀；
图6A表示具有一支撑多组试剂储蓄器的可旋转圆盘传送带的反应容器的工作面的可替换设备；
图7表示较低多歧管阀，注射阀，试剂储器和反应容器之间的相互连接；
图8表示同尽圆搅拌器；
图9表示反应容器工作面的顶部；
图10A和10B表示-较低的反应容器固定夹；
图11A-11D表示根据本发明的一个方面的利用光传感器来检测大致上为半透明的管中的液体的存在的光校直装置；
图12表示根据本发明的一个方面的反应容器；
图12A表示在图12的反应容器周围的温度控制套；
图12B表示图12A中的套和容器的横截面图；
图12C表示具有温度控制套的反应容器的可供选择的实施方案；
图12D表示图12C中的套和容器的横截面图；
图13表示透明容器；
图14是控制合成器的电子设备的简图；
图15表示控制电路的简图；
图16表示被控制计算机采用来排出反应器中所有液体的步骤；
图17表示被控制计算机采用来清洗底部歧管的特质步骤；
图18表示被控制计算机采用搅拌透明容器中的内容物的步骤；
图19A至19D表示被控制计算机采用将小球悬浮体以透明容器再分配至反应容器的步骤；
图20表示被控制计算机采用将来自加压运送系统的试剂装入反应容器的步骤；
图21A-21D示意说明被控制计算机采用将来自加压运送系统的试剂装入反应容器的步骤；
图22表示被控制计算机采用将氨基酸单体加入至反应容器中的步骤；
图23A-23C示意说明被控制计算机采用将氨基酸单体加入至反应容器中的步骤；
图24表示被控制计算机采用将小球悬浮体从反应容器转移至透明容器中混合的步骤；
图25示意说明控制软件的主要组件的数据变动；
图26示意说明命令译码结构；
图27示意说明用于获得阀门数据的示意图；和
图28示意说明用于获得传感器数据的示意图。
图29表示在细微小球上合成组合化学库的设备。该设备由一真空歧管或与固体载体相连的磁板组成，其中固体载体有一具一系列合成化合物的反应位点的合成表面。分隔板由一系列与所述反应位点对应的反应孔组成，并且在每一次混合步骤之后它被用来划分库的成员。该设备还可用来辅助标记化学库的合成。
图30说明监测噻唑烷稳定性的13CNMR的使用。Panel C表示载体结合的噻唑烷的13CNMR谱，其中噻唑烷在环的2位和对于接头碳基为α位(被标记的位置用“*”表示)上被13C双标记。Panel B表示在用95％TFA处理1小时后的载体结合的双标记噻唑烷的13CNMR光谱。Panel A表示在40个周期的DNA合成之后载体结合的双标记噻唑烷的13CN-MR谱。
图31进一步说明监测噻唑烷稳定性的13CNMR的使用。Panel C表示在环的α位和对于接头羰基为α位上(标记位置用“*”表示)用13原子进行双标记的载体结合的噻唑烷的13CNMR谱。Panel B表示在PBS缓冲液中光解90分钟后的载体结合的双标记的噻唑烷的13CNMR谱。Panel A表示在PBS缓冲液中光解3小时后的载体结合的双标记的噻唑烷的13CNMR谱。
图32表示通过将载体结合的噻唑烷经过40个周期的DNA合成和在PBS缓冲液中3小时的光解而制备的反应混合物的HPLC追踪。
图33说明被提供作为控制计算机上的图示的操作者连系装置(“GUI”)。如图所示，GUI包括带有一工作空间1303的矩形窗口。在窗口的顶部是带有使用者命令选择1306-1313的菜单区域1305。每一命令选择包括控制合成器操作的辅助的下一级菜单。使用者可通过用鼠标器选择适宜的命令选择来操作。
图34描述了GUI，显示大菜单中的下一级菜单选择。
图35描述了运行大菜单的对话箱。
图36描述了GUI，显示在组菜单中的下一级菜单选择。
图37描述了GUI，显示在可变菜单中的下一级菜单选择。
图38描述了GUI，显示在诊断菜单中的下一级菜单选择。
图39描述了阀诊断屏幕。
图40描述了传感器诊断屏幕。
图41描述了GUI，显示文件菜单中的下一级菜单选择。
图42-44表示启动合成的对话箱，它允许使用者选择用于合成中的反应容器(图42)，选择每一个反应容器中的开始，循环和结束宏命令(图43)以及输入氨基酸符号和寡核苷酸密码(图44)。
图45描述了GUI，显示在合成菜单中的下一级菜单选择。
图46描述了在合成或宏命令气执行期间出现的情况。
图47描述了使用者故障对话箱。
图48描述了GUI，显示在编辑菜单中的下一级菜单选择。
图49示意说明在Window环境下的控制软件的主要组件中的数据流量。
本发明一般涉及制备和筛选标记化学库的改进方法。本发明还涉及一种在一批不同分子如上述标记化学库的合成中有用的设备。
为了理解改进方法的意义，必须理解不仅制备和使用的标记库的基本工艺，而且各种合成和筛选步骤如何相互配合以及如何选择试剂都影响所获得的结果。标记化学库通常在固体载体上合成，载体和接头的选择是成功的关键。接头可用来将载体与标记物相连，将载体与库分子相连或在没有固体载体的情况下，将标记物与库分子相连。与化学结构单元，标记物和合成方法有关的选择可以是同样关键，而且还受可得到的固体载体和接头的特性的影响。对这些标记库的分析和应用同样影响这些选择，以及可得到的设备和试剂。
虽然本发明的设备和方法主要根据寡核苷酸和肽的合成来进行说明，但本发明不限于此。本发明将寻找在如多糖类，磷脂，聚氨基甲酸乙酯，2，3-苯并二嗪，前列腺素和β-转角拟晶和其它物质的合成中的应用。如本文引作参考的美国专利号5,242,974中(Holmes)所公开，可形成环状物质。
如寡核苷酸和肽的不同物质的使用和合成进一步详细地公开在下列正在审查中的申请中，它们均被本文引作参考：1992年4月29日提出的美国申请系列号07/876,792,1991年9月1 8日提出的美国申请系列号07/762,522和1992年9月16日提出的美国申请系列号07/946,239。
通过下表所示提供本发明的说明。
I、标记化学库的合成概述
II、固体载体
   A.类型
   B.接头
   C.分子载体
III、化学结构单元
   A.寡聚物和单体
   B.其它结构单元
IV、标记物
V、合成方法
  A.寡核苷酸标记肽库
  B.合成寡核苷酸-标记的肽库的改进方法
  C.小分子的合成
  D.制备可溶性库的方法
VI、分析方法
  A.小球库的筛选分析
  B.筛选可溶性分子
  C.筛选天然产物库
VII、设备和试剂
VIII、平行偶合合成反应设备实施例概述结束
除了上面概念，提供下面的术语以便于本发发明的描述，一些缩写和术语被规定具有普遍含义被本文用于描述本发明。
缩写：HBTV，O-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基糖醛六氟磷酸酯；HOBt，1-羟基苯并三唑；HATU，[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基糖醛六氟磷酸酯；TFA，三氟乙酸；TCA，三氯乙酸；DIEA，二异丙基乙胺；DMF，二甲基甲酰胺；Fmoc，9-芴基甲氧羰基；DMT，二对甲氧三苯甲基；Trt，三苯甲基；Bz，苯甲酰基；Pmc，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰；tBoC，叔丁基氧羰基；PBS，磷酸盐缓冲液；BSA，牛血清清蛋白；mAb，单克隆抗体。
互补或本质上互补：这些术语指一个化合物与另一个结合的能力，例如配体与它互补受体的结合。典型地，这些术语用在核酸的核苷酸之间的碱基配对的描述中，例如，双链DNA分子的两条链之间寡核苷酸引物与要测序或扩增的单链核酸上的引物结合位点之间。互补核苷酸一般为A-T(或A-U)，C-G，对于本领域普通技术人员熟知的具结合特性的合成或修饰核苷酸还存在一个广泛的变异。“本质上互补”存在于一条RNA或DNA链在杂交条件下杂交至互补核酸中时。典型地，杂交发生在一条至少有14至25个核苷酸的链存在至少约55％互补性时，但高选择性的杂交将发生在当互补性增加至65％，75％，90％和100％时。见于本文引作参考的Nucl.Acids.Res.12：203，1984。高选择性杂交条件已知为“严紧杂交条件”，定义如下。
表位：这个术语用来描述由与已知为抗体的受体亚类相互作用的区域来描述的抗原分子的一部分。
识别标记物：在最普遍的意义中，这个术语用来表示一种物理特性，它提供一种可识别化学反应的方法，例如在固体载体上的寡聚体合成中一个单独的固体载体经历的单体加成反应。识别标记物用来记录用于一个化学库的合成中的一系列反应的步骤。该识别标记物可有任何可识别的特性，包括例如：用显微镜或其它方式可辩别的形状，大小，质量，颜色，光密度等；微分吸光度或光发射；化学反应速度；磁或电学特性；或任何其它能编码所需信息，在一个(或一些)分子水平可翻译出来的鉴别性标记。识别标记物的优选为寡核苷酸，因为寡核苷酸的核苷酸顺序是被编码信息的坚固形式。无论合成中是否使用固体载体，“识别标记物”可直接偶联到合成的寡聚体上。在后面的实施例中，识别标记物可从概念上认为同样起到寡聚体合成的“载体”的作用。
配体：这个术语用来表示典型地通过与一特定受体结合来识别的分子。与受体结合或反应的介质标为“配体”，它只有就对应的受体而论才有明确意义。只要所研究的物质能结合或通过其它方式与受体反应，术语“配体”不包括任何特定的分子大小或其它结构或组成特征。而且，配体“可作为与受体结合的天然配体，或作为兴奋剂或拮抗剂的功能性类似物。通过本发明可试验的配体包括，但不限于此，细胞膜受体的兴奋剂，拮抗剂，毒素和毒液，病毒表位，激素，糖，辅因子，肽，酶底物，辅因子，药物(如麻醉剂，甾族化合物等)和蛋白质。
单体：这个术语用来表示可被连接在一起形成其它分子或分子组的一组分子的任何成员，例如一组寡聚体或聚合物。本发明中有用的单体组，但不限于此，例如对于肽的合成，包括L-氨基酸，D-氨基酸或合成氨基酸。本文所用的单体指一个寡聚体合成基本组的任何成员。例如，L-氨基酸的二聚体组成用于多肽合成的400“单体”的一个基本组。不同的单体基本组可用在聚合物合成中的连续步骤中。本领域的技术人员将认识到“单体”仅是一类“化学结构单元”，任何类型的化学结构单元可用于本发明中，不管是否正在合成寡聚体或小有机分子或一些其它分子。
寡聚体或聚合物：这些术语用来表示通过涉及单体亚基的化学或酶加成的方法形成的分子。如寡聚体包括例如核酸，多糖和磷脂的线性，环状和分枝聚合物的及具有α，β或ω-氨基酸的肽，杂聚物，聚氨基甲酸乙酯，聚酯，聚碳酸酯，聚脲，聚酰胺，聚乙烯亚胺，多芳基烯硫醚，聚硅氧烷，聚酰亚胺，聚乙酸酯或其它聚合物，根据本发明公开，它们对于本领域技术人员是显而易见的。
肽：这个术语用来表示其单体为通过酰胺键连接在一起的α-氨基酸的寡聚体。“肽”也可用来指“多肽”。在本发明的范围内，应理解为氨基酸可以为L-旋光异构体或D-旋光异构体，虽然大于20个氨基酸的肽可能常常被称为“多肽”，肽通常大于2个氨基酸单体长度，经常更多的为大于5至10个氨基酸单体长度，甚至可大于20个氨基酸，采用通用的一个字母缩写来表示氨基酸。采用通用的一个字母缩写来表示氨基酸(如P代表脯氨酸)。这些缩写包括在被本文引作参考的Stryer，Biochemistry，Third Ed.(1988)中。
寡核苷酸：用来表示一般通过合成方法制备的单链DNA或RNA分子。虽然不同长度的寡核苷酸在一些条件下为适宜，本发明采用的寡核苷酸通常为50至150个核苷酸长度，优选为80至120个核苷酸。例如，寡核苷酸标记物可用与用于合成寡聚体的单体和单体加成步骤一致的核苷酸和核苷酸的加成步骤来建立。此外，非常短的即有2至10个核苷酸的寡核苷酸可用来扩展现有的寡核苷酸标记物以确定单体偶联步骤。可通过被本文引作参考的由Beaucage和Carruthers，1981，Tetr.Lett.22.1859-1862中描述的氨基磷酸酯方法或根据Matteucci et al.，1981，J.Am.Chem.Soc.103：3185中的三酯方法，或通过如使用购置的寡核苷酸自动合成仪的其它方法来制备适宜的寡核苷酸。
可行地连接：这个术语指一核酸片断与另一核酸片断之间的功能性亲缘关系。例如，如果启动子导致或通过其它方式有效地影响了编码序列的转录，启动子则被可行地连接到编码序列上。一般地，可行地连接意味着被连接的核酸片断或序列为紧接的并且必需与阅读框中的紧接的两个蛋白质编码区连接。
平行偶联：这个短语指二个结构单元化合物同步偶联至底物独立特殊的位点上。该底物可以是具有与这些结构单元相连的特殊基团的固体载体，或形式拥有两个独立地与每一结构单元的特殊基用的其它化合物，同步偶联指在将新的结构单元化合物加入到首先被偶联的结构单元之前，两化合物与这些特殊位点的偶联。因此，本文所用的术语“同步”并不局限于这两个结构单元精确地同时被偶联。
受体：这个术语指对于所给配体具有特定集和性的分子。受体可为自然产生或合成的分子。受体可以它们未改变的天然或分离状态或与其它物质结合的状态使用。受体可共价或非共价地与其它物质连接。可采用在本发明中的方法中的受体包括，但不限于此，抗体，细胞膜受体，单克隆抗体，与抗原决定簇反应的抗血清(如病毒，细胞或其它物质)，多核苷酸，核酸，外源凝集素，多糖，细胞，细胞膜和细胞器。受体还已知为“抗-配体”。当两个分子一般为大分子通过分子识别结合形成复合体时，则形成了“配体-受体对”。其它受体包括，但不限于此，对于需要抗生素的微生物存活是必需的特殊的运输蛋白质或酶；酶的结合位点，抗体分子中的配体结合位点；核酸；如被本文引作参考的在Lerner et al.，1991，Science 254：659中描述的催化多肽；以及激素受体如胰岛素和生长激素受体。
底物或固体载体：这些术语表示具刚性或半硬的表面的物质。虽然可采用其它形式，这些物质优选地采用小珠，丸，盘或其它方便的形式。在一些实施例中，底物至少一个表面可基本上是平的。优选粗糙的球形表面。
严紧杂交条件：这个短语指高选择性的杂交条件，其中只有当相关序列为完全或高度(即大于80％)互补时，核酸与其它核酸(或相同核酸分子的其它区段)的结合才保持稳定。这些条件一般包括小于盐浓度1M的，如小于500mM，并且通常包括小于200mM的盐浓度。寡聚体的杂交温度将一般大于22℃，例如大于约30℃，并通常超过约37℃。对于特殊的杂交长的片断可能要求高的杂交温度。因为其它因素可能极大地影响杂交的严紧性(这些因素包括碱基组成，互补链的长度，有机溶剂的情况，碱基错配的程度)，所以这些因素的结合比对仅任何一个因素进行绝对的测定要重要得多。
合成物：当由体外化学或酶合成而制备时，化合物则为合成物。可将本发明的合成库与，例如可在细菌，酵母或其它活的宿主中繁殖的病毒或质粒载体中的那些进行比较。
I.标记化学库的合成概述：
本发明一般涉及合成和筛选标记化学库的方法。本质上，本发明的化学库的每一本“书”由感兴趣的化学药品或分子，鉴定感兴趣的化学药品或分子或它们的一些重要情况的标记物以及感兴趣化学药品或分子与标记物之间的连接物所组成。在一个重要的实施方案中，感兴趣的化学药品或分子为寡聚体，如肽，标记物为寡聚体，如核酸，连接物为固体载体或颗粒，从中寡集体和标记和可选择性地被裂开，如为了便于检测或提供可溶性的库、可筛选这些库来分离与受体结合或具有其他一些所需特性的各个寡聚体。通过一大批高度不同的寡聚体的制备来说明制备标记化学库的一般方法，其中每一个库成员针对其它库成员来讲，为具有特定单体顺序的寡聚体(虽然该库一般包括完全相同的“书”)。这种库或收集品可包含例如，一组单体中的装配到长度为n的寡聚体中的X个不同单体的所有组合产生的Xn个不同化合物。这种收集品还可包含例如仅在一个或少量位置具有不同单体单元，而所有其它位置具有相同顺序的寡聚体。
合成这些寡聚体的一般方法通常包括-随机组合(随机的)过程和单体单元的化学和/或酶装配。一种方法包括步骤：(a)将大量固体载体均分至大量反应容器中；(b)运用每一不同反应容器中的第一单体和标记物的不同组合，将第一单体和第一标记物偶联到第一反应容器中的载体上；(c)将载体汇集起来；(d)将载体均分至大量反应容器中；(e)运用每一不同反应容器中的第二单体和第二标记物的不同组合，将第二单体偶联至第一单体上，将第二标记物偶联至固体载体或第一标记物上；用不同标记物和不同单体选择性地重复偶联和均分步骤1至20次或更多。一般地，基本上等量的固体载体将均分至每一反应容器。本领域技术人员看到在不同偶联步骤中可采用相同的化学结构单元，相同化学结构单元可采用在不止一个的具简单偶联步骤的偶联反应中(反应容器)。
为了更易于检测本发明，可以首先考虑从三种不同单体A，B和C的单体组装配的长度为三个残基的所有寡聚体的未标记库的合成。将三等分的小球均分在三个反应容器中，将单体A偶联至第一个反应容器中，将单体B偶联至第二个反应容器中，单体C偶联至第三个反应容器中。接着汇集来自所有反应容器的小球。这种汇集包含大致等量的三种不同类型的小球，每一种小球以偶联至小球上的单体为特征。将这种汇集混合，并重新分配至分别包含A，B或C作为将要偶联的下一步单体的独立的单体反应容器中。
在这个偶联反应之后，现在每一反应容器包含带有位置1上的所有三种不同单体的小球和包含在每一特定的第二反应容器中的位置2上的单体。所有的小球被再汇集，这样制备了一个小球的混合物，其中每一小球提供九种可能的二聚体中的一种。再将这种小球的汇集分配在三个反应容器中，并偶联到这三种不同的单体上，这样制备了三种单体的所有三聚体的完整的组(33＝27)。很容易理解足够大量的合成小球的使用有助于确保这个组完全代表任意，随机组合的合成方法中采用的单体的各种组合。
对这个完全随机方法的修改也是可能的。例如，单体组可从一步到另一步而被扩展或缩小；如果偶联化学可达到。为了下一步可将单体组完全改变(如一个步骤中的氨基酸，另一步骤中的核苷，另一步骤中的糖类)。肽合成的单体单元例如可包括单个氨基酸或较大的肽单元或两者。一种是在固体载体上形成在合成的某些步骤被在不同单体组中分配的各种顺序的一些组合。通过这种方法，还可建立带有相关或非相关顺序的不同长度的寡聚体，并可在改变其它残基的同时将一些单体残基固定在一些位置上来建立寡聚体骨架，其中改变某些残基或区域以形成差异。
标记化学库的合成通常包含这些组合合成步骤。因为识别标记可容易地被译码来报告每个寡聚体的显著性，然而标记化学库可大大地比未标记库大和复杂。事实上，本发明合成化合物的编码合成库的方法使筛选大批由多步骤合成制备的不能测序的化合物成为可能。
具体地，寡核苷酸标记和寡核苷酸编码的使用为记录通过组合合成制备的限定化合物，特别是肽的巨大的库中的每一成员的结构个性提供了强有力的机制。只要平行合成方法保持正交和可配伍，这个方法广泛应用于编码其它非肽结构的组合装配中。仅对于产生极高产量来提供单产物的反应的顺序，明显定义了组合合成的净产量。这种情况与标准肽和DNA合成化学近似，得到的产物结构通过合成中使用的结构单元和/或偶联反应的顺序给予明确的规定。
然而大多数合成有机反应为比较特质的，产生变化的产率和常常为多种产物(如区域和立体异构结构)。利用这种化学来合成固体载体上的组合库在库中产生了一个位于每一个小球上的产物的混合物。在最一般情况下，合成的编码不能唯一地确定相关本体的化学结构。反之，该编码方法可更准确地被当作编码-建造库成员的正确的合成条件(例如试剂，反应条件等)。筛选这个库来识别接着可在制备规模上再生产和被分成几份来分离具生物活性的成份的“有效处方”。编码库技术对于扩大组合化学的范围和它在发现药物用的应用以及大量有用化合物的开发和分离具有相当大的潜力。根据标记分子库的合成，可以更好地理解本发明的重要方面，例如在库合成中的固体载体的使用和选择。
II、固体载体
   A.类型
一般地，本发明的标记化学库由一批固体载体组成，例如小球或颗粒。这些固体载体可为任何形状，尽管优选为粗糙形。这些载体不必为同一大小，形状或组成；虽然这些载体通常和优选为均一的。在一些实施方案中，大小非常均匀的载体可特别优选。然而，在其它实施方案中，两组或更多明显不同的固体载体可用于一定目的，即固体载体可由单个颗粒或更多的连结颗粒组成。
固体载体可由许多物质组成，主要受衍生至许多化学活性基团中的任何一个的能力，与寡聚体的化学性质或其它分子合成的匹配性以及标记连接的制约。适宜的载体物质包括玻璃，橡胶浆，高度交联聚苯乙烯或类似的聚合物，金或其它胶态金属颗粒和本领域技术人员已知的其它物质。除开其它被提到的，可用来衍生这些固体载体的化学活性基团是通常用在各分子或寡聚体的固态合成中的那些，因此它们对本领域技术人员将是熟知的。本文所用的术语“固体载体”包含带有寡聚体合成以及在一些实施方案中的标记连接和/或合成的适宜位点的颗粒。存在许多有用于本发明合成寡聚体库制备的固体载体。固体载体通常用于例如上面列举的肽，核酸和其它寡聚体的固相合成中，因此为本领域技术人员所熟知。本发明的固体载体不包括活细胞，病毒或如噬菌体载体或质粒的克隆载体。MonobeadsTM(从Pharmacia Fine ChemicalsAB，Uppsala Sweden购得)或它们的等效物作为本发明各个方面的固体载体都特别有用。MonobeadsTM提供了良好的大小均一性和10μm的小尺寸。进一步，这些MonobeadsTM在有机或无机溶剂中不凝集，并为寡核苷酸和肽的合成提供适宜的载体。最后，MonobeadsTM为最初氨基酸(100nmole/mg)提供非常高的负载。
被选择用来完成本发明的特定的固体载体的一个重要方面是载体的大小。如果需要，用足够的固体载体和有效的偶联，可制备某些寡聚体的完整组。一般地，固体载体大小在1nm至100μm的范围，但有时可用达1mm大小的较大质量的固体载体。固体载体的适宜大小依赖于(1)所需寡聚体合成位点的数目和识别标记连接位点；(2)将要合成的不同化合物的数目(和带有每一个需要筛选的寡聚体的固体载体的数目)；和(3)固体载体的大小对将要使用的特定筛选策略的影响(例如被荧光活化的细胞分检器)(FACS)。
作为特殊的例子，直径为1μm的固体载体可用于本发明。如果每一反应容器中包含近0.2ml的固体载体，并且寡聚体由50个单体合成(50个平行反应)，那么将需要总共100ml固体载体或近1013固体载体。如果想用这50个单体来制备六聚物，那么存在多于1.5×1010个的可能的顺序，并且那一特定顺序将出现在约103的固体载体上。根据通常使用的肽分成树脂的容量，每一小球的估算出来的容量为约0.1pg肽/小球。那么通过这个估算，每一固体载体将具约100amol或108寡聚体链。
为了提高洗涤效率，可采用比一般肽合成要少孔的无孔小球或其它固体载体；然而，对于本发明的某些应用，多孔小球或树脂工作良好并通常为优选。无孔载体将具有生长链的低密度，但尽管几个数量级的容量降低，为了有效的筛选，可制备足够大的寡聚体密度。运用少孔载体，更大部分的寡聚体在筛选过程中将可与受体结合。而且，少孔载体将减少从一个反应至下一个反应的标记转移，因此提高了主要(标准)标记的读数的准确性。
如上面所提到，另一实施例包含两个固体载体如小球的使用，它们被物理地连接在一起，其中一个与分子或寡聚体的合成位点(或接头)连接，一个与识别标记的连接位点(或接头)连接。这种结构允许分子或寡聚体分开，识别标记进入不连续“区域”以及允许为了连接使用极大不同的化学反应基和物质的化学组成。固体载体可被分别衍生，接着在所有或几乎所有合成固体载体将具有一牵引着的标记连接的固体载体的条件下被连接。固体载体可为不同大小，例如一个大的连接有不同(或许多)小标记连接的小球的合成小球。在一个实施方案中，第一固体载体将具有至少一个与氨基酸相连的，第二固体载体将具有至少一个与核苷酸相连的小球。
连接两个小球的方法受寡聚体合成化学的限制。连接小球的最显而易见的方法是使用与每一种固体载体上的主要化学反应基反应的杂二官能交联剂(这种试剂的例子见Pierce Immuno Technology Catalog and Handbook PP.E10-E18(1991)。这些交联剂可达到如下文部分描述的各种目的。
B.接头
当被连接至一固体载体上时，寡聚体和它相关的标记通常通用一个或多个分子接头连接到载体上。这个接头分子在连接之前在每一端具有一个适宜的官能基，一个基团适宜于与载体相连，另一个基团适宜于与寡聚体式检记物相连。在一些实施方案中，采用可裂解的接头以便于分析或检测步骤。
提供大量可得到的不同连接试剂，可将识别标记连接到寡聚体或其它感兴趣的库分子上或连接到固体载体或一个预先存在的标记上。例如，可将识别标记连接至结合到寡聚体中的单体上，或连接至结合到非寡聚化合物中的结构单元上。对于肽寡聚体，半胱氨酸残基的侧链为标记的连接提供了一方便的位点。在其它情况下，只要所需寡聚体的净合成的减少量可容易地被允许，标记甚至可被连接来覆盖少量寡聚体链。可将标记直接连接到将寡聚体(或其它感兴趣的化合物)结合至固体载体的接头上。在这个实施方案中，在连接之前，接头具适宜于识别标记的连接的第三个官能基团。
根据应用和所需效果，当然可以结合大量接头。例如，可选择传递疏水性，亲水性或立体部分以获得在例如偶联或结合效率的特性方面的所需效果的接头。在本发明的一个方面，分枝接头即例如接头Fmoc-Thr(tBu)的带有庞大侧链的接头被用来提供稳定性或用来控制库中固体载体上的分子的间隔或库中分子与标记之间的间隔。
如上所述，可采用可裂解的接头的获得有效的效果。本发明优选的可光解的接头包括6-硝基藜芦基氧羰基(NVOC)和其它NVOC有关的接头化合物(见被本文引作参考的PCr专利公开号WO90/15070和WO92/10092，也见于1992年11月2日提出的美国专利申请系列号NO.971,181)。在另一个实施方案中，接头为带有一个或多个限制性位点的核酸，这样库成员中的一部分(标记，寡聚体或其它感兴趣的化合物或两者，或固体载体)可通过适宜的限制性酶选择性地从另一个中裂解。这个新的核酸和接头说明了大量可用于获得为了本发明目的的有益效果的接头。
C.分子载体
如上所述，本发明还可以一种方法来完成，其中没有固体载体，直接将标记(一般通过一个接头)连接至正在合成的寡聚体或其它分子上。用另一种方法，可在固体载体上合成寡聚体或其它分子以及其相关标记，并在筛选或其它使用之前，裂开或通过其它方法从固体载体上除去。这个方法下面将更全面地描述。无论固体载体是否存在，库的大小和组成将由偶联和混合步骤，合成中所用到的单体或其它结构单元的数目来决定。
III、化学结构单元
   A.寡聚体和单体
通过考虑不同寡聚体和聚合物的大库的合成和筛选，可能最容易地理解本发明的广泛适用性。寡聚体是由单体组成的聚合物；对于生物聚合物，寡聚体中的单体顺序通常确定了重要的生物学特性。感兴趣的优选寡聚体包括肽，寡核苷酸，寡N-取代的甘氨酸和聚碳酸酯。如上所述，为了本发明的目的，单体是可被连接在一起形成-寡聚体或聚合物的一组分子中的任何一个成员，即氨基酸，碳酸酯，砜，亚砜，核苷酸，糖类，尿素，磷酸，类脂，酯，它们的混合物和类似物。因此，单体可以是可被适当活化来进行化学偶联或能被接受用来进行酶促偶联的任何类型。
从许多类型的单体装配寡聚体的方法要求运用给定的单体单元组或结构单元的适宜的偶联化学性质。在逐步的类型中可连接到另一个结构单元上的结构单元的任何组可作为单体组。可通过化学，酶，或其它方法或这些方法的任意组合来传递这种连接。得到的寡聚体可为线性，环状，分枝或采取那些对本领域技术人员为显而易见的各种其它结构。
B.其它结构单元
本文描述的发明主要是关于包含氨基酸序列的分子的制备，但本发明可容易地应用于寡聚体的制备的及可在步骤通过步骤的类型中合成的任何组的化合物中，这些均可被本领域技术人员理解。例如，如苯并二氮杂，海因和肽膦酸可通过使用本文来制备(见1993年9月9日提出的美国专利申请系列号08/119,700，它是1993年6月21日提出目前已放弃的为美国专利号5,339,115部分继续申请的系列号为081,577的部分继续申请，这里每一篇均被本文引作参考。
在一个实施方案中，本发明可用于建立分枝聚合物库。然而在许多例子中，线性聚合物库，例如带有大于3-4个残基的肽非常有用，这些线性分子的形状变得长而窄。也许部分因为分子的高度柔韧性大多数药物没有这种扩展的形状。分枝主链聚合物可致使分子形状与已知药物类似。因此，在一个实施方案中，本发明涉及单体与至少三种其它单体可被连接至其上的官能基团的结合。
如果仅用这种单体，那么完全分枝合成将通常导致被偶联的最后单体的高比率(相结于合成中所用的其它单体)。当然可以掺合不同的分枝单体的混合物来改变这个比率，但是接着在识别感兴趣的化合物的结构上可能有最有困难，即分枝单体的混合物越复杂，标记可提供的关于合成的特定分子的信息就越少。在本发明的一个改进方法中，在每一个单体偶联步骤中掺入两种单体的混合物，一种能分枝，一种不能，这样产生了一个包含带有高信息标记的大量不同形状的库。在这种情况下，标记将确定在每一个偶联步骤出现的单体，但不确定单体是否能分枝。然而，仅使用包含在来自第一库的选择组的化合物中的那些单体的简单再合成将容易识别这些化合物的结构。
VI、标记
识别标记具有一可辨认的特征，即例如在形状，大小，质量，电荷或颜色方面可通过显微镜或其它方法辨别。这些可辨认的特征可来自于标记的光学，化学，电学或磁特性，或来自于这些特性的组合。实质上，标记用作在一个(或多个)分子或固体载体的水平上标记分子和编码可辨认的信息。通过利用识别标记跟踪化学库的每一成员所采取的路径，可以通过阅读识别标记来推判库中任何化学物质的结构(即任何寡聚体的单体的顺序)。
可将用显微镜可识别的标记建造成具有可辨认的不同大小，形状或颜色或用条型码标记的小小球，这些标记可以为“机器可阅读”的发光或放射性标记。识别标记也可为可编码的分子结构，这些信息可被编码在大小(聚合物长度)或分子组成中。也许后面类型的标记的最好例子为核酸序列，即从天然或修饰碱基装配而来的DNA或DNA。
为了证实标记在合成和筛选化学库中所起的作用，考虑例如使用在寡聚体合成中被连接至每一小球上的在显微镜下可辨认的字母数字标记。标记“A”指在步骤1参加A-单体反应的小球；“C2”指在步骤2参加C-单体反应的小球，“B3”指在步骤3被加入的B-单体，以此类推。在第三步合成结束时，一个小球将具有三种被连接的标记；例如A1，C2和B3，这表明小球上的肽的序列为ACB。这个方法要求许多不同的识别标记至多等于不同单体数目和合成步骤数目的产物(在这个实施例中9)，如果标记以这样的步骤顺序A，A-C，A-C-B与另一个相连，识别标记的数目则被减少，在这种情况下只有与单体一样多的识别标记被使用，以加入与何种单体，在哪步加入的记录一致的方式装配识别标记。
在另一个实施例中，标记由一系列光可寻找的分子，例如发荧光的，发磷光的化合物，它们的光谱特性可被改变(例如光漂白)和因此用于贮存信息，这些信息被用于标记库中每一小球或其它固体载体。在这样的一个方法中，一个小球结合多种均可被选择性地光漂白，由此变得不能发荧光或不能减弱发荧光的荧光团。在每一偶联或化学反应步骤中，照射小球(或没有)使一个或多个特定类型的荧光团光漂白(或没有)，因此记录了被合成的寡聚体中的单体个性。见被本文引作参考的Science 255：123(1992年3月6日)。
因此识别标记识别每一单体偶联或各库成员或固体载体经历的其它反应步骤，并记录了合成系列中每一单体被加入的步骤或完成的其它化学反应。
为了方便和与识别标记类型，连接方式，和寡聚体化学性质或其它分子合成相适应，可在单体加成或其它反应之前，之中或之后立即将标记连接。如上所述，通过各种方式，或直接通过一连接分子，或通过寡聚物在其上被合成的固体载体，可将识别标记与寡聚体相连。在后面的方法中，还可将标记连接到反过来被连接至寡聚体在其上被合成的固体载体中的另一固体载体上。在经历了特定单体加成或其它化学反应步骤的固体载体被物理性地连接在一起，并且能被标记作为一个基团时，即在下一步汇集步骤之前，将识别标记加入。
在一此情况下，当然仅少量寡聚体的单体单元被改变时，象当想仅仅改变肽中的一此氨基酸时那样，可能需要确定仅仅是在寡聚体中变化的那些单体。例如，可能想改变6至12个氨基酸长度的肽中的仅3至6个氨基酸，或可能想改变长达50个氨基酸长度的多肽中的一些如5个氨基酸。通过为每一固体载体提供一个确定仅在每一序列中被改变的氨基酸的识别标记，可唯一地识别每一个肽的序列，这些将容易地被本领域技术人员理解。在这种情况下，所有固体载体可保留在为了共同单体单元的加成的相同反应容器中并均分于为了特殊单体单元的加成的不同反应容器中。
合成的寡脱氧核苷酸尤其优选为带有信息的识别标记。寡核苷酸为天然，高密度信息贮存介质。与化学合成方法相关的单体类型的个性，加成步骤或任何其它信息可容易地编码在一个短的寡核苷酸序列。寡核苷酸也很容易地与许多固体载体，寡聚体，接头和其它分子相连。例如，寡核苷酸可容易地被连接至肽合成小球上。
使用寡核苷酸编码方法中特有的一个显著好处是通过聚合酶链式反应(PCK，见于PCK Protocols：A Guide to Meth-ods and Applications(Innis，M，Gelfand，D，Sninsky，J.andWhite，T，Academic Press，San Diego 1990)；还见于美国专利号4,683,202和4,965,188，每一篇均被本文引作参考)和其它核酸复制和扩增技术得到巨大量的靶扩增的能力。虽然最常用于体外DNA扩增方法为PCR，适宜的可选择的扩增方法包括例如核酸序列扩增(Compton，1991，Nature 350：91-92)和扩增反义RNA(见被本文上作参考的Van Gelder etal.，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：7652-7656)和自续式序列复制系统(见于被本文引作参考的3SR，见Guatelli etal.，1990，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 8)：1874-1878)。PCR仅需要少量(运用高选择性和有效方法，甚至一个单拷贝就已足够)DNA模版，这样能使人们使用微观大小的固体载体并获得较大的库。
使用核酸标记便于远远超过通过其它被限制库方法获得的差异性的合成库的建立和筛选。而且，这些库采用易控制量的小球原料，因此可被采用切实可行量的生物试剂来分配受体结合。本发明的一个改进方法涉及具有寡核苷酸标记的ESL库的处理中的一个限制步骤——扩增，链分离，和来自各小球的标记的序列测定。这个方法提高了序列测定的效率至少一个数量组，并涉及标记连环(连接)步骤，其中许多一般从选择的库成员扩增而来的不同标记在寡核苷酸标记的克隆或序列测定之前被绑扎在一起。
在本发明方法的一个实施方案中，扩增的标记被连接，并接着克隆为常规序列测定载体中的线性排列的10至20(或更多)的标记。优选地，适宜的限制性位点被安装在与寡核苷酸标记的“编码区域”(具有信息含量的序列)相邻，在扩增了一组小球上的标记之后，限制性位点被切下，片断被连接形成多联体。接着将这个多联体克隆降至适宜的序列测定的载体中，只要发现每个模板上具有多于至少10个标记，那么每个模板可用于总共例如500至800个碱基的双向序列测定。这种方法还将提供避免用FACS分离各小球的选取方案。小球或标记化合物可被分类至库，用于序列测定的被扩增，连接和克隆的标记的库中。此外，因为摆脱了操作各小球的要求，可使用小于1μm(一般这个大小对于常规FACS分板来说太小)的小球来建立和筛选库。这种选择可通过亲和纯化法(扫视，磁性小球)，方便地被完成，接着富化的小球被如上所述地扩增和克隆。
寡核苷酸识别标记可在相应的单体偶联(对于寡聚体合成)或其它化学反应步骤之前，之中或之后，被一个碱基接着一个碱基地装配。在寡核苷酸标记的碱基接着碱基的合成的一种情况下，每步的标记为一个单核苷酸，或最多为非常少量的核苷酸(即2至5个核苷酸的块)。在块接着块的方法中，具2至5至10或更多碱基的编码核苷酸(密码子)作为被保护被活化的块加入。每一块携带单体类型或其它信息，一个标记块与下一个的加成顺序代表单体加成或其它反应的顺序。另外，块可编码寡聚体合成或其它反应步骤数目和单体类型或其它结构单元的信息。这种方法保持了与寡聚体平行生长的寡核苷酸链的线性排列中的步骤顺序。为了保持平行合成步骤(例如寡核苷酸和肽)的化学相容性，可以修改标准的合成化学组成的性质，它是下面将要进一步详细讨论的本发明的一个重要方面。
还可在每一步连接含有扩增引物位点，单体特定信息和反应顺序信息，长度为50至150个碱基的保护(或未保护)的寡核苷酸。在一系列n个寡聚体合成(单体偶联)或其它化学合成步骤结束时，将有n组不同的被编码的与库中每一寡聚体序列或其它化合物相关的寡核苷酸识别标记。在识别具有配体活性的寡聚体之后，相关的寡聚体可通过PCR来扩增并被进行序列测定来译码寡聚体或其它化合物的情况。
如下面将更全面的讨论，寡聚体识别标记中用到的碱基的选择是通过寡聚体合成化学或标记准被暴露于其中的其它化学反应条件来决定的。因此，当采用需利用强酸的化学过程和化学现象时，由仅嘧啶C和T以及双密码组成的寡核苷酸的使用能表现出有价值。用类似方法，嘌呤核苷酸对强酸的不稳定可通过使用嘌呤核苷类似物来克服，例如7-去氮杂-脱氧腺苷和7-去氮杂-脱氧鸟苷(见本文引作参考的Barr et al.，1986，Bio Techniques 4：428-432和Scheit，Nucleotide Analogs：Synthesis and Biological Function PP.64-65(John Wiley and Sons，New York)。使用这些或其它类似物将允许使用四元或其它与二元相反的编码方法。因此，在优选的实施方案中，识别标记将是一个有约50至150个核苷酸长度的寡核苷酸，它由嘧啶或嘧啶和嘌呤类似物或在用于装配寡聚体库的偶联条件下不分解的任何类型的核苷组成。寡核苷酸识别标记可包含一个5′和一个3′扩展位点和选择性地包含对于寡聚体合成的每一步骤可能是特定的一个DNA序列测定的引物位点。
编码带有寡核苷酸的组合成方法为定位在从大库中分离出来的少量配体的直接结构分析中遇到的不定性和灵敏度的主要限制提供了一个方法。DNA信息贮存的高容量可被开发归挡一个库结构的精确细节。在下面的实施例中，采用了一个包括三个碱基(C7dA，dC，T)的2个相邻核苷酸的“密码系”结构，它能编码结合了32＝9个氨基酸结构单元的合成(仅七个结构单元用于这个库的合成中)。如c7dG也被包括在编码模板中，那么采用1000个不同单体的组合成可通过使用仅5个核苷酸(45＝1024)的“密码系”大小来供给。
信息可被编码在长度中而不是或除了核苷酸序列中或编码在这方面的任何其它聚合寡聚标记中。只要长度被用来表示每一特定单体与寡聚体的加成，那么译码寡聚体的情况可通过如上所述的扩增寡核苷酸的标记和通过包括聚丙烯酸胺凝胶或毛细管凝胶电泳的按接大小分离的许多技术的任何一种来识别标记得以进行。在寡聚体合成的给定步骤或每一不同化学反应步骤中加入的每一不同单体通过独特长度的寡核苷酸标记来表示。寡核苷酸标记包含扩增位点，例如PCR引物序列，它的序列被设计为以寡聚体或其它化学合成中的给定步骤序号为特征。那么序列中任何给定位置的寡聚体组成的确定包括运用合成中的步骤为特征的PCR引物序列进行扩增标记和利用本领域熟知的技术如凝胶或毛细管电泳(利用正在标记的寡核苷酸作为标准)对扩增产物进行按大小分离。当希望制备一个与引导序列有关的化合物库时，这个实施方案特别有用。在合成一个正在被模拟的位点的步骤期间，仅需要一个标记。
除了长度，寡聚体序列信息还可编码在包括寡核苷酸标记的碱基序列中。这种类型密码不仅在每一偶联步骤中连接一个不同的寡核苷酸标记的实施方案中，而且在每一偶联步骤中扩展一预先存在的寡核苷酸标记的实施方案中都具有价值。例如，可采用达约100个碱基(或更长些)的寡核苷酸，如下所描述，其中每一个具有7个(或更多)区。
区1是3′-引物位点(20-25个碱基)。这个位点被用来与另一个PCR位点一起(在寡核苷酸的5′末端)连接到通过PCR的原始扩增上。也可使用另一个扩增方法。
区2是一个“步骤特有的”DNA序列测定引物位点(15-20个碱基)。这个位点对于合成系列中的特有的给编号的步骤是特有的。在特定步骤加入到所有小球中的全部的寡核苷酸将共同具有这个序列。每一给编号的步骤将具有一个代表那个步骤的高度特殊的引物位点。
区3是一个间隔区(20-30个碱基)。可定长度的间隔区区段，但优选为20至30个碱基长，将编码位点放置于离序列测定引物位点足够远以提供良好的对单体编码或识别区的阅读。
区4是单体识别区(8个碱基)。在这个说明性实施方案中，在8位信息串的每一个碱基代表二进制密码的一个单位，其中例如T＝0和C＝1。每一组步骤特有的识别标记由在8个位置的每一个上的带有一个1(C)或一个O(T)的8个碱基组成。每一个单体类型通过这些“开关”的1至8的混合来编码。
区5是步骤序号确定区(为3区域的区别在每一边上4个碱基加上2个碱基)。在这个短的范围中的四个单位编码步骤序号。这对于序列测定引物是多余的，但可用来确认适宜的引物被使用和正确的步骤被译码。
区6是单体识别标记(8个碱基)的重复，这个区域具有如区4相同的信息，并被用来确认单体情况。安装这个第二个单体编码区域还增加了获得良好序列测定“阅读”的可能性。
区域7是5′-PCR引物位点(20至25个碱基)。这个位点作为很大用于序列扩增的第二PCR引物的位点。带有全部七个这些特性，其中一些为选择性的寡核苷酸的长度，将普遍在75和125个碱基之间。
一个八个二进位数格式可编码256种不同单体类型。可被编码的步数由现有的步骤特有的组(每组8个)的寡核苷酸决定。使用10组(80个核苷酸)，可编码达256个不同的被装配到达10个单位长度的寡聚体上的单体(因此提供了编码达25610＝1.2×1024个寡聚体序列的能力)。可采用编码的识别标记，这样每一个单体被指定一个特定的二进制数(例Ala＝00000001，Gly＝00000110等)。组合适宜的寡核苷酸来提供正确的二进制密码。
为了便于寡核苷酸标记识别，有许多选择。例如，可通过序列测定式杂交直接从球上阅读标记。还可扩增寡核苷酸标记以便于标记识别，由一单一固体载体或寡聚体携带的寡核苷酸识别标记可通过体内克隆或体外例如PCR方法扩增。如果检测的限制为100个分子的顺序，那么至少将需要球上的每一寡核苷酸标记100或更多的拷贝。通过多种方法的任何一种，其中的一些将在下面描述，制备单链寡核苷酸，双链核酸，或单和双链核酸的混合物形式的标记拷贝并且对扩增的物质进行序列测定。在本发明的一个实施方案中，其中在每一单体加成步骤加入一分离和特殊的寡核苷酸标记(与每一步扩展现有的标记相反)，可立即扩增所有标记，并且接着将扩增的物质与对于每一类型的标记采用不同的序列测定的引物)具有与寡聚体合成步骤一样多的独立的序列测定反应。在这个实施方案中，通过引物序列的适当选择，还可标记使每一标记可从其它标记分别被扩增。完成序列测定反应，在标准序列测定凝胶上进行电泳，寡聚体序列由得到的序列信息揭示的密码推出。
一个供选择的方案是使用普通的PCR引物和普通的序列测定引物(序列测定引物甚至可以全部或部分地与PCR引物位点重叠)，通过杂交到至与珠的寡核酸中的每一步骤特有的序列互补的寡核苷酸探针上来识别该步骤。单组的序列测定反应在所有扩增的来自单珠的寡核苷酸上进行，反应产物在凝胶的单组道上电泳，接着将反应产物转移至一适宜的杂交膜上，杂交至单一步骤特有的探针上(见本文引作参考的，Maniatis et al.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harboo，NY(1982))。在检测得到的信号后，将探针从膜上洗掉，另一个步骤特有的探针被杂交。还可使用描述在本文引作参考的EPO公开号为237,362和PCT公开号为89/11548。
平行杂交为顺序性杂交提供了一种选择。将序列测定反应分成与肽合成步骤数目相等的许多等分试样，在序列测定凝胶上在每一个的独立的组道上进行电泳。在将反应产物转移至一适宜的膜之后，该膜被切下来分开各组道，接着每一道组杂交至许多步骤特有的寡核苷酸探针中的一个上。(见本文引作参考的“Uniplex DNA Sequencing”and“MultiplexDNA Sequencing，”in Plex Luminescent kits Protuct Catalog，Bed-ford，MA，1990)。
如上所述，单合成固体载体(或一带有标记的连接珠，或在“井”中的溶液中)可仅包括每个寡核苷酸标记的几百个拷贝。通过PCR或其它本领域技术人员熟知的方法可将这些标记扩增以提供足量的将要被准确地进行序列测定的DNA。译码寡聚体的能力依赖于可获得的寡核苷酸识别标记的数目，从可获得的标记能达到的扩增量以及对那个扩增的DNA进行序列测定的准确性。
如果采用寡核苷酸识别标记的PCR扩增，可能遇到“PCR产物污染”，它由PCR反应的产物引起，污染用来扩增其它具有相同PCR引物结合位点的标记的后来的PCR反应混合物。通过将不稳定性引入产物序列，处理后来反应以致消灭从前面反应带下来的可能的污染可预防这个问题。这种方法的一个特殊的实施例是将dUMP引入产物，其中购得的全套由PECI and Life Techndogies出售。用尿嘧啶N-糖苷酶处理每一新的PCR反应降解了出现的任何含dUM的DNA，这样防止了污染的扩增。不包含dU(仅含dT)的模板DNA不受影响，当然，在扩增开始前将糖苷酶去除或失活。
上面描述的一些肽合成标记具仅有包含嘧啶的独特特点。这意味着尿嘧啶糖苷酶方法(本文引作参考的PerkinElmer Cetus Instruments(PECI)Catalog，Alameda(1991))将在产生的这些链的仅仅一半中即那些含T′S(或U′S)的中起作用。不能将dUMP引入到互补的仅有嘌呤的链中；然而嘌呤链极易受酸脱嘌呤作用和主链的碱引起的裂开的损伤。这些处理的组合可大大地降低产物污染带来的问题。防止携带的污染的另一种方法包括在怀疑被标记污染的反应扩增之前将一限制性位点(EarI可用作多嘧啶标记)掺入到寡核苷酸标记中，并用相应的限制性酶消化。这个方法仅当将要扩增的标记不被酶所裂开时才起作用，它通常是单链寡核苷酸标记的情况。
对于序列测定的扩增的DNA，通常期望产生单链模板。可通过任何一种方法来产生。其中之一的方法是不对称PCR，其中使用过量的一种引物来扩增一条链至高于其它的10至100倍的量(见本文引作参考的例如US专利号为5,006,584)。提供一单链模板的另一种方法是通过生物素标记一种引物，通过吸附至固定化链毒亲和素来纯化或去除所得链(本文引作参考的Pierce Immunotechnology Catalog andHandbook，1991)。然而另一种方法包括从RNA聚合酶启动子产生的RNA转录物(代表仅一条链)以及用反转录酶序列测定转录物(本文引作参考的Sommer et al.，Chapter 25，InPCR Protocols：A Guide to Method and Applications，Supra)。如果标记仅由嘧啶核苷酸组成，那么所有嘌呤可通过酸/碱基处理被消去，留下序列测定的嘧啶链。
每一步骤特有的寡核苷酸的独立的序列测定引物的使用要求每一步骤特有的引物的独立方便的序列测定反应。被区别性标记的引物的使用允许来自单一固体载体的识别标记在单一反应中被序列测定，并在凝胶上的单道组(当仅为多嘧啶时为2个道；如果使用4个不同碱基则为4个道)中电泳。目前具有适于此目的的用可辨别的荧光基团标记的可购得到的引物(被本文引作参考的ABI Catalog)还可使用目前可购得到的一系列化学发光标记(本文引作参考的Bron-stein et al.，BioTechniques 8：310-314(1990)被扩增的产物可被容易地进行序列测定或通过其它方法被识别来译码球上的肽或其它分子的情况或通过其它方法连接至寡核苷酸的标记上。为了此目的，可使用多种序列测定方法中的一种，其中包括通过序列特有的探针杂交的序列测定。本发明中可采用的DNA序列测定酶包括Taq DNA聚合酶，E.Coli DNA聚合酶(或Klenow片断)，T7聚合酶，SequenaseTM测序酶和Sequenase IITM测序酶(被修饰的T7DNA聚合酶)，BSt DNA聚合酶和反转录酶(来自本文引作参考的AMV，MMLV，RSV，etc，see USB Enzymes for DNA Sequencing，VS BiochemicalCorp，1991，Clevaland OH)。寡核苷酸标记的序列还可通过高可靠性DNA杂交技术来识别，为此，大量带有寡核苷酸的固定化聚合酶合成可能是有益处的(见本文引作参考的PCT专利公开号92/10587和92/10588)。
无论标记是寡核苷酸还是一些其它分子结构，标记的选择依赖于组成库的分子的属性和合成这些分子的方法，它们将在下面讨论。
在合成化学过程包括使用与上述寡核苷酸标记不相容的试剂和反应条件时，可望使用替代的标记方法。因此，合成本发明的标记分子库的方法还期望利用通过一系列方法如色谱方法能单个地解析的化学惰性烃标记分子。
分子库中的这些隋性烃标记的使用已得到了描述。见均被本文引作参考的Michael HJ Ohlmeyer，et al.，Proc.Nat′1A-cad.Sci.90：10922-26(1993年12月)和已公开的PCT申请号为WO94/08951。
描述的标记运用象本文所述的二进制编码方法，二进制密码被用来规定每一化学结构单元，即在合成中要加入的氨基酸。密码的长度可依赖于加入的结构单元的总数目。例如，在仅有总共七个要加入的结构单元时，可用三位二进制密码。这允许七个独立不同的密码，从001至111，每一个用来规定七个结构单元的一个，例如赖氨酸＝001。结构单元的数目越大，可使用的密码越大，例如，如本文所述的一个八位二进制密码。
运用色谱方法制备许多标记，其中每一标记具有与其它标记不同的分辨或分离图形。如果出现一特殊标记，它将在给定合成分子的最终标记密码的每一个位置上显示一个“1”。因此，在一个分子具有四个结构单元，以三位编码系统编码时，具有12个可能的密码数字，每一个结构单元具有三位数。对于合成中的每一步，标记分子将要在其上被合成的固体载体，以致不仅显示加入的结构单元，而且显示加入时所在的步骤。例如，标记是1或“T1”的出现表明在第一步加入的结构单元的二进制标记密码的第一位上有一个“1”。类似地，T7的出现表明在所有密码的第七位上有一个“1”，在一个三个数字的密码中，它将同样对应于第三个加入的结构单元的第一个位置。因此规定为密码111的结构单元，如果在位置1加入，将由出现标记T1，T2和T3来编码。换句话说，如果在步骤2加入，相同的结构单元将由出现标记T4，T5和T6来编码。
由Ohlmeyer描述的特殊烃标记具有下列结构：
Figure A9419398400561
其中n为1至10。烃链变化的长度和被改变的卤代基团使其能通过色谱方法，具体地为俘获氯相色谱法进行标记的物理分离或分辨。
然而，这些烃标记的检测受检测方法灵敏度的限制。因此，为了确保标记的检测，必须用大量的标记。这要求大量分级的微球，这样降低了可被合成，并被增加了反应时间的保证标记最大量地偶联至固体载体上的所有库的大小。最后，在筛选较大分子的地方，更多的烃标记被加入至固体载体中，在固体载体上的大量烃的掺入，例如，具有大量标记的大合成化合物，由于空间，疏水或离子相互作用将有可能对连续合成和/或固体载体上的化合物的筛选产生不利影响。
与这些烃标记相关的可检测性，标记时间，和筛选或合成干扰的问题可运用本发明的方法来防止发生。特别地，在本发明的一个实施方案中提供了一种动用烃标记的标记方法，其中这种标记具有一“分子钩”来代替如Ohlmeyer等描述的可检测电泳，这种“分子钩”在本文被定义为允许连接可扩增，可检测基团的标记上的官能基团，因此使固体载体上的标记的检测成为可能。这个钩一般包括一稳定的官能基团或分子，这个分子与可扩展可检测的基团形成共价键或与那个基团的一部分具有高度的亲和性。这种钩包括例如生物素，连接了可扩增可检测的基团的链霉亲和霉可被结合到其上，或高结合肽的补体。这种高结合肽一般包括对另一个具高亲和性的肽的互补对。因此，补体指的是这样一对中的一个肽。高结合肽被概括地描述在1994年10月12日提出的美国申请系列号为08/321,933中，它是1993年5月24日提出的美国申请号为08/067,387的部分继续申请，每一篇均被本文引作参考。另一方面，钩可包括被保护的可活化基团，它可被活化共价性地将可扩增可检测基团连于标记上。被光保护的活化基团在运种应用中特别有用。活化基团在本领域中普遍熟知，包括这些基团，如羧基，羟基，氨基，硫羟和类似物。动用对光不要的保护基团例如在为所有目的被本文引作参考的已公开的PCT申请号WO93/22680中的描述的那些可保护这些基团。得到的基团为可光敏化的。
除上所述，分子钩可包括多官能基团。例如，分子钩可包括两或多个能被偶联至两个不同本体上的不同官能基团。可为这种情况，例如为了检测目的希望将标记再偶联至另一个固体载体上，例如微量滴定盘中的反应井。第一个官能基团可用来选择性地结合固体载体上的互补基团。一旦被偶联，第二个官能基团可用于可扩增可检测基团的选择性偶联上。这种钩一般包括本文描述的官能基团或能被选择性地结合到其它这种基团上的其它基团的组合。例如一个实施例，这一钩可包括正交性地连接至烃标记的生物素和digoxin。一旦被分离，这些标记可与固体载体例如微量滴定井接触，这种固体载体被覆盖一种能与标记上的一个官能基团例如抗digoxin的抗体结合的基团，并被允许与它们结合。在重复洗涤步骤之后，将固体载体与寡核苷酸接触，寡核苷酸被偶联至能结合到第二个官能基团如前面所述的链霉亲和素连接的寡核苷酸上的基团上。接着如前所述检测结合的寡核苷酸。本发明的烃标记的合成可通过本领域熟知的方法来进行。参见例如March，Advanced Organic Chemistry(John Wiley& Sons，3rd Ed.，1985)，Larock，Comprehensive Organic Trans-formations CVCH Pubishers，1989)。
由于本发明的惰性烃标记提供了更为灵敏的烃标记的检测，固体载体上的特殊标记的量可在不影响它的可检测性的情况下被降低。进一步，通过降低固体载体上的标记的量。将标记偶联至载体上所需的时间被缩短。
本发明中有用的标记将一般地包括可得到的烃区和分子钩。更优选地，这种标记将包括将标记与固体载体相连的可裂解的接头，所述的分子钩和将分子钩与接头相连的变化长度的烃链。不同标记将具有不同长度的烃链或不同的分子钩以便于它们的物理分离和检测。
具有下列通式结构的标记为优选的：
Figure A9419398400591
其中n为1至10，X为可裂解的接头，R为分子钩。优选的分子钩包括例如生物素，高结合肽和可活化基团，例如可光敏化的基团或它们的组合。
本发明中有用的可裂解的接头包括例如为所有目的被本文引作参考的1994年6月23日提出的美国申请号08/265090中描述的可光裂解的接头。这种可光裂解的接头包括具有下列结构的那些物质：
在合成和标记之后，通过例如接头的光解将标记从固体载体上去除。接着用维持标记分离图形的方法，例如对部分收集品的HPLC，或例如凝胶或毛细管电泳的其它色谱方法将标记各自分开。因为标记通常以常规方式如吸光度等不能检测的量出现，它们必须以允许后续检测，与它们分离图形相关的方式被分离。作为一个实施例，从固体载体上裂解的标记在HPLC柱上被分离，并收集在部分收集器中。当标记被进行最后的检测时，下面将进一步详细描述，对于用在标记/合成的所有标记，表示标记存在的部分与已知的洗脱分布型或分离图形相关。
接着根据它们的分离图形将分离的标记固定。这种固定可采取点样各部分，为凝胶为基础的分离点样，或在反应井即在微量滴定盘中固定的形式。
一旦被固定，标记可被用钩连结到可扩增增可检测的基团上，可扩增可检测基团一般包括能被扩增或产生能被扩增的信号的化合物或结构。能指数级扩增的化合物为优选的。特别有用的可扩增可检测基团是一个寡核苷酸序列。可扩增可检测的基团的用钩连结可采取多种形式。例如，在钩包括一个生物素基团时，将寡核苷酸偶联到将紧紧地与生物素结合的链亲和素上。另一方面，可在后面接着加入生物素标记的寡核苷酸的一个中间步骤中加入链霉亲和素。在一个选择实施方案中，标记可包括高结合肽的补体。在这种情况下，寡核苷酸与肽的其它补体结合，这样寡核苷酸可紧紧地与标记结合。然而在另一个实施例中，在标记包括由如以前被引作参考的已公开的PCF申请号为WO93/22680中描述的对光不稳的保护基团保护的活化基团，这个基团可通过对光不稳基团的光解被活化，使接着寡核苷酸通过本领域熟知的方法被偶联至标记上。在这种情况下，如果使用可期望选择具有与可光裂解的接头不同的光解特性的对光不稳的保护基团。这将允许在不活化分子钩的情况下标记选择性地从固体载体上裂解。
一旦被钩连接到标记上，使用本文描述的PCR技术可扩增寡核苷酸序列，当固定采用印迹形式时，必须进行扩增以保持局部浓度和避免扩增的寡核苷酸的扩散，因此使它能检测并与分离方法相应。例如，这些可通过进行印迹的凝胶重叠中的扩增反应来完成。
被钩住的寡核苷酸和由此的标记的检测可通过将一标记掺入到被扩增的寡核苷酸中或通过探测其中这个序列为已知的被扩增的寡核苷酸序列来完成。标记的检测与已知的标记分离方法相对应。再将如此识别的标记掺入到被合成分子的所有标记密码中。仅为实施例目的，如果根据HPLC分离，用钩连接，扩增和探测，数码#17表示标记相对应。例如，如果这是标记#15，那么“1”可用来表示特殊载体上的被合成分子的所有二进制密码的位置#5。本文描述的这种编码方法是仅为了实施例的目的，本领域的技术人员将理解为多种编码方法可被用于本发明的方法中。
本领域的技术人员还将认识到不需要将报导的合成分子的序列的密码包含在各标记的单一聚合序列中。相反，密码可通过固体载体上的各个不同标记的存在不存在来体现。虽然这些标记可能被顺序地互相偶联，技术人员将理解使每个不同标记单独地连接至固体载体上的好处。特别地，对任何和所有的标记步骤仅需要单偶联化学过程。进一步，可避免具有不同反应基团的标记的保护/去保护的复杂约定。
V合成方法
本发明的方法可用在制备不同化合物的程序中进行的任何组的合成化学反应中。虽然本发明一般使用化学结构单元来说明，更一般地用单体结构单元，应理解本发明的普遍实质。大多数合成化学反应的进行与一般单体偶联反应有很大不同；一般有机化学反应提供可变的产率并产生多种产物，例如区域和立体异构结构。本发明可用来识别这样一系列化学反应的有用产物，因为可利用这个方法来使标记编码合成产物的信息来代替清楚确定反应产物结构。
然而，为了简化讨论，本发明差不多被看作是一系列单体偶联步骤。因为本发明的各种偶联步骤可在分离时间在单别的反应容器中进行，甚至例如单元的具有极大不同的偶联化学过程的结构单元也可用于库中感兴趣化合物的装配。虽然本发明可通过将固体载体同时暴露于结构单元和识别标记中，或顺序地(先暴露于结构单元，再暴露于标记中或先暴露于标记中再暴露于结构单元中)，根据偶联化学这个有顺序性的方法允许了一附加的柔韧性。在任何情况下，进行偶联反应优选的安排是平行地进行不同的偶联反应。
在每一个平行系列的偶联步骤完成后，在重新分配至下一偶联步骤的各容器中之前，寡聚体和库的其它化合物在其上合成的固体载体被汇集和混合。这种混合方法制备了带有不同固体载体上的库的每一个不同成员的化合物的一个大库。如果每一合成步骤均具有高的偶联效率，那么基本上所有单一固体载体上的化合物具有相同结构，或如果化合物为寡聚体，则具有相同的单体序列。通过在合成末期的任何给定的固体载体的合成路径决定结构或序列。寡聚体的最大长度一般小于约20个，通常为3至15个单体长度，但在一些情况下8至12个单体(残基)的长度为优选的。
被给适宜于本发明的用途的不同数目的标记和结构单元，有许多可制备本发明化学库的化学方法。然而，必须确保无论是标记或寡聚体的每一偶联步骤不能产生不合格的量的不需要的反应或损坏已在载体上出现的标记或寡聚体。在一个实施例中，必须确保通过使用带有标记和寡聚体连接的化学反应基团的固体载体，仅发生所期望的反应，其中标记和寡聚体的连接通过使用两个不同或“正交”类型的保护基团被保护。固体载体被暴露在第一个去保护剂或活化剂中，从例作为寡聚体合成位点的化学反应基团中去除了第一种类型的保护基团。在与第一个单体反应之后，在任一选择性的保护步骤之后，接着将固体载体暴露于去除第二种类型的保护基的第二活化剂中，暴露例如作为识别标记连接位点的化学反应基团。再将标记偶联，重复这些步骤，一般为1至约20次。
A.寡核苷酸标记的肽库
在一个重要的实施方案中，本发明涉及不同肽的大型库的合成。虽然许多其它化合物和寡聚体可通过方法(见被本文引作参考的Gait Oligonucleotide Synthesis：A Practical Ap-proach，IRL Press，Oxford(1984)，Friesen and Danishefsky，1989，J.Amer.Chem.Soc.111.6656；and Paulsen，1986，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.25：212)来制备，但肽的固相合成方法为特别重要和众所周知(见被本文引作参考的Mer-rffield，1963，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)并且肽库对于各种目的都极为有用。在Merrifield方法中，氨基酸被共价地结合到由不溶聚合物制成的载体上。另一个带有α-氨基保护基团的氨基酸与被以共价键结合的氨基酸反应形成一个二肽。去除保护基团，将带有α保护基团的第三个氨基酸加1到二肽中。继续这个步骤直至肽获得了期望的长度和序列。可用本领域技术人员已知的保护基团来防止假的偶联(见本文引用参考的The Peptide，Vols.1&3(eds.Gross，E.，and J Meinhofer，Academic Press，Orlando(1979 & 1981))或允许一个来控制偶联。为了本发明的各种目的对光不稳定，对碱不稳定和对酸不稳定的保护基团和它们的组合可被都是使用。
此外，L型和D型氨基酸都可被采用在本文描述的肽合成方法中。如为所有目的被本文所引作参考的1994年9月21日提出的美国申请系列号08/309,45/中描述的，采用D-氨基酸可在“向后-反向肽”(retro-inverso peptide)的合成中有用。这些向后-反向肽将包括相同的氨基酸序列，但具有与运用L-氨基酸合成的肽相反的立体化学。
当本发明用来制备和筛选肽库时，选择的标记为核酸。对于肽合成和寡核苷酸识别标记一个循环接着一个循环的连接存在许多相容的化学性质和过程。然而，为了保持肽合成期间寡核苷酸标记的完整性，可能需要使用保护基团和/或合成核苷酸的不同组合来避免合成的标记或寡聚体的降解。一般地，多嘧啶寡核苷酸标记在一般的肽合成条件下相对稳定，这与包含天然嘌呤核苷酸的寡核苷酸标记相反，但多嘧啶核苷酸标记可多少耐熔PCR的扩增。可能需要将嘌呤基或类似物如7-去杂氮-脱氧腺苷和7-去杂氮-脱氧鸟苷，它们被测试经受肽偶联条件的能力，掺入到标记中的获得扩增的期望效率。为了本发明的目的，标记选择性地包含10％至90％，较优选地为35％至50％，更优选地为33％-35％的嘌呤或嘌呤类似物核苷酸。寡核苷酸标记可选择性地掺入生物素或其它报道基团以便于纯化，杂交，扩增或检测(见被本文引作参考的Pierce ImmunoTechnology Catalogand Handbook，1991)。
因此，在选择用于制备本发明寡核苷酸标记的肽库的化学过程和性质中，必须(1)选择带有适宜官能基团的固体载体；(2)选择氨基酸偶联化学；(3)选择寡核苷酸标记偶联化学；(4)选择各种标记，单体和寡聚体的保护基团和(5)选择去保护和在一些实施例中的裂解化学(对于标记或肽)。本领域技术人员认识到在每种情况下不是所有上面选择都需要作出，因为一些应用不可能提出与其它的相同的问题。例如，对于所有的应用不可能都要求一个或多个保护基团。在一般情况下，这些选择中的一个是重要的。
考虑与偶联化学，寡核苷酸标记的肽库的合成的保护基团的选择有关的因素，需考虑用标准的Merrifield化学偶联购得的Fmoc保护的氨基酸和用标准的氨基磷酸酯化学偶联寡核苷酸的合成。这个方法可认为具有以下步骤：(1)从连在小球的接头或肽上去除氨基末端的Fmoc保护基团；(2)将Fmoc保护(侧链也可被保护)的氨基酸偶联至步骤(1)中产生的游离氨基上；(3)对任何未反应的游离氨基进行选择性覆盖；(4)将DMT保护基团从小球或核苷酸标记被连接在其上的标记上的羟基中除去；(5)偶然带有5′-DMT保护基团和磷酸酯上的保护基团和碱基的环代胺的核苷酸氨基磷酸酯；(6)选择性地覆盖任何未反应的游离羟基；(7)寡核苷酸标记的三价磷的氧化；和(8)肽和寡核苷酸标记的去保护。下面讨论，这些步骤中每一步。
(1)在连接下一个氨基酸单体之前，必须从与小球相连的接头或肽中去除氨基末端的Fmoc保护基团。一般地，在DMF中用30％的哌啶处理约1小时来完成这种去保护(还见于步骤8)，但本发明的一个方面涉及为了寡核苷酸标记的肽库的合成，使用降低浓度的哌啶或缩短的去保护时间。哌啶可导致甲基三酯保护的寡核苷酸标记的去保护，O-甲基磷的酯保护团因比已知对哌啶裂解敏感的标准的β-氰乙基基团具有较大的碱基稳定性。本发明优选的Fmoc去保护条件为5％至15％，优选为10％哌啶处理5至60分钟，优选地为10至20分钟，15％至30％哌啶为15至30分钟。已知影响Fmoc去除的另一个处理为用DBU处理(1，8-二氮杂二环〔5.4.0〕十一-7-烯)，例如5％DUB处理5分钟。然而，被本文引作参考的Palom et al.，Tetr.Lett.34：2195-2198的报导认为这种处理能导致胸苷的N-3的甲基化作用。虽然DBU-介导的Fmoc的去除在一些应中的能够有效，但应承认碱基修饰的可能。
(2)用常规BOP偶联化学(见The Peptides，Supra可将Fmoc保护的氨基酸偶联至小球或肽的游离氨基基团上。一般地，采用由1∶1 DMF/DCM组成的溶液中的Fmoc保护的氨基酸(110mM)，HBTV(100mM)，HOBt(100mM)和DIEA(300mM)的混合物来氨基酸的偶联。其它活化化学过程也可被用在这种情况中，例如用HATV替代HBTV/HOBT。然而在本发明的一个实施方案中，反应混合物由3∶1DMF/DCM组成的溶液中的55mM Fmoc保护的氨基酸，50mMHBTV和150mMDIEA组成；这个实施方案优选使用可省略试剂运送瓶的设备，侧链也可被保护；由于结构单元的商业可获得性，为多种目的，优选Fmoc/tBu保护。其它带侧链保护的有用的氨基酸结构单元包括Arg(Pmc)，Gln(Trt)，HB(Trt)，Asn(Trt)，Asp(OtBu)，Glu(OtBu)和Lys(tBOC)和由对光不稳的保护基团提供的带侧链保护的氨基酸。
(3)通过用乙酸酐和1-甲基咪唑处理或其它本领域已知的方法可获得对未反应的游离氨基基团进行选择性覆盖。
(4)通过用三氯乙酸(TCA)即CH2Cl2中10％TCA处理可将DMT保护基团从核苷酸标记将与其相连的小球或标记上的羟基中除去。如果使用磷酸酯中的对酸不稳定保护基团和核苷酸的环代胺(即脱氧胞苷，7-去杂氮-脱氧腺苷，和7-去杂氮-脱氧鸟苷)，那么这些基团将足够坚固地抵抗5′-O-脱三苯甲基作用中用到的TCA(一般为1-3％)。
(5)偶联带有5′-DMT保护基团的核苷酸氨基磷酸酯可通过使用常规的氨基磷酸酯化学来获得，虽然必须考虑需要磷酸酯氧上和寡核苷酸标记的碱基的环代胺上的保护基。对于核酸的对光不稳的保护基团，见被本文引作参考的PCT专利公开WO92/10092和Baldwin et al.，1990，Tetr.Lett.46：6879-6884。如上所述，适宜的磷酸酯保护基团包括O-甲基和β-氰乙基，但O-烯丙基和/或IV-烯丙氧羰基(即引用的3-(烯丙基N，N′-二异丙基)氨基磷酸酯)也可用来保护磷酸酯氧和核苷碱基的环代胺，分别(见被本文引作参考的HgyaKawa et al.，1990，J.Amer，Chem.Soc.112：1691-1696。通过使用含有三(联苄基亚基丙酮)二钯氯仿复合物，三苯基膦和正丁胺/甲酸，接着进行THF洗涤，含水N，N-二乙基二硫化氨基甲酸钠和水洗涤可去除烯丙基保护基团。氨基磷酸酯偶联通过如1H-四唑；4-硝基苯四唑；吡啶鎓氢氯化物/咪唑。近来的氨基磷酸酯活化剂在以肽或寡核苷酸上的氮上的假反应的低水平为代价导致了选择性的5′-O-亚磷酸化(见被本文引作参考的Gryaznov andLetsinger，1992，Nuceic Acids Research 20：1879-1882)。
(6)通过用乙酸酐和1-甲基四唑处理或通过用乙酸酐/二甲基吡啶/DMAP处理可达到对任何未反应的游离羟基的选择性覆盖。
(7)通过用碘和吡啶处理或用I2，可力丁，水中的MeCN处理可达到寡核苷酸标记中的三价磷的氧化。另一方面，通过采用氧化三价磷的温和氧化剂tBuOOH，可减少氨基酸甲氨酸，色氨酸和组氨酸的氧化(见被本文引作参考的Hayakawa et al.，1990，Tetr.lett.27：4191-4194)。
(8)通过顺序地用二氯甲烷中1％的TCA，再用苯硫酚/NEt3/二噁烷(1∶2∶2)，接着用1，2-乙二胺/EtOH(1∶1)在55℃下处理从标记中去除保护基团，接着使用三氟乙酸(95∶5TFA/水，阳离子清除剂)来去除对酸不稳定的保护基团可实现肽和寡核苷的标记的去保护。嘌呤核苷酸对强酸(如TFA)的不稳定性可通过利用嘌呤核苷类似物7-去氮杂-2′-脱氧腺苷和7-去氮杂-2′-脱氧鸟苷的氨基磷酸酯来避免(见被本文引作参考的Barr et al..1986.BioTechniques4：428-432，and Scheit，Nucleotide Analogs：Synthesis and Bio-logical Function PP.64-65(John Wiley and Sons，NewYork)。
下面的部分说明合成寡核苷酸标记的肽库的一个优选实施例。
B.合成寡核者酸标记的肽文库的改进方法
建立一种实用的小球基寡核苷酸编码肽文库的方法需要满足几个关键技术标准。这些标准包括(i)平行装配肽和寡核苷酸的相互匹配化学方法的开发；(ii)具有适当物理性质的小球，材料的选择；(iii)方便地分离载有配体的微型小球其中配体与靶受体结合；和(iv)从单一球粒成功读码标记物，即通过PCR扩增和从单一小球排序模板标记物DNA。本发明提供一种合成这类文库的改进方法，正如此部分和实施例1所描述，其表明如何使用单链寡核甘酸标记物在10μm直径聚苯乙烯小球上编码组成肽的合成。
在该改进方法中，肽和核甘酸以平行交替合成方式进行装配，以便每一粒小球都带有一条单链肽序列和唯一的寡核苷酸识别标记物。这些寡核苷酸共享共同的5′-和3′-PCR引发位点；因此这些小球可作为PCR模板。为说明该方法，合成并筛选约8.2×105七肽的编码合成文库以与抗-强啡肽B单克隆抗体D32.39(Cull等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869，此处引为参考文献)结合，使用荧光激光激活细胞分选(FACS)仪选择与抗体强烈结合的个别小球。在选择小球上进行寡核苷酸标记物PCR扩增后，对DNA进行排序以确定肽配体的特性，这些更详细地描述于下文。
该方法一个重要方法描述于下面实施例1的附加细节部分，其是为肽和标记物合成选择的固相载体。优选固相载体，即10μm直径小球由大孔苯乙烯-二乙烯共聚物制成并用十二烷胺接头衍生。通过以Fmoc-甘氨酸完全酰化，随后哌啶除去Fmoc基固及分光光度法定量释放的哌啶二苯并富烯(piperidine-dibenzofulvene)加成物(e302＝7,800 1mol-1cm-1 ，估算这些小球上的氨基为～100μmol/g。5×109小球/g，其相应的最大肽载量为～20fmole/球。使用适当保护的氨基酸和Ω羟基酸的混合物进行小球酰化得到正交分化的氨基和羟基，由此可分别发展肽和核苷酸链。通过放变偶联于初始小球量(参见下文)的氨基酸和羟基酸的比例来控制每粒小球肽对寡核苷酸的平均化学计量。使用标准Fmoc化学方法测试在带有三氟乙酸可裂解Knorr接头(Bernatowicz等，1989，Fetr.Lett.30：4645-4648，这里引为参考文献)的小球上的肽合成(5肽至12肽，发现其具有高度的重现精度，与在常规肽合成树脂上进行的合成没什么区别，正如粗制的裂解肽酰胺HPLC分析所测定的结果。
平行合成策略要求在相互正交的氨基酸和核苷酸结构单元上使用一套保护基团，并且每一条聚合物链对合成中所使用的及第二链脱保护中所使用的试剂而言是稳定的。虽然原则上可使用各种保护/脱保护方案(如上所述)，但优选在肽结构单元上使用Fmoc/tBu保护，因为这种方式保护的天然和非天然氨基酸可广泛购买得到。然而，tBu-基的肽侧链保护基团要求使用强酸(通常为三氟乙酸)进行处理以脱去，条件是能够引起寡核苷酸包括2′-脱氧腺苷(dA)或2′-脱氧鸟苷(dG)的快速脱嘌呤作用(见Capon，1969，Chem.Rev.69：407-498，这里引为参考文献)。围绕这个问题的就是在模板寡核苷酸标记物中以7-脱氮-2′-脱氧腺苷(c7dA)取代dA。脱氮嘌呤核苷的配糖键抗酸催化的水解作用(参见Scheit，1980，Nucleotide Analogs：Synthesis and Biolgical Func-tion(John Wiley和Sons，New York)PP.64-65，这里引为参考文献)，通过PCR中使用的热稳定性聚合酶完全复制掺有这些单体的寡核苷酸(参见Mc Conlogue等，1988，Nucl.AcidsRes.16：9869，和Barr等，1986，Bio Techniques 4：428-432，其中每一篇在此都作为参考文献)，抗酸鸟苷也可被包含在模板DNA中。在所有平行合成中均使用5′-O-二甲氧三苯甲基2′-脱氧核苷3′-(O-甲基-N，N-二异丙基)氨基磷酸酯。在DNA合成方案中用来将核苷酸亚磷酸酯中间体转化为磷酸三酯的试剂(I2/可力丁/H2O/乙腈)，未发现其对易氧化残基Trp和Met或其它被保护氨基酸具有不利影响。使用二氯甲烷中1％的三氟乙酸(TCA)在～40秒内将5′-O-DMT基团从正在增长的寡核酸链上完全除去，而所有常规用于Fmoc/tBu化学方法中的酸不稳定性侧链保护基，除酪氨酸衍生的tBu醚外，对1％TCA处理1小时均呈惰性。Fmoc-Tyr(OBz)证明是含酪氨酸的肽合成中合适的替代，该O-苯甲酰脂对肽合成中用于除去α-N-Fmoc保护基的TCA和哌啶均是稳定的。α-氨基残基的定量脱保护要求以哌啶/DMF(10％v/v)处理5-10分钟，并还会导致被保护的多核苷酸磷酸三酯的部分脱甲基作用(t1/2～45min)。对照实验表明，在随后的核苷酸链增长过程中产物磷酸二酯类的任何异常的亚磷酸化作用会被最终寡核苷酸脱保护步骤改变回去(参见Lehmann等，1989，Nucl.Acid Res.17：2379-2390，这里引为参考文献)。平行合成完成时，使用苯硫酚酯(thiophenolue)(磷酸酯O-脱甲基作用)然后使用乙醇乙二胺(被保护胞苷和7-脱氮-腺嘌呤残基的脱苯甲酰作用)使DNA完全脱保护。这些温和的无水氨解条件不对被保护的肽序列产生不利影响(参见Juby等，1991，Tetr.Lett 3：879-882，这里引为参考文献)。在标准条件下使用TFA会使被保护的肽序列脱保护。
先前已表明阿片样肽强啡肽B(YGGFLRRQFKVVT)(SEQ ID NO：1)的羧基末端区代表了抗-强啡肽B mAbD32.39(参见Cull等，上述)的表位：可溶性七肽RQFKVVT(SEQ ID NO：2)与D 32.39以高度亲和力(Kd～1nM)结合。在带有一个酸可裂解的Fmoc保护的碳酰胺(Knorr)接头的正交分化的小球上进行此肽和69碱基寡氧核苷酸的平行合成。在加入起始的20个核苷酸之后，用哌啶/DMF和偶联于游离胺的第一个肽残基(Fmoc-Thr(tBu)-OH)处理小球。然后小球处于氨基磷酸酯化学反应过程和偶联下一个氨基酸(Fmoc-Val-OH)的双循环中。重复这一过程，直至七肽序列和核苷酸编码区被完全合成出来，然后再以下面的35个核苷酸延伸DNA以提供一个间隔区和PCR的5′-引发位点。最后将小球曝露于全部寡核苷酸和随后的肽脱保护条件中，含裂解下的肽的TFA上清液以反相HPLC分析。HPLC结果表明，平行合成的粗制肽由一种单一的主成分组成(用真正的RQFKVVT(SEQ ID NO：2)共洗脱)，这一粗产品与没发生寡核苷酸化学反应的对照肽合成所产生的肽相比没有明显区别。
含T，dC和c7dA的模板DNA的平行合成化学的稳定性与含标准嘌呤核苷酸dA的类似靶物相比。利用荧光激活细胞分选仪正细胞计数器(FAC Star Plus cytometer)的单一球粒克隆能力，来自双合成的个别脱保护小球被分选入微型离心(microfuge)管中，并且，被束缚的寡核酸模板通过PCR45个循环进行扩增。仅从含脱氮嘌呤的模板制得所期望大小和核苷酸序列的“干净的”扩增产品。因此在平行肽合成的过程中保持了该寡核苷酸的完整性，证明来自单一小球的模板可被容易地进行扩增和排序。
使用7个氨基酸结构单元Arg，Gln，Phe，Lys，Val D-Val和Thr通过组合合成方法构建编码文库，设计该文库含823，543(77)个不同的连接于10μm小球上的七肽。α-N-Fmoc-Thr(叔丁基-羟苯并三唑(被保护的苏氨酸)和4-O-DMT-氧化丁酸琥珀酰亚胺酯残基首先与所有的小球偶联，得到用于合成的正交分化的氨基和羟基。通常，每颗小球带有每分子DNA标记物20个分子的单链肽序列。通过建立特有的二核苷酸单元编码每一加入的氨基酸，在肽偶联的第七个循环之后，合并小球，DNA合成完成。初始所用总球量为35mg(1.75×108个小球)，确保了文库中每一肽序列存在于～200个不同的小球上。一等份文库的肽显微排序分析确证，七个氨基酸随机地分布于降解的七肽混合物(注意L-缬氨酸和D-缬氨酸在Edman降解过程中是不可区分的)每种情况中。
通过流动细胞计数分析mAb D32.39与对照小球和与小球文库的结合。带有正向对照序列RQFKVVT(SEQ IDNO：2)和69无寡核苷酸标记物的小球用抗体进行强烈染色，而对空白小球不染色。通过对比，只有一小部分的编码文库结合有D32.39。105次分析表明～2％。文库染色高于背景水平。显然，这种在结合位点与D32.39的结合是特异的，因为它能通过mAb与可溶性RQFKVVT(EDY ID NO：2)预温育而被完全阻断。来自文库的个别小球具有可与正向对照小球相比的荧光强度，其被分选入微型离心(microfuge)管中作为标记物通过PCR扩增(收集顶部有荧光的球，占总量的0.17％)。扩增反应含duTP和尿嘧啶DNA糖苷酶以防止遗留的杂质，带有来自前面扩增过程的可溶性产品(参见Longo等，1990，Gene 93：125-128，这里引为参考文献)。从12颗分选的小球获得核苷酸序列，推断出的肽序列列于表1。从单一球得到的代表性肽序列带有的荧光不是明显强于背景，作为对比其也被列成表格。
                   表1
               高荧光密度小球
           序列                      Kd、nM(SEQ ID NO：3)          TFRQFKVT         0.29(SEQ ID NO：4)          TTRRFRVT         4.3(SEQ ID NO：5)          TVRQFKTT         8.8(SEQ ID NO：6)          QvRQFKTT         16(SEQ ID NO：7)          RQFRTVQT         76(SEQ ID NO：8)          KQFKVTKT         340(SEQ ID NO：9)          QQFKVVQT         370(SEQ ID NO：10)         KQFKVTQT         410(SEQ ID NO：11)         TQFKVTKT         560(SEQ ID NO：12)         TFRvFRVT         1400(SEQ ID NO：13)         FRRQFRVT         not tested(SEQ ID NO：14)         RQFKQVQT         not tested
                    低荧光密度小球
          序列
                                      Kd、mM(SEQ ID NO：15)         QTvTvKKT          ＞1(SEQ ID NO：16)         QQVQRQTT          ＞0.4(SEQ ID NO：17)         KTQvVQFT          not tested(SEQ ID NO：18)         QvTQvRVT          not tested(SEQ ID NO：19)         FVVTVRVT          not tested
表1中的数据与较早期研究相一致，证明了D32.39的优选识别序列位于强啡肽B的RQFKVV六个氨基酸片断(参见Cull等，上文)。优选正电荷残基精氨酸和赖氨酸处于该表位的第一位和第四位，苯丙氨酸表现为该基序所独有的第三位残基。在该文库中优选第二位为谷氨酰胺残基而明显地优选脂肪族b-支链的氨基酸缬氨酸(仅L-异构体)和苏氨酸作为第5和第6位残基。D-缬氨酸表现为共同基序之外位置上最被接受的残基。根据所设计的结合分析实验，所选择的肽亲和性范围(Kd～0.3-1400nm)是可预知的带有被标记的另一抗体二价初级抗体的检测。结合价的操作(例如，使用直接标记的一价受体)和洗涤条件的严格性会提高仅分离最高亲和力配体的能力。C.小分子合成
虽然最初从肽合成或其它大的聚合物文库角度描述了本发明各个方面，正如前所述，本发明各方面可等同地适用于其它化学合成。特别地，本发明的装置和方法可用来在许多合成方案中完成各种化学合成步骤，包括如小分子合成。这些装置可被用于化学合成方案中以选择性添加试剂，与用于特定分子的合成方案一致。
进一步地，可平行地进行不同的合成方案，如与上述进行的肽合成一起进行，其中在不同步骤中加入不同的试剂从得到固体载体上多种小分子文库。这些多种文库可用这里所述的方法筛选，以具有所需性质。此外，当需要此小分子多种文库时，可对该文库进行标记以对合成步骤进行编码，这些合成步骤包含在分子文库的每一分离子的合成中。
这种小分子在固体载体上合成的例子包括，如噻唑烷酮(thiazolidinones)，间噻唑烷酮及其衍生物，正如这里包括的实施例2所述，及U.S.专利申请No.08/265,090,1994年6月23日申请，在此引为参考文献，用于所有目的。D.生产可溶性文库的方法
为某些应用，人们可设想一种“无球”或“可溶的”分子文库。可溶性分子，标记的和未标记的，可用于各种目的，包括分析化合物的活性(参见下面的VI.B部分)及扩增标记物。有各种方法产生可溶性分子文库，标记的和未被标记的，及溶解合成于固体载体上的化合物，标记的和未被标记的。通常，在这种方法中采用可裂解的接着。
例如，如上述部分II.B所示，可裂解的接头能用于从小球或其它固体载体上裂解被标记的或未被标记的分子，由此使所感兴趣的分子溶解。为生产可溶的被标记的分子，可裂解接头将连接于小球或其它固体载体上并具有至少两个官能团：一个是用于合成感兴趣的分子，另一个用于合成标记物。由此将分子和标记物合成连接于同一接头上，该接头反过来与固体载体结合。一旦合成此分子和标记物，便裂解掉接头得到一可溶的被标记的分子。
利用极大规模固定化聚合成(VLSIPSTM)技术，并在筛选之前从载体上可裂解合成物。参见U.S.专利No.5,143,854和PCT专利申请No.92/10092，其在此均引为参考文献。在一实施方案中，在VLSIPSTM片上合成一组寡核苷酸，并且每一寡核苷酸通过一可裂解接头与片连接，接头如二硫化物(参U.S.专利申请No874,849,1992所4月24日申请，这里引为参考文献)。寡核苷酸标记物具有一个游离的官能团，如胺，用于被标记分子的连接，该分子通常为寡聚体，优选为肽。该标记物可选择性地仅含有嘧啶或含有嘧啶和嘌呤的类似碱基。该标记物也可含用于扩增的结合位点，即PCR引物位点，可选拔的排序引物位点，及含有单纯编码被标记寡聚体的单体序列的短部份。然后，合成寡聚体，即从标记物的自由末端氨基或连接于标记物的接头进行合成，以便使每寡聚体与标记物连接。收集的被标记寡聚体可通过裂解接头而从片上被释放出来，产生一可溶性的被标记的寡聚体文库。
通过产生分子的可溶性文库可认识到其它优点。在任意一种球基文库中，小球的大小(数量)将会实际限制可装配的文库的大小。例如，可需要几克小球以装配一个含109个不同被标记分子的文库。本发明提供了一种合成被标记分子文库的改进方法，以使得人们可获得实用得多，大得多的文库。这种改进方法提供了一种手段，其中在混合步骤之前化合物从固体载体上释放，但在每次偶联步骤之前又连结于固体载体上。
在该方法中，被标记分子以一种可逆方式被固定于一固体载体上，在该方法的每一混合步骤中允许从载体上释放被标记的分子。在一实施方案中，通过一种超滤膜(适合的膜，参见如“Commercial Compatibilty Chart”在Millipore目录中，其表明了对用于合成方法的各种溶剂和化学品稳定的膜)提供此可逆结合。截留分子量约2,000至10,000 daltons的膜(如Amicon YM5膜)适于大多数文库，在偶联步骤中，文库的分子被膜保留，而偶联剂和其它试剂会通过真空抽吸穿过膜。在混合步骤中消除真空，以便分子混合。
在该方法另一实施方案中，在偶联步聚中可逆的共价连接被用于将被标记的分子与载体连接。合适的可逆化学连接例子包括(1)由，如硫醇化(thiolated)被标记分子和N-羟基-琥珀酰亚胺基载体提供的硫酯键，该连接作用可由NH2OH浓度控制；和(2)由如硫醇化(thiolated)被标记的分子和2-吡啶基二硫化物载体(如硫代琼脂糖，来自Sigma)提供的二硫键，该连接可由DTT(二硫苏糖醇)浓度控制。VI.分析方法
利用大的组合文库发现配体，强烈依赖于稳定的亲和敏感的生物化学分析方法的效力。本发明提供了大量与已编码的合成分子文库一起使用的新分析方法，该分子文库反正来也具有广泛的应用。例如，该文库可用于分析测定中以鉴别结合受体的配体，如与蛋白质结合的肽和核酸，与治疗的靶受体结合的药物，由抗体识别的表位(天然的与合成的)，以及识别各种化合物，具有药学，农业和治疗诊断应用。相应于所给的这些多种应用，有大量的分析方法相关于本发明。分析的两种重要类型，虽有某些重叠，包括小球基分析和可溶性分子分析。
然而通常这两类分析一般包括下列步骤。通过分析对文库进行筛选，其中对文库中每一不同的分子测定其与感兴趣受体结合的能力。该受体与合成分子文库接触，在受体和文库中分析条件下能与受体结合的任意分子间形成结合产物。然后通过相关于此分子的标记物检查鉴别结合分子，在一实施方案中，文库在结合条件下曝露于其中的受体是一种受体混合物，每个受体与特异于该受体类型的鉴别标记物相关联，所以结合分析之后检查两标记物。A.小球基文库的筛选分析
当在受体筛选中分离出特异的小球时，可通过各种方式分隔开球粒呈独立形式，包括无限稀释，显微操作或优选地流动细胞计数，在结合分析中用可溶性被标记的受体最有效地评估被束缚的配体文库，通过采用细胞大小的固体载体或小球，可使用流动细胞计数进行了灵敏度受体结合分析及快速球操作。
流动细胞计数，通常是指荧光激活细胞分选成FACS，被认为等同于为达到本发明目的所进行的“荧光激活细胞分选”或“荧光激活小球分选”。熟悉FACS方法的技术人员能很容易地实施本发明的分析方法，这里FACS应用于表达细胞表面抗原或受体的克隆的哺乳动物细胞。通常，这些分析测定包括标记有荧光标记物的受体与小球混合物的结合，该小球混合物显示了分子文库中各种分子。洗涤掉未结合的或非特异结合的受体之后，再利用FACS仪来分选小球并鉴别和物理分离有高度荧光的个别小球。参见Methods in Cell Biol-ogy，Vol.33(Darzynkievic2，2.and Crissman，H.A，编，Aca-demic Press)；和Dangel和Herzenberg，1928，J.ImmunolMeth.52：1-14，均在此引为参考文献。一旦所需的小球已被分离，人们例可确认标记物以例确定小球上所感兴趣的分子的特性(或分子结构)，组成，或合成条件)。
标准FACS仪允许小球(细胞)荧光分析速率为～104次/秒，并且当以单个球克隆模式操作时，分选速率会降低5-10倍。在分析非常大的文库时(如＞＞107个球粒)，在使用细胞分选仪分离个别小球之前，可用选择亲和性的一些预筛形式。例如，包有受体的亚微细粒大小的超顺磁颗粒经常用来从大的混合群体中通过磁激活分选亲和纯化特异性细胞(参见Miltenyi等，1990，Cytometry 11：231-238，这里引为参考文献)。为高概率探测极少有的结合情况，文库中每种不同的化合物均应存在于文库的许多小球上。对于大小为从10μm颗粒构建的已编码文库，假设有100倍的多余度，实际的上限为约1010～1011颗小球上合成108～109个化合物，使用较小的小球可制备出甚至更大的文库，但是常规的细胞计数器看来不能探测或操作远远小于～1μm直径的颗粒。当然，正如这里各处所注释的，本发明提供了这种小球在分子文库的合成和筛选中的各种用途。例如，通过使用本发明寡核苷酸标记物串联法，人们不必使用FACS技术来分选文库中的分子。
尽管如此，人们也不应过低估计用于本发明目的的FACS仪的效力。在本发明的一个分析方法中，被标记的分子文库合成于荧光小球上。该小球比细胞小，且由荧光材料组成。此文库与细胞悬浮液一起温育，此细胞是高水平表达所感兴趣的细胞表面受体的，如连结G-蛋白的受体。当然，人们还可以做许多对照实验，如在所有步骤中使用没有高水平表达细胞表面蛋白的细胞，以及利用这些对照确认错误的阳性细胞(positives)。
在任一种情况中，表达受体的细胞都能与具有受体配体的任一文库分子结合。使用FACS仪根据光散射或另一种荧光信号如来自细胞核内的信号能很容易地识别荧光标记的细胞，并将其从未结合荧光的文库小球中分离及从未标记的细胞中分离。分选后，检测与细胞相连的小球上的标记物，以确认特异于受体的配体，根据此用途，人们可通过如仅选择最明亮的细胞分选出最高水平表达所需受选择最明亮的细胞，并且可调整结合条件以使特异结合情况最大化。为区别开特异于所感兴趣的受体配体与特异于其它细胞表面受体配体，人们可检测与小球相关的标记物，这些小球结合有高水平表达所感兴趣的受体的细胞及非高水平表达的细胞。
本发明的方法也可使人们能够利用FACS仪分选在小球上合成的被标记的分子文库，该小球比当前使用的FACS仪所能分选的最小球粒要小得多。在此方法中，筛选已编码的合成文库在信号转换途径的有效活性。用几种修饰方法构建此合成文库：(a)小球为1μm或更小，且在FACS中不必是可分选的，这就允许更小的球粒用于一些实例中；(b)标记物是对胞内环境有抵抗性的(特别是对核酸酶有抗性的)寡核苷酸，硫代磷酸酯(physphorothioates)是实现此目的的优选物质；和(c)肽(或其它多种化学实体)通过一接头与小球载体相连接，该接头在胞内环境裂解掉。这类接头包括通过细胞无害的外部因素如光的使用可裂解的接头，和对胞内环境敏感的接头，如磷酸二酯键或二硫键，但在任一种情况下，可裂解的接头必须对平行合成过程是稳定的。
优选通过机械方法如brolish计划将文库小球导入报道细胞，在一些情况下，可利用导致内在化的生物化学介导的途径，但这种途径通常会导致不符合需要的细胞区室(即溶酶体定位)的掺入。一旦这些小球处在细胞中，所感光趣的肽或其它化合物就会释放出来。如果10μm的小球已证明具有容纳1010个肽(或其它)合成位点，且容量规模以体积表示，则1μm同样材料的小球将容纳107个分子的合成肽。如果所有合成的肽在10μm直径(体积为～0.5pl)的单个(球形的)细胞中被释放，那么将会得出～30μm的自由肽的浓度。此浓度可通过小球上的合成密度来控制，并且较低的装载密度会规定更为严格的筛选形式(即筛选活性更高的化合物)。制备受体细胞，在所感兴趣的途径激活或灭活产生荧光信号。通过FACS仪选择产生所需效果的个别细胞，并对仍连接于小球和含在细胞内的标记物进行扩增和排序，以确认有活性的合成化合物。
在另一实施方案中，采用巨球并用其筛选表达受体(即β半乳糖苷酶)的细胞群，该受体能够产生荧光或其它可探测信号，即通过裂解底物产生一种可检测的化合物。然后这些小球与细胞群混合，细胞群可与小球连接。如果用小球上的化合物刺激细胞表面的受体，那么便可产生可探测的化合物，从而提供了从未激活细胞中分选连接于小球上的激活细胞的基础。人们可使用合适的试剂(即未标记的或没被标记上的)最大限度的选择高亲和性配体。
当然有许多替代流动细胞计数的选择方法用以筛选和选择所感兴趣的分子文库。在一实施方案中，筛选一种编码合成文库，具有细菌活性，以发现能抑制细菌或任意其它微生物生长或杀死细菌或其它微生物的化合物，这些微生物能以二维形式铺平板，如病毒感染的细胞，许多真核细胞包括癌细胞，和一些原生动物。通过肽或化合物从其被合成的小球上的控制释放，可筛选相关的或不相关的化学结构的大文库，作用于琼脂培养物中的细胞。
此方法步骤如下：(1)在琼脂平板上对所感趣的细胞铺平板；(2)用另一层琼脂在细胞上面重叠辅层，其中第二层琼脂中以足以提供悬浮液的稀释度悬浮着带有合成肽/药物的小球，这样的例如使用毛细管可从固体琼脂上挑选出个别的小球；(3)从小球上初始释放肽/药物；(4).培养平板，以使肽/药物的扩散从小球被固定的琼脂扩至周围的琼脂中及下面含指示细胞的琼脂中；(5)读出来自个别小球的已扩散的测试化合物对指示细胞的生长/形态/表型的影响程度；(6)选择指示细胞指示出所需反应(如细菌菌苔死亡)的区带，并使用毛细管或类似工具选挑出含原始小球的琼脂区，其中测试药物从该小球扩散；(7)读码标记物，如通过对个别小球上编码材料的PCR扩增来读出，以确定给出所需反应的肽/药物的结构；和(8)可选择地化学合成适当的药物/肽，并证实所需效果。
有多种方式从小球中释放测试化合物，例如，使用TFA从小球上部分裂解肽/药物，并且允许裂解下的肽在小球表面干燥，这种形式使随后在水中(琼脂)中的重新悬浮允许肽/药物的释放以及将被释放化合物定位于特定小球周围的琼脂区。使用对小球环境的特定变化敏感的化学手段人们可将药物/肽与小球连接，其中这种特定的变化可由在琼脂上铺平板和指示细胞引发或在铺平板和琼脂固化后被引发，如光敏连接，硫醇敏感的连接，高碘酸盐敏感的连接等等，如果必要的话，这些化学试剂本身可被扩散入另一薄的琼脂重叠层中。这种释放化学过程必须与测试物质的完整性，小球上en-cryption的完整性及下部指示细胞的健康状况具有相容性。当然采用的特殊的释放化学过程也会依赖于用于合成文库的化学方法的类型及指示细胞的性质。特别优选的是筛选β-内酰胺抗生素文库的方法，用于鉴别新抗生素，这种新抗生素可能会杀死新发展的对已存在β-内酰胺有抗性素的细菌菌株，及优选筛选肽文库的方法，该肽文库是已知抗菌肽如瓜蟾抗菌肽的类似物的文库。
也可使用其它方法筛选小球基分子文库。可将亲和吸附技术与本发明文库一起使用。例如，小球的混合物可被暴露于受体被固定化的表面(参见PCT专利申请No。91/07087，这里引为参考文献)。洗涤底物从除去未结合的小球之后，便可使用能降低寡聚体/受体相互作用的抗体亲抗原性的条件(如低pH，酸处理或碱处理)洗脱结合于表面的小球。如果需要的活，可使用被洗脱的小球重新进行亲和吸附过程。这些方法及相关的变异体，如上述的磷选择的使用均可以多种方式实施；例如固体载体可以是装入色谱柱的树脂。
本发明的另一种方法中，将被束缚的化合物文库用作结构多样性的来源，所呈的形式适于一族相关分子的亲和性纯化，如药物学上令人感兴趣的受体族。通常，这种方法涉及使用一种被标记的束缚分子文库筛选另一种未被标记的分子文库。被标记的、被束缚的文库分子用作一种亲和性纯化试剂，筛选复杂的混合物可溶性蛋白，寡核苷酸，糖、抗体等。亲和纯化之后，通过洗脱适当的分离及鉴定方法来鉴别与组合文库成员多结合的分子。然后，将组合文库分为组合合成的化合物的小部分，通过必需的重复循环过程以少量实验次数准确地测定哪种化合物介导结合过程。
用相似的方式，使用组合化学文库鉴别和克隆的受体。许多受体是具有序列同源性(通常反映了来自一个祖先母体的多种进化形式)但呈现不同特异性/亲和性的蛋白质家族成员，其中特异性/亲和性是针对于一组结构相关的配体/同族受体的。受体家族(Rn)的每个成员都可代表针对特异药物作用的分离的靶，并且由此通过利用它们不同的性质即身体中的位置，特异性，与配体的亲和性等等来进行药物的发现和开发。如果鉴别出一个受体(R1)其结合性质足以令人感兴趣，以致于同一家族其它受体的鉴别将是有利的，那么便可采用下述方法鉴别与R1相关的受体在其结合位点的性质。人们首先鉴别与R1结合的配体，然后生产出结构上与该配体非常相关的被标记的组合化合物分子文库。
下一步，从认为能表达受体家族其它成员的细胞制备多核糖体制剂。这种多核糖体包含与mRNA结合的核糖体，在以新生肽至几乎完全制备好的蛋白质这一蛋白质合成的各个阶段此mRNA上带有下垂的受体。合成近乎完成时的受体蛋白会表达与一种或多种组合文库成员结合的特异的受体性质，使用束缚于固体载体的组合文库，通过与组合文库任一成员间的亲和力亲和纯化带有受体的多核糖体。这种亲和纯化可包括柱层析方法，从液相中批量分离固定化成分，或水溶液双相分离法；以分离带有连接受体的固相和从非粘附多核糖体编码受体的相关mRNA。
下一步，使用标准技术(逆转录酶等)从编码同源受体群的mRNA进行cDNA合成，并将cDNA群克隆入适于快速序列分析的载体中。根据可能的受体序列的现有知识及期望的序列保留程度，可使用PCR或另一种扩增方法扩增以该方法富集的cDNA。通过对适当数目cDNA克隆的，可鉴别与已知受体R1序列具有足够的序列同源性的cDNAs(无论是全部长度或不是全部长度的)，代表公认的相同受体家族(Rn)的其它成员。通过标准克隆方法，选择性地制备这些新cD-NAs的全长cDNA克隆(或其相关部分，如编码相关于配体结合的胞外区区域部分)，并通过标准方法表达这些cDNA(即在真核表达系统中表达为适当的可溶性或膜结合蛋白)。使用检测受体配体相互作用的标准形式，检测来自组合文库混合化合物的群体结合成个别化合物的结合。以这种方法可准确鉴定来自文库的那个化合物与新鉴别的受体结合。
例如通过有限稀释法或那些将细胞与偶联于小的超顺磁球粒的受体一起温育的类似方法，可物理分离个别小球，然后使用高功率磁力提取表达受体配体的细胞(参见Mil-tenyi等，1990，Cytometry 1.1：231-238，这里引为参考文献)。正如上所示，使用FACS可进一步分析和分选磁选择细胞。放射性核苷酸也可用于标记受体，这样可以通过选择被放射活性标记的小球来鉴别和分离小球。B.筛选可溶性分子
人们也可采用被标记的分子文库有效用于本发明新的分析中，其中配体在与感兴趣的受体结合之前被溶解呈标记的或未标记的形式。为筛选可溶性(不带有小球)被标记分子的特大文库，在弱亲和条件下优选使用亲和层析。例如，用含几百μg所感兴趣受体的10mL亲和层析柱的样品可筛选108个分子的30mg文库。寡核苷酸是该文库优选的标记物，其能很易被PCR扩增并克隆入商业可购的TA克隆载体(In-vitrogen，公司)该载体是DNA序列分析之前用于分选标记物信息的一种方便形式。此外，寡核苷酸标记物可按如上所述的方式串联起来，从而允许人们收集可溶性被标记分子库(pools)，克隆所选库的被串联的标记物，然后测定比标记序列鉴别所需的化合物。
使用固定化受体也可筛选可溶性被标记的分子。将被标记的分子与固定化受体接触并洗去非特异结合的分子之后，用各种方法中的任何一种方法将结合的被标记的分子从受体上释放出来。选择扩增标记的分子从受体上释放出来。选择扩增标记物，然后对其进行检定，解码以鉴别与受体特异结合的分子结构。使用一种通过与小球连接面被固定化的受体可分析测定溶液中的被标记的寡聚体，例如用一种荧光标记的配体重复测定。可将带有固定化受体的小球复原，并使用FACS分选小球以鉴别阳性小球(减弱的荧光是由于文库分子与被标记配体竟争而造成的)。然后将相关的识别标记扩增，解码。
在小球上可合成文库的可溶性分子；然后分析之前将分子裂解下来。在一实施方案中，分子文库的显微小球被置于非常小的个别室或孔中，这些是在硅或其它适合的表面上“毫微级制造”出的室或孔。通过将小球分散于足以产生每孔一个球粒的装载缓冲液中，使小球装载于小孔中。在一实施方案中，小球溶液被置于小孔上部的池中，允许小球沉降入小孔中。使用化学或热系统可完成寡聚体从小球上的裂解，但优选光裂的系统。所感兴趣的分子可从小球上裂解下来，在溶液中产生未标记分子(标记物仍连接于小球上)或在溶液中或产生标记分子。在任一种情况下，所感兴趣的分子从小球上裂解，但仍与小球和识别标记一起保留于小室中。
在一实施方案中，小孔的表面或部分表面覆盖有受体，在小孔中加入结合缓冲液和荧光标记的已知的受体配体，以进行配体的溶液相竞争分析，这里配体是特异于受体的。通过单层固定化受体的同焦图象可估计一实例中荧光标记配体与受体的结合。受体表面呈减弱荧光的孔表明被释放的配体与标记配体产生竞争，检查孔中呈现竞争的小球或标记物，以揭示竞争性配体的特性。
通过显微操作器从孔中取走个别小球，可选择性地对阳性孔的识别标记小球进行复原。另一种方式包含在小球生产过程中或标记过程中使用结合有荧光分子的小球，仅在阳性孔中使用合适波长的激光漂白存留的小球，然后将所有小球全部移去，并用FACS分选，以鉴别被漂白的阳性小球，之后相关标记物可被扩增，解码以鉴别与受体特异结合的分子。
在本发明另一实施方案中，采用相对较大的被标记小球，其中所感光趣的分子在一系统反应中从小球上被裂解下来。在该方法中，小球直径为50至500μm，容量相当于每粒球100至500pmol的肽，优选地如果构建肽文库，使用容量的为200pmol的100μm小球。这种文库的典型大小是从106至108，优选107个不同分子。文库被分为100个库，每库含约100,000颗球粒。例如在肽文库的情况下，从库中裂解某一百分比约25％的所感兴趣的分子，产生每1mL体积500nM的肽。
然后对初裂解的库进行竞争分析或功能分析测试。鉴别出具有最高活性的库，然后恢复原始中的存留分子，并将存留分子等分成100个库，每库1000颗球粒，重复进行此过程，直至每库具有一颗球粒，从该球粒读出标记物并鉴别出所感兴趣的分子。这种方法避免了Houghten法的再合成和框架限定，优点在于库是随机的而不是相关的化合物。由于许多低亲和力相关分子的累积作用，活性混合物的机会减少了。C.筛选天然产物文库
由于具有即可获得的自动高通量分析，现在在筛选天然产物时的限制条件首先是获得和操纵(分散，溶解，标记等等)样品的能力；第二是定性阳性样品的活性成份所要求的实际操作。本发明提供了产生和筛选天然产物的文库的方法，该文库提供了大量的呈易被筛选形式的样品并鉴别样品中活性化成份。该方法的基础是生物化学和化学多样性的结合，具有来自“天然产物”即来自自然的代谢作用的多样性，最简单的例子包括给微生物培养物补料肽收集物。每一微生物菌株会产生许多修饰的肽(代谢物文库)。因为每种培养物都会(潜在地)含有非常复杂的代谢物混合物，所以需要一种有效的筛选方法。
可采用几种途径，且这些途径可被正交分类为因子化的或被标记的，和可溶性的或被束缚的。为清楚描述，考虑作为原料的可溶性肽文库，将该文库的等份样与每种微生物发酵筛选程序中典型的菌株一起温育，且筛选典型形式的培养基，然后阳性培养物与文库的集合一起温育并再筛选，继续分解因子(factoring)过程，直至鉴别到产生最多活性代谢物的肽的输入，然后根据可能前体分子的知识进解活性代谢物的定性。因此，第一次筛选鉴别活性生物体，随后的步骤鉴别活性前体，最终通过标准分析手段鉴别活性代谢物。
然而在所有形式中，分解因子是最繁琐的过程，由切断合成产生的和从树脂上裂解下来自由的文库产生可溶性化合物，这些化合物用于细胞摄取和完整生物体代谢作用。然而，个别化合物的浓度相当低(相反地与培养收集物的多样性有关)，导致无效的酶转化和极低浓度的结果代谢物，通过生物产文库子集并将每一子集单独与每种微生物分离物一起发酵，可提高化合物的浓度。通过固定一个或多个位置并使剩余的位置随机化来构建子文库，例如，有500个五肽子文库，其使用了50个结构单元包含20个固定位置的所有排列。这些子文库中的每一个都包含125,000个化合物。标记文库的使用在便利程度和灵敏度方面其有很大的优越性，但对将化合物收集物暴露于代谢活性的方法，要求有所改变。组合原料不必仅仅是肽，但可由任意一种组合化学收集物组成。
寡聚体和其它分子文库可构建于在组合过程中，每步以识别标记物编码，这可通过与标记物直接连接和寡聚体平行合成来进行。如果寡核苷酸被用作标记物，那么复合体会相对大些，但仍小得足以插入细胞中，呈活性形式，这通过脂质体融合，电穿孔，溶剂透化等进行。一旦进入细胞中，该复合体将对与细胞的代谢机制，通过使用修饰的核苷酸和核苷酸连接可避免寡核苷酸标记物易受损害而降解。通过回收溶解细胞的培养物中的活性代谢物，筛选样品并解码标记物以揭示前体化合物。和活性前体一起进行的活性生物体扩大发酵将产生足够量的活性代谢物用于定性测定。通过小球上已编码组合过程制备的化合物文库可暴露于细菌，真菌，植物细胞等的溶解物中。以这种方式，避免在完整细胞中插入被标记复合体的需要，并且球粒上的许多分子中仅相对少量的分子需要进行检测(如在荧光激活结合分析测定中)。
本发明另一种有用方法包括使用一种微生物培养的产品作为另一种培养物的补料。以来自大规模培养物(～1升)的100个不同微生物分离物的收集体进行说明。通过过滤回收每一种培养物的上清液，并将其分为100个10mL的等份样。每一等份均以100株中的一株接种并温育。由此从100份微生物分离物中产生10,000个样品(代谢物的代谢物)。由差异甚大的种可将这种组合代谢的方法延伸为连续代谢：例如将微生物发酵产品与外来植物溶解物一起温育，或将植物组织的提取部分与真菌培养物一起温育。这些方法可作用：产生的化学多样性方法的任意一种产品都能用于这些连续代谢产品暴露步骤中。
在本发明的另一方面，通过产生组合标记的脂质体混合物来筛选天然产物多样性，每个脂质体优选包囊天然产物化合物文库的仅一种成份或一种简单的混合物。本发明允许同时分析1000个-10,000个化学化合物或天然产物提取物及分析100个色谱分离的馏分，这些馏分由带有阳性信号的天然产物提取物衍生。在这种关系中，“同时”的意思是在同一度管中与读出系统的细胞一起分析。
组合标记的脂质体混合物制备如下。对于来自库中的每一种单独的天然产物提取物或化学产品而言，制备分离的脂质体，该脂质体包囊水相中的试测物质，在包囊时特定的脂质体标记物被掺脂质体制剂中。可将脂质体冻干以便在低温下长期储存，这对收集物及收集位点附近的天然产物样品为储存很有益处，并且将脂质体冻干便于天然产物提取物呈一种适合随后组合实验的形式而长期储存。优选脂质体制剂中的类脂对所有样品是相同的并根据类型和组合物进行选择以产生所需大小和完整性的均一薄层的脂质体。试剂如海藻糖可在脂质体形成时被包入，以允许冻干及随后通过加水而重建完整脂质体。在包囊提取物/化学物质的标记脂质体产生/再生时，可使用高压技术，该技术允许包囊的水相体积大于由脂质体包裹的计算出的体积，从而能测试更大体积的测试材料，由此可读出细胞基的更大信号。
现存的脂质体技术便于结合有高百分比(＞80％)水相(与每种测试物质的使用效果相关)的脂质体的生产。可用各种“洗涤”方法除去未结合的水相。此外，可生产脂质体，其不会泄漏或改变包囊的水相(相关于标记的特异性和没有混合的被包裹水相)，并且可生产脂质体，其不会改变插在其类脂单层中的成份(作为标记物插入的糖脂/蛋白质抗原不会被改变)。
此方法可采用各种标记物，例如，标记物可以是(a)具有激发和发射性质的不同荧光团，这些性质允许每种荧光团在其它种荧光团或其结合物存在时可被检测-荧光团可被选择分配入包囊的水相中或重建脂质体的膜相中，面向外部；(b)不同的稀土元素的金属阳离子，其通过原子吸收光谱可被识别-稀有金属原子将被设计为盐形式分配于重建脂质体的包囊水相中；(c)不同的抗原，根据需要通过其与合适的单克隆抗体和初级/二级荧光探测抗体/荧光团的特异反应来识别这些抗原-在蛋白质，糖蛋白和/或糖脂上的抗原可被选择分配入重建脂质体的膜相中，面向外部；和(d)抗原，荧光团和/或金属离子的结合物，其能大大提高用于筛选的可能信号的数量，标记不同脂质体的附加水平增加的数目可来自不同水平的荧光团/金属离子/抗原的使用，由此可鉴别出信号混合物中每种成份的不同“数量”。
也可采用一种通用的荧光标记，其为所有脂质体共有，可从那些未与脂质体融合的细胞中快速选择出与脂质体融合的细胞。此标记物与任一用于个别脂质体制剂的组合标记不同，并且其与产生脂质体的类脂，信号标记，和药/天然产物的水溶液样品在脂质体产生时进行混合。也可采用荧光标记，其在高密度时自动猝灭(即在脂质体膜中)，但在脂质体融合和在细胞膜呈现荧光。根据脂质体与细胞的融合方式，例如也可结合入一种病毒起点或糖脂的融合蛋白，其将介导脂质体与细胞的紧密粘附(依赖于凝集素类粘附过程，由适当的受体介导，受体是根据需要导入用于读出的细胞系)。这类元素不会影响脂质体-脂质体的相互作用(所避免发生的情况)，但可提高脂质体-细胞融合的效率。
该方法可利用细胞读出系统，使用一种在启动子下游含报道基因(如荧光素酶)，β-半乳糖苷酶的细胞系，这里启动子在应答外源激素或配体如类固醇，细胞因子，前列腺素，抗体，抗原等等被加入到细胞中时被活化。活化配体与细胞表面受体或细胞内受体的结合激活一级联信号，其最终导致应答启动子的激活及信号基因的转录。信号蛋白的表达导致从个别的被活化细胞中产生信号，这些细胞可被定量检测。在寻找化合物时，该化合物作为拮抗剂作用于胞内信号转导级联的任意一部分，可通过加入外源信号激动剂(细胞因子，激素等)对细胞的整个群体进行预处理，并且在脂质体融合之后测量在个体的细胞基础上信号输出降低。在寻找化合物时，该化合物作为激动剂作用于胞内信号转导级联的任一部分，不必向细胞中加入外源信号，并在脂质体融合之后，可测量在个体细胞基础上的信号的出现。
标记的脂质体混合物与大量过量的读出细胞混合，过量细胞数目是至关重要的，在脂质体一细胞融合之后仅产生下列产品：(i)不与脂质体融合的细胞；和(ii)与一个脂质体融合的细胞(受体细胞)。这一步有效混合是很必要的，可使用连续搅拌或线性流动的细胞悬浮液来达到有效混合，其中将脂质体混合物慢速加入到细胞悬浮液中。用标准方法引发融合，如加入PEG或使用高电压，如果需要，可通过在细胞-脂质体膜中包含入融合剂或配体-受体识别对以增强融合。融合步骤有效地在受体细胞中加入单一脂质体的水相部分。由此，天然产物提取物水溶液，来自化学库(inventory)的测试化合物或天然产物提取物的层析分离级份现在便能在胞内信号转导途径的任一点起作用。融合步骤也可向个别受体细胞中加入特异性标记物，该标记物为特定测试化合物样品提供信号。如果那些标记物原来存在于脂质体的类脂膜中，则现在这些标记物分布于受体细胞的外层细胞膜中。此位置的抗原易接近特异性单克隆抗体的表面(panels)。原来存在于特殊脂质体水相中的稀土金属离子现在存在于受体细胞细胞质中。融合步骤也可加入共有的识别细胞的脂质体标记物，这些细胞原是受体细胞，来自那些没有参与脂质体融合的过量细胞。标记物可以是从脂质体膜移向受体细胞膜的荧光团。
下一步，细胞、与个别脂质体融合的细胞和任意一种未融合的脂质体的混合物，与外源配体一起温育(如在测试拮抗剂的情况下)或不加任何物质进行温育(如在测试激动剂的情况下)。使用限定浓度和温育时间的对照化合物来确定这一温育的时间。
优选的使用FACS选择所感兴趣的化合物(细胞)。例如可先使用前面或侧面光散射从任意未融合的脂质体中分选细胞(受体细胞或非受体细胞)。大的细胞可很快从小脂质体中分离出来。下一步可从那些不是脂质体受体的过量细胞中分选是脂质体受体的细胞，是受体的细胞带有共有的脂质体衍生的荧光标记，而非受体细胞带有的这些标记是非荧光的，当然这一步骤是可选择的，但是如果将其作为预分选步骤进行操作，会得到通常多数细胞的分离，这些细胞与作为受体的少数细胞的随后分析测定是不相关的。为确证拮抗剂的特性，可在报道蛋白(如β-半乳糖苷酶或我素酶)发射光的基础上进行分选，从少数负荧光细胞或低荧光细胞分离出多数正荧光细胞(通过早期加入外源性配体来抑制这些正荧光细胞)。后两种细胞类型由包囊于特定脂质体的化合物的假定拮抗效果产生，这些特定脂质体已与这些个体细胞融合。为确证激动剂，可在报道蛋白射光的基础上进行分选，从少数正荧光细胞分离出多数负荧光细胞，后者细胞产生于脂质体衍生的化合物的假定的激动效果。
在某些实验中，根据上述标准可将所有的感光趣的细胞作为一个群体进行分选，并用标准FACS方法收集偶然性细胞作为克隆个体。可将这些个体细胞作为单一细胞进行分析，分析其所带有的特定标记物，准确确认介导所需效果的特殊脂质体。在其它应用实例中，可分析测定标记物在整个被分选阳性细胞群体中的分布，并且根据实验设计方案及插入来自不同时间/地点/库的样品中的特定标记物，在第一次通过时能确认整个阳性细胞群中标记物类型的多样性。
通过适于所用的特殊标记物结合物的方法可对收集的单个细胞或细胞群进行分析，用FACS和/或传统的分光光度法可对荧光标记物进行分析。通过适当标记的单克隆抗体的加入和ELSA，FACS，放射性同位素或发光辅助分析可对抗原标记物进行分析测定。通过原子吸收光谱可分析测定金属离子标记物，对标记物解码后，仅以在第一次通过时产生阳性结果的那些脂质体的混合物重复进行测度，或使用向分离的细胞样品中加入的每一所感兴趣成员的纯脂质体进行重复测试。
本发明的这些及其它方法可以自动化形式进行，以实施本发明的操作，如下。VII.仪器
在某些实施方案中，一些单体(如氨基酸)的偶联步骤会要求相对长的温育时间，由于这个原因及其它原因，使许多单体平行加入的系统是合乎需要的。本发明涉及自动化仪器，用于产生和筛选被编码的合成分子文库，一种优选的仪器，能同时进行50至100或更多个平行反应，描述于1993所11月2日递交的美国申请No.08/149,675中，这里引为参考文献。这一装置能够在程序控制下，将反应混合物或合成反应的固体载体的料浆分布于各个通道中，进行收集，混合及重分布。
然而，一般情况下生产标记分子合成文库的专门仪器，如肽合成仪，都需要复杂的管道系统，同时还需大批量的单体池/及标记物，且往往伴随各种偶联反应。由于标记物的分配能力，它将一些简单的指令转化为适当的探针混合物讯号并因此指导混合物质的分配。由单体合成的产物，按照需要，在指定的混合物中分配。反应的启动，温度及时间控制功能均由系统提供。经过适当的设计，该产品也可用作多途径肽合成仪，能生产出1～50毫克(粗产品)达100种不同的肽段供分析之用。参见专利文献91/17823，再次引用仅供参考。
典型的该仪器主要由以下几部分组成。(1)各种贮存、混和及运送合成产物(如肽段及寡聚核苷酸)的装置：(2)一个封闭的反应室，各种反应物在此不活动的环境中发生各种复杂的反应；(3)一只封闭反应容器板模；(4)引导反应物流向各自反应器的装置；(5)收集和分离微型小球(0.1～100微米)的装置；(6)在每个化学反应完毕后冲洗该反应器中小球的装置。反应器的板模可有好几种设计方案。比如，反应器可置一个套环中致使其可按照一个中心轴旋转(相当于一个离心机)，也可以将其置于-12×8的板模(96孔微滴定平板格式96-well microtiter plate format)中。这任何一种设计都将使反应物及其产物运输、抽吸(aspirstion)的自动化变得简单易行，而且传递功能(transfer functions)在某些方面也有很高的应用价值。
用于粒子的收集及再分配系统也有好几种设计方案。例如，小球可悬浮于一适当表面张力及浓度的溶剂中以便于自动吸液装置(pipetting in strument)能将游离小球转化为一个联合的反应器。混合以后，这些小球可通过同样的自动吸液装置被重新分配到反应器中。同样，小球也可通过一特定有阀的反应室将其交联起来。阀门打开时溶剂流入，致使小球变成一个交联的容器。混合以后，再通过与前述流向向反的溶剂流致使小球重新分离。
在另一实施方案中，小球也可通过顶部开口的压缩式(closely spaced)反应器将其交联。浸泡反应器也可以使小球混合。如果小球带有磁性，那么应用一定的磁场，使小球再通过反应器的底部，可使它们重新得到分离。非磁化的小球可通过真空抽吸(vacuum suction)使小球通过反应器底部而使其重新得到分离。在其它的实施方案中，就是将小球置平板上，然后在上面覆盖一“切刀”(“cookie-cutter”)形的装置以使其各部分得到分离，下面将有更详描述。
洗球系统也可有好几种设计方案。小球可通过输液装置(liquid delivery)及抽吸管道系统来加以清洗。每个反应器都配备有自己的一套管道系统，或者具备一个适合各种反应器的清洗管道系统。在后一种情况下，移液及抽吸管道系统可以安装在一个自动化的臂上以对每个反应器能单独起作用。可运用离心，磁化小球或一定的磁场等手段将每个反应器中的小球制成球形小体。反应器的底壁可镀上一层惰性的膜以使反应物及其产物可用真空吸收器将其清除。同样，使用一种允许一个持续流体穿过反应物及清洗液的反应器，即反应器终端设有路配式装置(1uer fittings)及滤膜，也可以使反应内容物得以顺利清除。
任何一种自动化多功能仪器在使用上都要受到一些很重要的限制。因为该体系依靠各个单独的反应室而起作用，每个反应室都必须和反应物运输系统及一“母体罐”(″moth-er pot”)相连。小球被泵到罐中进行混合后又重新分配到各反应室，以便于以后的单体添加得以有条不紊地进行。由于单体或其它一些构建单元数量庞大，且在一个庞大的反应系统中分离小球及反应物都比较困难，故该类仪器在实际应用中受到了局限，使其中同时产生的反应不到100个。
本发明避免了因混和及再分配小球而将其在不同反应室内来回泵的必要，简化了反应物运输物运输手续，并使少量小球的分离准确而易行。最基本的设计主要包括一个平板，平板表面上带有一系列的反应“位点”；该平面或者是水平的，或者带有一系列小孔以形成反应位点。比如，反应表面可设计出256个反应位点，以16×16点阵排列。每一反应位点就是平板表面上的一点或一个小孔，一小批合成的小球将被吸附于此处。吸附力可由磁力、真空过滤(vacuumfiltration)、伴随被动机械分类的重力或其它一些简单手段得到。首先将稀释的小球悬浮液均匀地在平板表面涂成一薄层，然后同一定的吸附力将小球集中到每个反应位点。
当小球被集中到一定反应位点以后，应用隔离工艺将每个反应位点制成一个隔离的反应室(暂时性的)，如图29所示。通过一种变通手段，隔离装置可永久性地吸附于平板表面，以形成浅的反应小孔。反应物被运送到每个反应室，小球释放到由反应物而形成的悬液中，反应就会进行。条件理想时，小球还可被重新吸附到平板表面并将反应物清除。当所有偶联反应循环步骤完成后，反应室隔离体系也随之清除，小球被收集到反应位点上方的小池里保存。
小球的混和是由在反应池里诱导产生对流而得以完成的，然后小球被重新吸附到平板表面以进行下一轮新的偶联反应。随后的步骤，包括冲洗步骤是通过类似方式完成的。反应物的添加及清除是通过自动吸液及管道系统联合来实现的。特定反应物的添加(如：单体)可用自动多功能吸移管管理器(multi pipettors)来完成。普通反应物的添加及清除可由一固定管道系统来完成。该系统在每个反应室无需阀门。在反应室隔离装置安装之前或清除之后，一些常规工序如清洗工序可以直接在小球上进行(on the beads en masse)。
大批量单体及其它结构单元的使用给编码工作带来了额外的负担。在一寡聚核苷酸标记物编码过程中，一基本的1000单体序列需要一个5碱基序列来标记每个反应步骤；超过1024单体序列就需要6碱基序列十为之编码。为减少合成仪管道系统的复杂性(即减少特定反应添加步骤)，本发明提供了一种特定的编码策略。为说明此方法，现以16×16反应板为例加以说明。这种排布可使256个不同的反应同时进行。应用多碱基偶联为每个反应单独编码是一项十分艰巨的任务。
这种点阵排布具16行、16栏，每个点都有一个唯一的地理位置。每行位点可标记为一组，所有16可被特征性地用2碱基密码子(“亚密码子”)加以编码。一条形板或槽形块可用作2碱基添加的基板，以形成16个反应室(注意，偶联的碱基是作为单体的磷酰胺化产物(phosphoramidites)，而不是作为二聚体)。参见专利文献No.WO93/09668，再次引用仅供参考。这种反应位点定位形式与其它的类似；例如，可用光学方法标记小球，参见美国专利No.5,143,854，其中的条形覆盖法(striped masking process)，这里引用仅供参考。如果使用平板或槽形块，那么平板必须降至与网格合成表面同一水平面上，以使合成分子文库过程中，使每个反应得以分开。
在标记反应过程中，小球不能释放进去。然而，它们的空间分离一直要维持到下一小步完成为止。当行的每个反应位点被亚密码子标记后，将板上升且旋转90°，然后降低以形成覆盖栏的条带。16栏又重新被2碱基亚密码子标记，这样，256个反应位点都被4碱基“超密码子”(“supercodon/)特征性地标记上。通过识别反应位点位置，超密码子就能给出每个反应室所要加的单体。
VIII.平行偶联合成反应仪(Apparatus for Parallel ouplingSynthesis Reactions)
总体来说，本发明为合成多种多样的物质提供了一个固体底物(solid substrate)。例如，该仪器使用了上面所述的小球。下面就以肽合成为例介绍一下该仪器的基本情况。
首先它将使底物多元化(plurality)，用“S”表示，合成反应将可以在多元化底物上进行。在发生偶联反应的联系分子“L”的帮助力，使底物能有选择地提供。底物被分配后与各种单体起反应，比如与“A”及“B”单体反应形成以下的底物形式：
            S-A      和      S-B然后，底物又重新组合、混和并再次分配。经过混合及分配步骤后，就形成两种或更多的底物形式，每种形式中既包括S-A又包括S-B。
其余的偶联反应便可照此进行。例如，上述的聚合产物可再与单体C及D反应以形式以下的产品形式：
         1.S-A-C     S-A-D
         2.S-B-C     S-B-D通过上面简单的例子就可看出该合成技术可在短时间内得到大量不同的底物形式。通过对合成这类分子多种收集物的周密设计和(或)通过对该底物标记物提供平行合成方法，如上所述，这些底物将会有极高的应用前景。在一特别的实施方案中，该发明提供了一些能有效生产各类用途底物的设备和方法。
A.概说(General)
图1所示的是一能合成多种收集物分子的设备。该设备包括一个母体混合器200，通过一普通项式多阀箱体(topcommon manifold)212及215，221-229管道与一多元化反应器201-209相偶联。212箱体又与221-229及215管相偶联。反应器201-209也通过111-119阀及241-299管选择性地与添加单体的反应物供应池231-239相偶联。压力传递系统(pressurized dilivery systen PDS)265分别通过管260及256与母体混和器200及反应器201-209相偶联。
当小球悬液从母体混合器200转移至反应管201-209时，合成反应即开始。当129阀打开(所有其它阀关闭)时，小球悬液从母体混合器200通过215管进入顶式箱体212。然后小球悬液通过221-229管在201-209反应器中进行分配。从单体库231-239选出的反应物通过各自的管241-249进入各自反应器201-209。这样，在有小球的201-209反应器中，偶联反应便发生。
图1所示的压力传递系统265通过管260与母体混合器200相偶联。当阀门10及通风阀90打开时，该系统通过管260将受压的反应物从系统运到母体混合器。
压力传递系统265也通过管256，分离阀100，低位箱体阀101-109，低位管271-279，注射阀111-119以及管241-249与反应器201-209相偶联。为了将反应物从PDS265选择性地运到反应器201-209，受压的反应物通过打开的100阀时入管256及一低位多阀箱体214。然后，受压的反应物在压力条件下通过选择性打开的101-109阀，针对性地上升到管271-279。然后反应物再通过选择性打开241-249管进入各自的反应器201-209。
例如，为使反应物从一给定的单体池231运送至反应器201，一定量受压溶液被从PDS265被压向管256，然后进入低位多阀箱体214，进而进入管271。在一个适当的时刻，一定量的单体反应物从单体池231注射到正在流向管271的溶液流中。注射单体过后，从反应池231流出的混合液通过241管流向反应器201以参加下面的偶联反应。
为了用单体池406-412中的单体选择性地标记反应器201-209中的小球，经过打开的阀门4-7，一个受压的来自库406-412标记单体反应物溶液流进入-PDS265的普通型多阀箱体255。然后，受压标记物单体及一适当的压力溶剂流通过打开的100阀及256管进入低位多阀箱体214。受压的单体标记物及其适当的溶剂流上升到各自的271-279管，然后通过各自打开的101-109阀进入反应器201-209，在此将发生小球标记反应。
经过理想的单体和/或标记物添加反应后，反应器201-209的小球悬液可回收到母体混合器200供重新聚合和混和。为使小球悬液从反应器201-209回收到母体混和器200，可通过打开的122及101-109阀，从管250向小球悬液中吹入氩气以使其增压。100及110阀关闭，固此受压压小球悬液便流向管221-229，然后进入普通型多阀箱体212，再通过打开的129阀进入215管，最终进入母体混和器200。在200混和器中，小球悬液重新混和，然后再重新分配到反应器201-209，以为更进一步合成其它分子作好准备。
在另一种设计里，201-209的每个反应器之产及与母体混和器200之间，可安装上一多功能三通阀门(plurality ofthree-way vessel)。该阀门最好安装在普通顶式多阀箱体212中。通过这种方式，一些反应器可与母体混合器200分开。这对为进一步合成而重新分配小球悬液将特别有用。例如，小球最初被分配到反应器201-209用于合成反应，然后回收到母体混和器200中，在此重新分配过程中，仅一部分3通道阀门打开，比如这样，仅仅反应器201、205及209能够进入小球悬液以供进一步合成之用。
图1也显示了非同心搅拌器(nonconcentric agitators)280及285，分别与一顶式反应器托架290及一底式反应器托架295相偶联。顶式反应器托架290是不可动的，但底式295可随非同心搅拌器与涡形马达(vortexing motor)300联合，从而使底式反应器托架295及底端反应器201-209中产生搅拌力。由于托架之间的管道十分灵活，故搅拌力使反应器201-209中的反应物产生涡流，并因此促进合成反应的进行。
顶部普通多阀箱体212在一端与215管相连，这样便提供了物质在母体混和器200及多阀箱体212之间运输的管道。在另一端，多阀箱体212与126相连。管216通过121阀向箱体212中通入高压氩气，同时也使箱体212通过120阀能够向其内部通气。
两只功能强大的传感器90S及99S被安装在母体混和器200的外表面，以探测其中的液面高度。如果流体存在于伟感器的测量范围(detection envelope)之内，传感器将打开。反之，传感器将关闭。
传感器101S-119S为光学传感器，主要对半透明管中流体的存在与否进行监测。当一股流体存在于管中，传感器将打开。反之，传感器将关闭。
同样地，一只声学传感器120S也监测流体的存在。流体，包括小球悬液在内，流经管道时将被其监测到并将传感器打开。相反，当装有声学传感器的管道里无流体存在，传感器120将自动关闭。由于光学传感器在有些条件下不能可靠地区分半透明空的聚四氟乙烯管和含有小球悬液的同样管道，声学传感器的应用则弥补了这一不足。此外，虽然传感器120S使用了声学传感器，但任何其它能够区分出空管及含有流体或小球悬液管的传感器均可使用。因为声学传感器较之于其它类型传感器，如光学传感器要贵得多，故每台合成仪中仅120S一只声学传感器。
反应器库(bank)的设计使母体混和器与各反应器之间只需一个或更少的阀门。这种设计有其独到的优越性。因为阀门的机械打开和关闭常会造成对脆弱小球及合成多聚体的损害，这种设计大大降低了此过程的损坏程度。同样，如果小球体积过大，它们常被阻滞于阀门周围致使系统运转受阻。此外，众多阀门的来回关开将会产热使体系温度升高，这对一些温度敏感性的聚合分子将会产生不良的副作用。因此，减少小球悬液通过的阀门数是个十分有利的举措。如果129阀不包括在内，可利用增压技术来防止流体在母体混和器与反应器库(reaction vessel bank)之间的流动。
如前所述，上例中所说的阀门当有在工作状态时都是关闭的。没有一个特定的打开指令，阀门总是处于不工作的关闭状态。
B.机械文件
从机械角度，该自动化合成仪可大致分为三个系统：反应器库、母体反应器及压力传递系统。如上所述，偶联合成反应在反应器库的各反应器内进行。母体反应器负责来自各反应器小球的容纳、收集及混和工作。压力传递系统负责适当溶剂和/或适当反应物溶剂浓度溶液的合理运送，将它们在合成反应的一定阶段分送至母体反应器或各个反应器库。此外，整个体系是在封闭状态下工作的。必要时的增压往往是通过通入惰性气体如氩气来得以实现的。氩气由于容易得到及其化学惰性，故为一种理想的增压气体。
为了叙述方便，现以一特定的自动化合成仪为例来加以说明。该例将涉及在小球上合成一套多肽。小球被标记以易识别，接着是每个氨基酸与四个碱基单体：A、T、C及G的偶联反应。
然而必须认识到自动合成仪既不仅仅局限于上述特例中所描述的特定多聚物的合成，也不仅仅局限于标记多聚物的合成。以下描述中以多肽合成及以上述核苷酸标记小球反应为例，该例中一个反应器库(reaction vessel bank)含有9个反应器。但这只是一个特例，反应罐中反应器的数目并没有固定的上下限。实际上，合成仪的模块化构造(modular con-structien)使反应罐的添加变得简便易行。此外，许多其它分子及标记物也可在小球上进行合成，或者反应体系中无须标记物的存在。
1.压力传递系统
前述的压力传递系统265是经特殊设计来完成多肽的合成，其可再细分为：多肽合成池、小球标记池以及运送阀。
a.多肽合成池
该例中除需要9种氨基酸单体作为合成多肽的原料外，其它几种“常规”(common)试剂也在合成中得以应用。例如，在一典型多肽合成反应中，主要用到下列试剂：
                           表2功能                    化学成分脱保护(Deprotection)    含10％哌啶的DMF溶液激活(Activation)      0.2M HBTU及0.6M DIEA
                  溶于3∶1的DMF/DCM混合液帽封(Capping)         乙酸酐的THF溶液
                  n-甲基味唑的THF溶液清洗液                DMF
                  THFb.标记小球库
在该例中，小球被选择性地标记。在另一例肽合成反应中，小球被四种核苷酸A、T、C和G标记上。除了四种苷酸以外，在标记物合成中还得用到以下溶剂及反应物。
                    表3功能                  化学组成脱保护                三氯醋酸的DCM液氧化                  碘、三甲基吡啶，水及MeCN激活                  0.5M四唑MeCN液帽封                  乙酸酐THF液
                  N-甲基咪唑THF液清洗                  NeCN
这些核苷酸反应物装于足够大体积和数量的小池中以使自动合成仪完成标记物的合成。
如图2所示一代表性的400池容纳表3中的MeCN。表2、表3两个池都连有2根导管。如图2所示，管450内装有高压氩气，以将小池中内容物压向452管。有些设计中，反应池总是处于高压状态。而另一些设计中，仅在需要池中物质时，氩气管通一些特定的可控阀门向其中吹气升压。
c.运送阀
图3详述了一个典型3-通(3-port)螺线管阀。如，新泽西General Valve Corp.of Fairfield生产的2-110-900型阀门。此外，图3所示的3通阀门，比如阀门4从412池中运送反应物。图1的PDS265也用是的三通阀门。该例中所用的三通阀门包括第一通道454及第二通道456，还有一个贯穿其本身的通道458，与一通道454及二通道456都有物质交流，且可使流体在一和二通道自由流动。如要形成普通型多阀箱体462，那么，此方说二通道456就必须和另一三通道阀的第一通道454相偶联。其它三通道阀门还有图1所示的阀门5。其内部的一只螺线管通过线190对控制信号。
作出应答，并选择性地打开第三通道460，使其与458通道发生物质交换。图1中阀4的第三通道460与412小池相偶联。
为了控制好反应物从412小池流向多阀箱体462，载有高压反应物的线管464与阀门4的第三通道460相联。在适当的时候，螺线管打开，致使第三通道460与458通道发生物质交换，籍以使受压的3通道460内的反应物注入4阀的458通道并进而进入普通型多阀箱体462。
图4所示一典型开关型2-通道螺线管阀10。比如新译西General Valve Corp.of Fairfoield生产的2-17-900型阀门止适合于此。如图4所示，阀门10包括468和470二个通道。阀门10也有一螺线形管道贯穿其中，使其与第一能道468及第二通道470发生信息交流，从而使液体或气体能在两个通道之间流动。阀门10内的螺线管，通过472线对控制信号作出应答，籍以使第一通道468选择性与第二通道470发生交流。当阀门10的一个通道连上一个带有高压气体或液体的管道时，阀门10便可用作控制流体从该通道流向其中其它通道的开关。
图5更为详尽地描绘了一个压力传递系统265，其中有一方面与本发明十分一致。图5表示出了一个多阀箱体0-23号24个阀门。把2通道及三通道阀门的第一和第二通道绞连(daisy-chained)以形成普通型多阀箱体让反应物流过。三通道阀门1-7，9-12以及14-22，比方说在结构上与图4中的阀门10比较类似。普通型多阀箱体以下几部分构成，具贯穿管道的三通道阀、开关(on/off)阀以及相邻阀门间的偶联管。正如前所述，三通道阀门的第三通道受阀门内的一螺线管控制。三通道阀门的第三通道与反应物或溶剂池的导管相连，从而使反应物或溶剂能够在PDS265中来回传送。同样，第三通道还可用作一个出口，比如，它可将反应物运送到反应器组中的阀门100。两通道阀门主要用于隔离及通入氩气。
如图5所示，24个阀门被安装在三个分离的反应器组中以节省空间。图5中的压力运输系统表示出一导管480将阀门左边的反应器组与中部的反应器组相联。表4列出了运输系统中所用的阀门，并对一些典型的阀门类型及受阀门控制的反应地加以说明和解释。
                      表4阀    型号       池        池内含物0    开/关       -)        氩1    FWO60       400       MeCN2    FWO60       402       1％三氯乙酸的DCM溶液3    FWO60       404       四唑4    FWO30       406       C5    FWO30       408       T6    FWO30       410       G7    FWO30       412       A8    开/关9    FWO30       414       废物10   FWO30       416       母体反应器底部11   FWO30       100       RV库12   FWO30       420       废物13   开/关14   FWO60       422       顶端母体15   FWO60       424       碘、可力丁、水、乙腈16   FWO60       426       乙酸酐的THF溶液17   FWO60       428       N-甲基咪唑的THF溶液18   FWO60       430       派啶19   FWO60       432       HBTU20   FWO60       434       DIEA21   FWO60       436      乙腈22      FWO60     458    DMF23      开/关            氩
例如，阀22被表明是一种FWO60阀，即具有60/1000英寸通行管道的快速冲洗(FWO)三通道阀。而且阀22控制着压力池438中的一种反应物，如表4所示，该池含有DMF。再如，阀23是一种开关阀，它控制着从氩镤应源(未给出)到PDS265通用箱体中压缩氩的流量。
图5表示与阀0相连的供从一端给PDS265通用多阀箱体加压的管486。另一管486是与阀23相连并且从另一端用氩给PDS265通用多阀箱体加压。
作为说明，在一个多肽合成降解循环中的加压投掷系统265的操作被描述如下。对于多肽的降解，10％哌啶的DMF溶液被运至反应器(RV)库中的反应器中。表4表明阀18允许来自池430的哌啶流。因此，阀18需要有出口以允许来自压力池430的哌啶流至PDS265通用多阀箱体中。为了迫使溶液进入RV库阀11，关闭阀8而打开阀13以迫使加压哌啶进入开放的RV库阀11。
如图5和表4所示，RV库阀11和母体反应器阀10被安置在阀串的中心位置。这种安置有利于减少多阀箱体内这些阀与某一特定试剂阀间部位的长度。因此，需要较小量的试剂来填充该多阀箱体部位。隔离阀8和B可被关闭以防止试剂从多阀箱体的一端喷入RV库阀11或母体反应器阀10或者不必要地进入通用多阀箱体的一部位。
表4也表明阀4-7和9-12是具有大小为30/1000英寸通行管道的3通道阀。相对而言，多阀箱体的其余阀具有大小为60/1000英寸的通行管道。管道通行交叉部位的减少更减少了多阀箱体各自部位的体积。因而，需要用来填充多阀箱体的试剂更少。
例如，核苷酸A、T、C、G相对很贵。因此很值得让所用试剂量保持在所需的最小量。核苷酸阀4-7被安置在靠近RV库出口阀11的地方以保持核苷酸阀和RV库出口阀11间的距离很短因而所需试剂量低。沿着从任何核苷酸阀至RV库出口阀11的通路上的多阀箱体的交叉部位也保持很小以便进一步减小存在于多阀箱体中的核苷酸试剂量。实际上，图5的管480和多阀箱体中核苷酸阀和隔离阀8之间的部位具有被减小了的30/1000英寸的交叉部位。
C.反应器库
图6表示了根据本发明一个方面的一个简化反应器组500。为了便于说明，溶液流经的管道已被部分地删去了。反应器库500包括一个顶部托架(bracket)502、两个侧面托架504和506和两个底座508和510。顶部反应器托架290连在侧面托架504和506上。一个涡流马达300安在顶部反应器托架290上以便通过传动带521给反应器201-209复合体提供动力。反应器201-209的底部安在反应器托架295的底部上。托架502、504、506、290和底座508和510可由任何合适的材料制成。考虑到机械制造、强度和轻重量，在本发明中用铝来制造上述所提的托架。
底部反应器托架295通过轴套520中的两个非同心轴280固定在顶部反应器托架290上。非同心轴280通过顶部反应器托架290上的孔(未标明)可旋转地被安装好。通过传动带521将非同心轴280和涡流马达300相偶联。如后面将要讨论的，非同心轴280将涡流马达300提供的旋转力转移成驱动力以使底部反应器托架295以环型形式而运动。该环形运动对反应器201-209中的内含物产生涡流效应。由于反应器201-209中的每一个都在各自的底端与底部反应器托架295相连，因此所有反应器都被同时而一致地驱动。
图6也显示了底部托架522。底部托加522是连在侧面托架504和506上，并且也可由任何合适材料制成，包括铝。氨基酸池231-239安装着底部托架522下。氨基酸池231-239中的氨基酸试剂被用作合成特定实施方案中各套多肽的基本成分。为合成多肽本发明考虑使用九种不同的氨基酸单体。
图6也显示了安在侧面托架504和506上的隔离阀托架526。隔离阀托架526包括一个代安置较低多阀箱体阀101-109的管道530。如图6所示，在本发明中每个低多阀箱体阀101-109都固定在管道530中。然而，低多阀箱体阀101-109也可使用市场上可得到的固定金属器具或其它固定方法来被固定在隔离阀526上。较低多阀箱体阀101-109是三通道螺线管阀并且是与以前讨论的与图3有联系的3通道阀相同。如反应器组500中所使用的，低多阀箱体阀101-109中的通行管道偶联在一起以形成一个通用低多阀箱体214，来自加压投掷系统265中的溶液通过它而流动。
三个2通道阀100、110和122也在图6中显示了。九个阀101-109控制着溶液从低多阀箱体214到九个反应器201-209的流动。在通用低多阀箱体214的第一末端的隔离阀110开口于一废物线(在图6中未显示)。在通用低多阀箱体214的第二末端的隔离阀100选择性地禁止或允许溶液从PDS265流向箱体214的其余部位。一个可供选择的隔离阀122供应局部氩压力以协助溶液运到或运自反应器组500的各部分。
在另一实施方案中，这十一个隔离阀100～110和122以一个11阀组的形式提供，正如由利福尼亚州Foster City的ABI所提供的模型P/N601374那样。该阀组已预组装了因而简化组建程序。该11阀组的十一个阀的功能实际上跟上面所描述的一样。
由合适材料如铝构成的一个喷射阀托架532被固定在侧面托架504和506上。喷射阀群111-119通过喷射阀托架532上的孔而被安装上。图6表示共有9个喷射阀111-119来控制氨基酸来自九个氨基酸池231-239的喷射。喷射阀111-119是3通道螺线管阀并且同早在图3中所述的3通道阀是一样的。各喷射阀的第一部分与反应器201-209相偶联。而第二部分与低多阀箱体101-109的第三部分相偶联。该偶联是用合适大小的管来实现的，如本实施方案中采用的1/16英寸特氟隆管。如前已明白的，各喷射阀111-119的通行管道允许溶液在反应器201-209和低多阀箱体阀101-109之间的自由流动。各喷射阀111-119的第三部分与氨基酸池231-239相连以便选择性地禁止或允许氨基酸池231-239相连以便选择性地禁止或允许氨基酸被射入在低多阀箱体阀101-109和反应器201-209间的溶液流。
图6也显示了一个顶部通用多阀箱体212。该箱体包括九个多阀箱体通道542以使该箱全与九个反应器201-209相连。在本实施方案中，1/8英寸弹性特氟隆管被用来使箱体通道542与反应器201-209的顶端相偶联。顶部通用多阀箱体212也含有一个第一末端通道544以使它与母体反应器(未显示)相连，其中来自各个反应器201-209的小球已经混合在一起了。第二末端通道546把顶部通用箱体212与一个3通道压力/通气阀(未显示)相连。该压力/通气阀和第二末端通道546提供了另一条管路，通过该管路压力氩、溶液和试剂等可被供应到顶部箱体212中。另一方面，该压力/通气阀和第二末端通道546提供了另一条管路，通过该管路压力氩、溶液等可从箱体212排放到合适的池中。
图6A显示了对池231-239的另一种安排。它不是提供单一池组，如池231-239，而是提供，组群，如231a-239b、231b-239b等。这些安在一个可旋转传送带1000中。它们都开口于传送带1000的顶面1002以便使池中的试剂能从顶面1002来估算。传送带1000安在压力器(未显示)内以使每个池都在压力器内受到相同压力。为了把池中试剂转移至反应201-209，与管241-249相连系的一管群被安在压力器内。压力器中的管被放置在一选择池组的池内，如池231a-239a。通过将管平移到池中或者把传送带1000平移至管道中可把管安置在库中。传送带1000可旋转以使这些管与所选择的池组一致。压力器内的压力会使池和管241-249间存在一个压力梯度。当这些管被安在池中或选择阀111-119被打开时，压力梯度驱使池中的试剂到管241-249中去便运至反应器201-209中，这正如前所述。因此通过允许从各种不同试剂中选择试剂，例如，允许使用各合成步骤中的各套基本原料，传送带1000给合成器提供了灵活性。
图7更详细地显示了在氨基酸池231-239、喷射阀111-119、低多阀箱体阀101-109和反应器201-209之间的相互连接。低多阀箱体阀，例如阀101(它是一种三通道阀)，是与通用低多阀箱体214相连的，以使溶液在低多阀箱体阀101的第一通道和第二通道之间自由流动。低箱体阀101的第三通道通过管271与3通道喷射阀111的第一通道或第二通道相连。而第一能道和第二通道中的另一通道通过管241与反应器201的一端相连。反应器201的另一端通过管221与顶部通用多阀箱体212(未在图7中显示)中的多阀箱体通道542相连。管271、241和221都是由化学耐性材料如特氟隆制成。实际上，本实施方案中采用了具有许多交叉部分的半透明PTFE和FET特氟隆管，因为它具有低反应性和半透明特氟隆材料的光学特征。
氨基酸池231是利用惰性气体如氩经管道562来加压的。氨基酸池231中的加压氨基酸溶液通过管道560进入了通道喷射阀111的第三通道。在接收到一适当的指令后，喷射阀111被打开以允许加压氨基酸溶液进入到喷射阀111的通行管道中去
图7也显示两个光学传感器111S和101S光学传感器材111S和101S探测半透明特氟隆管271和241内的液体的存在与否。如图7所示，光传感器111S位于喷射阀111之下而光传感器101S位于反应器201之下。来自光传感器111S和101S的数据被送至一控制计算机(图7中未显示)以用一控制合成反应的各阶段。
图8更详细地显示图1中的非同心搅拌器280。非同心搅拌器280包括与圆柱开钩爪566相偶联的两圆柱形轴564和568。轴564与圆柱形钩爪566的辐射轴纵向校直并且在其两平面之一相偶联。轴568在另一平面相偶联。并且偏置于圆柱形钩爪的辐射轴。在一实施方案中，轴564和568、圆柱形钩爪566由同一架全属刨台制成。
当圆柱轴564在一固定旋转支持物如滚轴、圆柱轴568(它偏置于圆柱轴564的轴心作环形运动。操作上可偶联多于一个的非同心搅拌器280，例如通过带一轮结构允许一组非同心搅拌器280，例如通过带一轮结构允许一组非同心搅拌器280一起运动。在本实施方案中，两个非同心搅拌器280的轴568与单一托架相连以便在轴564旋转时以环形形式移动托架。而且，轴568和涡流马达300被设计来以每分钟约1500转在环形轨道内移动各反应器的底部。为了防止小球的损坏，本实施方案中的环形轨道最好限于半径约为3.5mm。
图9更详细地显示了反应器组500的上面部分，它包括图6中的反应器201-209和涡流马达300。与图6中所讨论的，反应器组500包括与顶部托架290相连的反应器组201-209。顶部托架290有供反应器201-209相连的一组孔洞630。来自该孔(未显示)上的一特氟隆管道在孔630与各反应器201-209的上末端相连，其连接方式允许液体在特氟隆管和反应管201-209之间自由流动。
反应器201-209的低末端与低反应器托架295相连。图10A和10B更详细地显示了图6中的低反应器托架295的底面视图。图10A是低反应器托架295-部分的放大底面视图。
图10B显示在低反应器托架295的一群管道650。一个弹性而半透明特氟隆管(从图10B中省略以便于演示)从各反应器201-209(也从图10B中省去)的低末端伸出并安在管道650中。供安放光传感器的沟652与各管道650相连。沟652在图10A中被清楚显示。
图10B显示了将光传感器固定在低反应器托架295上的一群安装孔654。图10B也显示了一群选择孔656以减轻重量。如前所讨论的，低反应器托架295随着非同心搅拌器的环形运动而涡流反应器中的内含物。供选择的孔656也可通过低反应器托架295制成以减轻托架的质量，进而减少移动托架所需的动力。
在低反应器托架295的每一端附近的通行孔658将一个非同心搅拌器280连接到低反应器托架295上。反应器201-209的低末端随着低反应托架295的环形运动而运动，它们是从弹性特氟隆管241-249伸出来安在低反应器托架295的通行管道650上。当低反应器托架295以环形运动时，反应器组中的所有反应器201-209中的内含物都以相应方法作涡流运动。
图9也显示了供安装非同心搅拌器280的可选择性的非同心搅拌器套520。该搅拌器套围着在空圆柱套内的非同心轴以防止在非同心轴运动时对使用者的可能伤害和对设备的损伤。
本实施方案使用级型马达(加尼福尼亚Oriental MoforU.S.A Corp.of Torrance提供的PX245-01AA模型)和级型马达控制器(加尼福尼亚Semix Corp.of Fremont提供的RD122模型)以给非同心搅拌器提供旋转力。如图9所示，三个滑轮670、672和674与涡流马达300和两个驱动带521和676一起操作以便在非同心搅拌器套520内使两个非同心搅拌器280一起旋转。尽管本实施方案使用了级型马达和组型马达控制器，旋转力可以由任何其它型号的马达供应，这包括其它电动或气动马达。而且，由涡漩马达300提供的动力可以通过任何合适的传递系统，包括链和轮齿、滑轮和带、齿轮等，传递到非同心搅拌器280去。
图11A显示了用于探测半透明特氟隆管内液体存在与否的一个典型光传感器680。光传感器680是与本实施方案中的光传感器101S-119S相同的。光传感器680(易利路易州Omron，Inc.of Schaumburg提供的EE-SX671模型)包括供悬挂光传递器和聚光器的两个分叉末端682和684。光传感器680也具有一个686室以供安放合适的电路将光感数据传递到主控计算机中并且也为了将光感器680安于托架上。
图11B更详细地显示了光传感器680的分叉末端682和684。安装在叉末端682内表面的是一个大体为长方形的传递器685，以供将光传递到箭头688方向的大体为长方形的聚光器(图11B中未显示)中。聚光器安在分叉末端684的内表面并且同样是大体为长方形。为了探测大致半透明特氟隆管内液体的存在，特氟隆管被安在两分叉末端682和684之间的缝隙中。当在大致半透明特氟隆隆管内存在液体时，聚光器被引发，预示着探测到特氟隆管内有一种液体。
在实践中，已发现当是空的时，大致半透明特氟隆材料不能引起光传感器680引发。为了很好地使用通用光传感器来感受半透明管内液体的存在，便用了一种新型光学校准挡光物。图11C更详细地显示了光学校准挡光物690。它是由足以阻挡任何由传递器685发出的不透光材料制成。它包括第一表面696的两个挡光壁692和694，它们是为了使挡光物690摩擦地附在光感器680的分叉末端之一上，并且使光学校准挡光物690固定在分叉末端上。在一个实施方案中，挡光壁692和694被设计为使聚光器附着图11B的分叉末端684上。
光学校准挡光物690也含有建在第二挡光表面700的一个管道698。第二挡光表面700是背对上述第一表面696的表面。管道698的轴心线垂直于挡壁692和694。管道698的大小恰好使其紧夹住特氟隆管。因此，特氟隆管是固建在管道698内的，并且当光校准挡光物700被安在分叉端682和684间的缝隙时它是垂直于上述传递器带685的。
图11D显示了位于管道698中心线的一个孔702。孔702允许少量光沿着第一表面696和第二表面700间的孔穿过光校准阻光物690。当大致半透明特氟隆重管如管241-249或271-279被牢固于管道698内时，孔702的轴心穿过特氟管的中心。孔702的形状和大小是一个管的光学特征函数。
当光校准阻光物690以图11A所示方式安装在分叉末端682和684之间时，来自分叉末端682内的传递器685的光穿过一个大致透明管704。在穿过管704后大部分光被光校准挡光器阻挡。穿过管704的一些光到达孔702(在图11A中被挡住)并且沿着孔702的孔眼到达分叉末端684内的聚光器。
既然孔702的轴心穿过半透明管704的中心，穿过管心的光到达分叉端684内的聚光器部位。既然通过空管704的光被发散，就没有足够的光到达聚光器而引发感受器。当半透明特氟隆重管704内存在液体时，穿过满管的光被其中的液体聚光。被聚集的光进入孔702从分叉端682的方向引发分叉端684内的聚光器。当液体不存在时，聚光效应甚微。因此，很少的光进入孔702。实际上，当特氟隆管704中没有液体时，就没有足够的光穿过孔702来引发分叉端684内的聚光器。
如前所述，光校准挡光物690的大小恰好是紧夹住特氟隆管704。当光校准挡光物690装在分叉端682和684之间时，如图11A所示，特氟隆管被光传感器680和挡光物690牢牢夹紧。通过将光感器680固定在一个托架上，特氟隆管704也随着固定在托架上。以同样方式，本实施方案反应器201-209的底部伸出来的特氟隆管241-249也被固定在底部反应器托架295上。
如图12所示，本实施方案中的反应器201之类的反应器由一段FEP特氟隆管710构成。管710的外径为1/4英寸，内径为0.19英寸。如后面更详细的描述，管710的直径为了应用起见也可做的更大，在此两种或更多试剂可同时在反应器201中混合。管710封闭性地与弹性特氟隆管271相偶联。弹性特氟隆管271被固定在反应器组的低反应器托架295上。当低反应器托架295作环形运动时，该弹性特氟隆管271的底部随着底部反应器托架作所述的环形运动以使管710内的内含物涡流运动。
在这个实施方案中，管271的外径为1/8英寸而内径为1/16英寸。图12显示了一个管道连接器，它由第一偶合器714、第二连接器716和第三耦合器718组成以使不同交叉部分的管紧密地连在一起。前述管连接器可从Norton，Inc.of Akron购得。在管710的底部有一个滤器或过滤物质1102(图12中被挡住)以供防止管710内的巷质进入弹性管712。例如，该滤器可以是2微米钛滤器。
在管710的另一端，一个第四耦合器720、一个第五连接器721和一个第六耦合器722紧密地将管710连接到管221上。耦合器720和722以及连接器721是必需的，因为本实施方案中管221有来自管710的不同交叉部位。管221连接到顶部多阀箱体212的一个多阀箱体通道542上(图6中未显示)。
一个弹性O-环724被安压托架290内的一个洞726内(在图12中以截面显示)。
O-环724弹性地夹住耦合器722，因而弹性地将反应器201牢固在托架290上。当反应器201的底端被驱动时，O-环作为一个支点而使反应器201的顶端相当不动以增加涡漩效应。
如图12A和12B所示，在一特定实施方案中的反应器201可选择性地备有一个控制套1100以控制反应器201-209的温度。在该实施方案中的温度控制套1100包括一个接头配件1104以将反应器201连接到221线和241线(未显示)。
进/出通道1106、1108是为了将热导液体供应到反应器201中去。该热导液体可被用来给反应器201加热或冷却。在这个实例中，反应器201是由一个特氟隆管1110形成，最好其外径为1/4英寸，壁厚1/32英寸。空间上相离于管1110的是一个外管1112，它最好由特氟隆构成并具有外径3/4英寸、壁厚1/32英寸。外管1112围住接头配件1104而形成一个环形空间1114以供接收热导液体。O-环1116、1118位于外管1112和接头配件1104之间以形成一液体密闭区。以这种方式，热导液体可通过通道1106和1108之一被导入环形空间1114以反应器201加热或冷却。通道1106或1108也允许热导液体通过环形空间1114而持续循环。
反应器1120具有一个整体形式温度控制套1112的另一个实施方案在图12C和12D中显示了。除了反应器1120最好由玻璃构成外，反应器1120的功能大体与反应器201的相同。温度控制套1122也最好由玻璃构成。这样的结构允许反应器1120和温度控制套1122作为一个整合单位而形成。反应器1120包括过滤器1124和连接1126、1128以连接到221线和241线(未显示)上。进/出通道1130、1132是为了使热导液体在套1122和反应器1120间的环形空间内循环。软管倒钩1136、1138是为了便于将进/出通道1130、1132连到合适的液体源上。以这种方式，热导液体能在环形空间1134内循环以给反应器1120加热或冷却。
D.母体反应器
图13更详细地显示了本发明实施方案的母体反应器。例如，母体反应器200的体积约为30毫升。管260与母体反应器200的底端紧密相连以将试剂或氩运到或运自投掷系统PDS 265(图13未显示)。一滤器过滤物746被安在母体反应器200底部附近以防止基质进入管260。在母体反应器200的顶端装有可移动盖743以供加入或除去材料。穿过盖743的管215在母体反应器200和反应器组的顶部通用多阀箱体212(图13中未显示)之间转移材料。管215从盖743穿出。一条可供选择的冲洗管路281连接到溶剂源以将加压溶剂运到母体反应器5的内壁冲洗该内壁。
图13显示了两个电容传感器905和995(ElectromaticControl Corp.of Hoffman Estates，Illinois的模型18-08)，它们安在母体反应器200的外面附近。电容传感器905或995探测其附近液体的存在情况并将传感数据分别通过线756和785传递到一控制计算机(未显示)。电容传感器995用于探测向母体中加入的试剂。电容传感器905用于探测重新分布的球粒悬浮液的。根据小球量和所用的反应容器数量可调节两种传感器。电容传感器的数据被软件使用，以控制合成过程的各个循环。
E.控制系统
1.控制计算机
自动合成仪使用控制计算机由传感器获得数据，并在合成过程各循环步骤中控制阀门和涡流马达。当与自动合成仪连接使用时，任何计算机，包括普遍公知的微机，小型机，工作站，大型机等等，可以用来处理传感器数据并发布命令控制阀门和涡流马达。
而且，来自合成仪传感器的传感器数据可以通过任何商售的使用一般数据显示方法的数据显示装置获得。同样，用商售输入/输出控制器，响应合适的计算机命令，阀门和涡流马达也可被控制。
在一实施方案中，IBM-兼容微机(也认为是个人计算机或PC)被用作控制计算机(Model Gateway 200。4DX2-50V，by Gateway 200Inc.of No.Sioux City，South Dakota)。在PC中，有允许加入各种扩充板的复杂扩充槽。这些插线板与PC总线源接着头并让PC与卡上的电路系统联通以完成电子功能。一些扩充板也允许PC与外部设备和电路系统联通。例如，一普遍公知的为调制解调器板的插线板插入PC上的扩充槽，并让PC与另一个具有调制解调器的计算机联通。用个人计算机使用扩充板是一般技术知识。
在一实施方案中，自动合成仪与PC通过多通道数字I/O插线板联通(Model PCTIO120-P by Industrial ComputerSource of San Diego，California)。PCDIO120-插板的说明详细描述于Product Manual No.00431-050-20A，其也可由In-dustrial Computer Source得到。
每一PCDIO120P提供120个以24通道一组的缓冲输入/输出(I/O)通道。每个24道组被程序辅助设备接头(PPI)8255A芯片控制。这些通道可选择地以8通道为一组用以输入或输出。
图14显示了控制硬件部分的简化图解。具有复杂扩充槽的计算机760，如PC与显示监视器762和键盘764连接。将PCDP120-PI/O板766插到一扩充槽中使PC与五个控制器线路7688联通。每一控制器线路760通过导体通道与I/O板766联通。在本实施方案中，导体通道770包括一具有服务为于24个通道的能力的50-导体带。
2.控制器线路
I/O板766的输出信号，典型地为15mA源电流和24mA接收器电流，不足以操动电磁阀。所以，控制器电路768将来自I/O板766的输出信号转化为动力信号，其具有足够的动力实际操动电磁阀。控制器线路具有接收来自I/O板766的24个输出信号的能力，并且顺序输出24个动力信号771来控制合成仪的各种装置。每个控制器线路768的24条动力线771见图14。
每个控制器线路768也提供一个中心物理存储单元，在那里每一传感器多至24条传感线的传感数据被集中。来自多至24个不同传感器的数据可以通过每个控制线路768上的传感器端口772被接收。
因此，每一控制线路768能服务于I/O板766上多至48I/O通道，24个输入和24个输出。图15显示了根据本发明一个方面的控制器线路768的示意图。50-插接首部781将控制器线路768与I/O板766(未在图15中显示)连接。首部781是一输入首部，并与传感器端口772通过总线780连接。传感器端口包括首部或用来连接控制器线路768和多至24个输入设置如传感器的接头。总线780上的每个导体将信号由一个传感器传到输入首部781。图15也显示了一个可选择的用来将来自传感器端口772的LED导体信号传送到一可选择的发光二极管(LEDs)786的LED总线784。可选择LED总线784的每个导体将一个信号传递到库786中的一个LED。
图15也显示了另一个用来连接控制器线路766和I/O板766(未在图15中显示)的另一50-插接首部788。首部788是一用来接收来自I/O板766输出信号的输出首部。总线790将多至8个来自首部788的输出信号载送到一个八进制反相器74LS240芯片792上。八进制反相器74LS240芯片792由Texas Instiuments，Inc.，Dallas，Texas制造。总线794将反转的缓冲输出信号由芯片792运载到一个八进制锁存器趋动器796上。锁存器趋动器芯片796是Model MIC59p50，由Micrel，Inc.，San Jose，California制造。来自每个锁存趋动器芯片796的输出信号与一输出端口798通过总线800连接。一个可选择的LED决线802将来自芯片796的LED导体信号传递到一可选择的发光二极管(LEDs)804库。可选择LED总线中的每个导体802可载运一个信号至库804中的一个LED。
3.阀
用在本发明实例中的电磁阀如，例如阀4-7，10，14，90-91，100-121和129通常是闭合的，除非命令其打开，因此合成仪中系统预置状态是闭合的。因为当合成仪处系统预置状态时没有材料允许流动，因此保障了安全性。当开动时，阀使用了动力并热化。除动力系统明显损耗外，热阀可以不利地影响化学物质通过其出入口。因为与保持一个已打开的阀门不闭合相比，打开一个电磁阀一般需要更大的动力，一种触击继动器，例如由Crydom，Inc.，Long Beach，California提供的DID20型，被用来操动阀门。一个触击继动器如DID20，在特定时间内，典型地为100毫秒，给阀门提供+12伏来打开关闭的阀门。触击继动器提供+12伏的时间片段可特定地通过软件控制，并且触击通过一I/O通道而起作用。此后，触击继动器提供一降低的电压，典型地为额定电压的一半或在本发明的实例中大约为6伏，来保持电磁阀的打开状态。从而需要较少动力来操动阀并产生较少量的热。
本发明提供了四种分别的动力供给。第一动力供给输出+5伏以趋动77L芯片，如那些控制器线路768上的芯片。第二动力供给输出+32伏用于步进马达。第三动力供给提供+12伏打开电磁阀。可选择第四种动力供给也提供了+12伏用于传感器。分开的给阀提供动力的第四动力供给保证当阀门打开和关闭所产生的任何噪音不干扰传感器工作。
在其系统预置状态，所有阀门都闭合。作为附加的安全措施。合成仪进一步提供了一固态触击监视器，当控制计算机出现故障时会关闭所有阀门。固态监视器如Brentek Inter-national提供的SM-WDT5型(由Industrial Computer Sourceof San Diego，Califonia获得)，被安装在控制计算机和阀门动力供给之间。软件产生的脉冲由控制计算机传递到一个I/O通道上的触击监视器。当脉中消失，例如CPU错误，锁上键或锁下键错误，触击监视器关闭阀的动力供给，从而关闭所有阀门。
F.控制软件
现将参照图16-24的程序框图详细讨论控制软件。这些程序框图说明了由控制计算机为完成合成方法的相关相而发布的命令。为简化下面的讨论，假设在所有相关时间，压力输送系统的阀门接到了控制计算机的正确的命令，将所需试剂送到了反应器库阀门。
图16是说明控制计算机为排泄反应器201-209内含物而发布的程序的组合的程序框图。在排泄前，反应容器201-209含有液体或小球悬浮液。与顶部共同管道212连接的氩气供气阀121接到开启命令并开启，用氩气给顶部共同管道212加压。同时，选择的了一端口阀门101-109开启使液体由反应器201-201流入较低管道214。只有选择的201-209阀门打开，因为在一些偶联反应中不是使用所有反应器201-209。如果一个反应器在一个反应阶段是空的，则没必要排泄其内含物。底部管道214中的排泄阀开启让液体流出。压力不同的结果使氩气压力驱使液体由反应器201-209，通过较低管道214，由排泄阀110流出。当传感器110S关闭，表明没有剩余的液体要排泄，阀门仍保持开启2-5秒以确保所有的液体由反应器库排出。
图17表示计算机控制清除较低管214发布的命令的组合。在起始步骤，在较低管道214存留有材料。此后，分离阀100开启让加压氩气由PDS265进入较低管道214。同时，排泄阀110开启将材料从较低管道214排出。材料由较低管道214排出直到没有材料剩余。当光学传感器检测到排泄管中无材料时，阀门又回到其系统预置状态。
图18说明一套控制计算机混合母体容器200内含物发布的命令。这一系统将氩气由底部31入母体容器200来混合内含物。氩气气泡当从母体容容底部升至母体容器中内含物的表面时，搅拌了母体容器200的内含物。没有被表达命令保持开启的所有阀都处于其系统预置状态。阀门100开启使加压氩气由PDS265进入到母体容器的底部来搅拌其中内含物。阀90也开启从母体容器中排出氩气。大约15-30秒后，阀100和90回到其系统预置状态。
图19A和19B表述了控制计算机把小球悬浮液由母体容器分配给各个反应器编写的命令程序。该程序隐含了用小球悬浮液填充各反应器的测量体积的技术。使用这一程序，反应器的装填几乎没有流速依赖性。因此将看到，不管小球悬浮液将进入的反应器和管道端口之间的距离的远近，小球悬浮液被均匀地分布在各反应器中。分配周期开始时，反应容器库只含有氩气，且母体容器在步骤852含有小球悬浮液。
在步骤854，在再分配阶段之前，反应容器库部分地装有DMF来代替反应容器库中存在的氩气。分离阀100开启使加压DMF由加压输送系统进入较低管道。阀101-109开启向反应器上送DMF。阀120开启从顶部共同通道排出氩气。预程序时间周期(每阶段大约3秒)后，阀100，101-109和120回到，优选顺序地，其系统预置状态。然后反应器201-209被混合去除气泡。阀100-109又开启大约3秒钟。在预程序时间期满时，通向反应器的每一管241-249中的DMF含量应接近顶部共同管道212。
然后在步骤858，反应器库与母体容顺200装入DMF。阀100开启使加压DMF由PDS265进入反应器库。阀101-109开启继续向反应器库加入DMF。阀129开启使流过反应器库的DMF进入母体反应器200。阀90也开启从母体反应器200排出被替代的氩气。继续填入直至传感器99S检测出其DMF在其检测范围内时，母体容器200中液体含量升至上限容量传感器99S的水平。然后反应器库完成填入。母体容器200填充物多至大约第二容量传感器99S水平。然后在步骤860，阀90，100，101-109又回到其闭合态。
下一步，在862步骤，顶部共同通道被清除DMF。阀121开启，用加压氩气给顶部共同管道加压。阀129开启让DMF由顶部共同管道进入母体体反应器。阀90开启由母体容器排出被替代的氩气。从而DMF从顶部共同管道转移至母体容器中。母体容器被设计具有足够体积容纳没有流过的另加的DMF。例如大约5秒的预程序时间周期后，阀90，121和129在步骤864又回到其系统预置状态。预程序时间周期是可变的，但一定等于或超过清除顶部共同通道DMF所需的时间。
如果在进入小球悬浮液之前反应容器中没有装入DMF，即如果反应器是空的，则不球悬浮液的分配将是不均匀的。如果反应器是空的，则离小球悬浮液由母体容器送入而通过的管通端口最近的反应器首先被装入。如果允许几个容器过量装入，则可能对一些反应器没有剩下的小球悬浮液。
本发明使用了一种新的控制反应器接收小球悬浮液体积的方法。首先，在步骤866，一小柱氩气被引入使反应器与顶部共同管道连接的每个管的顶部。为产生氩气气泡，阀121开启让加压氩气进入顶部共同管道。选择的阀101-109顺序打开让一些DMF由反应器排至较低管道。阀110开启让被替代的DMF由底部管道排出。大约0.3秒后，一小柱氩气出现在将反应器与上部共同通道连接的管的顶部。然后在步骤868阀101-110和121又回到它们系统预置状态。
在步骤869，在制备中，母体容器中的小球悬浮液被混合以在反应器间分布。与此步骤相联系的命令与图18相关的讨论相似。阀10和90在步骤870又回到其系统预置状态。这一步骤保证均匀小球悬浮液被均匀地分布在所选择的反应器间。
然后小球悬浮液的一部分被引入顶部共同管道，步骤871。这一步骤根据预程序时间周期定时，以使进入顶部共同管道中的小球悬浮液代替顶部共同管道中的氩气的大部分而不流过管道端口。这个端口与最后一个反应器试管，例如与传感器109S连接的反应管连接。已发现大约0.5秒的预程序周期是令人满意的。为将这部分小球悬浮液送入顶部共同管道，阀91开启用氩气给母体容器加压。阀129开启使小球悬浮液流进顶部共同管道。阀120开启排出存留在顶部共同管道中的氩气。先前讨论的预程序时间周期期满后，阀91和120在872步又回到其系统预置状态。更重要的是，阀129继续开启以防止小球和聚合物由于阀的关闭动作而受损伤。在本发明实施方案中，2-端口阀129继续接到控制计算机命令信号以上述方式保持开启。但是129可以是一个活门阀，其一收到控制计算机命令脉冲就套接在开和闭状态之间。如果阀129是一活门阀且已经打开，则控制计算机不需要发布命令保持活门阀129开启。
图19B是图19A的继续。当存在于顶部共同管道212中的部分氩气被替代后，剩余小球悬浮液在874步被转移到顶部共同管道212。阀91开启用氩气给母体容器200加压。保持开启的阀129使加压小球悬浮液进入顶部共同管道212。选择性阀101-109开启使反应器200中的DMF流出至较低管道214。阀110开启从较低管道214排泄DMF。部分由于小球悬浮液的抗性，DMF相对慢地顺着选择性反应管201-209退下。来自使选择反应器与顶部共同管道212连接的选择管221-229的替代DMF被小球悬浮液替代。悬浮起泡的DMF柱向较低管道214缓慢向下前进。
较早引入起泡的柱也可有利地作为一个体积标记，即提供了一条控制计算机测定什么时候每个反应器已接收了足够量小球悬浮液的途径。由于聚四氟乙烯的表面性质和DMF与聚四氟乙烯之间的高接触角，发泡柱被截留在DMF柱和悬浮液柱之间。如上文所讨论的，在本发明实施方案中使用的光学传感器可检测基本透明的聚四氟乙烯中液体柱的存在或不存在。由于DMF被向下前进的大量小球悬浮取代，气泡向下移动到反应管和将反应器与较低管道连接的管。此时用光学检测器101S-109S检测氩气气泡向下运动，检测器瞬间关闭。传感器数据，如上所讨论的，传给控制计算机，控制计算机立即发出命令信号关闭各个阀101-109。所有阀101-109关闭后，小球悬浮液转移物在878步再开始并继续该步骤直至声学传感器120S检测到在连接母体容器和顶部共同管道的管中没有液体。在步骤882，除129外的所有阀回到其系统预置状态。正如所讨论的，阀129持续打开以避免损伤小球和阀129。此合刻成仪在其反应器中含有悬浮液。并且可能有一些小球悬浮液残留在母体容器中。为保证所有小球都转移到了反应器中，要使用至少一个淋洗循环的淋洗过程。
该淋洗循环自890步用DMF喷洒母体容器内壁以疏松粘附在壁上的小球悬浮液残余物。阀14开启喷洒DMF从上至下洗壁。阀90开启从母体容器中排出替代氩气。继续用DMF喷洒内壁直到母体容器DMF水平升至较低容量传感器90S的水平，并将其关闭。控制计算机接收到传感器数据并立即发出命令在892步让除阀129以外所有阀回到其系统预置状态。然后以上述讨论的方式让氩气气泡搅拌母体容器内含物。
或者通过再装入DMF并混合以疏松粘附于母体容器内壁或玻璃料上的小球悬浮液残余物。首先，在步骤884用新鲜DMF再装填母体容器。通过开启阀10让DMF从加压输送系统进入母体容器完成这一步骤。阀90也开启让被替代的氩气由母体容器排出。当母体容器中DMF液面升至顶部容量传感器99S水平，顶部容量传感器99S接通，控制计算机接收到传感器数据立即发布命令在886步让除129外的所有阀回到其系统预置状态。用上面讨论过的方式，通过将氩气气泡导入母体容器在步骤888混合母体容器内含物。
然后通过开启阀91用氩气对母体容器加压并将混合物通过阀129转移到顶部共同管道，在步骤894将DMF和小球悬浮液的混合物转移到反应器中，其中阀129在整个淋洗过程中保持打开状态。选择阀101-109开启让液体由反应器流至较低管道。阀110开启将DMF从底部管道排出。反应器底部的玻璃料排出了反应器中的所有小球。最后母体容器被排空。当连接母体容器和顶部总共同管道的管中没有液体时，传感器120关闭。传感器数据传给控制计算机显示在母体容器中没有剩下的液体要转移。控制计算机继续开启阀915-10秒给顶部共同管道加压使任何存留的混合物进入反应器。5-10秒后除129外所有的阀回到系统预置状态。完成了一个淋洗循环。
如上所讨论，可进行多次淋洗循环以保证基本上所有的小球悬浮液由母体容器转移至反应器。发现2至3次淋洗循环是令人满意的。
当完成所有的淋洗循环时，包括129的所有阀在896步回到系统预置状态。注意阀129在整个小球悬浮液再分配过程中，包括淋洗过程，是保持打开的，以减少对球和聚合物的损伤。用早先讨论的方法在步骤898从反应器库排出所有液体。
从图19A-19B的步骤，可以看出使用氩气气泡可以使小球悬浮液均匀分布在反应器间，而不考虑母体容器与反应器间各流路的流速。只要氩气气泡在小球悬浮液和DMF试剂之间保持稳定，就提供了一个存在记号，使传感器测定反应器的情况。如上所提到的保持稳定氩气气泡的能力是由于DMF的良好物理性质，即DMF与聚四氟乙烯的高接触角。
但是当向反应器传送小球时也可能希望使用不是DMF的液体。这可能会产生问题，尤其是当取代的液体不具有能产生稳定氩气气泡的物理性质。例如乙腈(MeCN)用作DNA合成的溶剂，就不能产生稳定的气泡。因此需要不同的方法来分配小球到反应器中。
图19C-19D说明了当不能产生稳定氩气气泡时，控制计算机混合母体容器内含物而发布的可选择的一套命令。
当只使用少数反应器，例如至多4个至5个时，该技术特别有用。
步骤854a～860a与图19中的步骤854～860相似，只是少数阀101-109开启，即只有对应于选择反应器的那些阀打开。选择容器部分地装有溶剂，如MeCN，以替代在再分配阶段之前存在于反应器库中的氩气。此后，选择反应器和母体反应器中装入MeCN。当母体反应器200中MeCN的量升至第二容量传感器99S水平时，停止MeCN流，表明装填已完成，完成后，选择阀回到其闭合状态。
接着，步骤872a，在制备中混合母体容器中的小球悬浮液以向选择反应器分配。在步骤874a，开启阀91，129和选择阀101-109小球悬浮液进入顶部共同管道并分布到选择反应器中。这些阀持续打开直到传感器120S检测连接母体容器和顶部共同管道的管中不存在液体。由于没产生氩气气泡，不使用传感器101S-109S。因为只有少数反应器接收了小球，因此小球到达每一反应需时间大约相等，因而通常保证了每一反应器的等同分配。
在步骤890a，应用淋洗过程，已在图19A-19A讨论过，以保证所有小球被转送到反应器。淋洗过程完成后，包括129的所有阀在896a步回到系统预置状态。在步骤898a，反应器库排出了所有液体。
图20是控制计算机为用输送系统的所需的试剂装入反应器而发布命令顺序的程序框图。参照图20讨论的步骤也大略在图21A-21D中作了说明。这一方法假设较低管道中只装有惰性氩气(步骤900)。图21A图示了具有空管道的反应器库的相关部分。较低管道首先在步骤902装入一试剂。阀100开启让试剂进入较低管道，阀110开启以较低管道排出被取代的氩气。当试剂被传感器110S检测到时，所有阀在903步回到系统预置状态。
在一些例子中，传感器101S-109S在正当装载连接反应器和较低管道的管时，可能会被偶然地或过早地关闭。例如，传感器可能在试剂实际到达之前被试剂的散滴驱动。这样会导致没有足够量的试剂存在于向反应器输送的管中。
为了减少或排除与过早传感器驱动相关的问题，控制计算机在904步为预装载管而可任意选择地命令将阀101-109开启一定时间。一般在被传感器101S-109S检测之前限定时间以使装载管达大约75％。正如所述，该步骤不依赖传感器101S-109S的使用。因此预装载保证即使传感器过早被驱动，管中也会至少存在足够量试剂来注入反应器以适当地进行混合。在步骤905，在制备中装载管的预定时间期满后，阀回到其系统预置状态。
在步骤906，连接反应器与较低管道的管用试剂装载至传感器水平。装载过程可以平行进行以节省时间或顺序进行。阀100开启使加压氩气由加压输送系统进入较低管道。选择阀顺序或平行开启，使试剂进入连接反应器和较低管道的管中。当管中试剂含量达到光传感器101S-109S上限时，光传感器接通，控制计算机瞬间关闭相关的阀101-109。当所有传感器101S-109S灯全接通时，所有阀在步骤908全都回到系统预置状态。图21B大意说明装载过程完毕后的结果。
然后用上文讨论的方法在步骤910清除底部管道。图21C说明了具有清洁管道和一柱试剂的反应器的相关部分，其中试剂是在顶部传感器例如101S和阀例如101之间的管部分中。底部管道清除后，所有阀在912步又回到系统预置状态。管中的试剂通过玻璃料涌入反应器。为使试剂进入反应器，氩气阀122开启使氩气由加压输送系统进入加压较低管道。排泄阀120也打开。
在步骤913，开动涡旋马达共同搅拌反应器库一预测时间。该时间周期足以使反应器内含物混合完全。发现一般大约4秒是合适的，但也可根据反应类型而变化。
在上述混合周期期间，在步骤914，将阀101-109开启一预程序时间周期以使少量试剂流和主反应器。通常在合成过程中重复装载并排空反应器。每次反应器排放，其中小球就变干并聚集在一起形成“球块”。步骤914使反应器中的内含物液体化并溶解球块。因为涡旋运动在小球在或接近反应器底物时是最有效的，所以只需注入少量液体。另一方面，小球块可能漂浮在反应器顶部，需要更多的时间将其溶解。在步骤915，在预定时间期满后，阀回到系统预置状态。
在步骤916，通过开启阀101-109，使剩余试剂部分倒入反应器。装载各容器直到相应传感器101S-109S检测没有液体存在，控制计算机关闭阀。当所有传感器101S-109S关闭时，所有反应器都装载了。为提高混合效果，在装载的同时搅拌容器库。如上所指出的，通过一次开启全部的阀101-109或顺序开启，可设计反应器使平行装载容器或顺序装载。
或者，可不依赖传感器101S-109S装载反应器。例如，可以在足以装载容器到所需含量的预程序时间周期开启阀101-109。已发现0.1～1秒的时间周期是令人满意的。但是，这一时间周期可根据所用容器数目而变化，即使用容器数目越多，所需时间越长。图21D显示了装载后反应器的简图。
注意，进入反应器的容器的体积也可通过改进阀101-109和传感器101S-109S之间管的长度和直径而容易地改变。这种改变通过用一具有不同长度或横截面规格的管取代连接反应器和注入阀，例如，阀111的管而容易地实现。
在某些例子中也可有利地增加反应器自身的直径。例如，也许希望同时混合小球和两种或多种试剂。这样的混合可以在图21A-21D将第一种试剂引入反应器的步骤后进行。然后第二种试剂可以通过重复图21B-21D的步骤引到反应器中。但是这样做时，由于在引入第二种试剂之前有氩气留在管241-249和271-279中，因此将清除小球悬浮液和第二试剂间的氩气气泡。为了将氩气气泡从反应器中排出，可将反应器内直径作大来降低反应器中小球悬浮液的高度，从而使氩气气泡容易从小球悬浮液中逸出。去除氩气泡后，通过如上所述进行涡旋，将小球悬浮液和第二试剂一起混合。
图22是控制计算机为向反应器中加注活化的氨基酸试剂而发布的命令的顺序流程图。图23A-23C大略说明氨基酸加注过程的相当步骤。又假设初始时较低管道是清洁的，即只含有氩气。图23A是初始时反应器，较低管道，阀，传感器及相关管的示意图。
容器231-239另一选择性安置见图6A。
为使运动带动多组容器的旋转圆盘传送带具体化，在步骤917旋转圆盘传送带有选择容器组的管列成一排。一旦选择了合适的容器，就在918步用氨基酸活化剂如0.2MHBTV和0.6M DIEA的DMF与DCM比为3∶1的溶液注入管道。用与图20相关的讨论过的方法装载管道，即开启阀100和110直到传感器110S接通。此后所有阀在920步全都闭合。
然后活化剂进入连接反应器和较低管道的管中。阀100和120开启让加压活化剂在922步进入较低管道。阀101-109的选择阀开启直到较低充传感器111S-119S显示存在有液体。在步骤924，所有阀又关闭。图23B图示了这一初始注入步骤后反应器库相关部分中液体的存在。
为完成注入，在926步，阀100和120又开启让加压活化剂进入较低管道。阀101-109中的选择阀平行开启让加压活化剂柱在上述管中上升。同时，阀111-119中的相关阀开启将氨基酸注入加压活化剂的上升柱并与活化剂混合。图23C图示了这一注入步骤。
当每一传感器101S-109S检测到有液体存在时，控制计算机关闭与这个传感器相关的阀101-109。当所有的阀在928步关闭时，反应器库的所有阀回到系统预置状态。氨基酸和活化剂的混合物优选允许停留在上述管中大约2分钟以保证在步骤930适当的活化。
此后，用早些时候讨论的与图17相关的方法在步骤932清除底部管道。然后阀101-109和上传感器101S-109S之间的混合物柱以讨论过的与图20相关的方法在步骤913-916进入反应管。
图24显示控制计算机为将反应器中的小球悬浮液转移回母体容器而发布的命令的顺序。开始时，假设反应器是排空的，旦较低管道充有氩气。首先反应器在936步以讨论过的与图20相关的方法注入溶剂。此后所有阀回到系统预置状态。
接着在步骤938涡旋小球和试剂的混合物得一悬浮液。或者在反应器注入时涡旋小球混合物。这种方法提高了成悬浮液的速度并有助于防止小球在反应器底聚结。反应管内含物在步骤940被转移到母体容器中。阀122打开用氩气给较低管道加压。阀129开启让小球悬浮液由反应器库流流入母体容器。阀101-109中的选择阀开启，优选顺序开启，让氩气推动每一反应器内含物向上到达顶部共同通道并进入母体容器。因此反应器内含物被依次转移到母体容器中。尽管上述转移也可通过同时开启阀101-109平行进行，但顺序转移使保持反应器库中的高氩气压，因此是优选的。而且每一阀101-109优选保持开启大约4秒以保证基本上所有给定反应器内含物被转移到了母体容器。在这一过程中，阀90，122和129保持开启状态。
所有反应器内含物被转至母体容器后，淋洗反应器也进行另一转移过程。为淋洗反应器，从用步骤936含DMF反应器的再注入开始，重复以上步骤。如步骤937和941所示，在一系列循环中，阀129保持开启状态以防止损伤球和阀129。母体容器优选具有至少三次转移量的体积。再组合末期，母体容器最好通过开启阀110和91排放，直到母体容器中液体含量达到底部较低容量传感器90S并关闭该传感器。已发现三个淋洗循环是令人满意的。
此后，包括129的所有阀在942步回到其系统预置状态。用讨论过的与图20相关的方法在步骤944搅拌母体容器内含物以混合来自各容器的小球。如果要从母体容器中移出小球，优选通过开启阀10和91在946步排泄母体容器直到母体容器中液体含量达到底部较低容量传感器90S并关闭该传感器。在步骤948，所有阀依次回到其系统预置状态。然后可以从母体容器中移出含小球的混合物使用。
或者，用与图21A-21B相关的方式将小球再分配到反应器，再分配后，所有阀回到其未发生态。
G.总的软件图表
图25是本文附录I包括的源码程序框图。模块950代表使用者。命令解释程序952接到使用者正文命令。或者，使用者可以使用菜单系统953输入命令启动合成仪。菜单系统接受的集合或者转化成命令解释程序952可使用的格式，或直接在支援例行程序模块962调用支援程序。命令解释程序952也分析正文进入或使用者输入的命令。此后，分析命令调用或执行支援程序模块962的支援程序。并且分析命令被显示格式954格式化并在显示762上显示。
模块958含有大量宏指令文件。一个宏指令文件定义，例如实际进行合成或构建库的步骤顺序。在其最基础水平，一个宏指令文件含有，例如依次含有控制阀和阅读传感器情报的分散命令体系的宏指令。宏指令可以使用其它基础宏指令以完成高水平功能，如排放反应器201-209。
接到来自宏指令文件958命令解释程序952的宏指令进入合成仪库控制960，合成仪库控制器960调用宏指令进行实际合成。例如，一个宏指令可以规定合成开始前一定要建立的最初全局改变。
图25说明运行各种支援亚程序的支援例行程序模块962。一个这样的亚程序是自动装填，它是自动装填反应器直到传感器接通的亚程序。支援程序962接到来自命令解释程序952或菜单系统953的输入。功能选择表964含有功能等指示字。图26给出了功能选择表964的输入和输出及其与命令解释程序952和支援例行程序模块962的关系。
也有掌握全局变化和全局设置的初始文件966。初始文件966掌握，例如，代表给开启一闭合阀提供触击电压时间量的数值，等等。查表文件968与合成仪命令文库控制器960一起执行以，例如，让单体进入合适的选择反应器。查表文件968可以含有，例如，各反应器名单，其相应标记单体，合成所需肽所必须单体的名单。
图25也给出了记录文件970。记录文件970接受来自命令解释程序952和合成仪文库控制器960的输入。记录文件970含有诊断目的的操作数据。记录文件970的表目含有，例如，与所调用宏指令相关的情报。
相联文件972含有各反应器及其相连阀和传感器的名子。相联文件972与合成仪文库控制器960和支援程序962一起操作以简化记录各反应器及其相连阀和传感器地址的任务。
数字命令由支援程序962输出进行平行驱动器974。平行驱动器974可以是例如PCDIO 120-PI/O板766。平行驱动器974通过其I/O通道输出阀控制信号976驱动网络管阀。阀控制信号，如所讨论的，被控制器电路768进一步处理。而且平行驱动器974输出步进马达控制器信号978来控制涡旋步进马达。来自合成仪光传感器。超声传感器，容量传感器的传感器输入980也被平行驱动器974接收，通过传感器检查亚程序982由支援程序962处理。
图27说明了控制阀所需的数据结构。阀索引VINDEX数组986接收一阀数目984为输入，并对VALVES数组988提供了指示字。每一VALVES数组988的单元含有一数字字节990的指示字。每一数字字节990含有阀数字情报8个二进制位。含有给定阀阀数据情报的二进制位通过其数据字节990的地址，和代表数据字节990中二进制位的相对位置的移动值，是可存取的。数据字节990的每个二进制位可以受控来合适地接通或关闭一个阀。每个二进制位的阀数据情报通过输出端口992控制相应的阀。
图28说明接收来自输入端口994传感器情报必需的数据结构。代表每个传感器二进制态的情报储存在数据字节996的一个二进制位中，为存取数据字节996中的情报，使用了传感器号数存取SENSOR数组998。SENSOR数组998每一成员含有一个合适数据字节的指示字。每个数据字节996含有传感器数据情报的8个二进制位。含有给定阀阀数据情报的二进制位通过其数据字节996的地址和代表数据字节996中二进制位相对位置的移动值，是可存取的。
H.窗口接口
控制软件可以包括窗口型接口和工作空间。通常，窗口接口是一矩形图形使用者接口(GVI)，其提供一个或多个在屏幕上显示的窗口。辅助窗口对象如所希望的可以各种大小和格式(例如砖状或格状)显示。在窗口顶部是一个有大量使用者命令选择的选项单条形，每一条形可以调用辅助亚菜单和软件工具为应用目的而使用。窗口也包括用于显示和操纵屏幕对象的空区。这一空区是使用者与存储在控制计算机系统存储器中的数据对象交换信息的工作空间或视口。
窗口接口包括屏幕光标和用来选择和或者调用所感光趣屏幕对象的指示字。响应使用者指示装置如鼠标的运动信号，光标在屏幕上漂移(即自由移动)到所需屏幕定位。在光标运动期间或之后，使用者可给出用户事件信号(例如鼠标键钮“定位”和“制动”)以选择和操纵对象，如本领域所公知的。例如，窗口可以关闭，再定大小，或通过“定位”(选择)上卷屏幕组件。键笔画等效，包括键盘加速或“热键”被提供用来完成这些和其它通过键盘的用户操作。因此，窗口接口提供了与控制计算机交流的更直接的途经。
窗口接口下面是一条信息或事件驱动体系结构。这个模型可以通过将其操作与传统使用的模态或顺序体系结构的操作对比而给出最好的描述，如图25中的命令接口所示例的。在这一方式中，读数器可以有利于增加的事件驱动系统的灵活性和复杂性。
模态程序包括一系列在开始，中间进程，和结束时定义好的离散操作模块或模。因此程序按照完全固定的操作顺序，在进行下一步之前每一步骤必须完成。
模态程序相对容易设计和执行的同时，通常并不容易使用。设计当然保证所有所需情报进入，只是在使用户以程序方式操作的花费上进入。特别是，由于程序建立了一套预安排模，用户不首先完成预需模就不能由一个模进入另一个。不允许用户对此顺序有任何偏差。这种模态程序的不灵活性不利于处理现实任务。
另一方面，事件驱动体系结构避免预选择顺序，优化(opting)取代“事件循环”。事件循环是处理关于用户和系统事件信息的中心化机理制。它包括事件排队和进程，用来检索并发送信息至各窗口组。
信息是操作系统怎样设法使多种应用与硬件同步，如鼠标定位和敲击键盘，MS-窗口的信息被转化为窗口事件处理程序。从程序来看，一条信息只是包含特别事件情报的数字结构。信息结构可以含有用作特别事件恒定标记的信息识别。例如，来自窗口对象的信息可以包括关于窗口产生，关闭，移动，和变大小的信息。辅助事件数据可以作为信息参数而得到；给定参数的确切解释根据每一所代表的事件类型而变化。
提供进程以检索来自系统排队的信息并将安们发送到合适的应用，接着应用可以开始处理任何到达的信息。每个窗口属于一特别窗口类型，其定义了某些这种类型窗口共有的特征。与每个类型相联系的是具有送到这类窗口的所有信息的窗口功能。提供应用排队，其中Windows可以放置属于特定应用的信息。当该应用已收到输入时，它只读在等待的信息。如果没有找到或如果以较高优先性存在，其它应用信息，Windows通过其它应用控制。
在事件系统中检索并发送信息的一般进程，如Mi-crosoftR WindowsTM，是本领域公知的，参见例如Petzold，C.，Programming Windows，第二版，Microsoft Press，1990和Custer，H.，Inside Windows NT，Microsoft Press，1993.辅助情报可以在由Microsoft Corp.，Redmond，WA购得的Mi-crosoft Window Software Development中发现。上文所引的每个文献的公开内容为所有的目的引作参考。
图33说明在控制计算机上实现的GUI。该GUI包括有工作空间1303的矩形窗口1301。在窗口顶部是选择单条线1305，其有用户命令选择1306和1313。每个这些命令选择包括含有控制合成仪操作命令的亚菜单。这些命令选择通过用鼠标调用合适的命令给用户提供了自动或手工完成合成的灵活性。
GUI设计注意到给用户一个好的环境，因此减小了程序控制合成仪的努力。例如一个对话框对象或一套对话框对象与每个命令相联系。当调用一个命令时，合适的对话对象显示在工作空间，人机联作地提醒使用者输入所需情报。一个Help命令1313提供情报有助于用户通过该程序。使用对话对象，用户不用使用成文命令即可操作合成仪。
图34说明了与宏指令(Macros)选择相联系的亚菜单1320。用户可以通过分别在亚菜单上题目1321或1322的鼠标定位而调用Learn或Run命令。在Windows环境中，宏指令是包含一套离散命令的对象。如与图16-24控制合成仪相关的讨论过的命令。使用Learn命令1321，用户可定义一宏指令来完成特定功能。亚菜单也可以识别调用可得命令设计的键笔画等效。例如“Alt＋L”用来执行Learn命令。
宏指令一旦“Learned”，Run命令1322可以被选择执行程序设计学习过的宏指令和其它已预先定义的宏指令。图35例示了当调用Run命令时显示的对话框对象。对话框对象包括1325(结合框)，其列出了可得的宏指令。为了选择一宏指令，用户在Selet Macro空间1324输入宏指令的名字。或者用户通过鼠标定位和制动上卷，直到选择空间1325中所需宏指令文件。然后用户在空间1326输入宏指令将被重复的次数。最后运行宏指令，用户在RunMacro按钮1327或RunSMacro按钮1328上定位鼠标。RunSMacro命令使系统顺序完成宏指令功能，即一次一个反应器。当选择Cancel选择1329时，退出对话框对象1326。Help选择1330根据对话框对象提供情报。
图36说明当选择单线条上Groups选择1310被选择时显示的亚菜单1335。亚菜单1330包括Define命令1331，它被用来定义一套与一组特定反应器相连接的阀。一旦定义后，阀组就被作为一组对象储存在储存器中。计算机储存器可以含有很多组对象，每一对象定义一特别的阀组。
亚菜单1330也包含一Open/Pulse命令1332以在预定时间周期装填和排泄选择反应器。当调用时，显示与Open/Pules命令相关的对话对象框。这个对话对象框有些类似于图35中所说明的，含有一结合框，其列出从中选择的可得组对象。用户选择所需组并输入脉冲由对话对象提供的设计空间中选择阀所需时间周期。为了装填反应器，用户在Open按钮上定位表明阀要开启。接着用户通过定位Pulse或Spules(顺序装填反应器)按钮开始装填过程。为排空反应器，用户定位Close按钮和Pules或SPules按钮。
使用Fill/Drain命令1333，使用者能用传感器自动装填或排空容器。当选择Fill/Drain命令时，显示了与Open/Pules命令相似的对话框对象。用户选择一组阀，并定位AutoFill或SAutoFill按钮完成装入功能或定位AutoDrain或SAutoDrain按钮排空反应器。在一些实例中，可提供Time Delay选择，在触发传感器后推迟阀闭合或开启。这一功能在传感器被触动时反应器还没有限好地达到所需含量的情况下特别有用。通过建立有特定延迟周期的延迟选择，反应器可适当地被装填。可以看出，与Group菜单相关的命令在选择组合合成中应用反应器仅给用户提供了灵活性。
图37说明了含有适于变化菜单选择的选择的亚菜单1340。产生的命令1341定义了一个可在宏指令中执行的变量。变量可典型地，例如在值，如时间，可以从一个合成至另一个变化的情况下应用。代替产生每个时间值的宏指令，一个变量可简单地定义成相应时间。使用建立的命令1342在每一合成循环之前，可将变量建立成所需值。
图38说明与Diagnostics选择相关的亚菜单1345。亚菜单1345包括Valves 1346，Sensor 1347，和Mix 1348命令，这些命令传递给用户提示控制合成仪并存联关于诊断目的合成仪的情报。当选择Mix命令1348时，开动涡旋马达混合反应器，进行用户规定的时间周期。
参照图39，当选择Valves命令时，显示Valve Diagnostic对话框对象1390。用户通过对话框对象1390通过选择所需阀对应的入口，可以控制合成仪中任何阀的操作。例如库1中的阀100可以通过在框1391上定位光标而开启。为了方便，所有阀可以通过选择Close All命令1397而闭合。一Can-cel命令1398关闭对话框对象1390。
图40说明相应于传感器命令的Sensor Diagnostics对话框对象1391。如所述，对话框对象1391含有一与每个传感器相关的框1396。框1396通知用户相应传感器状态。例如，如果框中是“X”，长时相应传感器接通。相反，空框表明传感器关闭。
图41说明当选择File选择时显示亚菜单1350。新命令1351产生一新合成建立文件控制进行合成，Modify命令1352使用户选择编辑用预存在合成文件。一旦合成建立文件完成，用户调用Save 1354或Save As命令1355将文件存在储存器中。Print命令1357打印选择合成文件。Print Setup命令1358配置打印机至所需规格，因此打印文件以美观规格出来。调用Exit命令1359退出File选择。
在某些实例中，如每一合成之前，或当选择一组新阀时，用户可能希望通过调用Load CFG文件命令1356而配置该系统。系统装载合适的文件告知哪个是要使用的合适的阀。事实上，CFG文件变换或将阀与每个选择反应器“联系”上。
图42-44说明用在产生和修饰一合成建立文件中的对话对象。参照图42，Set Assozciatedi对话框1360让用户通过检查含在空间1361中的合适的框选择所需反应器。为了方便，提供Check All按钮1362和Uncheck All按钮1362容易地选择或不选择所有反应器。Check Bank按钮1364a-1364d让用户选择所有属于特定库的反应器。当选择Cancel按钮时，退出合成建立程序。如先前解释的，Help按钮1369提供帮助用户通过该程序的情报。为继续合成建立过程，用户定位关闭Set Associate对话框对象的OK按钮1365并显示Syn-thesis Setup对话框对象。
图43说明Synthesis Setup对话框对象1370，用它来定义合成的Start Macro 1371，Loop Macro 1372和End Macro1372。Start Macro和End Macro，例如，包括每一合成步骤之前或之后洗涤反应器的命令。Loop Macro含有进行合成的命令。这些命令包括用氨基酸结构单元和寡核苷酸注入反应器，在母体容器中合并反应器内含物并混合它们生成小球悬浮液。将小球悬浮液分配给所选择反应器。注入，合并和分配步骤构成一个合成循环。根据在Number Synthesis Steps参数1374中输入的数重复合成循环。一旦定义了宏指令，用户通过定位OK按钮1375存起Synthesis Setup对话框对象内容并继续建立过程。用户还是可以定位Cancel按钮1376终止该过程。
图44说明了Amino & Oligo Setup对话框对象1380。可见，框含有与每个反应器相关的入口1381。用户在入口输入所需氨基酸符号和寡核苷酸码。例如，反应器1(RVo1)入口含有“V ATGCCGA”，将使合成仪向反应器1中注入氨基酸V和寡核苷酸ATGCCGA。输入合适码后，用户定位OK按钮1382完成建立的过程。提供Cancel钮1383退出该程序。可以看到，用合成建立程序容易建立合成库。
一旦完成合成建立，用户可以开始合成过程。参照图45，用户首先选择Synthesis选择1308，然后是Go命令1391开始该方法。或者，用户可建立一个单宏指令完成相似于合成文件中储存的功能。
参照图46，GUI显示在合成或宏指令执行期间状态屏幕1400。如所示，状态屏幕分成两个分离的区1401和1402。第一区1401显示与合成相关的情报，例如列出Start Macro，Loop Macro，End Macro的名字，另外Loop Number程序行1408通知用户合成中保持的循环的次数。
第二区1402显示现在正在执行的Macro文件名。如上所述，一个宏指令可以与另一宏指令嵌套以完成高水平功能。设计状态屏幕列出被称为10嵌套水平的1409a-1409j宏指令。可以提供Command程序行1410，Timing程序行1411，Message程序行1412，和RV′S程序行1413，来显示辅助状态或配置情报。例如，Command程序行可以显示哪个宏指令命令正在执行，当使用Message程序行时，显示用户预程序的成文信息。Timing程序行显示阀开启或闭合保持的时间。RV′S程序行告知用户使用哪个反应器。Time to Complete线条1414告知用户合成完成前剩余时间的百分比。
在合成或宏命令执行期间的任何时候，用户可以按预设计的功能键，即F12，接通“User Abort”状态。User Abort状态使用户暂停或执行不作为合成一部分定义的宏指令，而不用退出合成程序。当调用时，系统暂时地暂停执行，并显示UserAbort对话框对象1420，如图47说明的。在此刻，用户可插入执行任何宏指令。可通过在Select Macro框1421中敲入所需宏指令名称和在Run Macro按钮1422上定位鼠标而进行。
User Abort对话框对象也提供了一个Ignore按钮1424，它使用户继续使用合成程序，就好象该系统从未进入过UserAbort模态。一个跳跃选择1423指令系统在继续合成之前第一次跳跃宏指令中的当前命令。Retry按钮1425使系统从头执行当前宏指令。Abort按钮1426让用户退出合成。
图48说明与Edit命令相关的亚菜单1430。Edit命令使用户很容易通过选择列在亚菜单上的合适标题存取和改变各种对象。当选择Associate命令1431时，显示在储存器中储存的列为Set Associate对象的对话框对象。通过选择所需对象，显示Set Associate对话框对象。此时用户可用鼠标编辑对话框对象的内容。完成后，用户定位OK按钮存起修改文件。类似地，用户可以通过选择所需对象编辑Group，Macro，Vari-able，和Code对象。然后将选择对象放在编辑器中，让用户修改文件。
如上所提到的，传感器可以由于液滴的存在而偶然触动，这是一个问题，特别是当合成循环中使用的溶液含有高浓度气泡。为避免或减缓传感器的偶然触发，其灵敏性可设计程序。
传感器用Machine Config命令1456设计程序。这一命令显示有几个入口，Fill％，Drain％，Time Out％，和PtsAve的Config对话对象框。Fill％规定传感器保持接通测定何时反应器注满的百分数。例如，如果进入80％，传感器一定会接通其读数的80％。Drain％规定传感器保持关闭测定什么时候反应器排空的百分数。如一个实施例，如果进入20％，传感器一定是关闭其读数的80％。Time out规定在传感器接通或关闭之前延长的时间周期。PtsAve规定用来测定传感器接通或关闭的时间百分数的点数或读数。用户也可规定要读数的传感器或传感器组。之后，用户定位OK按钮，其根据参数自动配置系统。
图49是说明如图33-48所描述的控制软件的事件驱动体系程序框图。如图所示，作为合成仪的GUI心脏的I/OObject程序块有利于各对象程序块之间的接通。当启动这个控制软件时，一个程序块1460将配置文件装载到I/O Object程序块上。这些文件被用来配置Variable Object程序块1456，Lookup Table程序块1457，Macro Objects程序块1458，Group Objects程序块1459，Valve Object Array程序块1461，和Sensor Object Array程序块1462。
Lookup Table Objects程序块包括一用来指令阀和传感器对应其相应反应器的文件，这样以减少人工记录每一阀或传感器相应于特定反应器的地址。Variable ObjectS程序块存储定义的变量，而定义的组对象存在Group Objects程序块中。
Valve Object Array程序块存有识别系统中每一个阀的数组。为关闭或开启一个阀，I/O Oject程序块扫描Valve Ob-ject Array程序块输出一个控制特定阀的信号。为控制一组阀，I/O程序块与Group Objects程序块一起扫描Valve ObjectArray，让它发出合适的控制阀的信号。
Sensor Object Array程序块存有识别系统中每一个传感器的数组。I/O程序块可以通过扫描Sensor Object Array程序块读一个传感器，直到发现一个使其读一个特定传感器的匹配。为了读一组传感器，I/O和Group Objects程序块扫描Sensor Object Array程序块来测定要读的合适的传感器。
GUI也包括Dialog Box Objects程序块1453和SynthesisObject程序块1454。Dialog Box Objects程序块含有当调用某些命令时显示的对话框对象。Synthesis Object程序块存有当前合成建立文件。为完成不同合成，GUI将所需合成建立文件由存储器读入Synthesis Object程序块。相反，Synthesis Ob-ject程序块的内容被写入储存器存入合成建立文件。
Main Window Object(MWO)程序块1452与在屏幕上显示GUI′主窗口(Fig，33)的View Object程序块1455接通。响应用户命令的一条Message被发送到MWO。分析这一信息给出合适的要执行的命令。例如，如果接到Macro命令，MWO指令I/O对象从Dialog Box Objects程序块检索宏指令对话框对象，并从Macro Objects程序块检索宏指令目录，View Object程序块接到来自I/O程序块的情报并将其显示在GUI上。
在一实施方案中，如果计算机发生障碍，I/O程序块含有一Watchdog途经来关闭合成仪。例如，I/O对象程序块可以设计程序每2秒钟给合成仪一个脉冲。如果因为某些原因合成仪未收到这些脉冲，则可假设控制计算机发生故障而将关闭。
实施例
下面实施例更详细说明本发明但不限制本发明。实施例1：库的制备和筛选
本实施例说明树脂球上可组合肽合成产物怎样通过命名寡核苷配识别器标记接触与合成中每一氨基酸偶联步骤共同存在的小球而明确地给定的。每个标记转运在合成的特定步骤中被偶联的氨基酸单体，可以通过阅读小球上的标记来推断小球上肽的总序列。收集的小球可以筛选，用荧光激活细胞分选仪(FACS)与荧光标记的抗肽抗体结合。那些抗体与其紧密结合的小球可以用FACS分离，与各被分选的小球接触的寡核苷酸识别符可通过PCR扩增。扩增DNA序列被测定具有与具有高亲和性抗体结合的肽序列的同一性。通过结合高容，寡核苷酸编码为基础的信息储存，扩增方法学，和以荧光为基础的分选，本发明提供了一种确定由天然或非天然化学高分子链节合成的庞大分子库中每个分子本性的方法，及有效分离具有生物受体高亲和性配体的各小球的方法。
在该实施例中，单链寡核苷酸被用来编码使用L和D-氨基酸两者结构单元和10μm直径聚苯乙烯小球的可组合肽合成。寡核苷酸标记物具有高情报内含，适合于非常高灵敏性检测和译码，并在本发明方法中，对用于肽合成的试剂是稳定的。肽和寡核苷酸平行装配交替合成，这样每个小球具有许多单肽序列和独特寡核苷酸识别标记的复制物。寡核苷酸共享通常的5′-和3′-PCR引发位点，因此小球可作为PCR的模板。编码合成库含有大约8.2×105个七肽并筛选，以结合到抗强啡肽B单克隆抗体D32.39(参见Barrett &Goldstein，1985，Neuropeptides 6：113-120，这里引作参考)，用荧光激活细胞分选仪(FACS)选择牢固结合抗体的各小球。分选球上寡核苷酸PCR扩增作用后，DNA被测定序列以测定肽配体的特性。
A.试剂和一般方法
用在该项工作中的单分散10μm直径小球原料是由Pharmacia购得的，商业上合成的用1，12-二氨基十二烷连接剂功能化的大孔苯乙烯-二乙烯苯共聚物。该小球是没有用Pharmacia′s Gene Assembler Support连接剂衍生化的Phar-macia MonobeadsTM。参见Ugelstad和Mork，1980，Adv.ColloidInterface Sci.，13：101-140，这里引作参考。
所有保护氨基酸由Bachem Bioscience Inc.获得。PCR和测序引物用Applid Biosystems model 394寡苷酸合成仪合成。一些肽的可靠样品是用Applied Blosystems model 431A肽合成仪合成的，使用Fmoc-保护氨基酸，HBTU/HOBt就地化学活化，并用40∶1∶1TFA/水/乙二硫醇去保护。这些肽通过在Rainin C18反相柱上的HPLC(＞95％纯度)进行纯化，用水/乙腈/0.1％TFA为洗脱剂，用质谱证实结构。
B.69碱基寡核苷酸和阿片样肽强啡肽B的平行合成
阿片样肽强啡呔B的C末端七氨基酸片段H-Arg-Gin-Phe-Lys-Val-Val-Thr-NH2(RQFKVVT)(SEQ IDNO：2)与69链节寡核苷酸(ST08)在10μm直径小球上平行合成，ST08的序列是5′-ATC CAA TCT CTC CAC(ATC TCTATA CTA TCA)TCA CC[TA TC CT AT TT TIAC]CTC ACTCAC TTC CAT TCC AC-3′(SEQ ID NO：20)
该序列划线部分相应于PCR引物位点，而括号中的区与用于测序模板的引物同源。括号中14碱基序列代表模板编码区。
首先用琥珀酰亚胺4-O-DMT-氧化丁酸酯(分子探针)和N-Fmoc-2，4-二甲氧-4′-(羧甲基氧)-二苯甲基胺(即酸裂解Knorr羧酰胺连接剂)或N-Fmoc-Thr(tBu)-OH(用于非裂解实验)的1-氧化苯并三唑酯的混合物处理小球。分光光度测得小球上Fmoc-保护氨基与DMT-保护羟基残基的比例大约为20∶1。使用下面核苷的3′-甲基-N，N-二异丙基氨基磷酸酯在自动合成仪上，使小球进行寡核苷酸合成的20次循环：N6-Bz-5′-O-DMT-(7-去氮杂)-2′-脱氧腺苷(Berry和Associates，Ann Arbor，Michi-gan)，N4-Bz-5′-O-DMT-2′-脱氧胞苷和胞5′-O-DMT-胸腺嘧啶脱氧核)苷(Glen Research)。
然后将小球从合成仪中取出并用10％哌啶的DMF溶液处理5分钟示除Fmoc保护基。偶联上第一个氨基酸残基后(N-Fmoc-Thr(tBu)-OH)，用乙酐和1-甲基咪唑的DMF溶液处理小球以覆盖未反应的胺。所有的肽偶联反应进行20分钟，并含有0.11M Fmoc-氨基酸，0.1M HBTU，0.1M HOBt和0.3MDIEA的DMFF溶液。然后让小球进行两次合成仪上核苷酸加成的循环(用TCA进行脱三苯甲基作用，四唑催化的亚磷酸基化作用，用乙酐覆盖，用乙腈/水中的碘氧化)。重复氨基酸偶联和二核苷酸加成的顺序步骤，直到完成肽序列RQFKVVT(SEQ ID NO：2)和寡核苷酸编码区构建的合成。进行另外的35次寡核苷酸合成循环后，依次用哌啶/DMF(1∶9，8分钟)，硫代苯酚/三乙胺/二噁烷(1∶2∶2，4小时)，亚乙基二胺/乙醇(1∶1，55℃下处理5小时)，和TFA/水(20∶1，1小时)处理以对肽和寡核苷酸两条链完全去保护。在使用酸裂解连接剂的实验中，真空下浓缩TFA去保护反应上清液，然后分离的粗肽产品用HPLC分析。
C.编码库的构建
上面划线的平行合成化学用在了该库的构建中。通过将N-Fmoc-Thr(tBu)-OBt和琥珀酰亚胺4-O-DMT氧代丁酸酯的混合物偶联到所有小球上，如上所述，使本实验中肽合成位点不同于DNA合成位点。与ST08不同的库中寡核苷酸标记物序列只在编码区内。寡核苷酸ST08的3′-保守区首先在35mg(～1.75×108个小球)总球量上合成。去除Fmoc保护基，将小球质量分为七等份。每一等份偶联-个七个不同2-N-Fmoc-保护氨基酸(侧链保护基在括号中表示)：Ary(NG-Pmc)，Gln(Trt)，Phe，Lys(tBoc)，Val，D-Val和Thr(tBoc).然后让每一部分进行两次自动寡核苷酸合成。唯一确定每个不同氨基酸残基的增补二核苷酸的各序列是TA，TC，CT，AT，TI，CA和AC。然后将小球合并，充分混合，将全部小球进行Fmoc去保护。
小球分配，肽偶联，寡核苷酸二聚体合成，小球再化合，Fmoc去除这一循环总共重复七次。最后的Fmoc保护基未去除。或者，让合并的大量小球进行35次寡核苷酸合成循环。然后如上所述，库被完全去保护。
D.库染色和FACS分析
将库的一部分(典型地0.5-2mg小球)悬浮在封阻缓冲剂(PBS，1％BSA，0.05％Tween-20)中并在室温下保温1小时。通过离心小球沉淀成片状并再悬浮在mAbD32，39溶液(10mg/mL封阻缓冲剂)中。悬浮液在冰浴上保温30分钟，离心成片状沉淀，并用封阻缓冲剂洗涤。然后在冰浴上将小球悬浮在藻红蛋白缀合的羊抗鼠抗体(分子探针)溶液中二十分钟。小球在封阻缓冲剂中洗涤并在PBS中稀释，送至荧光激活细胞分洗(FACS)(Becton Dickinson FACStar Plus)。通过它们需要的荧光鉴别已与mABD32，39结合的球。来自最明显染色的库的0.17％和具有最低荧光量区(大约98％)两者的各小球被分类进入PCR miscrofuge小瓶。D32.39对小球的特性结合通过mAb与可溶肽Ac-RQFKVVT-OH(SEQ IDNO：2)D XTU IPE YA O 10M的预保温而被封阻。
E.球结合模板PCR
在生产者提供的具有0.2mM dATP，dCTP和dGTP，0.8mM dVTP，2mM每种引物，3单位Tag聚合酶(Promega)，和1单位尿嘧啶-DNA糖苷酶(Gibco BRL)的缓冲系统(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH9.o，0.1％Triton X-100，2mM MgCl2)(总体积为70L)中进行PCR扩增。引物序列5′-ATC CAA TCT CTC CAC-3′(SP13)(SEQ ID NO：21)和5′-(生物素)-GTG-GAA-TGG-AAG-TGA-3′(SP14)(SEQ ID NO：22)分别与ST08模板同源或互补。PCR反应由45个在95℃变性30秒，在50℃引物退火1分钟，在72℃延伸反应1分钟循环构成。用20％丙烯酰胺或2％低熔点琼脂糖凝胶中的电泳分析反应。
F.测定PCR产物序列
用链霉抗生素蛋白包裹的磁珠(Dynal，Inc.)分离来自各反应的生物素化的PCR产物。非生物素化链碱性洗脱后洗涤，每一小球样品用测序混合物处理。根据生产者的说明，使用引物5′-ATC TCT ATA CTA TCA-3′(SP15)(SEQ IDNO：23)和Bst聚合酶(Bio-Rad)进行双脱氧序列测定，不同的是使用了1∶100比例的脱氧与双脱氧核苷酸三磷酸酯(Pharmacia)。
G.肽结合亲和性的测定
各种肽对单克隆抗体D32.39的结合亲和性在一竞争结合实验中被测定。含有与CAMP依赖蛋白激酶共有区底物序列融合的D32.39的已知表位的痕量肽(LRRASL GGGRRGFKVVT(SEQ ID NO：24；50pM)被用[g-33P]ATP放射标记至高特异活性(参见Li etal.，1989，Proc.Natl，Acad，Sci.USA 86：558-562，这里引作参考)，并与各种浓度待测肽混合(10μM-1pM)。将肽混合物加入到用D32.39(0.1Gmg/mL)涂层的聚苯乙烯井中，样品在4℃保温2小时，用PBS洗涤井，记数与每个井有关的放射活性并用来制成竞争结合曲线。在测定条件下，IC50应接近肽的相关常数(Kd)。实施例2：噻唑烷并酮(thiazolidinones)的合成和稳定性研究
下面实施例涉及用本发明方法合成噻唑烷并酮。这一合成在U.S.专利申请号No.08/256090，申请申1994年6月23日的专利中更详细地说明，本文为所有目的引作参考。
A.制备双标记噻唑烷并酮
H2N-S-TentaGel(500mg)，一种商购聚苯乙烯树脂(Rapp Pdymere，Tubingen，Germany，1g，0.30mmol/g装载)，用Fmoc-Gly-OH在α-碳上进行标记(2-13C，99％，由Cambridge Isotope Laboratories Inc.，And Over，MA购得)。树脂用Ac2O覆盖，用哌啶去保护，以其OBt-活化的酯偶联Fmol-光连接剂。树脂再被覆盖，去保护，并与未标记的Fmoc-Gly-OH的酸酐反应。再进行覆盖和去保护生成游离胺树脂。与0.75M在碳基上标记的PhCHO(羰基-13C，99％；购自Cambridge Isotope Laboratorios，Inc.，Andover，MA)和2.0巯基乙酸的含3分子的ACN溶液在70℃反应2小时，生成双标记噻唑烷并酮树脂。将树脂充分洗涤(3×5mlCH2Cl2，3×5ml DMF，3×5ml CH2Cl2，3×5ml MeOH，3×5mlCH2Cl2，3×5ml Et2O)并在真空下干燥。
B.TFA稳定性研究
一部分树脂(20mg)用95％TFA 15％H2O处理1小时，然后用CH2Cl2，MeOH和Et2O洗涤。Gel-13CNMR分析树脂表明没有噻唑烷并酮的损失，如通过两个标记碳相对整合作用所证实的。见条1，图30。希望光连接剂或噻唑烷并酮的任何破坏会导致苄位碳上的整合作用的减少。这一实验表明噻唑烷酮的光连接剂对TFA处理是稳定的。
C.DNA合成稳定性研究
将一部分树脂(20mg)装载到标准DNA合成柱上，并以其氨基磷酸酯的形成(Phosphoramidites)应用A，C，和T核苷进行DNA合成的40次循环。每一循环后用碘氧化。在每一循环开始用2％TFA/CH2Cl2处理树脂去除“模型”二对甲氧三苯甲基(DMT)。由柱中取出树脂，用DMF洗涤，用硅胶-13CNMR谱分析。见图30，条A。所得图谱表明几乎设有或设有光连接剂或噻唑烷并酮分子的破坏。
一部分树脂(2mg)也在pH7.4 PBS缓冲液中进行了三小时光解，用HPLC分析释放出的噻唑烷二酮。见图31和图32，条A。数据表明噻唑烷并酮在高纯度下释放，并且用标准DNA合成试剂处理，光连接剂和噻唑烷二酮两者都不明显变化。实施例3：可组合合成
用合成装置可进行YGGFL的可组合合成。合成在反应器1-6中进行，7-9是不连接的。向小球中加入的六种氨基酸是L，E，G，Y，A和F。YGGFL和其它肽一起规定。将小球加到母体容器中(29.5mg)并悬浮在DMF中。每次合成循环包括再分布，肽偶联，覆盖，胺去保护，去保护后FMOC的收集，用DMF淋洗，及在母体容器中再组合这几步。
合成后，将标记Hettz抗体引入混合的小球。Hertz抗体大部分与YGGFL结合。FACS分析证明YGGFL的存在，证明这种规定结合是在合成仪中合成的。本实验证明肽的异收集，包括YGGFL链，可通过合成仪规定并合成。
尽管本发明为了清楚和理解的目的以说明书和实施例的方式详细进行了说明，但很明显在增补的权利要求书范围内可进行一些变化和修饰。实施例4：使用本发明仪器测定小球分布
为测定母体容器中的混合小球是否被均匀地分布到反应器中，将一些小球生物素化。人工将生物化球放在一个反应器中。非生物素化球人工放置在另8个反应器中。合成仪将9个反应器中的球送至母体容器。从母体容器中取一样品，让带荧充的链霉抗生物素蛋白与生物素化小球上的生物素结合。荧光激活细胞分选仪(FACS)分析证明母体容器中大约9.1％的小球被生物素化。然后将小球再分配于9个反应器，每个容器中生物素化小球对总的小球的百分比用FACS分析仪测定。表5表明每个反应器中混合小球具有与母体容器大约相同的生物素化小球与总的小球的比例。
           表5
荧光球百分含量
   母体反应      9.1
      1      9.7
      2      9.7
      3      9.4
      4      8.7
      5      9.4
      6      8.9
      7      9.1
      8      8.9
      9      9.3
    平均值      9.2
    标准装置      0.32
应该明白上述描述只为了说明而不作为限制。通过上述说明，很多具体实例对于本领域熟练技术人员来说明显而易见的，因此本发明范围应该不受上述说明的局限，而应该参照权利要求书以及等价于权利要求书权利的全部范围。
                  序列表(1)综合信息：
(I)申请人：AFFYMAX TECHNOLOGIES N.V.
(II)发明名称：Synthesizing and Screening Molecular Di-versity
(III)序列数目：24
(IV)联系地址：
  (A)地址：Townsend and Townsend Khourie and Crew
  (B)街道：One Market Plaza，Steuart Tower，Suite2000
  (C)城市：San Francisco
  (D)州：California
  (E)国家：USA
  (F)邮编：94105
(V)计算机可读形式
  (A)媒体类型：Floppy盘
  (B)计算机：IBM PC兼容机
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release # 1.0，Version # 1.25
(VI)流程应用数据：
  (A)申请号：
  (B)申请日：
  (C)分类：
(VII)优先权数据
  (A)申请号：US 08/146，886
  (B)申请日：1993.11.02
(VII)优先权数据
  (A)申请号：US 08/149，675
  (B)申请日：1993.11.02
(VIII)代理人/事务所情报
  (A)名称：Norviel，Vernon A.
  (B)登记号：32，483
  (C)参考/摘要号：16528J-000740PC
(IX)电讯信息：
  (A)电话：415-326-2400
  (B)电传：415-326-2422(2)SEQ ID NO：1的情报：
(I)序列特征
  (A)长度：13氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)股数：单链
  (D)拓扑结构：线性
(II)分子类型：肽
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(I)序列特征
  (A)长度：7氨基酸
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(II)分子类型：肽
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Arg Gln Phe Lys Val Val The
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(I)序列特征
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(I)序列特征
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(I)序列特征
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(I)序列特征
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(I)序列特征
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(I)序列特征
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(I)序列特征
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(I)序列特征
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(II)分子类型：肽
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(I)序列特征
  (A)长度：8氨基酸
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(I)序列特征
  (A)长度：8氨基酸
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(I)序列特征
  (A)长度：69碱基对
  (B)类型：核酸
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(II)分子类型：DNA(寡核苷酸)
(XI)序列描述：SEQ ID NO：20：
ATCCAATCTC TCCACATCTC TATACTATCA TCACC-TATCC TATTITTACC TCACTCACIT CCATTCCAC(2)SEQ ID NO：21的情报：
(I)序列特征
  (A)长度：15碱基对
  (B)类型：核酸
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(II)分子类型：DNA(寡核苷酸)
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ATCCAATCTC TCCAC(2)SEQ ID NO：22的情报：
(I)序列特征
  (A)长度：15碱基对
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(II)分子类型：DNA(寡核苷酸)
(XI)序列描述：SEQ ID NO：22：
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(I)序列特征
  (A)长度：15碱基对
  (B)类型：核酸
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  (D)拓扑结构：线性
(II)分子类型：DNA(引物)
(XI)序列描述：SEQ ID NO：23：
ATCTCTATAC TATCA(2)SEQ ID NO：24的情报：
(I)序列特征
  (A)长度：17碱基对
  (B)类型：氨基酸
  (C)股数：单链
  (D)拓扑结构：线性
(II)分子类型：肽
(XI)序列描述：SEQ ID NO：24：
Leu Arg Arg Ala Ser Leu Gly Gly Gly
1               5
Arg Arg Gln Phe Lys Val Val Thr
10                  15

Claims (39)

1.一种合成大量底物上多种分子的方法，由以下步骤组成：
将所述底物分布在多个反应器中；
用不同试剂在每个所述反应器中将所述各种分子的第一部分与所述反应器中的所述底物偶联；
将所述底物通过流送管送到混合器再中并混合所述底物；
将所述底物通过所述流送管从所述混合器分布到所述反应器中；
将所述各种分子的第二部分与所述分子的所述第一部分偶联生成所述底物上的各种分子。
2.权利要求1的方法，其中所述再分布步骤。包括通过共用管道再分布至少一部分所述底物。
3.一种固相载体上平行偶联反应的仪器，包括：
母体容器；
至少一个与母体容器相连的反应器库，所述反应库含有大量平行进行偶联反应的反应器；
所述母体容器和反应器间有大量流送管，所述流送管形成所述反应器和所述母体容器间的流路；
将试剂送至所述反应器库的输送系统；和
在所述母体容器和所述至少一个反应器库之间协调转移所述固相载体的可编程计算机。
4.权利要求3的仪器，进一步包括一共用管道，所述共用管道与至少一个所述大量流送管连接。
5.权利要求3的仪器，其中所述输送系统进一步包括将试剂由仪器的第一部分输送到仪器第二部分的装置，所述第一部分具有比第二部分高的压力。
6.权利要求3的仪器，其中所述反应器库进一步包括平行搅拌所述大量反应器内含物的装置。
7.权利要求3的仪器，其中所述反应器库进一步包括响应来自所述可编程计算机命令信号的阀装置，用以以平行方式以第一模式将所述试剂输送到选择所述大量反应器中，并用以以第二模式顺序将试剂输送至选择所述大量顺序反应器中。
8.权利要求3的仪器，其中所述母体容器，所述的应器库，和所述输送系统在所述平行偶联合成反应中密闭隔离大气。
9.权利要求4的仪器，进一步包括在所述母体容器和所述大量反应器之间移运所述固相载体的阀，所述阀是在所述母体容器和所述大量反应器间移运期间所述载体通过的唯一阀。
10.权利要求9的仪器，其中所述反应器库进一步包括响应来自所述可编程计算机命令信号的阀装置，用以以平行方式以第一模式将所述试剂输送到选择所述大量反应器中，并用以以第二模式顺序将试剂输送至选择所述大量顺序反应器中。
11.一种在小球上平行进行偶联反应的方法，所述方法包括：
将所述小球悬浮液由母体容器转移到大量反应器中；
在所述大量反应器中在所述小球上进行所述偶联反应；
将所述小球由大量反应器转移到所述母体容器；并且混合所述小球。
12.权利要求11的方法，其中所述步骤重复预测定次数。
13.权利要求11的方法，其中所述转移步骤进一步包括通过共用管道转移至少一部分所述小球步骤。
14.一种在检测基本上半透明管中液体存在的用于光学检测器的光顺序序列模块，所述光顺序序列模块包括：
控制来自所述光检测器发送机的光束通过所述管中心到所述光检测器接收器部分的设置；和
抑制由所述光检测器发送机发射的除所述充束外的到达所述检测器接收器部分。
15.权利要求14的光顺序序列模块，其中所述控制设置包括一通过光顺序序列模块的针孔开口。
16.权利要求15的光顺序序列模块，其中所述光学检测器有两个插头，发送机连在第一插头上，接收器连在第二插头上，所述光学顺序序列模块进一步包括：
摩擦接合所述两个插头之间的光顺序序列模块的设置；和
放置所述管使所述针孔开口纵向轴和所述管径向轴以90度角交切的设置。
17.权利要求14的光顺序序列模块，其中所述控制设置进一步包括在发送机和所述光学检测器的接收器之间定位所述管的装置。
18.输送试剂的输送系统，包括：
一个具有第一端口和第二端口的2-端口阀；
一个具有一个第一通道和一个第三端口的3-端口阀；
响应可编程计算机的设置，用来选择地允所述第三端口与所述第一通道联通；
响应所述可编程计算机的设置，用以选择地允许所述第一端口与所述第二端口联通；和
将所述第一端口与所述第一通道密封连接而形成管道的设置。
19.权利要求14的系统，其中所述第三端口与载有试剂的第一管连接，而另一所述第一端口和所述第二端口与载有氩气的第二管连接，其中所述第一管载着所述试剂到所述管道或流出所述管道。
20.一种在小球上进行偶联反应的可组合合成设备，包括：
至少一个反应器库，所述反应器库包括大量反应器和大量单体储器，每个所述储器与一个所述反应器相关联；和
一个共用试剂储器，所述共用试剂储器与所述至少一个反应器库连接通过共用管道将共用试剂输送到所述大量反应器中。
21.一种合成标记分子库的方法，其中库中每一不同分子与一固相载体共价连接，并用一个或多个不同标记物标记，其中每个所述一个或多个不同标记物含有一变化烃区和一分子钩，每个标记物也是共价与所述固相载体连接，所述方法包括：(a)以随机方式在大量反应器间分配载体；(b)将每个反应器中的载体暴露于第一化学结构单元；(c)合并载体；(d)在大量反应器间随机分配载体；(e)将每个反应器中的载体暴露于一个化学结构单元；和(f)重复步骤(a)至(e)至少一次至二十次。
22.权利要求21的方法，其中所述固相载体是一接头。
23.权利要求21的方法，其中所述固相载体是MonobeadTM。
24.权利要求21的方法，其中所述分子通过一接头与所述固相载体连接。
25.权利要求24的方法，其中接头是可裂解的。
26.权利要求21的方法，其中每个所述一个或多个不同标记物含有：
一个将每个所述一个或多个不同标记物与所述固相载体连接的可裂解接头；
一个分子钩；和
一个连接所述接头和所述分子钩的可变长度烃链。
27.权利要求21的方法，其中所述每个一个或多个不同标记物具有下式：其中n是1至10的整数，X是可裂解接头，R是一分子钩。
28.权利要求27的方法，其中X是光裂解接头。
29.权利要求21的方法，其中所述分子钩选自生物素，可活化基团和高缔合肽组成的组。
30.一种筛选权利要求25标记分子库的方法，其中所述分子从所述固相载体上裂解，并与受体在有利于将配体结合到所述受体上的条件下温育。
31.权利要求30的方法，其中所述分子是肽，所述固相载体是直径为大约50至大约500μm的小球，所述可裂解接头是一可裂解接头的混合物，而且只有所述小球上的一部分所述分子在所述温育步骤前裂解。
32.一种合成含有大量不同成员合成肽库的方法，每一成员包括由与小球连接的氨基酸单体序列合成的肽，所述小球也连接一个或多个寡核苷酸识别标记物，识别所述肽的单体顺序，其中所述氨基酸单体用Fmoc保护并用哌啶去除Fmoc保护基，改进措施包括用5-15％哌啶处理5-60分钟或用15-30％哌啶处理1至30分钟有效去除Fmoc。
33.权利要求32的改进措施，其中所述小球具有大约10μm直径，并且由十二烷基胺接头衍生的大孔苯乙烯-二乙烯苯共聚物组成。
34.权利要求32的改进措施，其中所述小球是MonobeaduTM。
35.权利要求32的改进措施，其中所述氨基酸单体具有侧链(tBu)侧链保护基，用TFA去除所述(tBu)侧链保护基，且所述寡核苷酸标记物包括7-去氮杂-2′-脱氧腺苷。
36.一种检测权利要求26方法中存在一种或几种不同标记物的方法，该方法包括：
从所述固相载体上裂解一个或多个不同标记物；
固定一个或多个不同标记物；
在所述一个或多个不同标记物上偶联一可扩增的，可检测的基团到所述分子钩上；
扩增该可扩增，可检测基团；并且
检测所述可扩增可检测基团的存在，其中存在可扩增可检测基团说明存在一个或多个不同标记物。
37.权利要求35的方法，其中所述可扩增，可检测基团含有能与所述分子钩结合的寡核苷酸序列。
38.一种测定连接到权利要求21标记分子库中固相载体的分子的合成序列的方法，该方法包括各个测定所述一个或多个不同的与所述固相载体连接的标记物的存在，所述一个或多个不同标记物的存在或不存在表明是否发生了所述分子合成顺序中特定的合成步骤。
39.权利要求38的方法，其中所述一个或多个不同标记物的所述各个检测包括：
根据其结构，物理分离所述一个或多个不同标记物，所用分离形式来自所述一个或多个不同标记物；
固定所述一个或多个不同标记物，以保持所述分离形式；
用寡核苷酸序列处理所述标记物，所用寡核苷酸序列选择地结合所述一个或多个不同标记物；
扩增所述寡核苷酸序列；
检测所述寡核苷酸序列的存在，其中所述寡核苷酸序列的存在与不存在表示出所述一个或多个不同标记物的存在与不存在；
通过在所述分离形式中所述一个或多个不同标记物的相对位置识别所述一个和多个不同标记物的存在；和
将所述一个或多个不同标记物的存在与不存在与所述分子合成顺序中特定合成步骤的发生联系起来。
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