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CN113226353A - 治疗与抗中性粒细胞胞质抗体相关的疾病的体外装置和方法 - Google Patents

治疗与抗中性粒细胞胞质抗体相关的疾病的体外装置和方法 Download PDF

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CN113226353A CN201980085313.2A CN201980085313A CN113226353A CN 113226353 A CN113226353 A CN 113226353A CN 201980085313 A CN201980085313 A CN 201980085313A CN 113226353 A CN113226353 A CN 113226353A
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斯蒂芬·F·马里诺
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Gambro Lundia AB
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Abstract

本发明涉及一种血液处理装置，其被配置为在体外血液回路中从有需要的人的血液或血浆中去除抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)，其中该装置包括基质，并且其中所述基质包含单体形式的蛋白酶3(PR3)。本发明还涉及包括本发明的血液处理装置的体外血液回路，以及用作药物的血液处理装置或治疗与ANCA相关的医学病症的方法。

Description

治疗与抗中性粒细胞胞质抗体相关的疾病的体外装置和方法
技术领域
本发明涉及从患者的血液或血浆中体外去除抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)和相关装置的领域。
本发明涉及一种血液处理装置，其被配置为在体外血液回路中从有需要的人的血液或血浆中去除抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)，其中所述装置包含基质，并且其中所述基质包含单体形式的蛋白酶3(PR3)。本发明还涉及包括本发明的血液处理装置的体外血液回路，以及用作药物的血液处理装置或治疗与ANCA相关的医学病症的方法。
背景技术
人体免疫系统的基本组成包括在血流中自由循环的抗体分子(免疫球蛋白)。这些抗体，主要是G型免疫球蛋白(IgG)，是由B细胞产生的，所述B细胞之前已经暴露于靶分子，即抗原，所述抗原已被确定为身体的“外来物”。抗体分子有两个功能部分，即专为结合特定靶标而设计的抗原结合位点和效应子部分，其可以被认为是一个标签，并且可以被免疫系统的其他组件识别，然后破坏抗体结合的靶标。
抗体的B细胞激活和优化过程已经进化到消除产生抗体分子的B细胞，这些抗体分子可以识别患者自身存在的抗原，即所谓的“自身抗原”；这通常可以防止免疫系统对身体自身发起攻击。然而，确实有许多疾病是由这种针对自身抗原的抗体引起的，通常称为自身抗体。目前尚不清楚为什么一些被自身抗原激活的B细胞逃避消除，但结果可能很严重。在患有此类自身免疫性疾病的患者中，免疫系统会攻击身体自身的分子，导致组织损伤，从而导致重度残疾或死亡。
在一组自身免疫性疾病中，通常被称为ANCA-(抗中性粒细胞胞质抗体)相关血管炎(AAV)，产生的自身抗体可以与存在于中性粒细胞表面的抗原结合(Thieblemont，N.etal，(2016)Seminars in Immunology 28:159-173)。
中性粒细胞是最丰富的白细胞(占总白细胞池的40-70％)，代表了在损伤部位和大表面积粘膜暴露(例如，在肺部)于外部时抵御病原体的第一道防线。它们可以通过数种方式识别和破坏病原生物体，包括通过控制释放储存在称为颗粒的细胞内膜结合结构中的细胞毒性蛋白质和肽。这些颗粒与质膜的融合-以及它们的细胞毒性内容物的伴随释放(称为脱颗粒的过程)-通常是一个严格控制和局部化的过程。毒素被释放到中性粒细胞周围的环境中，这些中性粒细胞通过识别病原体而被“激活”。这些细胞毒素旨在杀死已识别的生物体，但也会对周围的健康组织造成损害。
在ANCA血管炎患者的情况下，即使没有识别病原体或外来抗原，ANCA与中性粒细胞表面上的抗原结合也会激活中性粒细胞进行脱颗粒。这种不受控制的脱颗粒可能发生在ANCA与中性粒细胞相遇的身体的任何部位，由此产生的细胞毒素释放会导致全身组织损伤，其主要影响小血管。皮肤、肺和肾脏等器官-包含大量小血管-遭受严重损害，导致其衰竭，并最终导致患者死亡。
鉴于ANCA是这些疾病的病原体，标准治疗旨在降低血液中的免疫球蛋白浓度。这通常是通过施用免疫抑制药物和/或非特异性靶向患者的产生抗体的B细胞来实现(Luqmani，RA (2014)Frontiers in Immunology 5:1-9)。虽然这种治疗对于暂时缓解症状是有效的，但它显然是非特异性的：治疗会引起全身免疫抑制，包括所有免疫球蛋白水平的降低，从而大大削弱患者的体液免疫。由于免疫系统受损，大多数ANCA患者因此遭受感染甚至死于感染。
在重度疾病的情况下，患者接受称为血浆置换术的程序，其中血液的整个液体部分，即血浆，与体外的血细胞分离并丢弃。分离的细胞被保留，与血浆替代品混合并重新注入。这种治疗也有效地消除了血液中的致病性免疫球蛋白，但代价很大：患者血浆中的所有免疫球蛋白和其他有益物质都被消除了。这也导致疾病症状的暂时缓解，但同样以体液免疫为代价，增加了感染的风险和对血浆替代流体成分过敏反应的风险。
根据现有技术中建立的方法，显然更具选择性的程序，即仅针对致病性抗体(ANCA)的特异性靶向，将对AAV患者大有裨益。特定程序将仅消除引起疾病的ANCA，同时保留剩余的免疫球蛋白补体和患者的体液免疫完整。这样的程序也不会增加过敏反应/感染的风险。预期特异性去除致病性自身抗体不仅会提高标准治疗的效果，而且还可能会强化不太严格的免疫抑制方案，从而更长时间地保持患者的天然免疫系统功能，并相应地减少辅助治疗/感染导致的死亡。
最常见的ANCA抗原之一是丝氨酸蛋白酶蛋白酶3(PR3)。PR3是一种颗粒成分，但也发现它粘附在中性粒细胞质膜的外部-因此它可接近PR3-ANCA。例如，针对嗜中性粒细胞和单核细胞的蛋白酶3(PR3)的IgG类ANCA似乎通过导致过度的嗜中性粒细胞活化和血管壁破坏直接参与血管损伤的病理生理学。现在认识到PR3-ANCA在大约80％的韦格纳肉芽肿患者中被发现，也在大约35％的显微镜下多血管炎、Churg-Strauss综合征和肾限制性快速进展性肾小球肾炎患者中被发现(Wiik A.(2000))Arthritis Res 2(4):252-254)。
在溶液中，PR3以大的异质低聚体物质形式存在，并且容易沉淀(Jerke，U.，等(2017)Scientific Reports 7:43328)。此外，在ELISA诊断领域尝试开发基于PR3的ANCA自身抗体捕获试剂时，PR3遇到了多种困难。例如，由诱变、可变细胞内加工或纯化程序引起的PR3分子构象变化会影响其被ANCA自身抗体的识别，因此降低了PR3蛋白在捕获、检测或消耗PR3ANCA自身抗体中的适用性。
考虑到上述困难，在治疗ANCA相关医学病症的领域存在对于开发用于选择性去除致病性PR3自身抗体的改进手段的显著需求。
发明内容
鉴于现有技术，本发明所基于的技术问题是提供用于治疗ANCA相关医学病症的替代和/或改进方法。因此，本发明的一个目的是提供从有需要的患者中减少、优选去除PR3ANCA自身抗体的手段。本发明试图提供这样的手段，同时避免现有技术中已知的缺点。
该问题由独立权利要求的特征解决。本发明的优选实施方式由从属权利要求提供。
本发明因此涉及一种血液处理装置，其被配置为在体外血液回路中从有需要的人的血液或血浆中去除抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)，其中该装置包括基质，并且其中所述基质包含单体形式的蛋白酶3(PR3)。
在分析已知的PR3聚集特性的过程中，本发明人制备了PR3的变体，其主要作为溶液中的单体存在并且显示出显著降低的聚集行为。
在一些实施方式中，PR3特性的这种根本变化是由于PR3蛋白的一级序列的微小变化。在一些实施方式中，单个氨基酸取代足以减少寡聚化。在其他实施方式中，设想来自野生型PR3蛋白的氨基酸序列的一个或多个改变以提供单体形式的PR3。
在一种实施方式中，本发明涉及如本文所述的血液处理装置，其中单体形式的蛋白酶3(PR3)是可溶的，并且当存在于生理条件下，例如当PR3蛋白未结合于设备的基质或包含在装置的基质中，即当蛋白质在生理溶液中游离时，相比于低聚物，单体形式的蛋白酶3(PR3)优先形成单体。生理溶液是技术人员已知的，例如在PBS或其他类似缓冲液中。
在一种实施方式中，单体形式的PR3是指不包含野生型人PR3序列的PR3蛋白。在一些实施方式中，单体PR3蛋白包含突变PR3序列，另外称为PR3变体或变体序列。当所述单体PR3存在于装置中时，即包含或结合在基质(基质固定的物质)中，通常认为蛋白质是不可溶的，因为固定到固相上使PR3变体不再可溶。
单体形式的PR3使操作更容易、重组生产更可靠、减少了分离足够量PR3的难度、降低了制造设备的难度、更可靠地固定到基质/载体上，并且由于避免了聚集体而更有效地去除ANCA。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置包含单体形式的蛋白酶3(PR3)，其至少包含Ile221处的突变。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置包含单体形式的蛋白酶3(PR3)，其至少包含Ile221和/或Trp222处的突变。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置包含单体形式的蛋白酶3(PR3)，其至少包含Ile221和Trp222处的突变。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置包含单体形式的蛋白酶3(PR3)的，其包含Ile221Ala和/或Trp222Ala突变。
在一些实施方式中，在获得PR3单体变体时，将SEQ ID NO 1的wt人PR3序列用作本文提及的氨基酸序列变化的参考序列。
技术人员未预料到的是，与wt PR3蛋白相比，一级氨基酸序列的这种微小变化会导致优先单体形成的组合有益特性，从而导致改善的溶解性和易于处理，结合适当结构的维持以向临床相关的抗PR3自身抗体呈递表位，并且进一步显示当固定在如本文所述的装置的基质中时这些特性的维持。有益特性的这种组合使得在根据本发明的分离性输血(apheresis)或血液过滤程序中使用单体PR3蛋白(优选修饰的PR3氨基酸序列)的这种迄今为止未被建议的方法成为可能。
尽管氨基酸序列的变化对PR3溶解度产生显著影响，但它们不会另外改变已测量的酶的野生型特性。
在一些实施方式中，变体具有蛋白水解活性(因此正确折叠)，与PR3的唯一确认的结合配偶体中性粒细胞受体CD177相互作用，并被多种抗PR3单克隆抗体(图2)有效识别为野生型PR3分子。这些特性使得能够在血液处理装置中使用如本文所述的基本上单体的PR3，该血液处理装置被配置为从人的血液或血浆中去除抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)，优选地使用体外血液回路。技术人员未预料到通过突变破坏聚集仍然能够针对临床相关的ANCA形成正确的表位，同时所述修饰的蛋白质被固定。因此，本发明代表了基于有益特性的组合的惊人成功。
因此，本文所述的PR3变体是用于制备选择性PR3-ANCA去除装置，或“过滤器”的改进试剂，可与血浆置换治疗结合使用以从患者的血液、血清或血浆中去除致病性PR3-ANCA。
在一些实施方式中，一个或多个变体可以共价连接到例如装在药筒中的惰性固体载体，药筒可插入到血浆置换或透析装置中。在一些实施方式中，在血细胞与血浆的标准分离之后，血浆可以通过该ANCA吸附基质，其中变体可以特异性地从血浆中捕获循环的PR3-ANCA，然后可以重新注入。
这种手术不仅具有仅靶向性地去除病原体物质的好处—从而保持体液免疫完好无损—而且由于重新注入了患者自己的血浆，这种手术的改进不会带来额外的过敏反应或感染的风险。在一些实施方式中，通过以多个取向连接PR3变体(完全加工和折叠两者和/或未加工、部分折叠)来制备基质，以允许多个可能的ANCA表位可及，从而使得基质可以从特定患者的血浆中特异性去除大部分可能的PR3-ANCA。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置包含单体形式的蛋白酶3(PR3)，其包含降低或消除蛋白酶活性的突变。
在一些实施方式中，单体形式的蛋白酶3(PR3)包含以下突变，其选自在His71、Asp118和/或Ser203，更优选His71Glu、Asp118Ala和/或Ser203Ala处的一个或多个突变。
在这些实施方式中，变体包含替代催化作用的丝氨酸(例如替换为丙氨酸(S203A))的进一步突变，以便消除酶的蛋白水解活性，从而也消除在通过基质过程中处理血清蛋白的任何可能性。在一些实施方式中，该突变不影响蛋白质的正确折叠或ANCA对其的识别。
在一些实施方式中，本发明因此涉及在氨基酸序列中具有一个或多个以下变化的PR3蛋白及其在血液处理装置中的应用，即位置变化：
Ile221、Ile221+Trp222、Ile221+His71、Asp118和/或Ser203处的一个或多个变化，或Ile221+Trp222+His71、Asp118和/或Ser203处的一个或多个变化。
在上述实施方式中，设想了在给定位置处的任何氨基酸变化导致本文所述的特性，即优选地基本上是单体形式的PR3，与野生型人PR3相比，在生理条件下具有改善的溶解度，而对PR3-ANCA自身抗体结合没有显著的不利影响。如果上述特性是明显的，则本发明的PR3序列可以包含一个或多个额外的氨基酸序列变化。
在一些实施方式中，本发明因此涉及在氨基酸序列中具有一个或多个以下变化的PR3蛋白及其在血液处理装置中的应用，即特定变化：
Ile221Ala、Ile221Ala+Trp222Ala、Ile221Ala+His71Glu、Asp118Ala和/或Ser203Ala中的一个或多个，或Ile221Ala+Trp222Ala+His71Glu、Asp118Ala和/或Ser203Ala中的一个或多个。
在本发明的一些实施方式中，PR3序列的赖氨酸残基(K115、K195和/或K253)可以如在wt PR3序列中一样保持或修饰，以改变与基质的结合特性。赖氨酸残基修饰将取决于用于将单体PR3固定到基质(即固体载体)上的化学键合。下面更详细地描述连接模式和化学的细节。
在一些实施方式中，当使用胺化学(基本上利用胺键的任何化学)时，赖氨酸作为与基质/载体的连接点。在一些实施方式中，可以修饰一个或多个赖氨酸残基以防止固定在修饰的赖氨酸上，从而指导分子的连接特性。
在一些实施方式中，关于固定的三个赖氨酸的行为没有差异(即没有特定的赖氨酸是优选的，因此以这种方式连接的PR3变体以分子表面上的三个赖氨酸位置允许的所有可能方向固定)。在这些实施方式中，所有可能的表位都可用于最终基质中的ANCA。
然而，考虑到两个赖氨酸在分子的同一面上紧密定位在一起，在一些实施方式中，当考虑基质上的整个分子集合时，固定是不均匀的。
在其他实施方式中，一个或多个赖氨酸残基被突变(在wt PR3序列上K115、K195和/或K253改变)，优选突变为精氨酸，从而保持正电荷并且从而基本上不改变任何可能的表位(包括该表位残留物)的特性。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置包含单体形式的蛋白酶3(PR3)，其包含在K115、K195和/或K253，优选K115R、K195R和/或K253R处的一个或多个变化。
在一些实施方式中，如果上述特性是明显的，则本发明的PR3序列可以包含一个或多个额外的氨基酸序列变化，即优选基本上单体形式的PR3，与野生型人PR3相比，在生理条件下具有改善的溶解度，而对PR3-ANCA自身抗体结合没有显著的不利影响。
在本发明的实施方式中，PR3蛋白包含根据SEQ ID NO.1(见下文)的氨基酸序列的变异或由其组成，该变异表现出单体性质。
在优选的实施方式中，单体PR3蛋白是SEQ ID NO 1，其中已经进行了本文提到的特定氨基酸变化(例如Ile221Ala、Ile221Ala+Trp222Ala、Ile221Ala+His71Glu、Asp118Ala和/或Ser203Ala中的一个或多个，Ile221Ala+Trp222Ala+His71Glu、Asp118Ala和/或Ser203Ala中的一个或多个)。
在一些实施方式中，单体PR3的优选序列涉及SEQ ID NO 2、3、4、5、6或7。
在一些实施方式中，所采用的PR3相似序列在功能上与这些PR3序列等效，换言之，这种功能等效性由结合ANCA并表现出单体性质的能力定义。
本发明还包括本文所述的氨基酸序列长度的变化。技术人员能够提供比SEQ IDNO 2、3、4、5、6或7更长或更短的氨基酸序列变体，其仍将表现出与本文所述的单体PR3变体足够的相似性，以提供所需的结果。例如，包含比全长形式少10、20、30、40、50或最多100个氨基酸的SEQ ID NO 2、3、4、5、6或7的较短变体也可以实现有效的ANCA结合，如本文所述。因此也考虑PR3的片段。此外，比天然PR3序列多任意给定的额外序列的包含10、20、30、40、50或最多100个氨基酸的SEQ ID NO 2、3、4、5、6或7的更长变体也可以实现有效结果，如本文所述。
在本发明的其他实施方式中，所采用的PR3蛋白可包含与SEQ ID NO 2、3、4、5、6或7具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。优选地，序列变体包含与SEQ ID NO 2、3、4、5、6或7至少80％、90％、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列同一性，并且优选地表现出与本文描述的单体PR3蛋白的功能相似性。在优选的实施方式中，采用的单体PR3蛋白与SEQ ID NO 2、3、4、5、6或7具有至少80％、90％、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列同一性，并且包含与SEQ ID NO 1相比的至少一个氨基酸差异，优选通过以下的一个或多个氨基酸取代：在Ile221、Ile221+Trp222、Ile221+His71、Asp118和/或Ser203处任选地一个或多个氨基酸取代，或Ile221+Trp222+His71、Asp118和/或Ser203处任选地的一个或多个取代，以及在K115、K195和/或K253，优选K115R、K195R和/或K253R处的一个或多个变化。
本发明的一个目的是提供一种适于从患有ANCA相关疾病的患者的血液或血浆或其他血液衍生样品中去除至少一种结合PR3的ANCA的血液处理装置。在一些实施方式中，该装置被配置为通过将ANCA固定在基质上而从患者的血液或血浆中体外去除所述ANCA，所述基质与患者的所述血液或血浆接触并且其中基质包含载体和单体PR3。在一些实施方式中，载体可由膜、树脂或无纺布组成，并且单体PR3对本文所述的ANCA具有高结合亲和力。例如，单体PR3可以通过离子相互作用或络合共价固定在载体上。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于，所述基质包括结合单体形式的蛋白酶3(PR3)的载体，其中载体包括或由选自由以下组成的组中的材料组成：中空纤维膜、平板膜、纤维垫、树脂、无纺布和开孔泡沫，例如聚氨酯(PU)泡沫。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于，所述载体是树脂，所述树脂由至少一种选自由海藻酸盐、壳聚糖、几丁质、胶原蛋白、角叉菜胶、明胶、纤维素、淀粉、果胶和琼脂糖组成的组中的聚合物；选自由沸石、陶瓷、硅藻土、二氧化硅、玻璃、活性炭和木炭组成的组中的的无机材料；或合成聚合物(其实例在下面提供)组成。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于，所述载体是树脂，并且所述树脂由至少一种合成聚合物组成，其实例在下面提供。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于，所述载体为中空纤维膜、纤维垫或平板膜，其由至少一种多糖衍生物或合成聚合物组成，其实例在下面提供。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于，所述载体是无纺布并且该无纺布由至少一种选自由多糖、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)和蛋白质组成的组中的生物聚合物，或至少一种选自由TiO2、SiO2或Al2O3组成的组中的无机材料，或至少一种合成聚合物组成，其实例在下面提供。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于，所述血液处理装置是吸附筒(adsorption cartridge)并且灌注有全血。
因此，该装置可以是或包括含有选自树脂或无纺材料的基质的吸附筒，其中任一种用PR3官能化，PR3被配置用于结合或固定感兴趣的ANCA(也称为靶蛋白)。这种装置可以是用于血液处理的体外回路的部件，被配置为提供血液透析、血液透析滤过、血液滤过或血浆置换。该装置可以是血液回路内的唯一血液处理装置，或者可以位于例如血液透析、血液透析滤过或血液滤过回路中透析器的上游或下游，或者可以替代地在血液入口或出口处立即连接到透析器，其中该装置被配置为用全血灌注。该装置还可以是体外血浆置换回路的部件，其中该装置灌注有血浆或其成分。该装置还可用于治疗性血浆交换(TPE)治疗，其中将血浆从患者体内取出，然后用替代品(例如新鲜冷冻血浆)代替。根据本发明的一方面，该装置用于在将其施用于患者之前或期间从供体的替代血浆中去除靶蛋白，例如PR3-ANCA。
该装置也可以是混合过滤装置，其在过滤器的滤液空间中结合中空纤维膜和基质(WO 2014/079680 A1)，其中所述基质由树脂组成，该树脂用配体官能化以结合或固定并因此去除靶ANCA。这种过滤器可以是被配置用于进行血液透析、血液透析滤过或血液滤过的体外回路的部件，其中所述过滤器位于用于血液透析、血液透析滤过或血液滤过的透析器的上游或下游，或者可以在没有这种透析器的情况下用作所述回路内的唯一过滤装置。这种装置可用于全血。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于，所述血液处理装置位于患者的血液通过的体外血液回路中，并且该血液处理装置包括用于将血液以限定的流速从患者的血管系统输送到血液处理装置，并将处理过的血液返回给患者的机构。
该装置通常可以设计为中空纤维膜过滤器或透析器，其中膜构成PR3结合在中空纤维的内腔侧上的载体，所述中空纤维与血液接触。所述膜可以是用于治疗肾衰竭的血液透析膜，在血液透析膜管腔侧另外用所述PR3或血浆分离膜进行功能化，血浆分离膜也在其内腔侧或可选地在中空纤维和/或其孔的外侧另外用PR3官能化。
本发明的一个目的是提供一种用于血液净化的血液透析器，血液透析器可用于同时治疗患有肾衰竭和与ANCA相关疾病的患者。根据一个方面，血液透析器的中空纤维的内腔侧用PR3功能化。
在一种实施方式中，其中膜具有允许ANCA通过的孔径，例如血浆分离膜，中空纤维膜的外表面和/或孔用PR3官能化。或者，血浆分离中空纤维膜的内腔侧用PR3功能化。
在一种实施方式中，该装置可以是用于治疗肾衰竭的血液透析过滤器，其中该过滤器在至少一个端盖中还包括树脂，例如海绵形式或无纺布形式的树脂，其用PR3功能化以固定感兴趣的所述ANCA。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于，所述血液处理装置所在的体外血液回路还包括血液透析器，该血液透析器位于血液处理装置的上游或下游。
在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于，所述血液处理装置所在的体外血液回路还包括血浆透析器或基于离心机的血浆分离系统，其允许从血液中分离血浆部分，并且其中血液处理装置位于血浆透析器的血浆出口的下游。
在另一方面，本发明涉及一种包括如本文所述的血液处理装置的体外血液回路，其中体外血液回路包括用于以限定的流速将血液或血浆从患者的血管系统输送到血液处理装置的装置和用于将处理过的血液或血浆返回给患者的机构。
在一种实施方式中，体外血液回路还包括用于血液透析的血液透析器，其中血液透析器位于血液处理装置的上游或下游。
在一种实施方式中，如本文所述的体外血液回路的特征在于，所述血液处理装置是用于血液透析的血液透析器，并且其中血液透析器包含单体形式的蛋白酶3(PR3)，并且被配置为固定抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)。
在一种实施方式中，体外血液回路还包括配置为从血液中分离血浆的血浆透析器或基于离心机的血浆分离系统，其中血浆通过血液处理装置，其中，血液处理装置位于血浆透析器的血浆出口的下游。
在一种实施方式中，如本文所述的体外血液回路的特征在于，所述血液处理装置是配置为将血浆与血液分离的血浆透析器，并且其中血浆透析器包含单体形式的蛋白酶3(PR3)并且被配置为固定抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)。
在另一方面，本发明涉及如本文所述的血液处理装置用作治疗与抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关的医学病症的药物。因此，本发明进一步涉及使用本文所述的装置治疗与抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关的医学病症的方法。根据一个方面，本发明提供了一种治疗或改善这种疾病的至少一种症状的方法。
因此，本发明的另一个目的是提供一种治疗或改善患者的ANCA相关疾病的至少一种症状的方法，其中该方法包括通过使患者的血液或血浆通过配置为结合或固定ANCA的基质从患者体外去除至少一种感兴趣的ANCA，从而将ANCA从患者的血液中去除的步骤。这种去除包括离体方法，其中，例如在进一步使用(例如输血)之前，对供体血液或供体血浆进行处理以去除这种靶标ANCA。
因此，本发明的一个目的是提供用自身免疫性成分治疗或预防慢性或急性炎性疾病的装置、体外回路和方法，其中，所述装置被放置在体外血液处理回路中并且被配置为从患者的血液中去除靶标自身抗体。
在另一种实施方式中，待治疗的与抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关的医学病症是与抗PR3自身抗体的存在相关的自身免疫性疾病，优选选自由抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)血管炎，例如肉芽肿性多血管炎(GPA，以前称为韦格纳肉芽肿)或显微镜下多血管炎、寡免疫性新月体肾小球肾炎或嗜酸性肉芽肿性多血管炎组成的组。
在另一种实施方式中，待治疗的与抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关的医学病症是抗中性粒细胞胞质自身抗体(ANCA)相关的自身免疫性血管炎(AAV)。
具体实施方式
本发明基于以下见解：单体形式的PR3可用于从有需要的患者体外去除至少一种ANCA。
专利和非专利文献的所有引用文件在此通过引用整体并入。除非本文另有说明，否则所有术语将被赋予其普通技术含义。
蛋白酶3：
蛋白酶3(PR3)，也称为成髓细胞蛋白酶、PRTN3、MBN；MBT；NP4；P29；ACPA；AGP7；NP-4；PR-3；CANCA；C-ANCA或韦格纳(Wegener)自身抗原是一种丝氨酸蛋白酶，降解弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白和I、III和IV型胶原蛋白，并处理白细胞介素-8(FEBSLett352:231-235)、IL-1β(JASN 23:470-482)、激酶抑制剂p21waf1(JBC 277:47338-47347)、膜联蛋白-1(JBC 282:29998-30004)、蛋白酶激活的受体-1(Arterioscler ThrombVasc Biol 33:275-284)2755-33和C5a受体(J.Immunol.192:1787-1795)。PR3是抗中性粒细胞胞质自身抗体(ANCA)相关血管炎(韦格纳肉芽肿)的主要自身抗原。
PR3蛋白被描述为具有256个氨基酸的长度和27807Da的估计质量。报告的野生型人PR3序列记录在公共序列数据库中，例如在UniProtKB-P24158(PRTN3_HUMAN)下：
Wt型人PR3(SEQ ID NO 1)：
MAHRPPSPALASVLLALLLSGAARAAEIVGGHEAQPHSRPYMASLQMRGNPGSHFCGGTLIHPSFVLTAAHCLRDIPQRLVNVVLGAHNVRTQEPTQQHFSVAQVFLNNYDAENKLNDVLLIQLSSPANLSASVATVQLPQQDQPVPHGTQCLAMGWGRVGAHDPPAQVLQELNVTVVTFFCRPHNICTFVPRRKAGICFGDSGGPLICDGIIQGIDSFVIWGCATRLFPDFFTRVALYVDWIRSTLRRVEAKGRP
在一些实施方式中，在获得PR3单体变体时，将SEQ ID NO 1的wt人PR3序列用作本文提及的氨基酸序列变化的参考序列。进一步优选的序列涉及：
Ile221X(SEQ ID NO 2):
MAHRPPSPALASVLLALLLSGAARAAEIVGGHEAQPHSRPYMASLQMRGNPGSHFCGGTLIHPSFVLTAAHCLRDIPQRLVNVVLGAHNVRTQEPTQQHFSVAQVFLNNYDAENKLNDVLLIQLSSPANLSASVATVQLPQQDQPVPHGTQCLAMGWGRVGAHDPPAQVLQELNVTVVTFFCRPHNICTFVPRRKAGICFGDSGGPLICDGIIQGIDSFVXWGCATRLFPDFFTRVALYVDWIRSTLRRVEAKGRP
其中X是除Ile之外的任何氨基酸，优选是Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr，更优选是Ala。
Ile221X+Trp222Z(SEQ ID NO 3):
MAHRPPSPALASVLLALLLSGAARAAEIVGGHEAQPHSRPYMASLQMRGNPGSHFCGGTLIHPSFVLTAAHCLRDIPQRLVNVVLGAHNVRTQEPTQQHFSVAQVFLNNYDAENKLNDVLLIQLSSPANLSASVATVQLPQQDQPVPHGTQCLAMGWGRVGAHDPPAQVLQELNVTVVTFFCRPHNICTFVPRRKAGICFGDSGGPLICDGIIQGIDSFVXZGCATRLFPDFFTRVALYVDWIRSTLRRVEAKGRP
其中X是除Ile之外的任何氨基酸，优选是Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr，更优选是Ala，和
其中Z是除Trp之外的任何氨基酸，优选是Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr，更优选是Ala。
Ile221X+His71、Asp118和/或Ser203处的一个或多个变化(SEQ ID NO4):
MAHRPPSPALASVLLALLLSGAARAAEIVGGHEAQPHSRPYMASLQMRGNPGSHFCGGTLIHPSFVLTAAU1CLRDIPQRLVNVVLGAHNVRTQEPTQQHFSVAQVFLNNYDAENKLNU2VLLIQLSSPANLSASVATVQLPQQDQPVPHGTQCLAMGWGRVGAHDPPAQVLQELNVTVVTFFCRPHNICTFVPRRKAGICFGDU3GGPLICDGIIQGIDSFVXWGCATRLFPDFFTRVALYVDWIRSTLRRVEAKGRP
其中X是除Ile之外的任何氨基酸，优选是Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr，更优选是Ala，和
其中U1是除His之外的任何氨基酸，优选是Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr，更优选是Glu，和/或
其中U2是除Asp之外的任何氨基酸，优选是Ala、Pro、Gly、Glu、Gln、Asn、Ser、Thr，更优选是Ala，和/或
其中U3是除Ser之外的任何氨基酸，优选是Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Thr，更优选是Ala。
Ile221X+Trp222Z+His71、Asp118和/或Ser203处的一个或多个变化(SEQ ID NO5):
MAHRPPSPALASVLLALLLSGAARAAEIVGGHEAQPHSRPYMASLQMRGNPGSHFCGGTLIHPSFVLTAAU1CLRDIPQRLVNVVLGAHNVRTQEPTQQHFSVAQVFLNNYDAENKLNU2VLLIQLSSPANLSASVATVQLPQQDQPVPHGTQCLAMGWGRVGAHDPPAQVLQELNVTVVTFFCRPHNICTFVPRRKAGICFGDU3GGPLICDGIIQGIDSFVXZGCATRLFPDFFTRVALYVDWIRSTLRRVEAKGRP
其中X是除Ile之外的任何氨基酸，优选是Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr，更优选是Ala，和
其中Z是除Trp之外的任何氨基酸，优选是Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr，更优选是Ala，和
其中U1是除His之外的任何氨基酸，优选是Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr，更优选是Glu，和/或
其中U2是除Asp之外的任何氨基酸，优选是Ala、Pro、Gly、Glu、Gln、Asn、Ser、Thr，更优选是Ala，和/或
其中U3是除Ser之外的任何氨基酸，优选是Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Thr，更优选是Ala。
Ile221Ala+Ser203Ala(SEQ ID NO 6):
MAHRPPSPALASVLLALLLSGAARAAEIVGGHEAQPHSRPYMASLQMRGNPGSHFCGGTLIHPSFVLTAAHCLRDIPQRLVNVVLGAHNVRTQEPTQQHFSVAQVFLNNYDAENKLNDVLLIQLSSPANLSASVATVQLPQQDQPVPHGTQCLAMGWGRVGAHDPPAQVLQELNVTVVTFFCRPHNICTFVPRRKAGICFGDAGGPLICDGIIQGIDSFVAWGCATRLFPDFFTRVALYVDWIRSTLRRVEAKGRP
Ile221Ala+Trp222Ala+Ser203Ala(SEQ ID NO 7):MAHRPPSPALASVLLALLLSGAARAAEIVGGHEAQPHSRPYMASLQMRGNPGSHFCGGTLIHPSFVLTAAHCLRDIPQRLVNVVLGAHNVRTQEPTQQHFSVAQVFLNNYDAENKLNDVLLIQLSSPANLSASVATVQLPQQDQPVPHGTQCLAMGWGRVGAHDPPAQVLQELNVTVVTFFCRPHNICTFVPRRKAGICFGDAGGPLICDGIIQGIDSFVAAGCATRLFPDFFTRVALYVDWIRSTLRRVEAKGRP
已知PR3蛋白经过加工，产生信号肽(aa 1-25)、前肽(aa 26-27)、链肽(aa28-248)和前肽(aa 249-256)。
因此，本发明包括各种功能等效的片段。去除信号肽和/或前肽可以导致产生功能性单体PR3变体。
PR3蛋白似乎在恒河猴、母牛、小鼠、大鼠、蚊子和青蛙中高度保守，其PR3序列在此引入作为参考。
替代的重组PR3变体先前也已被描述，例如在PR3的晶体结构的描述中，如Fujinaga等(J Mol Biol.1996Aug 16；261(2):267-78)所述。现有技术中氨基酸的编号也可能不同，例如在Fujinaga等(J Mol Biol.1996Aug 16；261(2):267-78)和Jerke等(2017，Scientific Reports 7:43328)中。技术人员能够根据适当的数据库，例如NCBI和UniProtKB，根据需要确定序列编号和正确的参考序列。
在一些实施方式中，可以采用PR3蛋白，该PR3蛋白与SEQ ID NO 2、3、4、5、6或7或其片段具有基本上相同或相似的氨基酸序列，并且包含产生单体性质的氨基酸序列变化。实例是PR3的片段，例如天然存在的PR3片段、同源物或衍生物，其具有与本文所述的单体PR3的实例基本相同的特性或功能类似物。
如本文所用，术语“基本上相同或相似的氨基酸序列”包括与参考氨基酸序列相似但不相同的氨基酸序列。例如，可以使用以下的氨基酸序列，即多肽，其与SEQ ID NO 2、3、4、5、6或7中的PR3具有基本相同的氨基酸序列，并且包含一个或多个修饰，例如相对于SEQID NO 2、3、4、5、6或7的氨基酸序列具有氨基酸添加、缺失或取代，条件是修饰的多肽基本上保留PR3的至少一种生物活性，例如上述那些，即优选单体形式的PR3，与Wt型人PR3相比，在生理条件下具有改善的溶解度，与wt PR3相比，PR3-ANCA自身抗体结合没有显著的不利影响。
本发明的多肽或其片段的特别有用的修饰是赋予例如增加的稳定性或反应性的修饰。一个或多个D-氨基酸的掺入是可用于增加多肽或多肽片段稳定性的修饰。类似地，赖氨酸残基的缺失或取代可以通过保护多肽或多肽片段免于降解来增加稳定性。
氨基酸序列还可包含在蛋白质的N-和/或C-末端的氨基酸添加或缺失0至100、2至50、5至20，或例如8至15，或0至20的任何值。末端也可以用额外的接头序列修饰，或去除序列，只要基本上保持蛋白质的自身抗体结合特性和免疫反应性，并且如本文所述的ANCA自身抗体以类似方式结合至提供的PR3序列，除了优选基本上或优先为单体形式的PR3，与野生型人PR3相比，在生理条件下具有改善的溶解度。
现有技术中已经公开了各种制备功能类似肽的方法。使用此类方法从本发明的肽开始设计的肽包括在根据本发明的教导中。例如，在PNAS USA 1998，Oct.13，95(21)，12179-84；WO 02/38592中描述了一种产生功能类似肽的方法；上述教导在此并入本发明的公开中。即，所有肽、肽片段或包含使用上述方法产生的肽的结构—从本发明的肽开始—都是根据本发明的肽，只要它们实现了本发明的目的，特别是与致病性自身抗体相互作用并显示出比wt PR3更好的单体性质。
如本文所用，术语“单体形式的蛋白酶3(PR3)”涉及在生理溶液中形成单体的程度比野生型PR3更大的任何PR3蛋白。
在说明书的一些段落中，使用术语“PR3”而没有明确提及“单体PR3”。本领域技术人员能够推断是指wt PR3或单体PR3变体。
评估单体性质的优选条件是在20mM HEPES的缓冲液、150mM NaCl缓冲液、pH 7.5的实验环境中。或者，可以使用包含20mM HEPES、150mM NaCl、0.02％月桂基麦芽糖苷、pH7.4的缓冲液来评估单体性质。或者，可以使用血浆、血液或血清条件。PR3形成单体的程度是比野生型PR3更大或更小，可以使用本领域建立的技术来评估，例如下文实施例中描述的尺寸排阻色谱法。用于评估PR3单体性质的其他技术涉及动态光散射结合凝胶过滤、天然凝胶电泳、小角X射线散射(SAXS)和/或基于技术人员已知技术的质谱法。
当在溶液中时，本发明的单体PR3与低聚体相比优先是单体的。这种性质不同于野生型PR3蛋白，后者在生理条件下存在时优先形成聚集体或低聚体。因此，对单体形式的PR3的提及是指分子本身在生理条件下的特性。在一些实施方式中，与单体形式的PR3在溶液中游离存在时相比，单体PR3形式在被基质(优选固定在基质上)包含时的单体性或溶解度可能不同。
在一些实施方式中，所采用的PR3序列是突变的或非天然存在的序列，例如不符合SEQ ID NO 1的序列。
在本发明的装置的上下文中，单体PR3蛋白在一种实施方式中共价地(即不可逆地)连接到基质。不知道共价连接到基质上的单体PR3变体会聚集并确实保持其单体性质。其他形式的固定PR3也对PR3的单体性质没有不利影响。因此，无论是在所述的缓冲溶液中，还是在固定存在和包围在血液、血清或血浆中时，当固定在本发明的装置中的基质上时，本文所述的PR3变体还表现出单体性质(在生理溶液中比野生型PR3形成单体的程度更大)和生理条件下的ANCA结合特性。
待治疗的疾病：
如本文所用，术语“自身免疫性疾病”是指与自身抗体的存在相关和/或由自身抗体的存在引起的任何给定疾病。自身免疫性疾病源于身体对正常存在于身体中的物质和组织的异常免疫应答(自身免疫性)。这可能仅限于某些器官或涉及特定组织。
如本文所用，术语“与抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关的医学病症”是指其中已检测到ANCA的任何医学病症，优选具有已确定的对疾病的病理学贡献的那些。
ANCA与小血管炎相关，包括肉芽肿性多血管炎、显微镜下多血管炎、原发性寡免疫性坏死性新月体肾小球肾炎(一种肾脏受限的显微镜下多血管炎)，嗜酸性肉芽肿伴多血管炎(之前称为Churg-Strauss综合征)和药物诱发的血管炎。
PR3导向的c-ANCA存在于80-90％的肉芽肿性多血管炎、20-40％的显微镜下多血管炎、20-40％的寡免疫性新月体肾小球肾炎和35％的嗜酸性肉芽肿性多血管炎。c-ANCA(非典型，一种PR3 ANCA)存在于80％的囊性纤维化(以BPI作为靶抗原)中以及还存在于炎性肠病、原发性硬化性胆管炎和类风湿性关节炎(具有针对多个抗原靶标的抗体)中。非典型ANCA与药物引起的系统性血管炎、炎性肠病和类风湿性关节炎有关(Savige，J等(2000)抗中性粒细胞胞质抗体和相关疾病：临床和实验室特征综述(Antineutrophilcytoplasmic antibodies and associated diseases:a review of the clinical andlaboratory features).Kidney International.57(3):846-62)。
如本文所用，术语“抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)血管炎”是指一组表现出PR3ANCA的疾病，其特征在于小血管的破坏和炎症。实例是但不限于肉芽肿性多血管炎(GPA，之前称为韦格纳肉芽肿)或显微镜下多血管炎、寡免疫性新月体肾小球肾炎或嗜酸性肉芽肿性多血管炎。一个实例是抗中性粒细胞胞质自身抗体(ANCA)相关的自身免疫性血管炎(AAV)。
根据本发明的一种实施方式，使用标准方法鉴定需要使用本文所述的包含单体PR3的装置治疗的患者，例如通过评估血液或源自患者的血液的样品中结合PR3的ANCA的存在。
适用于诊断与ANCA相关的疾病的方法包括例如ELISA或间接免疫荧光测试。ANCA检测是一种确立已久的诊断测试，用于评估疑似小血管坏死性血管炎。ANCA测试的诊断效用取决于所进行的测定的类型和临床环境，并可根据患者的情况进行调整。全球大多数实验室使用标准的间接免疫荧光测试(IFT)来筛选ANCA，然后通过蛋白酶3(PR3)和髓过氧化物酶(MPO)的抗原特异性测试来确认阳性IFT结果。还可以采用诸如免疫荧光模式的自动图像分析、所谓的第三代PR3-ANCA和MPO-ANCA ELISA以及多重技术的开发(Csernok等，NatRev Rheumatol.2014Aug；10(8):494-501)。
根据本发明的一种实施方式，本文所述的诊断和监测方法用于在治疗期间监测受试者或确定有效治疗剂量或确定所需治疗的次数和频率。
根据另一方面，该方法被提供给另外表现出急性肾损伤或衰竭或依赖于慢性肾脏替代疗法的患者。患有ANCA和肾功能损害的患者是要处理的目标患者群体。
抗中性粒细胞胞质抗体：
如本文所用，术语“抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)”是指自身抗体，主要但不排他地是IgG型，其与中性粒细胞(最常见的白细胞类型)和单核细胞的细胞质中的抗原结合。
ANCA在免疫荧光下可视化时可分为四种模式；细胞质ANCA(c-ANCA)、C-ANCA(非典型)、核周ANCA(p-ANCA)和非典型ANCA(a-ANCA)，也称为x-ANCA。c-ANCA显示具有中央小叶间增强的细胞质颗粒荧光。c-ANCA(非典型)显示细胞质染色，通常是均匀的，没有小叶间增强。p-ANCA具有三个亚型，经典p-ANCA、无核延伸的p-ANCA和粒细胞特异性抗核抗体(GS-ANA)。经典的p-ANCA显示有核延伸的核周染色，无核延伸的p-ANCA具有无核延伸的核周染色，而GS-ANA仅显示粒细胞的核染色。a-ANCA通常显示细胞质和核周染色的组合(自身抗体模式的高级图谱(Advanced atlas of autoantibody patterns)，Birmingham:TheBinding Site.ISBN 0704485109)。
所谓的c-ANCA抗原是特异蛋白酶3(PR3)。术语“PR3 ANCA”可以指结合PR3的任何自身抗体。
p-ANCA抗原包括髓过氧化物酶(MPO)和细菌通透性增加因子(BPI)。经典的p-ANCA与抗MPO的抗体一起发生。无核延伸的p-ANCA与抗BPI、组织蛋白酶G、弹性蛋白酶、乳铁蛋白和溶菌酶的抗体一起发生。其他不太常见的抗原包括HMG1(p-ANCA模式)、HMG2(p-ANCA模式)、α烯醇酶(p和c-ANCA模式)、过氧化氢酶(p和c-ANCA模式)、β葡糖醛酸酶(p-ANCA模式)、天青素(p和c-ANCA模式)、肌动蛋白(p和a-ANCA)和h-lamp-2(c-ANCA)。
在一些实施方式中，蛋白质MPO、BPI、组织蛋白酶G、弹性蛋白酶、乳铁蛋白、溶菌酶、HMG1、HMG2、α烯醇化酶、过氧化氢酶、β葡糖醛酸酶、天青素、肌动蛋白和h-lamp-2中的一种或多种作为p-ANCA的抗原可以与PR3组合使用(同时，在单独的或相同的装置中，或者在PR3装置治疗之前或之后)，以便以如本文所述的针对PR3的类似方式去除ANCA。这些蛋白质已被描述为ANCA的抗原，与单独使用PR3相比，它们的组合使用可以增强去除更多的ANCA。
装置
本发明包括被配置为位于体外血液回路中的装置，患者的血液通过该体外血液回路，并且设备包括用于以限定的流速将血液从患者的血管系统输送到血液处理装置，然后将被处理的血液返回给患者的机构，其中该装置还被配置为固定至少一个ANCA，从而将ANCA从患者的血液中去除。
之前已经描述了用于从患者的血液中去除目标成分的体外装置和方法。例如，WO2013/020967 A1公开了用于固定和去除来自患者的血型抗体的装置和基质的用途。US 8,969,322 B2描述了一种通过包含硫酸葡聚糖的装置从患者血液中去除可溶性Flt-1受体的体外血液分离术程序。
然而，尽管有大量关于与ANCA相关的疾病的文献，但据本发明人所知，本文描述的基于修饰的PR3蛋白的体外治疗方法迄今尚未被描述。
因此，一方面，本发明公开了包含基质的装置，该基质被设计用于在体外回路中从患者的血液中特异性去除涉及自身免疫性疾病的至少一种靶蛋白(ANCA)。根据另一方面，本发明公开了包括所述装置的体外回路并且描述了应该如何配置这种回路以有效地处理有需要的患者的血液。根据又一方面，本发明提供了一种降低受试者的体液中的至少一种靶蛋白(ANCA)的水平的方法，包括通过将患者的血液或血浆通过根据本发明的装置从患者中体外去除靶蛋白的步骤。根据一方面，根据本发明的装置包括吸附剂，例如以珠子形式存在，当用于全血灌注(血液灌注)时，根据本发明的设备的活性表面为每个设备0.5-50000m2。根据另一方面，当用于全血浆灌注(治疗性血液分离术)时，根据本发明的所述装置的活性表面为每个设备0.5-50000m2。根据又一方面，所述用于血液灌注和/或全血浆灌注的装置的活性表面积为每个设备0.5-10000m2。
如本文所用，表述“血液”是指包含生物体的血液的所有成分的全血，包括悬浮在血浆中的红细胞、白细胞和血小板。表述“血浆”是指流体，其由约92％的水、7％的蛋白质(如白蛋白、丙种球蛋白、纤维蛋白原、补体因子、凝血因子)和1％的矿物盐、糖、脂肪、电解质、激素以及维生素组成，其构成全血的一部分但不再含有红细胞和白细胞以及血小板。在本发明的上下文中，表述“血浆”还指其标准含义中的上述定义的血浆的特定部分，例如血清。
可以使用各种已知方法来固定靶标，例如根据本发明的靶蛋白。这种固定优选是特异性的或选择性的，因为它固定了感兴趣的靶蛋白，而血液或血浆或其样品(体外)中存在的其他蛋白质和组分没有被固定到显著程度。
根据本发明的一种实施方式，这样的方法是亲和色谱法，也称为亲和纯化，由此靶蛋白ANCA凭借其与固定的PR3的特异性结合特性而从溶液中去除。亲和色谱法可以定义为一种液相色谱法，其使用生物相关试剂，即“亲和配体”或“配体”，如PR3，用于选择性保留靶分子(ANCA)或研究生物相互作用(Hage等,J.Pharm.Biomed.Anal.(2012),69,93-105)；Ayyar等,Methods(2012)56:116-129)。
“特异性结合”通常是指靶分子(例如ANCA)和结合分子例如抗体或配体(PR3)之间的物理结合。这种结合通常取决于靶标的特定结构特征的存在，例如被结合分子识别的抗原决定簇、表位、结合口袋或裂缝。
亲和配体(PR3)固定在载体上并与其一起形成基质。然后将其用于选择性地结合样品(例如血液或血浆)内或来自样品的给定靶标或靶标组。由于许多亲和配体具有选择性或高度选择性，因此该基质可用于固定、结合、分离、测量或研究特定靶标，即使它们存在于复杂的生物样品(如血液或血浆)中。在一些实施方式中，在所测试的条件下，例如在有关例如盐浓度、pH和/或温度等的生理条件下，即合理地近似在根据本发明的使用期间应用的相应条件下，表现出特异性结合的两个分子(例如配体和靶蛋白之间)的亲和力(通过平衡解离常数Kd测量)为10-4M或更小、10-5M或更小，10-6M或更小，10-7M或更少、10-8M或更少、10-9M或更少、10-10M或更少、10-11M或更少、10-12M或更少，例如在10-13M和10-4M之间(或在以上述任意两个值作为端点的任何范围内)。结合亲和力可以使用本领域已知的多种方法中的任一种来测量。例如，在某些实施方式中可以使用基于等温滴定量热法或表面等离子体共振的测定法(例如，
Figure BDA0003125299860000221
测定法)。根据本发明的一种实施方式，配体对靶蛋白应具有10-6M至10-13M的亲和力范围。
因此，如本文所用的表述“基质”是指可用于根据本发明的靶蛋白的亲和色谱的材料。在本发明的上下文中使用的这种基质包含配体结合的载体。因此，载体充当配体的载体，即使载体也必须履行其他功能。
表述“结合”配体或“结合”(至)配体至用于提供可用于如本文所用的根据本发明的装置的基质的载体是指保持两个分子在一起的非共价或共价相互作用。根据本发明的一种实施方式，该表述是指共价相互作用，即共价结合的配体。非共价相互作用包括但不限于氢键、带电基团之间的离子相互作用、范德华相互作用和非极性基团之间的疏水相互作用。这些相互作用中的一种或多种可以介导两个分子彼此的结合。结合另外可以是特异性的或选择性的，或非特异性的。根据本发明的一种实施方式，表述“结合”或“结合”(至)是指配体与载体的共价连接。根据本发明的另一种实施方式，表述“结合”或“结合”(至)是指配体与载体连接的离子相互作用。
如本文所用，表述“配体(ligand)”或“配体(ligands)”通常是指特征在于其对靶蛋白的亲和力的分子。在一些实施方式中，单体PR3蛋白旨在作为配体，连接至装置，以结合靶蛋白，在这种情况下PR3结合ANCA。
配体的进一步特征在于其对靶蛋白的特异性。根据本发明的一种实施方式，其特征在于其在治疗或改善ANCA相关疾病的至少一种症状的方法使用期间的固定可行性、稳定性，以及在连接至基质后经过长时间储存和治疗持续时间至少2小时，优选至少4、至少8或至少12小时后保留靶结合能力。
根据本发明的另一种实施方式，表述“配体(ligand)”或“配体(ligands)”代表亲和配体，其是PR3衍生的肽，包含或由PR3序列或序列变体组成，并且已经基于它们与ANCA的结合特性进行选择。
术语“免疫亲和色谱法”(IAC)通常用于亲和色谱方法，其中基质包含抗体或其抗原结合片段(Moser等，Bioanalysis(2010)2：769-790)。在本发明的上下文中，基质包含结合抗体(ANCA靶标)的抗原(PR3)。靶蛋白与固定抗原的选择性结合是抗体和抗原(例如根据本发明的靶蛋白)之间可能发生的多种非共价相互作用的结果，并且可能导致在105-1012M-1范围内的结合平衡常数。由于天然存在的抗原的尺寸通常很大，因此通常会产生以一系列结合亲和力结合抗原的几个不同区域的抗体。可以与抗体结合的抗原/靶蛋白上的每个单独位置称为表位。根据本发明的一方面，只要相互作用的结合平衡常数在105-1015M-1的范围内，抗体靶标可以结合PR3蛋白呈现的任何表位。根据本发明的另一方面，相互作用的结合平衡常数在106-1012M-1的范围内，在106-1010M-1的范围内，在108-1010M-1的范围内，或在108-1012M-1的范围内。
根据本发明的一种具体实施方式，PR3试剂或其片段包含用于将它们固定在载体上的亲和标签。亲和标签可用于在蛋白质生产过程中纯化蛋白质和/或用于将它们固定在本发明的基质的载体上。亲和标签可以是短的多肽序列或完整的蛋白质，作为与靶蛋白的融合配偶体共表达。除了促进纯化和快速固定外，融合标签有时也有利于提高重组蛋白的表达和溶解度。亲和标签可用于确保蛋白质的正确取向，或者可以使用各种取向，从而使功能域可相互作用。它们还提供了用于靶蛋白的固定、定量和检测的系统，因此也特别适用于分析目的，包括免疫测定。不同类型的亲和标签是本领域众所周知的(Terpe，ApplMicrobiol Biotechnol(2003)60:523-533)，其中多组氨酸或His6-标签被特别详细地描述并且是用于将根据本发明的配体结合至载体材料的一种选择。可以另外用于将配体结合至载体的亲和标签可以选自包括C-myc-标签、FLAG-标签和血凝素(HA)-标签的组。
根据本发明的另一种实施方式，PR3蛋白也可以通过使用第二配体吸附PR3而固定在载体上。这可以通过使用已与生物素反应或生物素化的PR3来实现，然后吸附到含有固定化抗生物素蛋白或链霉亲和素的载体上。一种可能的生物素化技术是在pH 9下用N-羟基琥珀酰亚胺-D-生物素孵育PR3。然后可以使用生物素与链霉亲和素或亲和素的非共价键来固定这些蛋白质。这些连接具有在1013-1015M-1范围内的结合平衡常数。
根据本发明的另一种实施方式，PR3蛋白如下文进一步详述和/或如现有技术(Cuatrecasas，J Biol Chem(1970)245：3059-3065；Nisnevitch等，J Biochem BiophysMethods(2001)49:467-480)与载体共价连接。共价偶联通常包括基于利用载体和/或蛋白质上的官能团的蛋白质的共价非定点连接(Nisnevitch等，J Biochem Biophys Methods(2001)49:467-480，Section 2.3)。根据本发明的另一种实施方式，蛋白质的共价连接是蛋白质的定点连接(Nisnevitch等，JBiochem Biophys Methods(2001)49:467-480，Section2.4；Makaraviciute等，Biosensors and Bioelectronics(2013)50:460-471)。本质上，将抗体连接到基质上的技术指导(通常在免疫亲和方法中进行)可用于将PR3蛋白固定在载体上，以便从血液或血浆或患者中固定和去除ANCA。本文公开的关于将抗体固定到载体或基质上的参考文献也被认为可能与固定单体PR3变体相关。
如本文所用，表述“载体”是指用作“基质”或“载体材料”的基底部分，其与根据本发明的配体(PR3)相结合。此类载体或载体材料有时也称为“吸附材料”或“吸附剂”，并且此类表述应包含在本文所用的表述“载体”中。根据本发明的合适的载体应该是均匀的、亲水的、在相关的pH范围和温度下机械和化学稳定，在使用过程中配体没有浸出或浸出可忽略不计，选择性地表现出最小的非特异性吸收，否则应与血液相容，即不会引起包括激活补体系统或其他免疫途径的不良反应，对全血和/或血浆具有良好的流动特性，并为配体连接提供大的表面积。
载体可以是树脂、膜或无纺布。如本文所用，表述“树脂”是指可呈半透明凝胶或凝胶珠或具有孔隙且外观不透明的微孔珠的形式，或可呈海绵形式的不溶性材料。这种树脂可以是天然或生物聚合物、合成聚合物和无机材料。琼脂糖、葡萄糖和纤维素珠是常用的天然载体。合成聚合物或有机载体主要基于丙烯酰胺、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯衍生物，而多孔二氧化硅和玻璃是一些常用的无机载体。可以根据本发明使用的其他材料描述如下。
根据本发明的一种实施方式，树脂由以下组成：选自由海藻酸盐、壳聚糖、甲壳素、胶原蛋白、角叉菜胶、明胶、纤维素、淀粉、果胶和琼脂糖凝胶组成的组的聚合物；选自由沸石、陶瓷、硅藻土、二氧化硅、玻璃、活性炭和木炭组成的组的无机材料；或选自由聚乙烯(PE)、聚甲醛(POM)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚醋酸乙烯酯(PVA)、聚偏二氯乙烯(PVDC)、聚苯乙烯(PS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酸酯(PAA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚丙烯腈(PAN)、聚酯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酰胺、聚芳酰胺、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PEAS)、乙烯醋酸乙烯酯(EVA)、乙烯乙烯醇(EVOH)、聚酰胺酰亚胺、聚芳醚酮(PAEK)、聚丁二烯(PBD)、聚丁烯(PB)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚己内酯(PCL)、聚羟基链烷酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚醚酮酮(PEKK)、聚醚酰亚胺(PEI)、聚酰亚胺、聚乳酸(PLA)、聚甲基戊烯(PMP)、聚对苯醚(PPE)、聚氨酯(PU)、苯乙烯丙烯腈(SAN)、聚丁烯酸、聚(4-烯丙基苯甲酸)、聚(丙烯酸缩水甘油酯)、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚二乙烯基苯(PDVB)、聚(烯丙基缩水甘油醚)、聚(乙烯基缩水甘油醚)、聚(乙烯基缩水甘油基氨基甲酸酯)、聚烯丙胺、聚乙烯胺组成的组的合成聚合物，所述聚合物与通过引入官能团改性的这些聚合物中的任一种的共聚物。根据本发明的一种具体实施方式，载体选自由苯乙烯二乙烯基苯(DVB)和衍生物、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和衍生物以及聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)和衍生物组成的组。
如上所述，根据本发明的配体可以与载体共价结合。形成基质(其中所述配体可以共价连接)产生基础的载体必须提供或促进化学活化，从而允许配体的化学偶联。许多用于固定配体(例如抗体或其片段)的偶联方法是本领域公知的。一般来说，活化化学应该在很宽的pH值、缓冲条件和温度范围内保持稳定，从而导致配体的浸出可以忽略不计。偶联方法应避免配体的不正确定向、多位点连接或空间位阻，这可能会导致结合位点被掩蔽，从而导致活性损失。可以考虑定点连接和/或间隔子将配体固定在载体上。可以优化每体积基质的配体密度以促进目标可及性和结合。
偶联可以通过常见的官能团进行，包括胺、醇、羧酸、醛和环氧基(图6A和6B)。制备根据本发明的载体的方法是本领域已知的并且描述于例如US 8,142,844 B2、US 2015/0111194 A1和US 2014/0166580 A1中。这些参考文献还描述了可用于产生根据本发明的基质的间隔基团(或“接头”基团)。
根据本发明的一种实施方式，配体(PR3)直接偶联或通过胺官能团在添加间隔子的情况下偶联。在第一步中，胺基被引入到载体上。许多方法可用于将胺基引入根据本发明的基质。例如，在膜沉淀之前将胺化聚合物(例如胺化聚乙烯醇)添加到聚合物溶液中，或对膜进行后处理，例如使用APTMS((3-氨基丙基)三甲氧基硅烷-四甲氧基硅烷)对含有羟基或/和羧基的膜进行硅烷化，将PEI(聚(乙烯亚胺))或其他聚合物简单吸附到膜表面，或用铵或其他有机胺蒸气对膜进行等离子体处理，都可以有效地将胺基团引入膜上。第二步，可采用碳二亚胺化合物激活蛋白质的羧基，用于通过酰胺键直接与膜表面的伯胺结合。最常用的碳二亚胺是用于水性交联的水溶性EDC(1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)和用于非水性有机物合成方法的不溶于水的DCC(N'，N'-二环己基碳二亚胺)。根据本发明的另一种实施方式，可以将羟基引入到载体中。基于多糖的基质，例如纤维素或纤维素衍生物，其表面已经带有OH基团。羟基也可以被引入到基质中，例如通过用氧气或空气进行等离子体处理。在用琥珀酸酐酰化羟基后，所得的O-琥珀酸酯可以与蛋白质的胺反应，在碳二亚胺或其他偶联剂的存在下形成酰胺键。根据本发明的又一种实施方式，可以将羧酸基团引入到载体中。通过用二氧化碳进行等离子体处理，可以将羧酸根基团引入基质上。对于蛋白质固定，碳二亚胺/琥珀酰亚胺偶联化学可用于通过配体的胺基团进行表面连接。根据本发明的又一种实施方式，可以引入羰基(醛、酮)用于配体的后续偶联。通过使用高碘酸氧化OH基团，可以在基于多糖的固体基质上产生醛。蛋白质的伯胺(多肽的N端和赖氨酸的侧链)可以通过还原胺化和席夫碱的形成与醛反应。形成的席夫碱随后在水溶液中水解并且必须还原为烷基胺键以稳定。氰基硼氢化钠是一种温和的还原剂，可在不还原蛋白质的其他化学基团的情况下诱导该反应。根据本发明的另一种实施方式，可以将环氧基团引入到载体上。几种表面涂有高密度环氧官能团的预活化树脂可商购，见下文。例如在WO 2005/026224 A1中描述了在膜上引入环氧基团。在开环过程中与亲核试剂反应的环氧基团与蛋白质的伯胺、硫醇或羟基反应，分别形成稳定的仲胺、硫酯和醚键。环氧基团很容易与硫醇基团反应，需要接近生理pH值(pH7.5-8.5)的缓冲系统。环氧基团需要高pH条件(pH 11-12)才能与羟基反应，并需要中等碱性条件(pH>9)才能与胺基反应。在每种情况下，可以在载体和亲和配体之间引入不同链长的间隔基。
上面和下面提到的几种类型的载体可以有利地用于偶联，例如，用于亲和色谱的蛋白质。亲和载体可以基于诸如多糖的材料。合适的多糖是例如纤维素、硝化纤维素、壳聚糖、胶原、淀粉和交联的多糖凝胶如琼脂糖、交联葡聚糖或琼脂糖。制备多糖基质衍生物的方法早已为人所知，例如描述于US 4,411,832或US 3,947,352中。载体也可以基于合成有机载体。合成聚合物基质包括亲水性和疏水性合成聚合物及其组合。合成载体包括载体，其选自例如由聚丙烯酰胺载体或其衍生物组成的载体的组；聚甲基丙烯酸酯载体或其衍生物；聚苯乙烯载体或其衍生物；或聚醚砜载体或其衍生物。另外，衍生的二氧化硅、玻璃或二氢唑酮珠可用于根据本发明的装置中。这种装置优选使用有机载体。在本发明的上下文中，珠子的使用可能是有利的。
根据本发明的一种实施方式，载体材料应该是多孔的，其中孔径为10至200nm。对于亲和应用，已发现孔径为30至200nm或60至200nm是最佳的。然而，其他孔径也可能是有利的，这取决于所使用的偶联化学、间隔子和配体，也取决于靶蛋白。如果载体以珠子的形式使用，这种珠子的直径可以在一定范围内变化。使用直径为50至1000μm的珠子可能是有利的。使用直径为60至800μm、100至700μm、120至800μm的珠子可能是进一步有利的。
根据本发明的一方面，载体携带将接头和/或配体与其偶联所需的特定官能团。例如，许多官能化树脂是可商购的并且是本领域技术人员已知的。已携带用于偶联配体的反应性基团的预活化树脂载体(有或没有间隔子)是可商购的，并且消除了在使用之前(即在配体偶联之前)提到的载体的许多化学活化步骤。这种载体通常是如前定义的树脂，而对于膜和/或非织造载体，活化步骤通常必须在偶联之前进行。包括伯胺、巯基、醛、羟基和羧酸在内的多种偶联化学可在用于共价连接配体的所述商业载体中获得。可商购活化树脂的实例有UltraLink碘乙酰树脂、CarboLink偶联树脂、ProfinityTM环氧树脂、Affi-Gel 10和15、环氧-活化的琼脂糖6B(Epoxy-activated SepharoseTM 6B)、三氟代乙烷磺酰氯活化的琼脂糖(Tresyl chloride-activated agarose)、Tosoh
Figure BDA0003125299860000271
AF氨基或环氧树脂650-M、ChiralVision ImmobeadTM 350、Resindion ReliZymeTM EXE 135或SEPABEADSTM以及用环氧基团官能化的
Figure BDA0003125299860000272
LifetechTM甲基丙烯酸酯聚合物。
根据本发明的一种实施方式，用于偶联配体(PR3)的载体是环氧树脂官能化的，因为环氧基团与不同的蛋白质基团形成非常稳定的共价键，例如赖氨酸或亲核试剂(氨基、硫醇、酚)中的-NH2，并且固定化可以在pH和温度的温和条件下进行。
根据本发明的另一种实施方式，载体采用珠子的形式。根据本发明的又一种实施方式，载体是环氧树脂官能化的甲基丙烯酸酯聚合物。根据本发明的又一种实施方式，载体选自Tosoh
Figure BDA0003125299860000288
环氧树脂650-M、ChiralVision ImmobeadTM 350、ResindionReliZymeTM EXE 135、Resindion SEPABEADSTM和
Figure BDA0003125299860000281
LifetechTM。根据一方面，使用的
Figure BDA0003125299860000282
LifetechTM ECR8209F环氧树脂甲基丙烯酸酯珠子携带有作为可与配体结合的官能团的环氧基团。它们的平均孔径为1200至
Figure BDA0003125299860000283
粒径为150至300μm。根据另一方面，使用的
Figure BDA0003125299860000284
LifetechTM ECR8215M环氧树脂甲基丙烯酸酯珠子携带有作为可与配体结合的官能团的环氧基团。它们的平均孔径为600至
Figure BDA0003125299860000285
粒径为300至710μm。根据另一方面，使用的
Figure BDA0003125299860000286
Life-techTM ECR8215F环氧树脂甲基丙烯酸酯珠子携带有作为可与配体结合的官能团的环氧基团。它们的平均孔径为1200至
Figure BDA0003125299860000287
粒径为150至300μm。
根据本发明的另一种实施方式，还可以将配体(PR3)非共价地固定到载体上，例如离子地或通过络合。然而，优选共价结合以避免配体从基质浸出到患者的血液或血浆中的风险。
根据又一种实施方式，根据本发明的载体包含磁珠。磁珠是通过将磁铁矿包埋在琼脂糖或其他聚合材料中来制备的，根据本发明的配体固定在其上。配体与靶蛋白相互作用后，在磁铁的作用下，可以实现快速分离。磁珠的使用特别适用于作为体外应用的体外应用，其中用于固定靶蛋白的基质被配置为用于监测包含靶蛋白的血液或血浆样品或任何其他体外应用中的靶蛋白的存在和/或浓度，用于筛选或其他分析目的，且不属于体外血液回路。配体与靶蛋白相互作用后，在磁铁的作用下，可以实现靶蛋白的快速分离。
根据本发明的另一种实施方式，载体是膜。与凝胶、树脂和珠子相比，膜作为亲和基质的组成部件已被用于蛋白质纯化，因为它们简单、易于处理、缩减的表面积和较低的扩散限制。膜已成功用作纯化重组抗体的亲和膜(Sun等，J.Sep.Sci.,31(2008),pp.1201-1206)。亲和膜适用于各种尺寸和形式。膜可以采用中空纤维的物理形式，或者也可以采用平板膜的物理形式。
根据本发明的一种实施方式，载体膜是中空纤维膜。根据本发明的另一种实施方式，多个中空纤维膜形成为一束中空纤维并嵌入外壳中，从而形成过滤器或过滤装置。根据一种实施方式，载体包括血液透析中空纤维膜透析器，其中过滤器是血液透析器。
这样的实施方式提供了两种功能的组合并且可以有利地用作用于在体外血液回路中从有需要的人的血液或血浆中去除ANCA的装置，其中该装置包括配置为通过结合单体PR3固定ANCA的基质，因为该装置同时去除根据本发明的靶蛋白并从患有肾衰竭的患者的血液中去除尿毒症毒素、过量离子和水。因此，仅需要一个装置来治疗患有ANCA相关疾病的患者。因此，体外回路与用于在肾衰竭治疗中进行血液透析的标准体外回路没有根本区别。因此，对患有肾功能衰竭和ANCA相关疾病的此类患者的治疗显著简化，并且可能有助于降低患者累积治疗的成本并增加患者和主治医师的治疗选择。
用作根据本发明的装置中的载体的中空纤维或平板膜可由纤维素、纤维素酯(醋酸纤维素和三醋酸纤维素)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚酰胺(PA)、其他含氮聚合物(聚苯并咪唑、聚丙烯腈(PAN)、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)组成，所述聚合物和通过引入官能团改性的任何这些聚合物的组合。根据本发明的一种实施方式，根据本发明的膜载体包含选自由以下组成的聚合物的组中的聚合物：聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚酰胺(PA)、聚丙烯腈(PAN)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)，所述聚合物和通过引入官能团改性的任何这些聚合物的组合。根据本发明的另一种实施方式，根据本发明的膜载体包含选自由以下组成的聚合物的组中的聚合物：聚酰胺(PA)、聚丙烯腈(PAN)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)，所述聚合物和通过引入官能团改性的任何这些聚合物的组合。根据本发明的又一种实施方式，根据本发明的膜载体包含选自由以下组成的聚合物的组中的聚合物：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)和聚芳醚砜(PAES)，所述聚合物和通过引入官能团改性的任何这些聚合物的组合。
为了进行偶联反应以随后在膜表面上结合配体(PR3)，需要聚合物官能化步骤，可以使用已知方法，例如在US 2015/0111194 A1和US 2014/0166580A1中描述的。例如，由烷烃链(如聚乙烯)制成的合成材料不包含用于将分子与其偶联的合适的官能团。因此，必须在聚合物合成后化学引入合适的官能团。改性聚合物的一种可能性是已知的等离子体官能化方法，该方法允许通过选择合适的气体等离子体将官能团引入聚合物中。该方法包括例如使用氨等离子体，其中氨基官能团形成在处理过的聚合物的表面上。因此，处理例如带有氨等离子体的聚乙烯产生带有一定量的氨基官能团的聚乙烯基体。这些氨基随后可以与接头的合适的官能团反应，例如羧基。或者，基质聚合物可以通过等离子体活化来官能化以获得羧基。例如，在US 2007/0296105 A1中进一步描述了以连续方式官能化中空纤维膜的方法。在所述方法中，由前体气体引入的官能团可以是氨基、羧基、醛、酯、环氧基、羟基或磺酸基团。可用作本发明载体的膜包括例如本领域已知的血浆分离膜和血液透析膜，包括但不限于众所周知的高通量膜、高截留膜或中等截留膜。血浆分离的目标是在分离的血浆部分中含有血液的总血浆蛋白，而血液中较大的红细胞成分，如血细胞和细胞碎片，被膜保留。此外，这种血浆分离膜应该表现出膜的高表面孔隙率和总孔隙率以实现高过滤性能。它还应具有亲水性、自发可湿性膜结构、长期稳定过滤的低污染特性和低蛋白质吸附性。这种血浆分离膜优选具有与血液接触的光滑表面，从而避免或最小化血液处理期间的溶血。在整个处理期间，膜应显示出恒定的筛分特性和过滤行为。它还应表现出高生物相容性、低补体激活或无补体激活和低血栓形成性。可用于提供根据本发明的装置的适用于血浆分离的膜在本领域中是已知的并且例如已在EP 1 875 956 A1或EP 1 875 957 A1中进行了描述。EP2 113 298 B1中已经描述了可以改进并用作根据本发明的装置中的载体的其他膜，例如在
Figure BDA0003125299860000301
透析器中使用的高通量膜。US 2017/0165616 A1中描述了例如在
Figure BDA0003125299860000302
透析器中使用的中等截留膜，EP 1 572 330 A1中描述了例如在
Figure BDA0003125299860000303
透析器中使用的高截留膜。
根据本发明的一种实施方式，根据本发明的装置包括选自由聚砜、聚醚砜或聚芳醚砜和聚乙烯吡咯烷酮制备的血液透析中空纤维膜的组中的中空纤维膜。
可有利地用于提供根据本发明的装置的中空纤维膜优选具有100至500μm的内径。根据本发明的一种实施方式，中空纤维膜的壁厚为20至150μm。较低的壁厚是不利的，因为在生产过程中以及其在根据本发明的装置的使用过程中纤维的机械性能降低。较高的壁厚是不利的，因为它们需要增加的时间间隔来进行相转化过程，导致不稳定的过程条件和不稳定的膜。
在本发明的一种实施方式中，其中用于提供根据本发明的装置的膜是血浆分离膜或以其他方式配置以允许根据本发明的靶蛋白通过至显著量且筛分系数高于0.5，优选高于0.7或高于0.9，中空纤维的内层或内腔通常是血液接触层，其未被官能化并且不携带任何配体。配体(PR3)反而通过接头偶联至中空纤维的外层，并且任选地还偶联至连接内层与外层的层的至少一部分，即膜的孔。因此，配体的官能化仅存在于外滤液层上并且任选存在于连接膜的外层和内层的孔表面结构的至少一部分上。例如，这种配置可以用于从全血中去除靶蛋白，因为它们的大小能够从内层传递到外层，而较大的血液蛋白质保留在膜的腔侧。当包括靶蛋白在内的血液成分传递到膜的外层时，它们被固定在特定的配体上或被特定的配体结合。
根据本发明的另一种实施方式，特别是当膜载体是如上所述的血液透析膜时，中空纤维膜在中空纤维的内腔侧额外地或替代地用根据本发明的配体官能化，其中它们可以直接与灌注中空纤维膜腔的血液或血浆中包含的靶蛋白相互作用并结合或固定。
本发明的另一方面是一种血液处理装置，其包括根据本发明的用配体(单体PR3)功能化的膜，该配体被配置为结合或固定靶蛋白(ANCA)。这种装置的实例是透析器、血液过滤器和超滤器。这种装置通常由外壳组成，该外壳包括带有端盖的管状部分。一束中空纤维膜通常以在由纤维腔形成的第一流动空间和在外侧围绕膜的第二流动空间之间提供密封的方式布置在外壳中。在EP 0844 015 A2、EP 0 305 687 A1和WO 01/60477 A2中公开了这种装置的实例。
根据另一方面，根据本发明的装置可以是如WO 2014/07680 A1中公开的过滤装置，其包括一束中空纤维膜和装置的滤液空间中的树脂，其中树脂优选由珠子组成。通过选择允许至少相关靶蛋白通过膜壁的膜，可以将这种装置配置为用作根据本发明去除靶蛋白的装置。装置的滤液空间中的树脂作为基质并包括树脂载体，如本文或WO 2014/07680 A1中公开的，对靶蛋白具有亲和力的配体通过本文公开的方法或如本领域已知的方法结合。
根据一方面，所述装置的中空纤维膜是血浆分离膜，其允许血浆连同其中所含的靶蛋白一起通过膜并与滤液空间中的基质相互作用，从而使靶蛋白固定在基质上。净化后的血浆将重新进入同一装置内的中空纤维膜，血液可以返回患者体内。这种装置可以位于血液透析器的上游或下游的体外回路中，例如在WO 2014/079681 A2中描述的，或者它可以用作回路内的唯一血液灌注装置。在另一方面，配体还可以或专门结合到如上所述的血浆分离膜，例如结合到膜的外部和/或孔。一方面，滤液空间中的树脂可以被配置为去除相同或不同的靶蛋白。
根据本发明的又一实施方式，载体是无纺布。如本文所用，表述“无纺布”是指广泛定义为通过机械、热或化学而非编织或针织方式缠结纤维或细丝(以及通过穿孔膜)结合在一起的片材、织物或网状结构的材料。它们形成多孔结构，由于它们的高过滤效率、高表面积和高渗透性，可以有效地用作根据本发明的装置中的载体材料。无纺布及其生产方法包括熔喷无纺布和纺粘无纺布，以及包含此类无纺布的装置在本领域中是已知的并且例如在EP 1 922 097 A1、WO 2007/025738 A2以及赵等，J Mem Sci(2011)，369：5-12中有所描述。无纺布可由选自由多糖、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)和蛋白质组成的组的生物聚合物，选自由TiO2、SiO2或AlO2组成的组的无机材料，或选自由聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚丙烯腈(PAN)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚酰胺酰亚胺(PAI)、聚氨酯(PUR)、聚醚砜(PES)、聚丙烯酸(PAA)、聚环氧乙烷(PEO)、聚苯乙烯(PS)和聚偏二氟乙烯(PVDF)组成的组的合成聚合物组成。
通常，根据本发明的装置被设计为具有圆柱形外壳的圆柱体，该圆柱形外壳具有用于用其处理血液或血浆的至少一个入口和至少一个出口。当装置是血液透析器时，除了去除至少一种靶蛋白之外还用于治疗HD、HDF或HF中的肾衰竭，该装置还包括透析液的入口和出口。可以根据本发明使用的设备的配置是公知的并且在本发明的范围内。
根据本发明，表述“体外血液净化”是指通过从患者身体外(体外)的分流回路中的流动的血液中清除体液中的物质的过程。所述物质可包括内源性毒素(即尿毒症毒素)、外源性毒素(即乙二醇或真菌毒素)、给予的药物、病毒、细菌、抗体和蛋白质(即IMHA、重症肌无力)、异常细胞(即白血病)，以及过量的水。治疗程序包括：血液透析，包括间歇性血液透析(HD、HDF、HF)和连续肾脏替代疗法(CRRT)；血液灌流；和治疗性分离性输血。
根据一方面，体外血液净化回路中的血液流速为20ml/min至700ml/min。除了根据本发明的血液处理装置或在另外配置血液透析器以固定靶蛋白的情况下，包括用于治疗肾衰竭的血液透析器的体外回路中的典型透析液流速为0.5l/h至800ml/min。
在血液透析中，血液在体外回路中循环，其组成通过跨界面半透膜的扩散和/或对流力的溶质和水的质量转移而改变。溶质转移的幅度和频谱取决于跨膜施加的力的性质、溶质的化学和物理特性，尤其还包括尺寸和膜的结构特性。血液透析是肾衰竭患者的标准治疗方法。
血液灌流是一种体外吸附疗法，用于控制血液透析无法有效清除的内源性和外源性中毒。吸附是溶质(例如蛋白质)分子附着到材料表面(基质)的原理。与血液透析期间发生的血液和透析液之间的物理分离相反，在血液灌流期间，血液直接暴露于吸附剂，该吸附剂具有选择性或非选择性结合血液路径内的溶质的能力。
在治疗性分离性输血中，例如通过离心或通过质膜或过滤器将血液分成其组成部分，并且含有应被去除的溶质部分，通常是血浆部分，在返回患者之前经过专门处理。本发明提供了一种分离性输血治疗，其中从患者流动的血液中去除血浆(含有靶蛋白)，并在与根据本发明的装置或基质接触后返回给患者(图5)。在血液处理装置被血浆灌注的体外回路中的典型血浆流速为7ml/min至250ml/min。
根据一方面，根据本发明的体外血液回路被配置为进行血液透析。在这种情况下，根据本发明的装置是例如血液透析仪，其另外被配置为固定根据本发明的靶蛋白。该回路可以根据医疗需要在不同的治疗模式下运行，包括血液透析、血液透析滤过、血液滤过模式。
根据一方面，根据本发明的体外血液回路被配置为提供连续性肾脏替代疗法(CCRT)。连续性肾脏替代疗法(CRRT)是一种缓慢的透析疗法，其提供连续的每天24小时疗法，主要用于ICU环境中的危重患者。与慢性肾功能衰竭患者的间歇性HD一样，CRRT的溶质去除是通过对流(血液滤过)、扩散(血液透析)或这两种方法的组合(血液透析滤过)实现的。这个过程需要使用置换液来防止医源性酸中毒和电解质消耗以及过多的液体去除。CRRT以及如何使用它是本领域已知的。
根据另一方面，根据本发明的体外血液回路被配置为进行血液灌注。因此，根据本发明的血液处理装置灌注有全血并且位于体外回路内(图3)。根据本发明的一个方面，该装置是包含膜、无纺布或树脂的筒，对靶蛋白具有亲和性的配体结合到该膜上。根据一个方面，当筒的基质包括一束中空纤维膜，其中结合有对靶蛋白具有亲和力的配体(过滤装置)时，治疗模式可以是具有封闭的透析液/滤液端口的血液灌流。根据又一方面，筒可以位于血液透析器的下游或上游，该血液透析器被配置为对患者的血液进行血液透析(图4A和4B)并且可以以选自血液透析、血液透析滤过和血液滤过的不同的治疗模式进行操作。
根据一方面，血液处理装置是过滤器，该过滤器在如上所述的过滤器的滤液空间中包括中空纤维和树脂。过滤器可以在血液灌注模式下操作，或者如果与可以位于根据本发明的装置的上游或下游的血液透析器结合，则治疗模式可以是血液透析、血液透析滤过或血液滤过。
根据本发明的又一种实施方式，根据本发明的装置可在治疗之间再生。
附图说明
通过以下附图进一步描述本发明。意图代表本发明的多个优选的非限制性实施方式或方面的更详细的说明，而非限制本文所述的本发明的范围。
图1：通过尺寸排阻色谱法比较wt PR3和单体PR3的特性。(A)示出了wt PR3洗脱曲线的尺寸排阻色谱图(S200)。蛋白质不会以离散的峰洗脱，而是作为大的聚集体的集合，其近似的大小范围从单体(ca.26kD)到超过600kD。(B)示出了单体Trp222Ala PR3变体的类似色谱图，显示出主要在单体物质的预测保留时间更均匀的洗脱。
图2：通过SPR和ELISA比较wt PR3和单体PR3特性。(A)示出了一系列浓度的可溶性单体Trp222Ala PR3变体与固定化CD177的结合相互作用的原始SPR传感图。测量的相互作用的亲和力为5.7×10-8M。(B)示出了使用从杂交瘤上清液中纯化的两种不同的抗PR3抗体(抗PR340和抗PR381)的ELISA测定。抗体各自识别PR3上不同的、非重叠的表位。wt PR3(左侧条)和单体Trp222Ala PR3变体(右侧条)同样被抗体识别。
图3：包含血液处理装置的体外处理回路的示意图。该装置可以是基于包含膜、树脂或无纺布载体的筒或过滤器，对靶蛋白具有亲和力的配体已结合到该载体上。该回路可以在血液灌流模式下运行。在血液处理装置是中空纤维膜过滤装置的情况下，处理模式可以是血液透析、血液透析滤过、血液滤过或具有透析液/滤液端口封闭的过滤器的血液灌流。
图4：包括血液处理装置的体外处理回路的示意图。该装置可以是包含树脂或无纺布的吸附筒或包含膜的过滤器，对靶蛋白具有亲和力的配体分别结合到该膜上。血液处理装置可位于血液透析器的上游(透析器前设置，图4A)或血液透析器的下游(透析器后设置，图4B)。回路中的非功能化血液透析器可以根据医疗需要以不同的治疗模式运行，包括血液透析、血液透析滤过或血液滤过模式。
图5：包括血液处理装置的体外处理回路的示意图。该装置灌注有血浆。在所示的实施方式中，血浆分离过滤器用于从全血中分离血浆。血浆过滤器通过0.03μm到2μm范围的孔径产生包含靶蛋白的血浆部分。血浆通过血液处理装置被灌注，该血液处理装置包括基于无纺布、树脂或膜载体的基质，对靶蛋白具有亲和力的配体已经结合到该基质上。
图6：靶蛋白与环氧活化载体或氨基载体共价偶联的示意图。载体可以是树脂、膜(包括中空纤维膜、平板膜或纤维垫)或无纺布。(A)示出了蛋白质通过蛋白质的氨基与载体的直接偶联(实施例6)。(B)示出了酶的共价固定是基于氨基树脂的使用。氨基树脂可以用戊二醛预活化，然后用于酶的共价固定。醛基与靶蛋白的氨基的反应很快，形成席夫碱(亚胺)，从而在酶和载体之间形成稳定的多点共价结合。可以用硼氢化物进一步还原亚胺双键。
实施例
通过以下实施例进一步描述本发明。这些旨在提供对本发明的许多优选的非限制性实施方式或方面的可操作性的支持，而非限制在此描述的本发明的范围。
实施例1:单体PR3蛋白变体的生产
单体PR3蛋白变体基本上按照Jerke等(2017，Scientific Reports 7:43328)中的描述创建。蛋白质是从质粒pTT5作为与人Ig1 Fc的C端融合物，从293_6EEBNA细胞(NRC，加拿大)通过N端Ig1分泌信号肽分泌，并通过固定蛋白A从培养的上清液中纯化产生的。蛋白A洗脱的材料立即用1M HEPES pH 7.5中和，并通过添加TEV蛋白酶去除Fc，并在4℃下孵育过夜。随后的蛋白A捕集柱的流通液被浓缩并通过Superdex 200尺寸排阻器，对于CD177，在20mM HEPES、150mM NaCl、pH7.5中，对于PR3变体，在相同的缓冲液中加上0.02％LM。PR3变体通过肠激酶去除N端FLAG肽并通过抗M2琼脂糖来激活。
实施例2：通过尺寸排阻色谱法比较wt PR3和单体PR3的特性
使用尺寸排阻色谱法评估如上所述获得的PR3蛋白的分子量。PR3蛋白在合适的缓冲液中稀释(500μl，以1.2mg/ml，20mM HEPES，150mM NaCl，0.02％月桂基麦芽糖苷，pH7.4)，通过0.45μm过滤器，随后以0.5ml/min的流速施加到Superdex S200凝胶过滤柱上，在4℃下施加到凝胶过滤柱上。wt PR3的高分子量聚集体以约8.8mL洗脱体积洗脱(图1A)，而Trp222Ala PR3变体主要以约16.5mL洗脱体积洗脱，与蛋白质的单体形式一致(图1B)。对于Ile221Ala、Ile221Ala+Trp222Ala、Ile221Ala+Ser203Ala和Ile221Ala+Trp222Ala+Ser203Ala获得了类似的结果。正在评估进一步的PR3突变体。
实施例3：通过SPR比较wt PR3和单体PR3的特性
实验在ProteOn XPR36仪器(BioRad)上进行，其中蛋白质使用标准胺化学固定在GLH传感器芯片(BioRad)上。评估了一系列浓度的可溶性单体Trp222Ala PR3变体与固定化CD177的结合相互作用(图2A)。测量的相互作用的亲和力为5.7×10-8M，表明PR3变体在与其天然蛋白质靶标CD177的结合中没有表现出任何损失。
实施例4：通过ELISA比较wt PR3和单体PR3的特性
PR3 ELISA用于定量评估PR3的量。简而言之，将抗PR3捕获抗体(抗PR3 40和抗PR381)包被、封闭并与WT或单体变体的PR3样品一起孵育。洗涤后，加入生物素化抗PR3检测mab。链霉亲和素-HRPO缀合物和OPD基质用于可视化结合。在酶标仪中在405nm处测定吸光度。图2B示出了wt PR3(左侧条)和单体Trp222Ala PR3变体(右侧条)同样被抗体很好地识别。
实施例5：包含环氧官能化树脂的基质的制备
首先，平衡树脂。树脂用固定缓冲液洗涤并过滤。1/1(w/v)的树脂/缓冲剂比例是优选的。选择与PR3兼容的固定缓冲液。该过程重复2-4次。PR3溶液是通过将蛋白质溶解在固定缓冲液中来制备的。例如，每克湿树脂可负载100-200mg PR3。蛋白质浓度可以通过使用标准蛋白质含量测定来确定。PR3溶解在足够量的缓冲液中，以获得1:4(w/v)的树脂/缓冲液比例。该比例可以根据所使用的PR蛋白进行优化(范围可以从1:1-1:4不等)。固定化始于将含有PR3蛋白的固定化缓冲液转移到固定化容器中。然后加入环氧官能化树脂，例如本文所述的
Figure BDA0003125299860000371
LifetechTM树脂。将浆料以70-80rpm轻轻混合18小时，然后在不搅拌的情况下放置20小时。在蛋白质固定过程中应避免磁力搅拌，因为这会损坏珠子。固定化可以在20℃-30℃的温度下进行，具体取决于蛋白质的稳定性。不应在高温下进行固定，因为这会导致环氧环降解(水解)并促进微生物生长。最后，滤出并收集液相。确定液体中的蛋白质含量并计算固定产率。然后用洗涤缓冲液洗涤树脂。该过程在温和搅拌或柱洗涤下重复2-4次。可以使用含有0.5M NaCl的缓冲液进行额外的洗涤步骤，以完全解吸非共价结合的蛋白质。通过过滤除去过量的水。然后可以根据水分含量和特异性结合活性来表征固定的PR3蛋白。
实施例6：包含环氧官能化树脂的基质的制备
首先，平衡树脂。树脂用固定缓冲液洗涤并过滤。1:1(w/v)的树脂/缓冲液比例是优选的。选择与PR3蛋白兼容的固定缓冲液。在第二步中，从25％(w/v)戊二醛溶液开始制备2％戊二醛缓冲液。使用固定缓冲液制备2％戊二醛(v/v)溶液。在第三步中，通过将步骤2中制备的2％戊二醛缓冲液添加到树脂中来活化氨基树脂。2％戊二醛缓冲液的最佳体积应在树脂/缓冲液比例1:4(w/v)的范围内。将浆料在20℃-25℃下混合60分钟。然后将珠子过滤并用固定缓冲液洗涤，树脂/缓冲液的比例为1:4(w/v)。应避免将预活化树脂储存超过48小时。然后将珠子准备好进行固定步骤。在第四步中制备PR3蛋白溶液。为此，将蛋白质溶解在固定缓冲液中。例如，每克湿树脂可以负载1mg至100mg的PR3蛋白质。蛋白质浓度可以通过使用标准蛋白质含量测定来确定。
将蛋白质溶解在缓冲液中，以获得1:4(w/v)的树脂/缓冲液比例。可以在进一步的试验中对该比例进行优化(范围可以在1:1-1:4变化)。在第五步中，蛋白质被固定。将固定缓冲液转移到固定容器中，并加入在步骤3中制备的预活化氨基树脂(例如来自
Figure BDA0003125299860000381
LifetechTM)。将浆料以70-80rpm轻轻混合18小时。在固定过程中应避免磁力搅拌，因为这会损坏珠子。根据PR3蛋白的稳定性，固定可以在20℃-30℃下进行。固定不应在高温下进行，因为这可能会导致步骤3过程中形成的树脂上的醛基的副反应。最后，滤出并收集液相。确定液体中的蛋白质含量并计算固定收率。然后用洗涤缓冲液洗涤树脂。该过程在温和搅拌或柱洗涤下重复2-4次。可以使用含有0.5M NaCl的缓冲液进行额外的洗涤步骤，以完全解吸非共价结合的蛋白质。通过过滤除去过量的水。然后可以根据水分含量和特异性结合活性来表征固定的PR3蛋白。
Figure IDA0003125299910000011
Figure IDA0003125299910000021
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Figure IDA0003125299910000051
Figure IDA0003125299910000061
Figure IDA0003125299910000071
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Figure IDA0003125299910000091
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Figure IDA0003125299910000111

Claims (15)

1.一种血液处理装置，其被配置为在体外血液回路中从有需要的人的血液或血浆中去除抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)，其中所述装置包含基质，并且其中所述基质包含单体形式的蛋白酶3(PR3)。
2.根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置，其中，所述单体形式的蛋白酶3(PR3)包含在Ile221和/或Trp222处的至少一个突变。
3.根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置，其中，所述单体形式的蛋白酶3(PR3)包含至少在Ile221和Trp222处的突变。
4.根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置，其中，所述单体形式的蛋白酶3(PR3)包含Ile221Ala和/或Trp222Ala突变。
5.根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置，其中，所述单体形式的蛋白酶3(PR3)包含降低或消除蛋白酶活性的突变，所述突变优选选自His71、Asp118和/或Ser203处的一个或多个突变，更优选为His71Glu、Asp118Ala和/或Ser203Ala。
6.根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置，其中，所述基质包含结合所述单体形式的蛋白酶3(PR3)的载体，其中，所述载体优选包含或由选自由以下组成的组的材料组成：中空纤维膜、平板膜、纤维垫、树脂、无纺布和开孔泡沫，如聚氨酯(PU)泡沫。
7.根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置，其中，所述血液处理装置是吸附筒并且灌注有全血。
8.根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置，其中，所述血液处理装置位于患者的血液通过的体外血液回路中，并且包括用于将血液以限定的流速从患者的血管系统输送到血液处理装置并将处理过的血液返回给患者的机构。
9.根据权利要求8所述的血液处理装置，
其中，所述血液处理装置所在的体外血液回路还包括位于血液处理装置上游或下游的血液透析器，和/或
其中，所述血液处理装置所在的体外血液回路还包括允许从血液中分离血浆部分的血浆透析器或基于离心机的血浆分离系统，并且其中，所述血液处理装置位于血浆透析器的血浆出口的下游。
10.一种体外血液回路，包括根据权利要求1至9所述的血液处理装置，其中，所述体外血液回路包括用于将血液或血浆以限定的流速从患者的血管系统输送到血液处理装置并将处理过的血液或血浆返回给患者的机构。
11.根据权利要求10所述的体外血液回路，
其中，所述体外血液回路还包括用于血液透析的血液透析器，其中，所述血液透析器位于所述血液处理装置的上游或下游，或
其中，所述血液处理装置是用于血液透析的血液透析器，并且其中，所述血液透析器包括单体形式的蛋白酶3(PR3)，并且被配置为固定抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)。
12.根据权利要求10所述的体外血液回路，
其中所述体外血液回路还包括配置为从血液中分离血浆的血浆透析器或基于离心机的血浆分离系统，其中使血浆通过血液处理装置，其中所述血液处理装置位于所述血浆透析器的血浆出口的下游，或
其中所述血液处理装置是配置为将血浆与血液分离的血浆透析器，并且其中所述血浆透析器包含单体形式的蛋白酶3(PR3)，并且被配置为固定抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)。
13.根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置用作治疗与抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关的医学病症的药物。
14.根据前述权利要求所述的用作药物的血液处理装置，其中，所述与抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关的医学病症是与抗PR3自身抗体的存在相关的自身免疫性疾病，所述自身免疫性疾病优选选自由以下组成的组：抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)血管炎，例如肉芽肿伴多血管炎(GPA，之前称为韦格纳肉芽肿)或显微镜下多血管炎、寡免疫性新月体肾小球肾炎或嗜酸性肉芽肿伴多血管炎。
15.根据前述权利要求所述的用作药物的血液处理装置，其中，所述与抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关的医学病症是抗中性粒细胞胞质自身抗体(ANCA)相关的自身免疫性血管炎(AAV)。
CN201980085313.2A 2018-12-20 2019-12-20 治疗与抗中性粒细胞胞质抗体相关的疾病的体外装置和方法 Pending CN113226353A (zh)

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