CN112409465B - 蛋白质m57在调控水稻对铵的抵抗能力中的应用 - Google Patents
蛋白质m57在调控水稻对铵的抵抗能力中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了蛋白质M57在调控水稻对铵的抵抗能力中的应用。向日本晴中导入表达蛋白质M57的重组载体，得到T0代转OsMADS57‑R基因水稻；将T0代转OsMADS57‑R基因水稻连续自交三代，得到T3代纯合转OsMADS57‑R基因水稻。与日本晴相比，T3代纯合转OsMADS57‑R基因水稻，在营养生长期的生长更茁壮、叶片宽度显著增加、茎杆显著加粗，在成熟期株型更加紧凑、叶夹角显著增加、株高显著降低，穗粒收获后粒重、粒宽和产量显著增加、穗长和穗粒数也显著增加。由此可见，蛋白质M57在调控水稻对铵的抵抗能力、产量、株高、粒重、粒宽、穗长、穗粒数、叶片宽度、茎杆直径和叶夹角中具有重要的作用。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质M57在调控水稻对铵的抵抗能力中的应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球有120多个国家种植水稻，栽培面积常年保持在1.5亿公顷以上，并有占世界50％比例的人口以稻米为主食。水稻的产量非常依赖氮肥的施用，但氮肥的施用也产生了许多严重的负面影响，例如，施用的氮肥中大部分不能被水稻有效利用，却以各种形态的氮化合物渗透到地下水和挥发到空气中，经氮循环造成大面积水资源、土壤和生态系统的污染和破坏。另外，水稻是喜铵态氮肥的作物，但过量的铵肥又对水稻产生毒害，影响水稻的生长和产量。因此，提高水稻对铵的抵抗能力对水稻生产至关重要。
发明内容
本发明的目的为提高植物对铵的抵抗能力。
本发明首先保护蛋白质M57的应用，可为如下a1)-a10)中的至少一种：a1)调控植物对铵的抵抗能力；a2)调控植物产量；a3)调控植物粒重；a4)调控植物粒宽；a5)调控植物穗长；a6)调控植物穗粒数；a7)调控植物叶片宽度；a8)调控植物茎杆直径；a9)调控植物叶夹角；a10)调控植物株高。
上述应用中，所述蛋白质M57可为b1)或b2)或b3)：
b1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；
b2)在序列表中序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
b3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与对铵的抵抗能力和/或产量和/或粒重和/或粒宽和/或穗长和/或穗粒数和/或叶片宽度和/或茎杆直径和/或叶夹角和/或株高相关的蛋白质。
其中，序列表中序列3由241个氨基酸残基组成。
为了使b1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列3所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
上述b3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述b3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述b3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2或序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还保护编码所述蛋白质M57的核酸分子的应用，可为如下a1)-a10)中的至少一种：a1)调控植物对铵的抵抗能力；a2)调控植物产量；a3)调控植物粒重；a4)调控植物粒宽；a5)调控植物穗长；a6)调控植物穗粒数；a7)调控植物叶片宽度；a8)调控植物茎杆直径；a9)调控植物叶夹角；a10)调控植物株高。
上述应用中，编码所述蛋白质M57的核酸分子可为如下c1)-c6)任一所示的DNA分子：
c1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
c2)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
c3)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
c4)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
c5)与c1)或c2)或c3)或c4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质M57的DNA分子；
c6)在严格条件下与c1)或c2)或c3)或c4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质M57的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列表中序列2由726个核苷酸组成，序列表中序列1由726个核苷酸组成，序列表中序列2或序列1的核苷酸编码序列表中序列3所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质M57的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质M57的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质M57，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质M57的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述任一所述的应用中，所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种日本晴。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中所述蛋白质M57的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物对铵的抵抗能力增强和/或产量增加和/或粒重增加和/或粒宽增加和/或穗长增加和/或穗粒数增加和/或叶片宽度增加和/或茎杆直径增加和/或叶夹角增加和/或株高降低。
上述方法中，所述“提高出发植物中蛋白质M57的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子或转基因的方法，达到提高出发植物中所述蛋白质M57的表达量和/或活性的效果。
上述方法中，所述“提高出发植物中蛋白质M57的表达量和/或活性”可通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体为向表达载体插入编码蛋白质M57的核酸分子，得到的重组质粒。
上述方法中，所述编码蛋白质M57的核酸分子可为d1)或d3)或d5)或d6)所示的DNA分子：
d1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
d3)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
d5)与d1)或d3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质M57的DNA分子；
d6)在严格条件下与d1)或d3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质M57的DNA分子。
上述方法中，所述表达载体可为pCAMBIA1300载体。
上述方法中，所述重组载体可为重组质粒pCAMBIA1300-MADS57-Resist。所述重组质粒pCAMBIA1300-MADS57-Resist可为将pCAMBIA1300载体的限制性内切酶BamHI识别序列和限制性内切酶SacI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子，得到的重组质粒。
本发明还保护一种植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质M57的表达量和/或活性，从而植物对铵的抵抗能力增强和/或产量增加和/或粒重增加和/或粒宽增加和/或穗长增加和/或穗粒数增加和/或叶片宽度增加和/或茎杆直径增加和/或叶夹角增加和/或株高降低。
上述方法中，所述“增加植物中蛋白质M57的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子或转基因的方法，达到增加植物中所述蛋白质M57的表达量和/或活性的效果。
上述任一所述调控植物对铵的抵抗能力可为提高植物对铵的抵抗能力。
上述任一所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种日本晴。
上述任一所述叶夹角具体可为旗叶和所连接的叶鞘之间的夹角。
上述任一所述产量可为单穗产量。
向水稻品种日本晴中导入实施例提及的重组质粒pCAMBIA1300-MADS57-Resist，得到T0代转OsMADS57-R基因水稻；将T0代转OsMADS57-R基因水稻连续自交三代，得到T3代纯合转OsMADS57-R基因水稻。与水稻品种日本晴相比，在营养生长期，T3代纯合转OsMADS57-R基因水稻的生长更茁壮，叶片宽度显著增加，茎杆显著加粗(表现为茎杆直径显著增加)；在成熟期，T3代纯合转OsMADS57-R基因水稻的株型更加紧凑，叶夹角显著增加，株高显著降低；穗粒收获后，T3代纯合转OsMADS57-R基因水稻的粒重和粒宽显著增加，穗长和穗粒数也显著增加，产量也显著增加。由此可见，蛋白质M57在调控水稻对铵的抵抗能力、产量、株高、粒重、粒宽、穗长、穗粒数、叶片宽度、茎杆直径和叶夹角中具有重要的作用。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为T3代纯合转OsMADS57-R基因水稻对铵的抵抗能力。
图2为营养生长期和成熟期水稻的表型。
图3为水稻的叶片表型和穗粒表型，以及叶片宽度、粒重、粒长和粒宽的统计结果。
图4为水稻的茎杆表型和茎节间表型，以及穗粒数的统计结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
植物cDNA合成试剂盒为TOYOBO公司的产品。
高保真Phusion DNA聚合酶为Thermo公司的产品。
DNA凝胶纯化柱和pGEM-T载体为Promega公司的产品。
叶夹角是指旗叶和所连接的叶鞘之间的夹角。
实施例1、T3代纯合转OsMADS57-R基因水稻的获得及其对铵的抵抗能力和农艺性状的鉴定
一、重组质粒pGEM-T-MADS57的构建
1、以水稻品种日本晴(以下简称日本晴)的10天苗为实验材料，用Trizol试剂提取总RNA，得到日本晴的RNA。取日本晴的RNA，先用DNA凝胶检测RNA质量，然后用nanodrop分光光度计测定RNA的浓度。
2、完成步骤1后，取1μL日本晴的RNA，用植物cDNA合成试剂盒进行反转录，得到20μL cDNA产物(cDNA产物即日本晴的cDNA)。
3、完成步骤2后，以cDNA产物为模板，MADS57-Fp：5′-atggggagggggaagatagt-3′和MADS57-Rp：5′-ttaaggcagatgaagtccca-3′为引物，采用高保真Phusion DNA聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应体系为50μL。各个引物在反应体系中的浓度为10μM。
反应程序为：98℃30s；98℃10s，55℃15s，72℃30s，35次循环；72℃5min。
4、完成步骤3后，用DNA凝胶纯化柱回收PCR扩增产物中约726bp的DNA片段。
5、将步骤4回收的DNA片段和pGEM-T载体进行连接，得到重组质粒pGEM-T-MADS57。
将重组质粒pGEM-T-MADS57进行测序。测序结果表明，重组质粒pGEM-T-MADS57中含有序列表中序列1所示的DNA分子。序列表中序列1所示的DNA分子即OsMADS57基因。
二、重组质粒pGEM-T-MADS57/Resist的构建
1、根据MADS57基因上miR444(核苷酸序列为：5′-GCAGCAAGCTTGAGGCAGCAACUGCA-3′)结合的靶位点，设计并合成MADS57-Resist-Fp：5′-gcCgcCTCcCtCCgCcaAcaGctCcaTaaTCtCcaagaaagccacaagcaactg-3′和MADS57-Resist-Rp：5′-agattatggagctgttggcggagggaggcggcctccctctgccaaatcttaa-3′。
2、第一轮PCR扩增反应
(1)以20ng重组质粒pGEM-T-MADS57为模板，MADS57-Fp和MADS57-Rp为引物，采用高保真Phusion DNA聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物甲。
(2)以20ng重组质粒pGEM-T-MADS57为模板，MADS57-Resist-Fp和MADS57-Resist-Rp为引物，采用高保真Phusion DNA聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙。
步骤(1)和(2)中，反应体系均为50μL；各个引物在反应体系中的浓度均为10μM。
步骤(1)和(2)中，反应程序均为：98℃30s；98℃10s，55℃15s，72℃30s，35次循环；72℃5min。
3、回收
(1)用DNA凝胶纯化柱回收PCR扩增产物甲中约300bp的DNA片段甲。
(2)用DNA凝胶纯化柱回收PCR扩增产物乙中约400bp的DNA片段乙。
4、第二轮PCR扩增反应
(1)将50ng DNA片段甲和50ng DNA片段乙充分混合，得到混合DNA。
(2)以100ng混合DNA为模板，MADS57-Fp和MADS57-Rp为引物，采用高保真PhusionDNA聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物丙。
反应体系为50μL。各个引物在反应体系中的浓度为10μM。
反应程序均为：98℃30s；98℃10s，55℃15s，72℃30s，35次循环；72℃5min。
5、回收
用DNA凝胶纯化柱回收PCR扩增产物丙中约700bp的DNA片段丙。
6、将步骤4回收的DNA片段丙和pGEM-T载体进行连接，得到重组质粒pGEM-T-MADS57/Resist。
将重组质粒pGEM-T-MADS57/Resist进行测序。测序结果表明，重组质粒pGEM-T-MADS57/Resist中含有序列表中序列2所示的DNA分子。
序列表中序列2所示的DNA分子即OsMADS57-R基因。
OsMADS57-R基因和OsMADS57基因均编码序列表中序列3所示的蛋白质M57。
三、重组质粒pCAMBIA1300-MADS57-Resist的构建
1、以重组质粒pGEM-T-MADS57/Resist为模板，采用MADS57-重组-Fp：5′-gaacacgggggactctagagatggggagggggaagatagt-3′和MADS57-重组-Rp：5′-cgatcggggaaattcgagctttaaggcagatgaagtccca-3′组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、用DNA凝胶纯化柱回收步骤1得到的PCR扩增产物中约750bp的DNA片段。
3、用限制性内切酶BamHI和SacI酶切pCAMBIA1300载体，回收大小约10kb的载体骨架。
4、采用GIBSON公司的无缝克隆体系进行同源重组反应，将步骤2回收的DNA片段整合至步骤3回收的载体骨架，得到重组质粒pCAMBIA1300-MADS57-Resist。
将重组质粒pCAMBIA1300-MADS57-Resist进行测序。根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA1300-MADS57-Resist进行结构描述如下：将pCAMBIA1300载体的限制性内切酶BamHI识别序列和限制性内切酶SacI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子(序列表中序列2所示的DNA分子即OsMADS57-R基因)。
重组质粒pCAMBIA1300-MADS57-Resist中，由35S启动子驱动OsMADS57-R基因的表达。重组质粒pCAMBIA1300-MADS57-Resist表达序列表中序列3所示的蛋白质M57。
四、重组农杆菌的获得
将重组质粒pCAMBIA1300-MADS57-Resist导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA1300-MADS57-Resist。
将pCAMBIA1300载体导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA1300。
五、T0代拟转OsMADS57-R基因水稻的获得
采用Hiei等的方法(Hiei Y，Ohta S，Komari T&Kumashiro T.Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J.1994，6:271-282)将EHA105/pCAMBIA1300-MADS57-Resist转化日本晴，得到T0代拟转OsMADS57-R基因水稻。
六、T0代拟转OsMADS57-R基因水稻的实时定量PCR检测
随机选取10个T0代拟转OsMADS57-R基因水稻(分别命名为OsMADS57-OE1-T0至OsMADS57-OE10-T0)进行实时定量PCR检测，具体步骤如下：
1、分别以10个T0代拟转OsMADS57-R基因水稻的10天苗实验材料，用Trizol试剂提取总RNA，然后用植物cDNA合成试剂盒进行反转录，得到各个T0代拟转OsMADS57-R基因水稻的cDNA。
2、使用RT-qPCR技术分别检测10个T0代拟转OsMADS57-R基因水稻的cDNA中OsMADS57-R基因的相对表达量(以OsACTIN基因作为内参基因)。检测OsMADS57-R基因的引物为OsMADS57-qF：5′-CGAAGCGTCGGAACGGGCTT-3′和OsMADS57-qR：5′-AGGCCAGAAAGCTCCTCACCC-3′。检测OsACTIN基因的引物为OsACTIN-qF：5′-AGGAAGGCTGGAAGAGGACC-3′和OsACTIN-qR：5′-CGGGAAATTGTGAGGGACAT-3′。
3、按照上述方法，将T0代拟转OsMADS57-R基因水稻替换为日本晴，其它步骤均不变，得到日本晴中OsMADS57-R基因的相对表达量。
以日本晴中OsMADS57-R基因的相对表达量作为1，统计其它水稻植株中OsMADS57-R基因的相对表达量。结果表明，与日本晴相比，10个T0代拟转OsMADS57-R基因水稻中OsMADS57-R基因的相对表达量均显著增加。
上述结果表明，OsMADS57-OE1-T0至OsMADS57-OE10-T0均为T0代转OsMADS57-R基因水稻。
七、T3代纯合转OsMADS57-R基因水稻的获得及实时定量PCR检测
1、将OsMADS57-OE1-T0至OsMADS57-OE5-T0经连续三代自交，获得T3代纯合转OsMADS57-R基因水稻，分别命名为OsMADS57-OE1-T3至OsMADS57-OE5-T3。
2、按照步骤六的方法，对OsMADS57-OE1-T3至OsMADS57-OE5-T3和日本晴分别进行实时定量PCR检测。
检测结果表明，与日本晴相比，OsMADS57-OE1-T3至OsMADS57-OE5-T3中OsMADS57-R基因的相对表达量均显著增加。
按照上述方法，将EHA105/pCAMBIA1300-MADS57-Resist替换为EHA105/pCAMBIA1300，其它步骤均相同，得到T3代转空载体水稻的植株，以下简称转空载体水稻。
八、T3代纯合转OsMADS57-R基因水稻对铵的抵抗能力和农艺性状的鉴定
待测水稻为OsMADS57-OE1-T3、OsMADS57-OE3-T3、转空载体水稻或日本晴。
1、T3代纯合转OsMADS57-R基因水稻对铵的抵抗能力
铵对水稻的毒害效应的主要指标是叶片枯黄，因此可以通过叶片枯黄的程度判断铵对水稻的毒害程度。水稻叶片枯黄程度越高，则说明铵对水稻的毒害程度越大，水稻对铵的抵抗能力越低。
(1)取50粒待测水稻的种子，脱壳，然后用10％次氯酸钠消毒45min，无菌水冲洗5次，每次5-10min。
(2)取完成步骤(1)的、饱满的待测水稻种子30粒，播种于3个无菌培养瓶，每瓶10粒种子。每个培养瓶的培养基为含0.25mM NH4 +的培养基、含0.5mM NH4 +的培养基、含1mM NH4 +的培养基、含2.5mM NH4 +的培养基或含5mM NH4 +的培养基。
含0.25mM NH4 +的培养基：向1L超纯水10g蔗糖和0.39gM531型无氮素的MS固体粉末(PhytoTechnology Laboratories，USA)，磁力搅拌器上溶解完全后，用KOH水溶液调节pH值至5.7；然后加入3g植物凝胶和0.25mL浓度为1M的NH4Cl水溶液，113℃高温灭菌30min。
含0.5mM NH4 +的培养基：按照含0.25mM NH4 +的培养基的制备方法，将“0.25mL浓度为1M的NH4Cl水溶液”替换为“0.5mL浓度为1M的NH4Cl水溶液”，其它均不变。
含1mM NH4 +的培养基：按照含0.25mM NH4 +的培养基的制备方法，将“0.25mL浓度为1M的NH4Cl水溶液”替换为“1mL浓度为1M的NH4Cl水溶液”，其它均不变。
含2.5mM NH4 +的培养基：按照含0.25mM NH4 +的培养基的制备方法，将“0.25mL浓度为1M的NH4Cl水溶液”替换为“2.5mL浓度为1M的NH4Cl水溶液”，其它均不变。
含5mM NH4 +的培养基：按照含0.25mM NH4 +的培养基的制备方法，将“0.25mL浓度为1M的NH4Cl水溶液”替换为“5mL浓度为1M的NH4Cl水溶液”，其它均不变。
(3)完成步骤(2)后，将培养瓶置于恒温培养箱，25℃、光暗交替培养14天，观察水稻叶片的枯黄程度。
光暗交替培养即光培养和暗培养交替，条件为：12h光照培养/12h黑暗培养；光照培养时的光照强度为90μE/m2/s。
部分结果见图1(A为不同铵根离子浓度下，水稻根的生长状态；B为铵根离子浓度为5mM时，水稻叶片的生长状态)。结果表明，与日本晴相比，OsMADS57-OE1-T3、OsMADS57-OE2-T3和OsMADS57-OE3-T3对铵的抵抗能力显著增强；日本晴和转空载体水稻对铵的抵抗能力无显著差异。随着铵根离子浓度的增加，铵对日本晴、转空载体水稻、OsMADS57-OE1-T3、OsMADS57-OE2-T3或OsMADS57-OE3-T3的毒害程度也有一定程度的增加。
2、农艺性状鉴定
实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
(1)将15粒待测水稻的种子播种于大田，常规田间管理，然后分别在营养生长期和成熟期对待测水稻的叶片、茎杆、株型、叶夹角、株高进行比较及统计，观察收获的穗粒表型并统计粒重、粒长、粒宽和穗粒数。
营养生长期，部分待测水稻的表型见图2中A(WT为日本晴)。
成熟期，部分待测水稻的表型见图2中B(WT为日本晴)。
部分待测水稻的叶片表型见图3中A(WT为日本晴)。
部分待测水稻的叶片宽度的统计结果见图3中B(WT为日本晴)。
部分待测水稻的穗粒表型见图3中C(WT为日本晴)。
部分待测水稻的粒重统计结果见图3中D的左图(WT为日本晴)，粒长统计结果见图3中D的中图(WT为日本晴)，粒宽统计结果见图3中D的右图(WT为日本晴)。
部分待测水稻的穗粒数统计见图4中A(WT为日本晴)。
部分待测水稻的茎杆表型见图4中B(WT为日本晴)。
部分待测水稻的茎节间长度见图4中C(WT为日本晴)。
结果表明，在营养生长期，与日本晴相比，OsMADS57-OE1-T3和OsMADS57-OE3-T3的生长更茁壮，叶片宽度显著增加，茎杆显著加粗(表现为茎杆直径显著增加)；在成熟期，与日本晴相比，OsMADS57-OE1-T3和OsMADS57-OE3-T3的株型更加紧凑，叶夹角显著增加，株高显著降低；穗粒收获后，与日本晴相比，OsMADS57-OE1-T3和OsMADS57-OE3-T3的粒重和粒宽显著增加，穗长和穗粒数也显著增加，由此可知，与日本晴相比，OsMADS57-OE1-T3和OsMADS57-OE3-T3的单穗产量显著增加。日本晴和转空载体水稻的上述农艺性状无显著差异。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 蛋白质M57在调控水稻对铵的抵抗能力中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 726
<212> DNA
<213> Oryza sativa L.
<400> 1
atggggaggg ggaagatagt gataaggagg atagacaact cgacgagcag gcaggtgacg 60
ttctcgaagc gtcggaacgg gcttctgaag aaggcgaagg agctatccat cctctgcgat 120
gcggaggtcg gccttgtcgt cttctccagc accggcaggc tctatgagtt ctccagcacc 180
aacatgaaaa ctgtgataga ccggtatacc aacgcaaagg aggagctact tggcgggaat 240
gcaacttcag aaattaagat ttggcagagg gaggcagcaa gcttgaggca gcaactgcac 300
aacttgcaag aaagccacaa gcaactgatg ggtgaggagc tttctggcct aggtgttaga 360
gacctacaag gtttagagaa taggcttgaa ataagtctac gtaatatcag aatgagaaag 420
gacaatcttt tgaaaagtga aatcgaggag ttacatgtga agggaagcct aattcaccag 480
gaaaacatcg aactttctag aagcctaaat gtcatgtcgc aacaaaaatt ggaactgtat 540
aacaagcttc aggcctgtga acagagaggt gccacagatg caaatgaaag ttccagcact 600
ccatacagct ttcgtatcat acaaaatgct aatatgcctc ctagtcttga attgagccaa 660
tcacagcaaa gagaagggga gtgcagcaaa acagctgctc cagaactggg acttcatctg 720
ccttaa 726
<210> 2
<211> 726
<212> DNA
<213> Oryza sativa L.
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aacatgaaaa ctgtgataga ccggtatacc aacgcaaagg aggagctact tggcgggaat 240
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ccttaa 726
<210> 3
<211> 241
<212> PRT
<213> Oryza sativa L.
<400> 3
Met Gly Arg Gly Lys Ile Val Ile Arg Arg Ile Asp Asn Ser Thr Ser
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala
20 25 30
Lys Glu Leu Ser Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Leu Val Val Phe
35 40 45
Ser Ser Thr Gly Arg Leu Tyr Glu Phe Ser Ser Thr Asn Met Lys Thr
50 55 60
Val Ile Asp Arg Tyr Thr Asn Ala Lys Glu Glu Leu Leu Gly Gly Asn
65 70 75 80
Ala Thr Ser Glu Ile Lys Ile Trp Gln Arg Glu Ala Ala Ser Leu Arg
85 90 95
Gln Gln Leu His Asn Leu Gln Glu Ser His Lys Gln Leu Met Gly Glu
100 105 110
Glu Leu Ser Gly Leu Gly Val Arg Asp Leu Gln Gly Leu Glu Asn Arg
115 120 125
Leu Glu Ile Ser Leu Arg Asn Ile Arg Met Arg Lys Asp Asn Leu Leu
130 135 140
Lys Ser Glu Ile Glu Glu Leu His Val Lys Gly Ser Leu Ile His Gln
145 150 155 160
Glu Asn Ile Glu Leu Ser Arg Ser Leu Asn Val Met Ser Gln Gln Lys
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Asn Ala Asn Met Pro Pro Ser Leu Glu Leu Ser Gln Ser Gln Gln Arg
210 215 220
Glu Gly Glu Cys Ser Lys Thr Ala Ala Pro Glu Leu Gly Leu His Leu
225 230 235 240
Pro
Claims (7)
1.蛋白质M57在增强水稻的铵抵抗能力中的应用；
所述蛋白质M57为b1)或b2)：
b1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；
b2)在序列表中序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.编码权利要求1中所述蛋白质M57的核酸分子在增强水稻的铵抵抗能力中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下c1)-c4)任一所示的DNA分子：
c1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
c2)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
c3)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
c4)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。
4.一种培育转基因水稻的方法，包括如下步骤：提高出发水稻中权利要求1中所述蛋白质M57的表达量和/或活性，得到转基因水稻；与出发水稻相比，转基因水稻的铵抵抗能力增强；
所述提高出发水稻中权利要求1中所述蛋白质M57的表达量和/或活性通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体为向表达载体插入编码所述蛋白质M57的核酸分子，得到的重组质粒。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述编码蛋白质M57的核酸分子为d1)或d3)所示的DNA分子：
d1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
d3)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组载体为重组质粒pCAMBIA1300-MADS57-Resist；所述重组质粒pCAMBIA1300-MADS57-Resist为将pCAMBIA1300载体的限制性内切酶BamHI识别序列和限制性内切酶SacI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子，得到的重组质粒。
7.一种水稻育种方法，包括如下步骤：增加水稻中权利要求1中所述蛋白质M57的表达量和/或活性，从而水稻的铵抵抗能力增强；
所述增加水稻中权利要求1中所述蛋白质M57的表达量和/或活性通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体为向表达载体插入编码所述蛋白质M57的核酸分子，得到的重组质粒。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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