CN112646016B

CN112646016B - 改变玉米开花期的基因及方法

Info

Publication number: CN112646016B
Application number: CN202110085352.1A
Authority: CN
Inventors: 金敏亮; 刘相国; 许洁婷; 刘海军; 尹悦佳; 黄磊; 郭嘉; 韩宝柱; 严建兵
Original assignee: Weimi Biotechnology Jiangsu Co ltd; Jilin Academy of Agricultural Sciences; Huazhong Agricultural University
Current assignee: Changzhou Xinmi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2041-01-22
Also published as: CN112646016A

Abstract

本发明属于分子遗传学领域。具体涉及改变玉米开花期的基因及方法。本发明提供了一个控制玉米开花期基因的序列，且公开了利用基因工程手段突变该基因以改变开花期的方法。本发明还提供了开花期改变的玉米突变基因序列，该突变基因序列可以用来改良玉米开花期性状。

Description

改变玉米开花期的基因及方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域。具体涉及控制玉米花期的基因及其在改变玉米花期性状方面的应用。本发明提供了一个控制玉米花期基因的序列，且公开了利用基因工程手段突变该基因以缩短花期的方法。本发明还提供了花期缩短的玉米突变基因序列，该突变基因序列可以用来改良玉米花期性状。

背景技术

在高等植物中，开花代表着从营养生长到生殖生长的转换过程，其在植物体的整个生长发育阶段中具有重要的作用。而何时开花这一生物性状则受到植物体自身遗传因子及外界环境因素的双重作用。在这双重作用的影响下，一系列开花诱导过程在高等植物中具有普遍的规律，即植物体叶片通过感受外界生长条件(光照，温度，湿度等)，在适宜的时间产生成花物质(或叫开花素florigen)，成花物质经过输导组织由叶片运送到茎尖生长点，刺激顶端分生组织成花。

开花期是作物进化和适应过程中的重要性状，理解作物开花期性状的遗传基础、克隆候选基因可以提高作物的环境适应能力和可塑性，这对培育适应不同生态区的优良作物品种具有重要的意义，同时也将促进产量等与开花期密切相关的重要生产性状的遗传改良进程。

CCT(CO、COL和TOC1)家族基因广泛参与植物花期的调控过程，对植物的生长与发育起着至关重要的作用。玉米B73参考基因组中共有53个具有CCT结构的基因，申请人之前利用一个由368份玉米自交系组成的关联群体，定位到34个与玉米开花有关的CCT类基因(金敏亮.玉米泛转录组的构建及玉米开花抑制因子ZmCOL3的功能解析[D].湖北：华中农业大学，2018；Jin M,Liu X,Jia W,et al.ZmCOL3,a CCT gene represses flowering inmaize by interfering with the circadian clock and activating expression ofZmCCT[J].J Integr Plant Biol.,2018,60(6):465-480.)，其中的大部分基因尚没有具体的功能鉴定研究结果，因此具体哪些基因会确实地控制玉米开花性状尚不完全清楚。如果想要更加精准的改变玉米花期，需要具体明确究竟哪些基因会控制玉米花期性状以及这些基因进行了基因工程操作后对花期性状产生了什么程度的变化。

为解决上述问题，本发明利用基因编辑技术对这34个基因中的15个基因进行了突变，通过表型鉴定获得能够影响玉米开花期性状的基因和突变基因，并提供了人工改变玉米花期的方法。这些基因和方法可以用于人工调控玉米花期，培育适应不同生态环境的玉米新材料。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一个控制玉米花期性状的基因序列。

本发明的目的之二在于公开一种改变玉米花期的方法。

本发明的目的之三在于提供一个改变玉米花期性状的突变基因。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种蛋白在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种核酸分子在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述核酸分子编码上述的蛋白；在一些实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.1序列为GRMZM2G095598基因在玉米自交系B73中的氨基酸序列。SEQID NO.2序列为GRMZM2G095598基因的基因组序列。SEQ ID NO.3序列为GRMZM2G095598基因的cDNA序列。

本发明还提供了一种提早玉米开花期的方法，其特征在于：抑制玉米中上述基因编码蛋白的表达和/或活性，选择玉米开花期提早的植株。

在一些实施方案中，上述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入、物理或化学诱变中任一种。

在一些实施方案中，上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

在一些实施方案中，上述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种用于提早玉米开花期的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

(1)sgRNA分子，其序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)所述sgRNA的编码DNA分子；

(3)表达所述sgRNA的载体。

本发明还提供了一种玉米开花期提早的突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.6所示。

通过基因编辑突变靶基因可以得到很多不同的编辑类型，这些不同的编辑类型所对应的植株表现并不是完全一样的。本发明经过筛选鉴定，确定SEQ ID NO.6所示的突变基因能够使玉米开花期适度提早。该突变基因可以通过有性杂交的方式导入不同遗传背景的玉米材料中，从而创制早花玉米新品种。

本发明还提供了用于检测上述突变基因的引物对，其特征在于：所述引物对为SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列或其互补序列。

本发明还提供了上述引物对在检测上述突变基因中的应用。利用上述引物对对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，并测序分析扩增产物序列，如果扩增产物测序后序列与SEQ ID NO:6所示序列的部分序列一致，则待测样品中包含上述突变基因。

本发明的优点及有益效果如下：本发明利用关联群体定位到34个与玉米开花期性状有关的CCT类基因，然而并不知道这些候选基因中具体哪些基因会确实地控制玉米开花性状以及对开花期性状的影响程度。本发明利用基因编辑技术对这34个基因中的15个进行了突变，通过表型鉴定确定GRMZM2G095598确实能够影响玉米开花期性状。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法可以改变玉米开花期，编辑后的突变基因能够用于创制早花玉米新品种。本发明为人工调控玉米开花期以培育适应不同生态环境的玉米新材料提供了新的基因和方法。

附图说明

图1基因编辑载体图。各元件英文及缩写含义列举如下：

RB T-DNA repeat T-DNA右边界重复序列

M13 fwd M13引物序列(正向)

p000204_1F 靶标gRNA序列

Ubi promoter 泛素启动子

3×FLAG 标签序列

SV40NLS 猿猴病毒40核定位信号

Cas9 cas9基因序列

Nucleoplasm in NLS 核定位信号

NOS terminator 胭脂碱合成酶终止子

lac promoter 乳糖启动子

M13 rev M13引物序列(反向)

lac operator 乳糖操纵子

CAP biding site CAP结合位点

CaMV35S promoter(enhanced) 增强的花椰菜花叶病毒35S启动子

BlpR 编码Bar蛋白赋予植物具有草铵膦耐性

CaMV35S polyA single 花椰菜花叶病毒35S多聚腺苷酸序列

LB T-DNA repeat T-DNA左边界重复序列

Kan R 卡那霉素抗性序列

Ori 起始区序列

Bom 骨架区序列

pVS1 RepA pVS1复制子

pVS1 StaA pVS1转录起始区

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

如本文所用，可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”，以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分，其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而，用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时，分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基，或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时，基本上不含化学前体或其它化学品。“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如，编码蛋白的序列)。例如，在各种实施方案中，所分离的核酸可以包含在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸的少于约0.5kb的核苷酸序列。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。

在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

实施例1基因编辑敲除候选基因后鉴定玉米开花期的变化情况

本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对关联分析结果显示的与玉米开花期相关的34个基因中的15个基因进行定点编辑。

实施方式包括基因编辑载体的构建、玉米的遗传转化以及编辑效果的功能验证。具体如下：

1、基因编辑载体的构建

本发明的基因编辑载体为G08943-CPB-ZmUbi-hspCas9，其载体图如图1所示。该载体的基础载体为CPB-ZmUbi-hspCas9。本发明通过OverlapPCR获得双靶U6-sgRNA进而通过同源重组克隆到基础载体中，具体的构建流程如下：

(1)U6启动子的克隆。从B73中克隆U6启动子。

(2)靶标gRNA的设计。将受体材料B73参考基因组序列输入http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/进行靶标设计。

(3)通过Overlap PCR获得U6-sgRNA。引物对U6F1/U6R用于扩增第一个靶标的U6启动子，产物长度为515bp；引物对gR-1F(3F)/gRR1用于扩增第一个靶标的sgRNA，产物长度为127bp；引物对U6F1/gRR1用于进行Overlap PCR第2步扩增(U6-sgRNA)，产物长度为634bp。Overlap PCR第1步分别扩增U6和sgRNA，PCR产物分别稀释50倍后混合作为模板进行Overlap PCR第2步扩增。扩增产物电泳切胶回收并测序确认序列。Overlap PCR体系和条件如下：Overlap PCR第1步的15μL的反应体系如下，模板DNA(U6或sgRNA，≥30ng/μL)：0.5μL，Primer F/R：各1.2μL，灭菌ddH₂O：3.7μL，2×phanta max Buffer：7.5μL，dNTP mix：0.6μL，Phanta酶(产品编号：P505-d1/d2/d3)：0.3μL。Overlap PCR第2步的反应体系为30μL体系。U6吸1μL，加49μL ddH₂O稀释；sgRNA吸1μL，加49μL ddH2O稀释各吸10μL，混匀。具体如下：混合模板DNA(U6+sgRNA)：1.5μL，Primer F/R：各2.4μL，灭菌ddH2O：6.9μL，2×phanta maxBuffer：15μL，dNTP mix：1.2μL，Phanta酶：0.6μL。Overlap PCR程序如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃30秒，(3)62℃35秒，(4)72℃30秒，第(5)步是从(2)步－(4)步循环32次，(6)72℃10分钟，(7)25℃5分钟。载体构建所需的引物序列见表1。

表1载体构建所需的引物序列

(4)通过重组克隆构建到骨架载体。将CPB-Ubi-hspcas9载体用HindIII消化，回收。通过同源重组将U6-gRNA和载体二者连接。配反应液前保证各Overlap产物浓度接近一致，20μL的同源重组体系如下：Cas Hind III：3μL，T-1F Overlap：1μL，灭菌ddH2O：10μL，5×CE MultiS buffer：4μL，Exnase MultiS(产品编号：C113-01/02)：2μL。

2、玉米遗传转化

将载体通过电击法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米自交系KN5585(未米生物科技(江苏)有限公司选育的自交系)的幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0mL农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养2周，然后转到含8mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基1中，25℃，5000lx，光照培养1周。再将愈伤转移至分化培养基2中，光照培养2周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。

3、基因编辑植株的性状鉴定

对获得的基因编辑材料的开花期性状进行鉴定，发现这些基因中，有的编辑后确实能够造成玉米开花期的显著改变，而有些基因编辑后不能观察到明显的开花期变化，具体的变化方式见表2。

表2各基因编辑后的开花期变化情况

实施例2玉米开花期性状的深入分析和突变基因的鉴定

对开花性状有变化的基因编辑材料进行更深入的性状鉴定，并分析具体的编辑位点。GRMZM2G095598这个基因编辑后，T0代材料的玉米开花期比受体对照KN5585提早。对这个转化体的T1代材料的开花期进行更深入地鉴定，并分析具体的编辑位点。

GRMZM2G095598这个基因编辑时设计的靶标位点如SEQ ID NO.4所示。含有这个靶标的载体所表达的gRNA序列如SEQ ID NO.5所示。

提取苗期DNA检测基因编辑情况。设计引物，引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示。扩增靶标编辑区段，扩增体系为：DNA：3μL，双向引物各1μL，2×TaqMix：7.5μL，ddH₂O：2.5μL，总体积10μL。PCR反应条件如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃40秒，(3)57℃30秒，(4)72℃60秒，(5)从(2)步－(4)步循环35次，(6)72℃7分钟，(7)4℃保存。PCR产物交由武汉擎科生物科技有限公司进行Sanger测序。将转化株与受体KN5585的PCR扩增测序结果进行比较，发生碱基替换、插入或缺失的材料即为阳性编辑材料，否则为阴性材料。

序列比较后发现只有1种编辑类型的材料，靶点处删除了GG(表3)。因此，编辑后，A1材料的基因序列由SEQ ID NO.2变为SEQ ID NO.6。

表3基因编辑玉米材料的花期性状数据

“-”表示删除序列，方框表示PAM序列，下划线表示编辑靶标。

2018年夏季在吉林省试验地调查A1材料的开花期性状(包括抽雄期、散粉期、吐丝期)，结果如表4所示。A1已编辑的材料比未编辑的对照材料的花期有明显的提早，证明该基因控制花期性状，基因编辑后花期提前。

表4基因编辑玉米材料的花期性状数据

花期数据以平均值±标准差表示，单位：天。“CK”表示未编辑的对照材料。“**”表示与对照相比有极显著差异(P<0.01)。

因此SEQ ID NO.6所示的突变基因能够使玉米开花期适度提早。该突变基因可以通过有性杂交的方式导入不同遗传背景的玉米材料中，从而创制早花玉米新品种。

在导入的过程中，利用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列的引物对可以检测玉米基因组中是否含有上述突变基因，用该引物对对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物测序，如果扩增产物与SEQ ID NO:6第1-1140位所示序列一致，则包含SEQ IDNO.6所示的突变基因；如果扩增产物与SEQ ID NO:2第1-1142位所示序列一致，则为未编辑的基因型。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华中农业大学，吉林省农业科学院，未米生物科技（江苏）有限公司

<120> 改变玉米开花期的基因及方法

<130> 1

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 320

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 1

Met Glu Gly Asp Glu Lys Ser Ala Gly Gly Ala Pro Ala Tyr Trp Gly

1 5 10 15

Leu Gly Ala Arg Pro Cys Asp Ala Cys Gly Ala Glu Ala Ala Arg Leu

20 25 30

Tyr Cys Arg Ala Asp Ala Ala Phe Leu Cys Ala Gly Cys Asp Ala Arg

35 40 45

Ala His Gly Ala Gly Ser Arg His Ala Arg Val Trp Leu Cys Glu Val

50 55 60

Cys Glu His Ala Pro Ala Ala Val Thr Cys Arg Ala Asp Ala Ala Ala

65 70 75 80

Leu Cys Ala Ser Cys Asp Ala Asp Ile His Ser Ala Asn Pro Leu Ala

85 90 95

Arg Arg His Glu Arg Leu His Val Ala Pro Phe Phe Gly Ala Leu Ala

100 105 110

Asp Ala Pro Lys Pro Phe Ala Ser Ala Ala Pro Pro Lys Ala Thr Asp

115 120 125

Asp Asp Gly Ser Asn Glu Asp Glu Ala Ala Ser Trp Leu Leu Pro Glu

130 135 140

Pro Asp His Gly Gln Lys Glu Gly Ala Thr Thr Glu Val Phe Phe Ala

145 150 155 160

Asp Ser Asp Pro Tyr Leu Asp Leu Asp Phe Ala Arg Ser Met Asp Glu

165 170 175

Ile Lys Thr Ile Gly Val Gln Gln Ser Gly Ser Pro Glu Leu Asp Leu

180 185 190

Ala Gly Thr Lys Leu Phe Tyr Ser Asp His Ser Val Asn His Ser Val

195 200 205

Ser Ser Ser Glu Ala Ala Val Val Pro Asp Ala Ala Ser Gly Met Ala

210 215 220

Pro Met Val Ala Val Val Ser Arg Gly Leu Glu Arg Glu Ala Arg Leu

225 230 235 240

Met Arg Tyr Arg Glu Lys Arg Lys Ser Arg Arg Phe Glu Lys Thr Ile

245 250 255

Arg Tyr Ala Ser Arg Lys Ala Tyr Ala Glu Thr Arg Pro Arg Ile Lys

260 265 270

Gly Arg Phe Ala Lys Arg Thr Pro Gly Ala Gly Glu Asp Thr Leu Glu

275 280 285

Glu His Glu Glu Met Tyr Ser Ser Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Leu

290 295 300

Met Ala Pro Gly Gly Ala Asp Ala Asp Tyr Gly Val Val Pro Thr Tyr

305 310 315 320

<210> 2

<211> 1518

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 2

gcacgggcga acaaattgac ccgggagccg ggacggcgac ttccgtggtc agtcggtcct 60

ccacgtcgct cgttcgcgcc gaagacccgc ccaggccgcc ccacacggcc acagctcaaa 120

tcctgagcag agtgggaaag cttggctgag aatcgcttcg tcccgacagc cactactagg 180

aattgccgag cgagcgagct tgcgccgtgc gcgatggagg gtgacgagaa gtcggcgggc 240

ggggcccctg cttactgggg cctgggcgcg cggccctgcg acgcgtgcgg cgccgaggcg 300

gcgcgcctct actgccgcgc ggacgcggcg ttcctgtgcg ccgggtgcga cgcgcgggcg 360

cacggcgccg ggtcgcgcca cgcgcgggtc tggctctgcg aggtctgcga gcacgcgccg 420

gcggcggtca cgtgccgcgc ggacgctgcc gcgctctgcg cctcctgcga cgccgacatc 480

cactcggcga acccgctcgc gcgccgccac gagcgcctcc acgtggcgcc cttcttcggc 540

gcgctggccg acgcgcccaa gcccttcgcc tcggcggcgc cgcccaaagc aaccgacgac 600

gacgggagca acgaggacga ggcggcgtcg tggctcctcc ccgagcccga ccacgggcag 660

aaagaaggcg ccacgacgga ggtgttcttc gcggactctg acccgtacct cgacctcgac 720

ttcgcgcgtt ccatggacga aatcaagacc atcggcgtcc agcagagcgg gtcaccagag 780

ctcgacctcg ccggcaccaa gctcttctac tccgatcact ccgtgaacca cagtgtgagc 840

tagcatctct gatctgggca ctatctattt atctatcatt ctatctacgc acgtcccagc 900

actacttact tgaagttgaa gttaagccat gacgtgacgt cctatatctc actctcagtg 960

ttctgaaaat aaagacacgg atacgattgc aggtgtcatc gtcggaggca gcggttgtgc 1020

ccgacgcggc gtctggcatg gcgcccatgg tggcagtggt cagcaggggc ctggagcgag 1080

aggcgcggct gatgcggtac cgggagaagc gcaagagcag gcggttcgag aagacgatcc 1140

ggtacgcgtc ccgcaaggcg tacgcggaga cgcggccgcg catcaagggc cggttcgcca 1200

agcgcacgcc cggggctggg gaggacacgc tggaggagca cgaggagatg tactcctccg 1260

ccgctgccgc cgtggctgcg ctcatggccc ccggcggagc cgatgcggac tacggcgtcg 1320

tgcccacata ttgatctatg caattgcaac gccgacatgt acactagtta gcctcgtgct 1380

ctggggctgt aatttttgct gcatgcattg catgcaaagc tcttattgat tgcctgtatg 1440

attaacggaa gccattacaa gcaaggactt cctccctcct tttcaattcc tatgtatatt 1500

actatcatca ctacgagc 1518

<210> 3

<211> 1349

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 3

caaattgacc cgggagccgg gacggcgact tccgtggtca gtcggtcctc cacgtcgctc 60

gttcgcgccg aagacccgcc caggccgccc cacacggcca cagctcaaat cctgagcaga 120

gtgggaaagc ttggctgaga atcgcttcgt cccgacagcc actactagga attgccgagc 180

gagcgagctt gcgccgtgcg cgatggaggg tgacgagaag tcggcgggcg gggcccctgc 240

ttactggggc ctgggcgcgc ggccctgcga cgcgtgcggc gccgaggcgg cgcgcctcta 300

ctgccgcgcg gacgcggcgt tcctgtgcgc cgggtgcgac gcgcgggcgc acggcgccgg 360

gtcgcgccac gcgcgggtct ggctctgcga ggtctgcgag cacgcgccgg cggcggtcac 420

gtgccgcgcg gacgctgccg cgctctgcgc ctcctgcgac gccgacatcc actcggcgaa 480

cccgctcgcg cgccgccacg agcgcctcca cgtggcgccc ttcttcggcg cgctggccga 540

cgcgcccaag cccttcgcct cggcggcgcc gcccaaagca accgacgacg acgggagcaa 600

cgaggacgag gcggcgtcgt ggctcctccc cgagcccgac cacgggcaga aagaaggcgc 660

cacgacggag gtgttcttcg cggactctga cccgtacctc gacctcgact tcgcgcgttc 720

catggacgaa atcaagacca tcggcgtcca gcagagcggg tcaccagagc tcgacctcgc 780

cggcaccaag ctcttctact ccgatcactc cgtgaaccac agtgtgtcat cgtcggaggc 840

agcggttgtg cccgacgcgg cgtctggcat ggcgcccatg gtggcagtgg tcagcagggg 900

cctggagcga gaggcgcggc tgatgcggta ccgggagaag cgcaagagca ggcggttcga 960

gaagacgatc cggtacgcgt cccgcaaggc gtacgcggag acgcggccgc gcatcaaggg 1020

ccggttcgcc aagcgcacgc ccggggctgg ggaggacacg ctggaggagc acgaggagat 1080

gtactcctcc gccgctgccg ccgtggctgc gctcatggcc cccggcggag ccgatgcgga 1140

ctacggcgtc gtgcccacat attgatctat gcaattgcaa cgccgacatg tacactagtt 1200

agcctcgtgc tctggggctg taatttttgc tgcatgcatt gcatgcaaag ctcttattga 1260

ttgcctgtat gattaacgga agccattaca agcaaggact tcctccctcc ttttcaattc 1320

ctatgtatat tactatcatc actacgagc 1349

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 4

gttgtgcccg acgcggcgtc 20

<210> 5

<211> 103

<212> RNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 5

guugugcccg acgcggcguc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 6

<211> 1516

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 6

gcacgggcga acaaattgac ccgggagccg ggacggcgac ttccgtggtc agtcggtcct 60

ccacgtcgct cgttcgcgcc gaagacccgc ccaggccgcc ccacacggcc acagctcaaa 120

tcctgagcag agtgggaaag cttggctgag aatcgcttcg tcccgacagc cactactagg 180

aattgccgag cgagcgagct tgcgccgtgc gcgatggagg gtgacgagaa gtcggcgggc 240

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gcgcgcctct actgccgcgc ggacgcggcg ttcctgtgcg ccgggtgcga cgcgcgggcg 360

cacggcgccg ggtcgcgcca cgcgcgggtc tggctctgcg aggtctgcga gcacgcgccg 420

gcggcggtca cgtgccgcgc ggacgctgcc gcgctctgcg cctcctgcga cgccgacatc 480

cactcggcga acccgctcgc gcgccgccac gagcgcctcc acgtggcgcc cttcttcggc 540

gcgctggccg acgcgcccaa gcccttcgcc tcggcggcgc cgcccaaagc aaccgacgac 600

gacgggagca acgaggacga ggcggcgtcg tggctcctcc ccgagcccga ccacgggcag 660

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ctcgacctcg ccggcaccaa gctcttctac tccgatcact ccgtgaacca cagtgtgagc 840

tagcatctct gatctgggca ctatctattt atctatcatt ctatctacgc acgtcccagc 900

actacttact tgaagttgaa gttaagccat gacgtgacgt cctatatctc actctcagtg 960

ttctgaaaat aaagacacgg atacgattgc aggtgtcatc gtcggaggca gcggttgtgc 1020

ccgacgccgt ctggcatggc gcccatggtg gcagtggtca gcaggggcct ggagcgagag 1080

gcgcggctga tgcggtaccg ggagaagcgc aagagcaggc ggttcgagaa gacgatccgg 1140

tacgcgtccc gcaaggcgta cgcggagacg cggccgcgca tcaagggccg gttcgccaag 1200

cgcacgcccg gggctgggga ggacacgctg gaggagcacg aggagatgta ctcctccgcc 1260

gctgccgccg tggctgcgct catggccccc ggcggagccg atgcggacta cggcgtcgtg 1320

cccacatatt gatctatgca attgcaacgc cgacatgtac actagttagc ctcgtgctct 1380

ggggctgtaa tttttgctgc atgcattgca tgcaaagctc ttattgattg cctgtatgat 1440

taacggaagc cattacaagc aaggacttcc tccctccttt tcaattccta tgtatattac 1500

tatcatcact acgagc 1516

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 7

gcacgggcga acaaattgac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 8

ccggatcgtc ttctcgaacc 20

Claims

1.一种蛋白在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种核酸分子在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1中所述的蛋白。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。

4.一种提早玉米开花期的方法，其特征在于：抑制玉米中权利要求1中所述蛋白的表达和/或活性，选择玉米开花期提早的植株。

5.根据权利要求4所述提早玉米开花期的方法，其特征在于：所述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰或T-DNA插入中任一种。

6.根据权利要求5所述提早玉米开花期的方法，其特征在于：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

7.根据权利要求6所述提早玉米开花期的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

8.一种用于提早玉米开花期的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

(1)sgRNA分子，其序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)编码(1)所述sgRNA的DNA分子；

(3)表达(1)所述sgRNA的载体。

9.一种玉米开花期提早的突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.6所示。

10.用于检测权利要求9所述突变基因的引物对，其特征在于：所述引物对为SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示的序列。

11.权利要求10所述的引物对在检测权利要求9所述突变基因中的应用。