CN100387717C

CN100387717C - 通过功能性地抑制植物细胞周期蛋白抑制剂基因增加植物细胞增殖的方法

Info

Publication number: CN100387717C
Application number: CNB008092214A
Authority: CN
Inventors: J·罗伯茨; B·凯利
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Current assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-15
Publication date: 2008-05-14
Anticipated expiration: 2020-05-15
Also published as: US20120192314A1; EP1179003A4; HK1049845A1; AU2005203616B2; JP2002543823A; WO2000069883A1; DE60042404D1; AU781259B2; ATE433990T1; CN101285068A; EP1179003B1; EP1179003A1; AU2005203616A1; AU5018500A; CA2372323A1; ES2328217T3; US20120096590A1; CA2372323C; HK1049845B; CN1379783A

Abstract

本发明提供了用于调节植物生长和/或产量的方法。具体地说，这些方法包括使用功能性地抑制植物D样细胞周期蛋白抑制剂表达的物质，这些物质包括与编码能够结合植物D样细胞周期蛋白的蛋白质的DNA或RNA相互作用的分离的多核苷酸序列。另外，本发明提供了重组的多核苷酸序列，载体以及宿主细胞，它们编码能够结合植物D样细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶复合体和灭活其活性，防止植物细胞退出细胞周期的蛋白质。本发明也提供了测定方法和这样一些物质，它们是BRO细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂蛋白质的抑制剂，这些抑制剂能够调节植物细胞周期进程。本发明还提供了产生转基因植物细胞和具有提高的生长速率和产量(当与野生型植物相比时)的植物的方法。

Description

通过功能性地抑制植物细胞周期蛋白抑制剂基因增加植物细胞增殖的方法

相关申请的交叉参见

本申请要求对1999年5月14日申请的、美国临时申请号60/134,373的优先权和利益，其说明书一并参考。

发明权利的陈述是在联邦政府赞助的研究与发展的指导下提出的。

按照从美国国家卫生研究所收到的准予资助号RO1CA67893，美国政府可以享有本发明一定的权利。

发明背景

真核细胞仅仅在细胞周期的一个简短的窗孔期间可以从一种增殖状态变换成为一种静止状态。Temin，J.细胞生理学杂志。78：161(1971)。这样，取决于它们在细胞周期中的位置，丧失分裂素的细胞，如当检查哺乳动物细胞时那些存在于血清中的细胞将经历直接的细胞周期停滞，否则它们将完成有丝分裂，并且停滞在下一个细胞周期。从依赖于分裂素过渡到不依赖于分裂素发生于细胞周期的中期到晚期G1期。Pardee，美国国家科学院院刊71：1286(1974)，表明许多不同的抗-促有丝分裂的信号使细胞周期在一个动力学上的普通点停滞，并且进一步表明细胞周期在中期到晚期G1期中的大约同一时间对所有这些信号变得没有反应。这个点被称为限制点，或者R点。

有丝分裂增殖的单个细胞的定时电影摄影术也被用来精确地描绘记录细胞周期向不依赖于分裂素的转变的时机。这证实了分裂素耗尽或者其它的生长抑制信号造成有丝分裂后，早期的G1细胞立即退出细胞周期，并且细胞周期的定型(促有丝分裂信号的自主性)发生于中期-G1期(Larsson等，细胞生理学杂志。139：477(1989)，和Zetterberg等，美国国家科学院院刊。82：5365(1985))。这些观察资料表明在细胞增殖方面依赖于分裂素的控制是与细胞周期进程相互联系的。

过渡通过G1期，和进入S期需要依赖于细胞周期蛋白的激酶(Cdks)的作用(Sherr，细胞79：551(1994))。已经表明生长抑制信号在G1期间可阻止这些Cdks的激活(Serrano等，自然366：704(1993)；Hannon和Beach，自然371：257(1994)；El-Deiry等，细胞75：89(1993)；Xiong等，自然366：701(1993)；Polyak等，细胞78：59(1994)；Toyashima和Hunter，出处同上，P.67；Lee等，基因和发育。9：639(1995)；Matsuoka等，出处同上，P.650；Koff等，科学260：536(1993))。已知Cdks的催化活性是受两种一般的机制调节的，即蛋白质磷酸化和与调节亚基的相关性(Gould等，EMBO杂志。10：3297(1991)；Solomon等，出处同上，12：3133(1993)；Solomon等，分子生物学。细胞3：13(1992)；Je ffrey等，自然376：313(1995)；Morgan，自然374：131(1995))。在调节亚基中，Cdks与抑制的CKI亚基(细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制剂)的联系与分裂素耗尽对细胞增殖和Cdk活性的影响最密切地相关。

植物细胞用于细胞生长和分裂的早期的研究中，以便确立真核细胞周期的阶段(Howard等，遗传6(增刊)：216-273(1953))，但是关于植物细胞周期调节的机制知之甚少。在活体内由于休眠或在体外由于营养饥饿停止分裂的植物细胞在G1和G2期的主要控制点停滞(van’t Hof等，在《分生细胞群体的动力学》中，Milier等编辑，Plenum，纽约，pp15-32(1972)，Gould等，原生质106：1-13(1981))。一般地，这种模型与其它真核系统中所观察到那种类型是一致的。cdc2激酶的同系物已从一些植物种类中分离出来，包括豌豆(Feller等，美国国家科学院院刊87：5397-5401(1990))，苜蓿(Hirt等，美国国家科学院院刊88：1636-1640(1991)和Hirt等，植物杂志4：61-69(1993))，以及拟兰芥(Ferreira等，植物细胞3：531-540(1991)，Hirayama等，基因105：159-165(1991))。而且，一些编码具有A-，B-，或D样特征的或具有混合的A-和B-型特征的植物细胞周期蛋白的一些cDNA序列已从各种植物中分离出来，包括胡萝卜和大豆(Hata等，EMBO杂志。10：2681-2688(1991))，以及拟兰芥(Hemerly等，美国国家科学院院刊89：3295-3299(1992)，和Soni等，植物细胞7：85-103(1995))。

近来，已经鉴定了拟兰芥的编码植物-细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的DNA序列(WO 99/14331；Wang等，植物杂志15：501-510(1998)；每个在此一并参考)。这些DNA序列编码的蛋白质因为其结合到细胞周期蛋白和/或对激酶类似的抑制效果已被提出是植物细胞分裂的调节子。还提出了部分和/或整个除去一个基因或者减少编码植物-细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的表达可能影响并且很有可能将抑制细胞分裂(WO99/14331)。

植物的遗传工程，需要遗传材料的分离和操作，以及随后的遗传物质向植物、植物组织的导入，近些年来已经相当大地改变了植物育种和农业。提高的农作物食品价值，更高的产量，饲料价值，降低的生产成本，病虫害的抗性，逆境的耐性，干旱抗性，药物和生物分子的生产以及其它有益的品质通过遗传工程技术都是有潜力可完成的。

操纵基因表达的能力提供一种产生转化植物中新的特征的手段。例如，增加植物的根系大小的能力将允许从土壤中的营养吸收。此外，增加叶片生长的能力，即叶片大小和/或叶片数量的增加将增加植物吸收太阳能的能力。显然，控制整株植物生长的能力，或者植物特定的靶器官将是非常理想的。

可以使用细胞周期控制基因提高作物的经济上有价值的部分的生长和发育，包括单子叶植物和双子叶植物两者。在单子叶植物上，另外使用细胞周期控制基因或蛋白以提高其从愈伤组织的再生能力将是有用的。

而且，在植物的发育阶段，当细胞数量影响经济上有价值的组织的产量时，细胞周期控制基因是潜在的影响细胞分裂和行为的位点。一个具体的例子是在禾谷类上在胚乳发育的多核期或者果实或花发育阶段核分裂的次数的数量。

根据以上所述，显然需要一些方法，用于调节植物细胞，植物组织和携带有一个或多个功能性地灭活的内源细胞周期蛋白抑制剂基因或者携带一种转基因的植物的细胞分裂，该转基因编码一种在至少一个亚群的宿主细胞中表达的异源的细胞周期蛋白抑制剂多肽或突变的细胞周期蛋白抑制剂多肽变异体。因此，本发明的目的是通过功能上抑制植物细胞周期蛋白抑制剂的表达或者活性提供用于增加细胞分裂的方法和组合物。

此外，本发明提供了编码植物D样细胞周期蛋白结合蛋白BRO4的核苷酸序列。同时，本发明提供了导向转基因，以灭活内源性细胞周期蛋白抑制剂基因，尤其是编码具有植物D样细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶结合结构域的蛋白质的基因。本发明的另一个目的是提供产生转基因植物细胞，植物组织和携带本发明的正确定向转基因的转基因植物的方法。这些方法也可用来灭活从植物上移出的细胞(例如，用于活体间插入)的细胞周期蛋白抑制剂基因，以便给予产生的定向细胞，因为增加的细胞增殖表型引起的表型。

发明概要

本发明提供了用于调节植物细胞的细胞周期，以便与野生型植物相比，植物的生长和/或产量增加的方法。该方法包括功能性地灭活植物D样细胞周期蛋白抑制剂。可通过修饰细胞周期蛋白抑制剂基因诱导功能性地灭活作用，例如通过物理修饰细胞周期蛋白抑制剂基因，插入一个编码反义分子(对编码细胞周期蛋白抑制剂基因特异的)的基因，或者通过RNA诱导的沉默，即(RNAi)，等等。细胞周期也可以通过提供一种细胞周期蛋白的抑制剂/细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的形成，即，小分子，抗体，多克隆的和单克隆的，重组抗原结合蛋白质等等来调节。

在另一实施方案中，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，该转基因植物与相应的野生型植物相比具有增加的生长速率和/或产量。该方法包括，把植物细胞与在功能上破坏编码细胞周期蛋白核酸序列的一些核酸序列相接触，以获得转化的植物细胞；从这些转化的植物细胞产生植物，以及筛选表现出增加的生长速率或产量的植物(与野生型植物相比)。在一特定的实施方案之内，细胞周期蛋白抑制剂编码基因是一个BRO基因，即BRO4基因或者另一种植物细胞周期蛋白抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明包含一种用于产生具有增加的生长速率或产量特征的植物(与野生型植物相比)的方法，以及包含把植物与一种为本发明的细胞周期蛋白抑制剂的抑制剂的物质相接触的方法。该物质防止细胞周期蛋白抑制剂与植物D样细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶复合物相互作用，从而使细胞继续分裂。本发明的附加的物质可以诱导细胞周期蛋白抑制剂蛋白质的抑制剂的表达。

本发明也提供了被植物D样细胞周期蛋白抑制剂的抑制剂处理的、分离的植物细胞群体和植物，并且照此处理的植物细胞群体和植物具有增加的分裂细胞与未分裂细胞的比例(相对于未处理细胞群体的这种比例)。分裂的细胞，转基因原生质体在产生整株转基因植物方面特别有用。

另外，本发明提供了分离的、编码植物D样细胞周期蛋白结合蛋白(指定BRO4)的多核苷酸序列。在一个特定的实施方案中，该蛋白质也能够结合和灭活植物细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶复合物，即，植物D样细胞周期蛋白抑制剂，并且可用来增加植物细胞的增殖。

在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的多核苷酸序列BRO4编码的、实质上已纯化的植物D样细胞周期蛋白抑制剂蛋白。本发明还提供一些载体，这些载体包含编码本发明的BRO4细胞周期蛋白抑制剂氨基酸序列的多核苷酸序列，或其互补的多核苷酸序列。也提供了用于本发明的细胞周期蛋白抑制剂表达的宿主载体系统，其中该抑制剂能够结合植物D样细胞周期蛋白和植物D样细胞周期蛋白/cdk复合体。

附图简要描述

图1描述了各种ICK-IR转基因植物品系和对照植物的最大的丛生叶片的宽度(对毫米)的测量结果。

图2描述了几个ICK-IR转基因植物品系与对照植物的第一片茎生片重量的测量结果。

图3描述了各种ICK-IR转基因植物品系和对照植物的茎干高度(毫米)的测量结果。

图4是植物的单体和结构的一种图示。

具体实施方案的描述

在陈述本发明之前，阐明在下文使用的某些术语的定义对其理解可能是有帮助的。

定义

除非另外有其它定义，本文所使用的所有技术和科学的术语具有一般理解为与本发明所属领域中普通技术相同的含义。虽然任何类似的或者等同于这里所描述的方法与材料可以用于实践中或者用于本发明的检验，本发明描述了优选的的方法以及材料。为了本发明的目的，下列的术语被定义如下。

如本文所使用的″细胞周期蛋白抑制剂蛋白质″或者″细胞周期蛋白抑制剂多肽″，指在细胞中的细胞周期蛋白途径中结合和灭活细胞周期蛋白-依赖性激酶(CDK)或有关的蛋白的蛋白质或者多肽。BRO3和BRO4蛋白质是植物细胞周期蛋白抑制剂蛋白质的例子。如本文所使用的一种细胞周期蛋白抑制剂基因是一个多核苷酸序列，这个多核苷酸序列编码细胞周期蛋白抑制剂蛋白或多肽，该序列包括所有的含有编码相同的氨基酸序列的替换核苷酸序列(因为遗传密码的简并性)的核酸序列。

如本文所使用的，术语″细胞周期蛋白抑制剂基因″或者″细胞周期蛋白抑制剂基因座″是指横跨所有潜在地编码细胞周期蛋白抑制剂多肽的外显子的、并且延伸到参于细胞周期蛋白抑制剂蛋白表达的侧翼序列(例如，包括启动子，增强子，等等)的染色体的一个区域。本质上说，任何编码细胞周期蛋白抑制剂蛋白的基因可以被破坏，包括但不限于BRO3(FL39)，BRO4，ICK1，等等。本发明一特定的实施方案包括BRO4基因，该基因可以破坏，并且，如果需要的，可以用一个同种异源基因或小基因代替，即，通过结构上的破坏或沉默方式。

本文所使用的术语″被破坏的″是指一个基因座可以″在结构上被破坏″，以至于包含至少一种突变或结构的改变，因而被破坏的基因不能指导一个功能基因产物的有效表达，或者该基因可以是″功能上被灭活的″，因而基因座是不表达的或者不能够表达一个功能基因产物。功能灭活可以在转录或翻译水平上由于结构的破坏和/或表达的中断引起。一个内源的细胞周期蛋白抑制剂基因，如BRO3(FL39)，BRO4，或ICK1基因的功能灭活也可通过其它方法产生，例如，反义的多核苷酸基因抑制，双链RNA诱导的基因沉默，等等。

本文使用的术语″对应于(相当于)″是指与所有的或一部分的参照多核苷酸序列具有一致性的多核苷酸序列。本文使用的术语″与...互补的″是指与所有的或一部分的参照多核苷酸序列互补的序列。

本文使用的术语″实质上相当于″，″实质上同源的″，或者″实质上的同源性″表示一个核苷酸序列的特征，其中一个核苷酸序列与参照序列相比具有至少大约70％的同源性，与参照序列相比典型地至少大约85％的同源性，优选地至少大约95％的同源性。序列同源性的百分比的计算把总共占不到25％的参照序列的小的缺失或添加排除在外。参照序列可以是一亚群一种较大的序列，如基因或侧翼序列的一部分，或者染色体的一个重复部分。然而，参照序列至少为18核苷酸长，典型地至少大约30个核苷酸长，优选地至少50至100个核苷酸长。本文所使用的″实质上互补的″是指与一个实质上相当于一个参照序列的序列互补的一个序列。

对序列的比较可以进行最佳的序列对比，例如，通过Smith等的局部同源性算法，应用数学进展，2：482(1981)，通过Needleman等的同源性序列比较算法，分子生物学杂志，48：443(1970)，通过Pearson等的搜寻相似性的方法，美国国家科学院院刊，85：2444(1988)，通过对这些算法执行计算机处理(GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，在威斯康星遗传学软件包中，遗传学计算机小组，575Science Drive，Madison，WI)，或者通过视觉检查。

实用算法的一个例子是PILEUP。PILEUP从一组相关序列中创建多重的序列比较，用渐进的，朝序列对方向的排列比较，来显示相互关系和百分序列同源性。它也绘制一个树或树状图谱表明用来创建序列比较的聚类相互关系。PILEUP用一个简单化的、渐进的序列比较方法，Feng等，分子进化杂志，35：351-360(1987)。所使用的这种方法类似于由Higgins等描述的方法，CABIOS 5：151-153(1989)。该程序可分析比较多达300个序列，每个序列的最大长度为5,000个核苷酸或者氨基酸。多重序列分析过程从两个最相关的序列的序列对方向开始排成行进行序列对比。该聚簇然后与下一个最相关的序列或序列对比的序列聚簇排成行进行序列对比。两个序列聚簇通过两个单独的序列的成对方向排列的简单延伸进行序列对比。通过一系列渐进的，朝序列对方向的排列获得最终的序列比较。该程序通过指定的特异序列和对序列比较区域同等的它们的核酸或氨基酸以及通过指定程序参数运行。例如，参照序列可以与其它检验序列进行比较，利用下列参数测定百分序列一致性的相互关系：空位缺口权重(3.00)，空位缺口长度权重(0.10)和加权末端缺口。

适合于测定序列相同的百分比和序列相似性的另一个算法的例子是BLAST算法，该算法在Altschul等，分子生物学杂志215：403-410(1990)中有描述。用于执行BLAST分析的软件通过国家生物工程信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公开使用。在查询序列中通过鉴定短序列字串长度W，该算法包括首先鉴定高分值的序列对(HSPs)，在一个数据库序列中当与一个相同长度的字串序列比较时，该查询序列中的短序列字串与某些正值阈值分T相匹配或满足。T指邻近序列字串分值阈值(Altschul等，见前述)。这些命中的最初的邻近字串作为开始搜索的种子，以发现更长的含有这些命中的邻近字串的HSP。命中的字串再沿每个序列向两个方向延伸，累积的序列对比分值将增加。当累积的序列对比分值从最大完成值的数量X下降时；因为积累一个或多个的负得分对比序列，累积的分值变为零或者零以之时；或者已抵达两个序列的末端时，每个方向命中字串的延伸被终止。BLAST算法参数W，T和X确定序列对比的灵敏度和速度。BLAST程序用字串长度(W)为11，BLOSUM62得分矩阵(参见，Henikoff等，美国国家科学院院刊89：10915(1989))序列对比(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较作为一些空位(欠缺)。

除计算百分序列同源性，Blast算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin等，美国国家科学院院刊90：5873-5787(1993))。Blast算法提供的一种相似性测量是最小总数概率(P(N))，它提供一种概率指示，通过该概率指示，两个核苷酸或氨基酸序列的配对将随机发生。例如，如果在一个比较实验中最小总数概率不到大约0.1，更优选地不到大约0.01，最优选地不到大约0.001，一个核苷酸序列将可以考虑类似于参照序列。

一般来说，导向效率随着实质上与目标DNA(即交换目标序列)中存在的一个参照序列互补的导向转基因部分(即，同源区)的长度而增加。一般地，虽然认识到各种重组酶的存在可以减少需要有效重组的序列同源性的程度，导向效率随着使用等基因的DNA锁状同源物而最优化。

本文使用的术语″非同源的序列″具有一般的和特定的两种含义；它一般是指与一个指定的参照序列在实质上不相同的一个序列，并且在没有明确确定特定的参照序列的地方，它特定是指在一个定向的内源细胞周期蛋白抑制剂基因上，如BRO4基因，与至少大约50个邻近的碱基在实质上不相同的序列。

本文把特定的杂交定义为一个导向转基因序列(例如，一个编码植物D样细胞周期蛋白抑制蛋白的多核苷酸，它可能包括取代，缺失和/或添加)和一个特定的目标DNA序列(例如，BRO3(FL39)，ICK1，或者BRO4的基因序列)之间的杂合体形成，其中，一个标记的导向转基因序列优选地与该目标杂交，因而，例如用所说的标记的导向转基因序列作为探针从细胞中制备的DNA的Southern印迹上可以鉴定相当于基因组的细胞周期蛋白抑制剂基因的单一条带。显然，最适的杂交条件将依赖于导向转基因和内源目标的组成和长度以及实验人员所选的实验方法而变化。可用各种实验指导来选择合适的杂交条件(参见，Sambrook等，分子克隆：实验室手册(1989)，第二版，冷泉港，纽约。以及Berger和Kimmel，酶学方法，第152卷，分子克隆技术指导(1987)，学院出版社公司，San Diego，CA.，本文一并参考)。

本文所使用的、应用于一种物质的术语″天然存在的″指可在自然界发现的物质。例如，存在于有机体(包括病毒)的多肽或多核苷酸，它们可以从自然界的一个来源中被分离出来，并且没有在实验室中通过人有意识地加以修饰，这种多肽或多核苷酸即是天然存在的。如本文所使用的，按照传统遗传学选择性地培育的实验室的植物品系被认为是天然存在的植物。

本文使用的术语″同源染色体″指物种之间在进化上和功能上相关的一个基因序列。

本文使用的术语″导向构建体″指一个核苷酸，它包含：(1)至少一个具有与存在于宿主细胞的内源植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因座上的序列实质上相同或实质上互补的一个序列的同源区，和(2)一个通过导向构建体同源区和所说的内源植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因座序列之间的同源重组整合到宿主细胞内源植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因座上的。如果该导向构建体是一个″打了就跑的″或″进进出出的″类型的载体(Valancius和Smithies，分子细胞生物学。11：1402(1991)；Donehower等，自然356：215(1992)(本文在此一并参考)，导向区域只是瞬时地整合到内源细胞周期蛋白抑制剂基因座，通过选择可从寄主染色体上去除。导向区域可以包含实质上与内源细胞周期蛋白抑制剂基因序列同源的序列和/或包含非同源序列，如可选择的标记(如，neo，tk，gpt)。术语″导向构建体″不一定表明多核苷酸含有可整合到寄主基因组的基因，也不一定表明多核苷酸含有完整的结构基因序列。如本领域中使用的，术语″导向构建体″与本文使用的术语″导向转基因″是同义词。

本文使用的术语″同源性区域″与″同源性锁状物″是指具有实质上相当于或实质上与一个预定的内源植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因序列互补的序列的导向构建体的一段(或一部分)，它可以包括所说的细胞周期蛋白抑制剂基因侧翼的序列。一个同源性区域一般地至少有大约100个核苷酸长，优选地至少为大约250至500个核苷酸长，典型地至少为大约1000个核苷酸长。虽然对介导同源性重组的一个同源性锁状物没有理论上证明的最小长度，人们相信同源重组的效率一般随着同源性锁状物长度而增加。同样地，重组效率随导向构建体同源区和内源目标序列之间的序列同源性程度而增加，当同源性锁状物与内源目标序列为等位基因时，发生最佳的重组效率。

如本文所使用的，术语″同源性锁状物″与″同源性区域″是可以互换的，鉴于不一致地使用本领域的类似的术语，为了明晰起见，提供该可替换的术语。同源性锁状物不一定意味着具有内源序列的碱基对杂合体结构的形成。实质上相当于或实质上与转基因同源性区域互补的内源的植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因本文称为″交换目标序列″或者″内源目标序列″。

如本文所使用的，术语″正确定向的构建体″是指整合在内源交换目标序列之内或其邻近的导向构建体的一部分，如内源BRO4基因座的一部分。产生具有正确定向的转基因和不正确定向的转基因是可能的。具有正确定向的转基因和/或不正确定向的转基因的细胞和植物可以通过基因组DNA的PCR和/或Southern印迹分析进行鉴定和分辨。

如本文所使用的，术语″导向区域″指同源性锁状物和内源的植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因之间的同源重组之后、整合到内源染色体位置的定向构建体的一部分，如BRO4基因序列。典型地，导向区域的每一端是同源性锁状物，因而每个同源性锁状物和它们相应的内源植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因序列之间的双交换重组导致内源植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因座部分被导向区域所替换；在这种双交换基因替换的导向构建体中，导向区域可称为″替换区域″。然而，某些导向构建体可以只使用单一的同源性锁状物(例如，一些″打了就跑的″-类型的载体，参见，Bradley等，生物/技术10：534(1992)，本文一并参考)。

术语″物质″本文用来表示化合物，化合物的混合物，生物大分子，即抗体，对植物D样细胞周期蛋白抑制剂特异性的多克隆或单克隆抗体，或者生物材料如细菌，植物，真菌，或动物(尤其是植物的)细胞或组织的提取物。

术语″细胞周期蛋白抑制剂失效表型″指存在于细胞周期蛋白抑制剂基因+/-和-/-植物中的(如，功能性上灭活的细胞周期蛋白抑制剂等位基因的拟南芥属的半合子的或纯合的，即，BRO的家族基因，例如，BRO4.)和不存在于相同条件下培育的同种，同一品系和同一年龄的野生植物中的一种表型特征。例子包括本文所描述的，如，与野生型相比的超常增生，整个的过度生长，增生的，细胞过多的和本文注意到的其它表型特征。

本文使用的术语″植物细胞″指原生质体，配子产生的细胞和可以再生为完整植物的细胞。如本文所使用的，术语″植物″是指整个植物，植物细胞或者一组植物细胞，如植物组织或者植物种子。血小板也包括在″植物″的含义之内。本发明中包括的植物是任何的植物，尤其是有经济重要性的、适合于基因转移技术的植物，包括裸子植物和被子植物，以及单子叶和双子叶两者。

单子叶被子植物的例子包括但不限于，芦笋，大田玉米和甜玉米，大麦，小麦，稻米，高粱，洋葱，小米，黑麦和燕麦和其它禾谷类。双子叶被子植物的例子包括但不限于，番茄，烟草，棉花，油菜，菜豆，大豆，辣椒，莴苣等等。木本种类的例子包括杨树，松树，雪松，橡木等等。

本文所使用的术语″遗传修饰″指一个或多个外源核酸序列(即，异源基因)，如植物D样细胞周期蛋白抑制剂编码序列，以及调节序列导入到一种或多种能够产生完整的，有生殖能力的，并且种子能生长发育的植物细胞中。本文所使用的术语″遗传上修饰的″指通过前面提到的方法产生的植物。

把核酸序列，例如所需的异源基因导入到植物细胞中的优选方法是用事先经核酸序列转化的根癌农杆菌侵染植物细胞，外植体，分生组织或者种子。在本领域熟知的条件下，转化的植物细胞生长形成芽，根，和进一步发育为植物。核酸序列可导入到合适的植物细胞中，例如借助于根癌农杆菌的Ti或Ri质粒。根癌农杆菌一旦侵染之后，Ti或Ri质粒被传送到植物细胞中，并且稳定地整合到植物基因组中(Horsch等，科学233：496-498(1984)；Fraley等，美国国家科学院院刊80：4803(1983)，本文一并参考)。一种农杆菌的方法是在植物中农杆菌介导的基因转移，如通过成熟的拟南芥植物的农杆菌渗透(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.生命科学316：1194-1199(1993)，本文一并参考)。

能由农杆菌侵染及随后的转化的所有植物细胞和从转化细胞再生的整个植物也可以按本发明进行转化，结果产生含有转移的核酸序列的完整植物。植物细胞用农杆菌可以各种方式转化，包括：农杆菌与分离培养的原生质体的共培养，用农杆菌转化细胞或组织或者用农杆菌转化种子，顶端或分生组织。

在用农杆菌转化植物中，转化DNA(T-DNA)典型地被修饰结合到编码所需的异源基因的核酸序列上。在侧翼的非编码调节序列和野生型的肿瘤(Ti)诱导质粒的左右边界区域之间，重组的T-DNA含有所需的异源基因。重组的T-DNA提供作为整合质粒的部分，它通过同源重组整合到一种野生质粒上。然而，典型地，重组T-DNA以一种二元载体的形式提供，并通过辅助Ti质粒上的毒性基因的反式作用转移到植物细胞。T-DNA随机整合到核基因组中，某些转化子允许所需要的蛋白质的表达。通过选择表型的标记也可以选择转化子。这些表型标记包括但不限于，抗生素抗性，除草剂抗性，或视觉观察。其它的表型标记是本领域已知的，并且可用于本发明中。

如果选择裸露的核酸导入法，那么载体需要的仅仅是必需赋予所需特征的最小的核酸序列，无需附加其它的序列。因此，可能的载体包括Ti质粒载体，仅仅设计来最大限度地产生高数量的拷贝的穿梭载体，含有一旦转化发生对极限复制必需的最小序列的附加型载体，同源重组载体，微型染色体载体和病毒载体，包括可能的基因序列的RNA形式。载体的选择和构建载体的方法是本领域一般技术人员所熟知的，并且在一般的技术参考书中都有描述(Bai等，酶学方法，前述的)。

然而，对被导入的核酸序列的降解赋予抗性的、和协助基因组整合过程的、或提供一种容易选择实际上已转化的那些细胞或植物的方法的任何附加的载体序列是有利的，而且大大地减少了筛选有用的转基因子的难度。

所有的可以产生完整的再生植物的可转化植物在本发明中是有用的。用农杆菌通过电穿孔法(Fromm等，自然319：791-793(1986)；Rhodes等，科学240：204-207(1988))；通过直接的基因转移(Baker等，植物遗传学201-211(1985)；通过使用花粉管介导的载体(EP 0 270 356)；以及通过把DNA注射到花分蘖中(de la Pena等，自然325：274-276(1987)，本文在此一并参考)可以转化单子叶植物。

另一种向植物细胞中导入编码细胞周期蛋白抑制剂基因的核苷酸片段的方法是通过携带待导入的核酸序列的微粒(核酸序列包含在这种微粒的基质中或其表面上)的高速弹果穿透法。(Klein等，自然327：70(1970)。粒子轰击转化方法在Sanford等中也被描述。(技术3：3-16(1991)和Klein等，生物/技术10：286(1992))。虽然典型地只需要一次导入新的核酸序列，该方法还特地提供多重导入法。

侵染某种类型植物的其它病毒也可以用来插入核酸片段。例如，也可以利用花椰菜花叶病毒(CaMV)(美国专利4,407,956，本文一并参考)。CaMV病毒基因组插入到亲本细菌质粒，创建可以在细菌中繁殖的重组的DNA分子。克隆之后，通过导入所需的核酸序列，该重组质粒能再被克隆和进一步被修饰(改造)。然后再从亲本细菌质粒上切去重组质粒的修饰的病毒部分，并用来转化或转染植物细胞或植物。

通常，植物细胞再生以从转化过程中获得完整的植物。转化的直接产物被称作为″转基因子″。从原生质体的再生随植物种类的不同而不同，但通常首先要制作原生质体的悬浮液。在某些植物中，从原生质体悬浮液可诱导胚的形成。培养基一般含有植物生长和再生的各种氨基酸和激素。所使用的激素的例子包括生长素和细胞分裂素。有效的再生将依赖于培养基，基因型和培养的时间。如果这些可变因素可以控制，再生是可以重复的。

从植物愈伤组织，器官和部分也可以形成再生。在植物部分再生的通常条件下可以完成转化。(参见，酶学方法118，和Klee等，植物生理学年评38：467(1987))。利用Horsch等的叶盘-转化-再生法，科学227：1229(1985)，叶盘在选择培养基上培养，其后在大约2-4周内形成芽(茎)。从愈伤组织上切下发育的芽，移植到合适的诱导生根的选择培养基上。当根出现之后，再把生根的小植株尽快地移栽到土壤中。小植株可按需要再移栽到花盆中，直到成熟。

在营养繁殖的作物上，通过利用插条或组织培养技术产生多个相同的植物可以繁殖成熟的转基因植物。为了商业用途，选择需要的转基因子，获得新的品种以及进行营养繁殖。

在种子繁殖的作物上，成熟的转基因植物可以自交产生纯合的近交植物。获得的近交植物产生含有导入的外源基因的种子。这些种子经培育产生表现出选择的表型，如增加大小/或产量的植物。

从再生植物获得的部分，如花，种子，叶片，枝条，根，果实等等都包括为本发明的部分，假如这些部分包含有用所描述的方法转化的植物细胞。这些再生植物的子代和变异体及突变体也包括在本发明的范围之内，假如这些植物包含有导入的核酸序列。

″分离的″核酸，多核苷酸或者多肽是实质上从其它的天然地与其相伴的污染物，如蛋白质，脂类，和其它的核酸和/或多核苷酸中分离的核酸，多核苷酸或者多肽。该术语包括从天然存在的环境或克隆文库中分离的或提纯的核酸或多核苷酸，以及包括重组的或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。

本主题发明提供了一个家族基因，本文指定为BRO，它编码能够结合植物细胞周期蛋白的蛋白产物。在一个特定的实施方案中，蛋白质基因产物能够结合植物细胞周期蛋白和抑制植物细胞周期蛋白/细胞周期蛋白-依赖性激酶复合体活性。

在一个实施方案中，BRO基因家族的成员编码一种含有大约5至10个氨基酸残基的氨基酸序列结构域，该结构域是植物细胞周期蛋白结合结构域。植物D样细胞周期蛋白的共有序列结合结构域包含序列：

Glu Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄Phe，

其中，Xaa₁可以是亮氨酸，异亮氨酸或其它疏水氨基酸残基，Xaa₂可以是谷氨酸或天冬氨酸，Xaa₃可以是亮氨酸，精氨酸，天冬氨酸，或者任何其它氨基酸残基，Xaa₄可以是苯丙氨酸，亮氨酸，或其它疏水氨基酸残基(SEQ ID NO：9)。当细胞周期蛋白依赖性激酶结合结构域存在时，该结构域位于本文下面描述的细胞周期蛋白依赖性激酶结合结构域的从大约15个到大约30个氨基酸残基上。

BRO基因家族的成员还编码包含特异性结合细胞周期蛋白依赖性激酶和在细胞周期调节中抑制细胞周期蛋白/cdk复合物活性的氨基酸序列的蛋白质。编码细胞周期蛋白依赖性激酶结构域的氨基酸序列与哺乳动物细胞的细胞周期蛋白依赖性激酶结构域的氨基酸序列同源，并且一般地包含以下氨基酸残基：

Lys Tyr Asn Phe Asp Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Pro Leu

Xaa₆ Xaa₇ Gly Arg Tyr Xaa₈ Trp Xaa₉ Xaa₁₀ Leu Xaa₁₁；

其中Xaa₁可以包括苯丙氨酸或异亮氨酸，Xaa₂可以包括谷氨酸或缬氨酸，Xaa₃可以包括赖氨酸或天冬酰氨，Xaa₄可以包括天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₅可以包括谷氨酸或赖氨酸，Xaa₆可以包括甘氨酸或谷氨酸，Xaa₇可能不存在或可以包括甘氨酸，Xaa₈可以包括谷氨酸或赖氨酸，Xaa₉可以包括缬氨酸或天冬氨酸，Xaa₁₀可以包括赖氨酸或精氨酸，Xaa₁₁可以包括天冬酰氨或谷氨酸(SEQ ID NO：10)。序列内某些其它的替换是可以接受的，只要蛋白质能够结合植物细胞周期蛋白和能够抑制细胞周期蛋白/cdk复合物的活性。

可以测量植物细胞周期蛋白/cdk复合物的激活的抑制，例如，利用测定(a)cdk部分或植物细胞周期蛋白/cdk复合物的点特异的磷酸化，或(b)蛋白质激酶活性。本文更详细地描述了这种测定方法。这些测定方法可以以动力学的方式进行，即测定磷酸化的速率，或作为定性的或定量的静态测定，即一定时间内在选择的点进行测定。本领域的技术人员将认识到在这种测定中可以使用的多种酶和条件。

举例来说，通过使用酵母双杂交筛选可获得本发明的植物D样细胞周期蛋白抑制剂。例如，实行酵母双杂交筛选的方法在Fields和Sternglanz的遗传学趋势10：286-292(1994)和Bai等，酶学方法273：331-347(1996)中有描述。一般地，酵母双杂交筛选系统设计用来鉴定编码物理上与活体目标蛋白相联系的蛋白。在一优选的实施方案中，″诱饵″构建体含有一个编码DNA-结合结构域的表达载体，即GAL4DNA-结合结构域载体pAS1，pAS2，pGBT9，或者诸如此类，这些载体融合到编码植物D样细胞周期蛋白的核酸序列中。在一特定的优选实施方案中，″诱饵″构建体编码植物D样细胞周期蛋白。然后从兴趣植物中构建cDNA融合文库，即从具有GAL4激和结构域(即GAL4激和结构域载体pACT1，pACT2，或者诸如此类)的拟南芥中构建。然后，两个融合质粒可转化到酵母报告菌株中。鉴定那些含有与植物D样细胞周期蛋白等等相互作用的拟南芥文库中核酸序列。然后可分离和鉴定编码BRO细胞周期蛋白抑制剂基因家族成员的cDNA片段。

或者，从整个植物，植物组织或者植物细胞的基因组文库可以用探针检测，例如，按Rose等描述的用共有序列-简并杂合体寡核苷酸引物(CODEHOP)探测远缘相关的序列扩增(核酸研究。26：1628-1635(1998)；本文一并参考)。简言之，含有较短的3′简并核心区的引物和一个较长的5′共有序列锁状区用于PCR扩增。利用这种方法，对只需要3-4个高度保守的氨基酸残基用于核心区序列的设计，该核心区在与模板分子退火的过程中由锁状物维持稳定。在一特定的实施方案中，BRO基因家族的细胞周期蛋白结合结构域的一个核酸序列用来产生一个从大约18个到大约20个碱基对的5′共有序列锁状区。根据SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：5，SEQ ID NO：7提供的一种BRO基因序列，可设计大约11至12碱基对的简并3′核心区。CODEHOP程序在http://blocks.fhcrc.org/codehop.html可供使用，该程序直接地从BlockMaker多重序列对比位点连接，用于一套相关蛋白序列开始的杂合体引物预测。

通过任何技术人员熟知的方法可以合成引物。从一个植物来源可以提取基因组DNA，例如，用市售的设计用于植物DNA的试剂盒。整个PCR产物可用任何一些克隆质粒载体克隆，并且可通过例如琼脂糖凝胶电泳和用标准的方法通过DNA测序进行分析(Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)；Ausubel等，现代分子生物学流程，Wiley，纽约(1994))。如BLOCKS世界宽带网址(Lisitsyn等，科学259：946-951(1993)；http://blocks.fhcrc.org)上提供的方法用聚类W(Thompson等，核酸研究。22：4673-4680(1994))中的邻近连接和引导程序步骤产生树状图谱。

一般来说，可转录的植物D样细胞周期蛋白抑制剂多核苷酸序列或其逆向补体含有一个可操作连接的、能够在植物细胞(多核苷酸能被转移至其中)中发挥功能的启动子。植物功能性的启动子包括但不限于，CaMV35S，番茄E8，马铃薯糖蛋白，泛素，甘露碱合成酶(mas)，水稻肌动蛋白，大豆种子蛋白大豆球蛋白(Gyl)，以及大豆营养储藏蛋白(vsp)。许多杂合体启动子，例如含结合有甘露碱合成酶启动子3′区的CaMV 35S组成部分的Mac(Comai等，植物分子生物学。15：373-381(1990)；本文一并参考)在本发明中也是有用的。

可转录的植物D样细胞周期蛋白抑制剂多肽序列典型地至少为25个核苷酸长，更常见地为至少50-100个核苷酸长，经常为至少100-250个核苷酸长，常常为至少500个核苷酸长或更长，多达完整的内源基因长度(横跨启动子区直到转录终止序列/多聚酰苷化位点)。可转录的细胞周期蛋白抑制剂序列的方向定位是相对于启动子，因而可转录序列的RNA转录物与内源基因的mRNA转录物相同或为逆向补体极性(即，正义或反义方向)。

编码植物D样细胞周期蛋白抑制剂的多核苷酸可以是较大的多核苷酸的部分，如具有可选择标记的转基因，以鉴定具有整合的转基因的细胞，或者是具有可选择标记和同源性区域(用于把抑制剂多肽导向细胞基因组中的一个预定位置)的同源重组构建体。编码抑制剂的多核苷酸在转染子细胞或转基因细胞中是一种异源表达盒的形式。经常，编码抑制剂的多核苷酸以一种载体的形式获得，该载体是从目标内源基因的一个克隆的拷贝(或其部分)中用DNA分离产生的。抑制剂多核苷酸序列常常以一个基因组基因克隆的部分分离，虽然在某些实施方案中可使用待抑制的目标蛋白的cDNA克隆(或其部分)(对于一般的cDNA方法，参见，Goodspeed等，基因76：1(1989)；Dunn等，生物的化学杂志264：13057(1989)，两者在此一并参考)。

含有抑制剂多核苷酸序列的载体典型地是在细菌、如大肠杆菌中生长，并且用标准的分子生物学方法分离，或者可以作为寡核苷酸合成。可进行直接的多核苷酸合成和连接(如果必要的话)，该多核苷酸合成和连接不需要原核或真核载体。通过任何合适的技术，包括把转化的细胞真空渗透到完整植物中(Bechtold等，C.R.Acad.Sci la Vie/生命科学。316：1194-1199(1993)，本文一并参考)，微注射，电穿孔，脂质转染法，基因枪，磷酸钙沉淀和基于病毒的载体等等(例如，美国专利5,442,052，5,354,854，5,278,057，5,262,316和4,962,028，所有的文献本文一并参考)，多核苷酸(和含有这种核苷酸的转基因)能被转化到宿主细胞中。

细胞周期蛋白抑制剂

抑制植物细胞周期蛋白/cdk复合体激活的本发明的细胞周期蛋白抑制剂能以各种筛选分析方式进行鉴定。例如，在允许有活性的植物细胞周期蛋白/cdk复合体形成的条件下，用把试验化合物暴露于一种合适量的植物细胞周期蛋白，即一种植物D样细胞周期蛋白，以及植物细胞周期蛋白-依赖性激酶中的试验方法可以筛选细胞周期蛋白介导的植物细胞周期蛋白/cdk复合体激活的抑制剂。然后定量分析形成的有活性的植物细胞周期蛋白/cdk复合体，并且在试验物质不存在的情况下与形成的没有活性的复合物相比较。在试验物质不存在的情况下与有活性复合物相比，导致降低活性的复合物就是细胞周期蛋白抑制剂。

在另一实施方案内，也可以检测细胞周期蛋白抑制剂的抑制剂。用于所说的物质的筛选方法包括，例如，在允许有活性的植物细胞周期蛋白/cdk复合体形成的条件下，用把试验化合物暴露于一种合适量的植物细胞周期蛋白，即一种植物D样细胞周期蛋白，以及植物细胞周期蛋白-依赖性激酶中的试验方法。然后定量分析形成的有活性的植物细胞周期蛋白/cdk复合体，并且在试验物质不存在的情况下与形成的有活性的复合物相比较。在试验物质不存在的情况下与有活性复合物的数量相比，导致增加活性的复合物就是细胞周期蛋白抑制剂的抑制剂。

可以作为BRO家族细胞周期蛋白抑制剂活性的抑制剂的物质包括但是不限于：a)能够抑制植物D样细胞周期蛋白/cdk复合物激活的BRO-介导的抑制作用的化合物，该化合物能以上述描述的方法鉴定，b)特异地抑制BRO家族蛋白和植物细胞周期蛋白/cdk复合体之间的相互作用，但在BRO细胞周期蛋白抑制剂不存在的情况下非点特异地抑制细胞周期蛋白/cdk复合体的cdk部分磷酸化的化合物，c)降解或灭活BRO细胞周期蛋白抑制剂蛋白质的化合物，和d)干扰BRO细胞周期蛋白抑制剂蛋白质表达的化合物等等。这些物质可以包括BRO细胞周期蛋白抑制剂蛋白质的化合物抑制剂，例如包括小的分子，肽，肽模拟物及类似的物质，细胞周期蛋白抑制剂拮抗剂，以及抑制BRO家族细胞周期蛋白抑制剂表达的分子，如三联体形成的寡核苷酸，反义寡核苷酸，即基因组的和合成的反义分子，核酸酶，RNAi等等。

对于在本发明中作为BRO基因家族抑制剂调节细胞周期进程的用途，三联体形成的寡核苷酸是干扰BRO家族基因转录的BRO序列特异的DNA结合物质。三联体形成的寡核苷酸在以下文献中有一般性(Maher，生物测定14：807-815(1992)；Gee等，基因149：109-114(1994)；Noonberg等，基因149：123-126(1994)；Song等，Ann.NY Acad.Sci.761：97-108(1995)；Westin等，核酸研究23：2184-2191(1995)；Wand和Glazer，生物的化学杂志207：22595-22901(1995)，每篇文献本文一并参考)。在生理条件下，通过物理上封阻RNA聚合酶或转录因子进入细胞周期蛋白抑制剂基因DNA模板，这些化合物在选择性地抑制细胞周期蛋白抑制剂基因转录的双链上形成三螺旋的复合体。也参见，例如WO 95/25818；WO 95/20404；WO 94/15616；WO 94/04550；和WO 93/09788，本文一并参考。定向于BRO4基因和ICK1基因的三联体形成的寡核苷酸含有一个核苷酸尾或非核苷酸尾，以增强对转录因子结合的抑制作用。

干扰本发明的细胞周期蛋白抑制剂基因表达的和允许通过细胞进程(如在下面的实施例中描述的)的反义寡核苷酸在本发明中是特别有用的。利用一些方法，如实施例中详细描述的方法可鉴定细胞周期蛋白抑制剂基因反义寡核苷酸，具体地说BRO4或者ICK1的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸的用途和它们的应用有一般性的描述，例如，在Mol和Van derKrul编辑，反义核酸以及蛋白质基础和应用，纽约，NY，1992中，本文一并参考。

本文使用的反义包括下文提供的遗传的合成的反义分子。合适的反义寡核苷酸长度至少为11个核苷酸，并且多达11个核苷酸和包括细胞周期蛋白抑制剂基因的上游非翻译区和相关的编码序列。对本领域的技术人员十分明了的是，反义寡核苷酸的最佳长度取决于反义寡核苷酸和mRNA上它们的互补序列相互作用的强度，温度和翻译发生的离子环境，反义寡核苷酸的碱基序列，以及mRNA和/或反义寡核苷酸上的二级及三级结构的存在。

反义寡核苷酸合适的目标序列包括内含子-外显子连接区(以防止适当的剪接)，其中DNA/RNA杂合体将防止mRNA从细胞核到细胞质，起始因子结合位点，核糖体结合位点和干扰核糖体前进的位点的运输。对反义寡核苷酸一个特别优选的目标区域是细胞周期蛋白抑制剂基因的5′非翻译区。

另外，双链RNA基因沉默(RNAi)可用来功能性地抑制或熄灭植物D样细胞周期蛋白抑制剂的表达。含有一个植物D样细胞周期蛋白抑制剂，即BRO4或者ICK1的反向重复的基因可以工程化，该基因含有100到300个碱基对的茎状结构，一个包含200到500个碱基对编码一段细胞周期蛋白抑制剂的环状结构，以及与将形成双链茎的茎状结构互补的茎状结构倒置。该构建体可剪接成一个含有植物功能性启动子(即，CaMV 35S，番茄E8，马铃薯糖蛋白，泛素，甘露碱合成酶(mas)，水稻肌动蛋白，大豆种子蛋白大豆球蛋白(Gyl)，以及大豆营养储藏蛋白)的质粒。另外，还含有杂合体启动子，如含CaMV 35S组成部分和甘露碱合成酶启动子3′区的的Mac启动子，或组织特异性的启动子。扩增之后，该构建体可转移到一个转运载体，如可用来转化植物或植物细胞的农杆菌载体。

控制某种植物基因表达的方法可用来修饰所需的植物表型，如控制果实成熟发生的速率和时间，或者甚至植物，植物组织，或细胞的生长速率。一种控制内源植物基因表达的方法是通过反义抑制抑制特异基因表达(美国专利5,457281，5,453,566，5,365,015，和5,073,676)，抑制特异基因表达的另一方法是正义抑制(美国专利5,283,184，5,231,020，和5,034,323)，所说的每种专利本文一并参考。

通过把含目标DNA序列的DNA分子插入到合适的表达载体，制备定向于植物细胞周期蛋白抑制剂基因的反义多核苷酸，这样，与基因本身相比，DNA分子以一种反方向插入到启动子的下游。表达载体可以转导，转化，或转染到一个合适的细胞，导致反义多核苷酸的表达。

或者，用标准的实验手册或自动合成技术，可以合成反义寡核苷酸。通过种种方法，包括电穿孔(例如，如Yang等所描述的，核酸研究23：2803-2810(1995))，磷酸钙沉淀，多聚-L-鸟氨酸/DMSO(Dong等，核酸研究21：771-772(1993))合成的寡核苷酸可以导入合适的细胞。选择合适的反义寡核苷酸的引入方法对本领域的技术人员将是十分清楚的，关于体外合成的寡核苷酸，通过向核苷酸添加稳定化的物质可以增加反义寡核苷酸-mRNA杂合体的稳定性。稳定化的物质包括共价地结合到寡核苷酸的一端或两端的嵌入物。可以使寡核苷酸对核酸酶有抗性，例如，通过引入磷酸三酯，磷酸酯，硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，亚磷酰胺或二硫代磷酸酯修饰磷酸二酯骨架。如同Mol和Van der krul(见上面)所作的一般性的描述方法，也可以用脱氧核糖核酸的α-异头物合成寡核苷酸使寡核苷酸对核酸酶有抵抗性。

对基于核苷酸的抑制剂，例如，通过抑制剂的类型(即三联体形成的寡核苷酸或反义寡核苷酸)和待处理的物种指导合适序列的选择。优选地是选择物种之间保守的序列以方便地以现有模型方式使用。可选择BRO基因内的保守序列的反义寡核苷酸用于这些模型中。

本发明也提供用于抑制BRO基因家族成员表达，从而使用核酶允许细胞周期进行的组合物和方法。能以多种多样的方式施用核酶，包括通过定向的基因方式施用到所需的细胞中。本发明的核酶瞄准作用于BRO基因家族的RNA转录物。每个核酶分子含有一个能够切割细胞周期蛋白抑制剂RNA的有催化活性的节段，还包含具有与定向的RNA部分互补的核苷酸序列的侧翼序列。侧翼序列以点特异的方式使核酶与RNA退火。侧翼序列与目标细胞周期蛋白抑制剂序列的绝对互补性是没有必要的，然而，只需要一定量的互补性，以足够与目标RNA形成双链体和使核酶有催化活性的节段在目标位点进行切割。因此，只需要足够的互补性，以允许核酶与目标RNA杂交。

如本文所使用的，术语″核酶″是指具有酶活性的、能够以核苷酸碱基序列特异的方式切割或者剪接其它单独的RNA分子的RNA分子。具有催化的或酶活性的分子是指一个在底物结合区与特定的BRO4 RNA目标具有互补性，并且还具有酶活性(有活性地切割和/或剪接该目标区的RNA)的RNA分子，从而改变目标分子。

在本发明的某个实施方案中，有酶活性的RNA分子以一种锤头结构域的方式形成，但也可以发卡形式的，丁型肝炎病毒形式的，集团I内含子或RNA酶P RNA(与RNA指导序列相关联)形式的结构域形成。Rossi等，艾滋病毒研究.人类逆转病毒：8：183(1992)描述过锤头结构域的例子，Hampel等，生物化学：28：4929(1989)，Hampel等，核酸研究：18：299(1990)描述过发卡结构域，在Perrotta和Bean，生物化学：31：16(1992)中例举描述过丁型肝炎病毒结构域，在Guerrier-Takada等，细胞：35：849(1983)中描述了RNA酶P结构域，和在Cech等，美国专利4,987,071中描述了集团I内含子结构域的例子，以前公开的专利本文一并参考。这些特定的结构域在本发明中是没有限定的，本领域的技术人员将认识到本发明的具有酶活性的RNA分子具有一个特定的与一个或多个目标细胞周期蛋白抑制剂RNA区互补的底物结合位点，以及它在其底物结合位点内或其周围具有对该分子传递一种RNA切割活性的核酸序列。

核酶催化位点的上游和下游侧翼序列可包含任何长度的有效地传递所需程度的对核酶的导向特异性的片段。优选地，侧翼序列包含从大约4个至24个核苷酸，更优选地从大约6个至15个核苷酸，典型地为大约9至12个核苷酸，并且导致与包含切割位点的细胞周期蛋白抑制剂RNA序列(即BRO3或者BRO4)最接近的上游和下游底物序列形成碱基配对。

通过如TILING(基因组中导向诱导的局部斑，Nat Biotechnol.18345-457(2000)；本文一并参考)的方法，也可以鉴定提供降低功能的植物D样细胞周期蛋白抑制剂蛋白的突变，其中，植物能够用例如乙基甲磺酸(EMS)实施突变，并且表现出畸形生长的表型，即更多的和/或较大的叶片，花，含种子的结构，果实等等的植物可以用于筛选已知序列的植物D样细胞周期蛋白抑制剂中的突变，例如通过异源双链体的形成。

通过例证说明的方式而非局限性的方式提出下面的实施例。

实施例1

在此实施例中，用酵母两杂种筛选方法分离编码与拟南芥D样细胞周期蛋白，D1和D2相互作用的蛋白质。酵母两杂种筛选方法在Fields和Sternglanz公开发表的(遗传学趋势10：286-292(1994)；本文在此全面参考)文章中有评论。下面简要描述所使用的方法。

用本质上由Fields和Song描述的两杂种筛选方法(自然340：245(1989)和美国专利5,283,173，本文在此一并全面参考)。并如本文描述的加以修改，分离编码能够与拟南芥D样细胞周期蛋白D1和D2相互作用的蛋白质(指定为CycD1_At和CycD2_At)的互补DNA。″诱饵″载体含有一个编码GAL4-CycD1_At或者Gal4-CycD2_At融合蛋白质的表达载体。为构建GAL4-CycD1_At″诱饵″质粒，pGBT9CycD1_At，用设计的在其基因两端各增加一个BamHI位点的寡核苷酸引物通过PCR扩增获得质粒pJG8(D1)的插入片段(Soni等，植物细胞7：85-103(1995)；本文一并全面参考)。用BamHI消化包括整个编码序列的编码CycD1_At1至334个氨基酸的扩增的PCR片段，并连接到事先用BamHI消化的pGBT9载体(Clontech实验室公司，和Bartel等，发育中的细胞相互作用：一种实用方法，Hartley编辑，牛津大学出版社，牛津大学，英国，pp.153-179(1993)；本文一并全面参考)，以获得编码GAL4-CycD1_At融合子的多核苷酸序列。质粒pGBT9是一个携带2微米的含有一个GAL4表达载体的酵母载体，在其整个框架中，该载体含有酿酒酵母ADH1启动子，GAL4DNA结合结构域的一个多接头位点和一个含有终止密码子的终止序列，紧接着酿酒酵母ADH1终止子。

按Kim等描述的方法(见上述)，制备含有随机的-寡-dTcDNA和GAL4激活结构域的拟南芥cDNA融合文库(Kim等，美国国家科学院院刊94：11786-11791(1997)；本文一并参考)。简言之，通过把胚溶解到异硫氰酸胍，再通过氯化铯梯度垫离心沉淀RNA，从3天苗龄的拟南芥中分离总RNA。

用寡聚dT和1000个单位的SUPERSCRIPT(BRL)从5微克的多聚腺苷化的RNA在37℃下合成第一链的cDNA。在第二条链反应之后，用精胺沉淀cDNA，并用精胺洗涤缓冲液洗涤。把cDNA溶于40μl的TE缓冲液中，并按供应商的指导说明(New England Biolabs)用T4DNA聚合酶补平末端。通过加入5μl的0.5M的EDTA灭活酶的活性之后，用苯酚/氯仿提取样品，并用乙醇沉淀。将cDNA再悬浮于12μl的TE缓冲液中，然后用3μl的磷酸化的接头(100μM)的相同量的混合物在20μl的总体积中于4℃下过夜连接。接头序列(Elledge等，美国国家科学院院刊88：1731-1735(1991))通过在88℃下加热2分钟，65℃下加热10分钟，37℃下10分钟和室温下5分钟进行退火。连接之后，样品通过加入精胺沉淀并按描述的方法(Elledge，见上述)洗涤。

连接的cDNA再悬浮于20μl的TE缓冲液中，并于1％的低熔点胶上电泳。从胶上纯化用于连接到λ-ACT臂上的多于570个碱基对长的cDNA。从0.5μg的多聚腺苷化的RNA中制备的cDNA在5μl的体积中于4℃下过夜连接到2μg的用T补平的λ-ACT质粒DNA上，并用GIGApack金包装法提取物(Stratagene)进行包装。按描述的方法(Harper等，细胞75：805-816(1993)；本文一并参考)把拟南芥cDNA文库自动亚克隆转化到质粒文库中。噬菌体文库在大肠杆菌中扩增，并在7％的二甲基亚砜存在的条件下保存于-80℃下直至使用。

按以前描述的方法(Vojtek等，细胞74：205-214(1993)；和Hollenberg等，分子细胞生物学15：3813-3822，(1995)；本文一并全面参考)并作某些修改，进行两杂种筛选。酿酒酵母菌株Y190(MATa，leu2-3，112，ura3-52，trp1-901，his3-200，ade2-101，GAL4-fa180，URA43 GAL-lacZ，LYS GAL-HIS3，cyh^r)用作供筛选的寄主菌株。该寄主菌株用pGBT9cycD1^At或者pGBT9cycD2^At转化。该转化的寄主菌株随后用拟南芥的融合文库转化。在含有3-氨基-1，2，4-三唑(25mM)和缺乏组氨酸的培养基中选择转化子。组氨酸阳性的细胞进行β-半乳糖苷酶的活性的测定。

从在His^-的培养基上和含有3-氨基三唑的培养基上表现出旺盛生长和表现出高水平的β-半乳糖苷酶的活性的转化酵母分离的DNA用来转化大肠杆菌。使该大肠杆菌的质粒DNA再转化回酵母中。从大约2×10⁶个用细胞周期蛋白D1作为诱饵转化的克隆中，选择3个指定为BRO2(含有BRO2的核苷酸序列，SEQ ID NO：3)，BRO3(含有BRO3的核苷酸序列，SEQ ID NO：5，和BRO4(含有BRO4的核苷酸序列，SEQ ID NO：7)的克隆，并通过常规的方法测序。

从测定的这些克隆的核苷酸序列预测含有一个BRO基因的每个开放阅读框架的氨基酸序列。检查编码BRO2的开放阅读框架显示出一个大约128个氨基酸残基的蛋白质，该蛋白质在SEQ ID NO：4的第20个氨基酸残基上以甲硫氨酸起始，在第147个氨基酸残基上以精氨酸终止。对BRO3类似的检查显示出一个大约183个氨基酸残基的、在第20个位置上(SEQ ID NO：6)开始于甲硫氨酸和在第202个位置上终止于脯氨酸的蛋白质。Bro4含有一个大约196个氨基酸残基的、在第13个氨基酸残基位置上(SEQ ID NO：8)起始和在第208个氨基酸残基位置上以亮氨酸终止的蛋白质。对BRO3(SEQID NO：6)和BRO4(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列的视觉检查显示一个大约22个氨基酸的、与哺乳动物共有序列细胞周期蛋白-依赖性激酶结合结构域实质上同源的区域。检查BRO2，BRO3和BRO4(分别为SEQ ID NO：4，SEQID NO：6和SEQ ID NO：8)的氨基酸序列显示出一个接近于ckd结合结构域上游的17到20个氨基酸的大约6个氨基酸残基的保守区。在哺乳动物细胞中，众所周知的是细胞周期结合蛋白结构域发现于大约距离ckd结合结构域的这一位置。由于所有三个克隆是根据结合到植物D样细胞周期蛋白而分离出的，已经确定的是6个氨基酸的这一区域可能是细胞周期蛋白结合结构域。因此，BRO2，BRO3以及BRO4被鉴定为编码细胞周期蛋白结合的具有限定的结合特征序列的蛋白质的cDNA片段。

筛选了大约7.2×10⁵个用细胞周期蛋白D2作为诱饵转化的克隆，选择一个指定为BRO1(包含BRO1的寡核苷酸序列，SEQ ID NO：1)的克隆作进一步的分析。对该克隆进行测序，并从该克隆的DNA序列推测出其氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。对其氨基酸序列的检查显示大约135个氨基酸残基的、开始于第1个位置的甲硫氨酸(SEQ ID NO：2)和终止于第135个位置的精氨酸的多肽。对其可能的氨基酸序列的视觉检查揭示了一个与BRO2，BRO3和BRO4相类似的、大约7个氨基酸序列的细胞周期蛋白结合结构域特征序列。因此，BRO1的cDNA片段被鉴定为编码细胞周期蛋白的结合蛋白质。

最初，对BRO1和BRO2的氨基酸的视觉检查来看，其相应的cDNA片段可能是不完整的。通过探测λ载体中拟南芥下胚轴基因组文库可以测定编码这些蛋白的完整基因的开放阅读框架的剩余部分。用探针检测文库的BRO2和BRO1基因，本文提供其完整的序列。只有测定的BRO1序列是不完整的。

实施例2

在本实施例中，鉴定的编码细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶抑制剂的每个氨基酸序列从用于酵母两杂种筛选的pACT载体中克隆出来，以反方向插入到pCGN1547质粒中，并用来转化拟南芥植物。检查转BRO基因的反义分子的转基因植物的改变细胞周期调节机制特征的表型变化，即根，页和茎生长的速率，生物量产量的增加等等。

简言之，把编码BRO家族蛋白质的核苷酸序列从pACT载体中克隆至含有一个嵌合的包含兼有CaMV 35s和MAS组成成分的植物启动子(Comai等，植物分子生物学15：373-381(1990)，本文一并全面参考)的质粒pLAY112中。BRO1和BRO2都用BglII消化，然后克隆至pLAY112的BamHI位点。BRO3用XhoI酶切，末端用Klenow片段补平。含有BRO3编码序列的XhoI片段连接到事先用SmaI消化的pLAY112。BRO4用HincII(平端)和EcoRI消化。EcoRI末端用dNTPs和Klenow补平。分离BRO4片段并连接到事先用SmaI消化的pLAY112。用连接混合物转化大肠杆菌，在合适的培养基上筛选转化子。选择的转化子在具有抗生素的液体LB培养基上生长。从每个转化子中提取质粒DNA，并且检验其合适的插入片段。

用PstI酶切质粒pLAY112BRO1，pLAY112BRO3和pLAY112BRO4，并克隆至质粒pCGN1547的PstI位点(McBride等，植物分子生物学14：269-276(1990))。将连接混合物转化到大肠杆菌中，并在合适的培养基上选择转化子。选择的转化子在含抗生素的液体培养基中生长。从每个转化子中提取质粒DNA，并检验该DNA合适的插入片段。

质粒pCGN1547BRO1和pCGN1547BRO2用来转化根癌农杆菌。通过真空渗透的方法(Bechtold等，Acad.Sci.Paris，生命科学.316：1194(1993))，用每个BRO家族成员转化拟南芥。用50μg/ml的卡那霉素在AB平板上选择转基因子苗，并与野生型比较。

实施例3

在此实施例中，检查植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因对细胞增生抑制的影响。

简言之，对含有ICK1(244bp的茎和420bp的环)和BRO4(203bp的茎和303bp的环)编码区反向重复序列的基因进行基因工程改造(Waterhouse等，美国国家科学院院刊95：13959-135964(1998))。为了构建ICK1-和BRO4-反向重复序列，用表1中表示的引物通过PCR扩增目标片段。每个引物含有一个合适的限制位点，该位点可被酶切以允许单独的PCR产物组装到反向重复序列中。

表1.用于构建反向重复结构的PCR引物

ICK1 IRI ggtacccgamcgagaaggagaagc SEQ ID NO：11

ICK1 IR2 gatatcgacacgacmtctgggctc SEQ ID NO：12

ICK1 IR3 gatatcctacggagccggagaattg SEQ ID NO：13

ICK1 IR4 actagmgmctcagcttccacsrzlns SEQ ID NO：14

ICR1 IR5 actagtgacacgacmtctgggctc SEQ ID NO：15

ICK1 IR6 gagctccgamcgagaaggagaagc SEQ ID NO：16

BRO4 IR1 ggtacccgacaacagaaatggaatcatc SEQ ID NO：17

BRO4 IR2 gtcgacaaagtcgatcccacttgtagc SEQ ID MO：18

BRO4 IR3 gtcgacaaagcgiigagcttgcagaag SEQ ID NO：19

BRO4 IR4 actagtcggmcgamgatgatcc SEQ ID NO：20

BRO4 IR5 actagtaaagtcgatcccacttgtagc SEQ ID NO：21

BRO4 IR6 gagctccgacaacagaaatggaatcatc SEQ ID NO：22

这些构建体被剪接成p LAY112，一个结合有CaMV 35S的组成成分和甘露碱合成酶3′区形成杂合体启动子Mac(Comai等，植物分子生物学15：373-381(1990))的质粒，并利用标准的方法导入到二元载体pCGN154(McBride和Summerfelt1，植物分子生物学4：269-276(1990))中。将二元载体转化到农杆菌菌株At503中。这些基因转化到拟南芥生态型Ler和Col-0(Bechtold和Pelletier，分子生物学方法82：259-266(1998))。通过其卡那霉素抗性表型鉴定这些转基因植物，并检查其形态表型。

ICK-IR表型

ICK-IR的转基因植物显示三个增加的生长迹象：更大和更宽的叶子(位于茎上的丛生的叶子)，3至4心片而不是2心片，以及主茎上的裂缝，似乎是内部的茎组织过度生长，外组织层的生长与其不相匹配。叶子和心皮大小的测量以及各种转基因植物品系和对照植物的数量在图1-3和表2中有描述。在两个不同的实验中测量表型。

多种心皮的表型在解释ICK1的抑制效果方面是非常重要的。这种表型有充分的研究，因为该表型与CLA VATA 1，2和3基因突变引起的表型相似(Chen等，遗传学26：42-54(2000)；Clark等，发育122：1567-1575(1996)；Fletcher等，科学283：1911-1914(1999))。

表2.ICK1-IR和对照植物的心皮数量(1547个植物)

遗传型长角果(心皮#)¹

2 3或4

Ick 1 IR 2-7 31 1

Ick 1 IR 3-14 32 4

Ick 1 IR 4-10 8 9

Ick 1 IR 5-6 25 1

Ick 1 IR 6-20 7 14

Ick 1 IR 7-7 5 14

1547 2D 10 18

1547 9A 18 16

¹检查第一次产生的4个心皮

分生组织是负责茎和根生长的顶端器官。在棒状突变体中，过度的细胞分裂形成较大的分生组织，该分生组织再形成超数量的心皮。CLAVATA基因编码细胞到细胞交通系统的组分。ICK1-IR表型是通过控制细胞分裂的调节子形成较大的分生组织的第一个直接证据。这提供了ICK1操作可用来调节植物生长性质的证据。

BRO4表型

转BRO-IR的转基因植物更象灌木状生长茂盛，即，它们有更多的共花期，在每次共花期上有更多的叶片，这些植物似乎是通过形成更多的单体(发育的基本单位)发育成这种表型。每个单体由一个节间和一个带节的器官(图4)。单体是通过顶端分生组织的作用形成的。分生组织的顶端的每个侧生赘疣(生长晕)形成一个节。每个节产生一个叶片，在叶腋处有一个侧芽。因此，具有更多节的植物通过形成更多的侧芽而变为丛枝状。因此，BRO4抑制导致侧面器官和更多的节的加速形成是可能的。

生物材料的保藏

按照布达佩斯条约，下列材料保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 Boulevard大学，Manassas，VA 20110-2209。

质粒保藏号保藏时间

pACT BRO1 ATCC 203953 1999年4月23日

pACT BRO2 ATCC 203954 1999年4月23日

pACT BRO3 ATCC 203955 1999年4月23日

pACT BRO4 ATCC 203956 1999年4月23日

虽然为了清晰理解本发明的目的，以说明和举例的方式在一定程度上详细了以上发明，但明显的是，在附加权利要求的范围内，可以进行某些变化和修改。

序列表

<110>Fred Hutchinson Cancer Research Center

Roberts，James A

Kelly，Beth L.

<120>通过功能性地抑制植物细胞周期蛋白抑制剂基因增加植物细胞增殖的方法

<130>14538A-004510PC

<140>PCT/US00/13379

<141>2000-05-15

<150>60/134,373

<151>1999-05-14

<160>22

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>408

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>1

atggcatcaa aaaaagcaag aaaaccaaac cgagccgaaa agaaactcac aagaagctgt 60

ttcaagaaac aagttcctca acacaacaac atcaacacaa gtataactct cgatcaaaca 120

tctacatcta ctattgtctc tacatgttct tcttcatcaa cgactttgtc ttctcctcta 180

gacacaatct actctgttcc ctctccatcc ccagcagcgg tgctgacgtc accaggcggt 240

tgttgtaccc cgaaagccaa gaagtctagg ataccggaga tgctgacgtg tccaccggcg 300

ccgaagaagc aaagggtctc gaaaaactgt gtgttacgac ggagacagat cgttttcttt 360

gctccgccgg agatagagct cttcttcgtc aacgcacacg atcgatga 408

<210>2

<211>135

<212>PRT

<2l3>拟南芥

<400>2

Met Ala Ser Lys Lys Ala Arg Lys Pro Asn Arg Ala Glu Lys Lys Leu

1 5 10 15

Thr Arg Ser Cys Phe Lys Lys Gln Val Pro Gln His Asn Asn Ile Asn

20 25 30

Thr Ser Ile Thr Leu Asp Gln Thr Ser Thr Ser Thr Ile Val Ser Thr

35 40 45

Cys Ser Ser Ser Ser Thr Thr Leu Ser Ser Pro Leu Asp Thr Ile Tyr

50 55 60

Ser Val Pro Ser Pro Ser Pro Ala Ala Val Leu Thr Ser Pro Gly Gly

65 70 75 80

Cys Cys Thr Pro Lys Ala Lys Lys Ser Arg Ile Pro Glu Met Leu Thr

85 90 95

Cys Pro Pro Ala Pro Lys Lys Gln Arg Val Ser Lys Asn Cys Val Leu

100 105 110

Arg Arg Arg Gln Ile Val Phe Phe Ala Pro Pro Glu Ile Glu Leu Phe

115 120 125

Phe Val Asn Ala His Asp Arg

130 135

<210>3

<211>639

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>3

ctcgagattt accaaaaaag tttcccaaaa aaacaaaaac atacacaagt ttagatatgg 60

atcttgaatt actacaagat ttgtccaaat tcaatttccc aacacccatc aagatccgat 120

ccaaaacctc aaaaacaaag aaggacgaag gtgatgacga cgaagatgac ctccgctgca 180

gcacacccac atcccaagaa cacaagattc ccgccgtcgt agactctcca cctcctccgc 240

cgagaaaacc ccggccacca ccgtcagcac cgtcggctac ggcggctctg atgatcagat 300

cgtgcaagag gaagctttta gtgtcgacct gtgagataat catgaatcgg gaagagattg 360

accgtttctt ctcctccgtc tacaatgaga cgtcgactac ggctaaacgg cggagaagtt 420

acccttattg ttctcgaaga tgaggcttaa ttcaatattt acattttttt acagttttac 480

tggaaatatt gtgaaattaa ttatctgttg gtgttcggtt ttaaatattt ttaatttaat 540

tatgaatatg gatggataat tttctgcaac cgcgcatatt aatttcgcat ggaggggtcg 600

atgttgtaaa ttgagtaata aatgaaggta aatctcgag 639

<210>4

<211>213

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>4

Pro Arg Asp Leu Pro Lys Lys Phe Pro Lys Lys Thr Lys Thr Tyr Thr

1 5 10 15

Ser Leu Asp Met Asp Leu Glu Ieu Leu Gln Asp Leu Ser Lys Phe Asn

20 25 30

Phe Pro Thr Pro Ile Lys Ile Arg Ser Lys Thr Ser Lys Thr Lys Lys

35 40 45

Asp Glu Gly Asp Asp Asp Glu Asp Asp Leu Arg Cys Ser Thr Pro Thr

50 55 60

Ser Gln Glu His Lys Ile Pro Ala Val Val Asp Ser Pro Pro Pro Pro

65 70 75 80

Pro Arg Lys Pro Arg Pro Pro Pro Ser Ala Pro Ser Ala Thr Ala Ala

85 90 95

Leu Met Ile Arg Ser Cys Lys Arg Lys Leu Leu Val Ser Thr Cys Glu

100 105 110

Ile Ile Met Asn Arg Glu Glu Ile Asp Arg Phe Phe Ser Ser Val Tyr

115 120 125

Asn Glu Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Arg Arg Ser Tyr Pro Tyr Cys

130 135 140

Ser Arg Arg Xaa Gly Leu Ile Gln Tyr Leu His Phe Phe Thr Val Leu

145 150 155 160

Leu Glu Ile Leu Xaa Asn Xaa Leu Ser Val Gly Val Arg Phe Xaa Ile

165 170 175

Phe Leu Ile Glx Leu Xaa Ile Tro Met Asp Asn Phe Leu Gln Pro Arg

180 185 190

Ile Leu Ile Ser His Gly Gly Val Asp Val Val Asn Xaa Val Ile Asn

195 200 205

Glu Gly Lys Ser Arg

210

<210>5

<211>809

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>5

ctcgagattt accacgagat gtggttgaag agaatggagt tacgacgacg acggtgaaac 60

gaaggaagat ggaggaggaa gtggatttag tggaatctag gataattctg tctccgtgtg 120

tacaggcgac gaatcgcggt ggaattgtgg cgagaaattc agcaggagcg tcggagacga 180

gtgttgttat agtacgacgg cgagattctc ctccggttga agaacagtgt caaatcgaag 240

aagaagattc gtcggtttcg tgttgttcta catcggaaga gaaatcgaaa cggagaatcg 300

aatttgtaga tcttgaggaa aataacggtg acgatcgtga aacagaaacg tcgtggattt 360

acgatgattt gaataagagt gaggaatcga tgaacatgga ttcttcttcg gtggctgttg 420

aagatgtaga gtctcgccgc aggttaagga agagtctcca tgagacggtg aaggaagctg 480

agttagaaga cttttttcag gtggcggaga aagatcttcg gaataagttg ttggaatgtt 540

ctatgaagta taacttcgat ttcgagaaag atgagccact tggtggagga agatacgagt 600

gggttaaatt gaatccatga agaagacgat gatgataatg atgatcattg ttttcaccaa 660

agtacttatt atttctcttc tgtaataatc tttgctttga tttttctttt aacaaaatcc 720

aaatgtagat atctttctct cgaataatca ataacatgta attcaactaa aaaaaaaaaa 780

aaaaaaaaaa aaaaaaggta aatctcgag 809

<210>6

<211>203

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>6

Pro Arg Asp Val Val Glu Glu Asn Gly Val Thr Thr Thr Thr Val Lys

1 5 10 15

Arg Arg Lys Met Glu Glu Glu Val Asp Leu Val Glu Ser Arg Ile Ile

20 25 30

Leu Ser Pro Cys Val Gln Ala Thr Asn Arg Gly Gly Ile Val Ala Arg

35 40 45

Asn Ser Ala Gly Ala Ser Glu Thr Ser Val Val Ile Val Arg Arg Arg

50 55 60

Asp Ser Pro Pro Val Glu Glu Gln Cys Gln Ile Glu Glu Glu Asp Ser

65 70 75 80

Ser Val Ser Cys Cys Ser Thr Ser Glu Glu Lys Ser Lys Arg Arg Ile

85 90 95

Glu Phe Val Asp Leu Glu Glu Asn Asn Gly Asp Asp Arg Glu Thr Glu

100 105 110

Thr Ser Trp Ile Tyr Asp Asp Leu Asn Lys Ser Glu Glu Ser Met Asn

115 120 125

Met Asp Ser Ser Ser Val Ala Val Glu Asp Val Glu Ser Arg Arg Arg

130 135 140

Leu Arg Lys Ser Leu His Glu Thr Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Asp

145 150 155 160

Phe Phe Gln Val Ala Glu Lys Asp Leu Arg Asn Lys Leu Leu Glu Cys

165 170 175

Ser Met Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Glu Lys Asp Glu Pro Leu Gly Gly

180 185 190

Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu Asn Pro Xaa

195 200

<210>7

<211>626

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>7

ctcgagattt acccaaaaat ccaagagaga aaaaaatgag cgagagaaag cgagagcttg 60

cagaagaagc ttcaagcaca agcttctcac cactgaagaa aacgaagctt aatgattctt 120

ctgattcatc accggactct catgacgtca tcgtcttcgc ggtttcatct tcttccgttg 180

cttcgtcggc ggctttagcg tctgatgaat gttccgttac catcggtgga gaagaaagtg 240

atcagtcctc gagtatcagc tccggttgtt tcaccagtga atcgaaagaa atcgcgaaga 300

acagttcgtc gtttggtgta gatctggagg atcatcaaat cgaaaccgaa accgaaacct 360

caacattcat caccagcaat ttcagaaaag agacgagtcc agtgagtgag ggtttgggag 420

aaacgacaac agaaatggaa tcatcatcgg caacgaagag aaaacaaccg ggggtgagga 480

agactccaac ggcggcggag attgaggatt tgttctcgga gctagagagt ccagacgata 540

agaagaagca attcatagaa aagtacaact tcgatattgt caatgacgaa ccgcttgaag 600

gtcgctacaa gtgggatcga ctttaa 626

<210>8

<211>209

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>8

Pro Arg Asp Leu Pro Lys Asn Pro Arg Glu Lys Lys Met Ser Glu Arg

1 5 10 15

Lys Arg Glu Leu Ala Glu Glu Ala Ser Ser Thr Ser Phe Ser Pro Leu

20 25 30

Lys Lys Thr Lys Leu Asn Asp Ser Ser Asp Ser Ser Pro Asp Ser His

35 40 45

Asp Val Ile Val Phe Ala Val Ser Ser Ser Ser Val Ala Ser Ser Ala

50 55 60

Ala Leu Ala Ser Asp Glu Cys Ser Val Thr Ile Gly Gly Glu Glu Ser

65 70 75 80

Asp Gln Ser Ser Ser Ile Ser Ser Gly Cys Phe Thr Ser Glu Ser Lys

85 90 95

Glu Ile Ala Lys Asn Ser Ser Ser Phe Gly Val Asp Leu Glu Asp His

100 105 110

Gln Ile Glu Thr Glu Thr Glu Thr Ser Thr Phe Ile Thr Ser Asn Phe

115 120 125

Arg Lys Glu Thr Ser Pro Val Ser Glu Gly Leu Gly Glu Thr Thr Thr

130 135 140

Glu Met Glu Ser Ser Ser Ala Thr Lys Arg Lys Gln Pro Gly Val Arg

145 150 155 160

Lys Thr Pro Thr Ala Ala Glu Ile Glu Asp Leu Phe Ser Glu Leu Glu

165 170 175

Ser Pro Asp Asp Lys Lys Lys Gln Phe Ile Glu Lys Tyr Asn Phe Asp

180 185 190

Ile Val Asn Asp Glu Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Lys Trp Asp Arg Leu

195 200 205

Xaa

<210>9

<211>6

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>9

Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Phe

1 5

<210>10

<211>23

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>10

Lys Tyr Asn Phe Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Leu Xaa Xaa Gly Arg

1 5 10 15

Tyr Xaa Trp Xaa Xaa Leu Xaa

20

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>11

ggtacccgat ttcgagaagg agaagc 26

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>12

gatatcgaca cgacttttct gggctc 26

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>13

gatatcctac ggagccggag aattg 25

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>14

actagtttgt ttctcagctt ccacaaaa 28

<210>15

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>15

ggtacccgat ttcgagaagg agaagc 26

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>16

actagtgaca cgacttttct gggctc 26

<210>17

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>17

ggtacccgac aacagaaatg gaatcatc 28

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>18

gtcgacaaag tcgatcccac ttgtagc 27

<210>19

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>19

gtcgacaaag cgagagcttg cagaag 26

<210>20

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>20

actagtcggtt tcgatttga tgatcc 26

<210>21

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>21

actagtaaag tcgatcccacttgtagc 27

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>22

gagctccgac aacagaaatg gaatcatc 28

Claims

1.一种用于产生增生的变种植物的方法，包括功能性地灭活植物中植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因的表达，其中植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因包含编码具有SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的多肽的核酸，由此产生了具有数目增加的侧生器官或数目增加的结节的增生的变种植物，该增生性是相对于野生型植物而言的。

2.权利要求1的方法，其中所述植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因包含与SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7所示核苷酸序列具有至少70％序列一致性的核酸。

3.权利要求2的方法，其中所述植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因包含具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示序列的核酸，或包含编码具有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽的核酸。

4.权利要求3的方法，其中所述植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因包含具有SEQ ID NO：7所示序列的核酸，或包含编码具有SEQ IDNO：8所示氨基酸序列的多肽的核酸。

5.权利要求1所述的方法，其中所述增生的变种植物的基因组包含结构上被破坏的植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因。

6.权利要求1的方法，其中反义的或反向重复的多核苷酸功能性地灭活植物中植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因的表达。

7.权利要求6的方法，其中反向重复的多核苷酸通过使用引物来扩增，该引物为具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22所示的序列的寡核苷酸。

8.权利要求5的方法，其中功能性灭活的植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因是用导向构建体通过同源重组进行结构上破坏的。

9.权利要求2-4任一项所述的方法，其中所述增生的变种植物的基因组包含结构上被破坏的植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因。

10.一种多核苷酸导向构建体，其包含与权利要求1-4中任一项定义的植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因中存在的序列同源的序列，并且当该序列整合到植物中的相应的植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因座时，功能性地灭活植物D样细胞周期蛋白抑制剂蛋白质的表达，而产生增生的植物，其中所述增生的植物具有数目增加的侧生器官或数目增加的结节。

11.具有功能性灭活的权利要求1-4中任一项定义的植物D样细胞周期蛋白抑制剂基因的植物细胞，其中所述植物细胞能够产生与野生型植物相比显示增生性的整株植物，其中所述增生的植物具有数目增加的侧生器官或数目增加的结节。

12.权利要求11的植物细胞，其中所述植物细胞是植物细胞群、植物组织或原生质体。

13.一种用于产生增生的变种植物的方法，包括将植物暴露于足够量的植物D样细胞周期蛋白抑制剂的抑制剂，以产生所述增生的植物，所述增生性是相对于未处理的植物而言的，其中植物D样细胞周期蛋白抑制剂包含具有SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的多肽，并且其中所述增生的植物具有数目增加的侧生器官或数目增加的结节。

14.权利要求13的方法，其中所述植物D样细胞周期蛋白抑制剂包含由核酸编码的多肽，所述核酸与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有至少70％的序列一致性。

15.权利要求14的方法，其中植物D样细胞周期蛋白抑制剂包含由具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示序列的核酸所编码的多肽，或具有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽。

16.权利要求15的方法，其中植物D样细胞周期蛋白抑制剂包含由具有SEQ ID NO：7所示序列的核酸所编码的多肽，或具有SEQ IDNO：8所示氨基酸序列的多肽。

17.权利要求13的方法，其中所示抑制剂是反义的或反向重复的多核苷酸。

18.权利要求17的方法，其中反向重复的多核苷酸通过使用引物来扩增，该引物为具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22所示的序列的寡核苷酸。

19.权利要求1-8和13-18中任一项的方法，其中通过转化植物祖先来形成所述植物，所述植物祖先包括原生质体、种子、根细胞、分生细胞或叶细胞。

20.一种植物D样细胞周期蛋白抑制剂的抑制剂，其包含特异性结合DNA或从该DNA转录的RNA的寡核苷酸，并抑制植物D样细胞周期蛋白抑制剂蛋白质的表达以产生增生的植物，其中所述DNA包含与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示核苷酸序列具有至少70％序列一致性的核酸，其中所述增生的植物具有数目增加的侧生器官或数目增加的结节。

21.权利要求20的抑制剂，其中所述寡核苷酸所特异性结合的DNA包含具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的核酸，或编码具有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽。

22.权利要求21的抑制剂，其中所述寡核苷酸所特异性结合的DNA包含具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的核酸，或编码具有SEQID NO：8所示氨基酸序列的多肽。

23.权利要求20-22中任一项的抑制剂，其中所述寡核苷酸包含反向重复序列，该反向重复序列是用具有SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID N0：21或SEQID NO：22所示序列的寡核苷酸作为引物进行扩增的。

24.分离的植物D样细胞周期蛋白抑制剂，其是由核酸编码的多肽，所述核酸与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有至少70％的序列一致性。

25.权利要求24的分离的植物D样细胞周期蛋白抑制剂，其是由具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的核酸所编码的多肽，或具有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽。

26.权利要求25的分离的植物D样细胞周期蛋白抑制剂，其是由具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的核酸所编码的多肽，或具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽。

27.分离的核酸，包含编码权利要求24-26中任一项的植物D样细胞周期蛋白抑制剂多肽的核苷酸序列。

28.一种载体，包含权利要求27的分离的核酸。

29.一种宿主细胞，包含权利要求27的分离的核酸或权利要求28的载体。