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CN112166197A - 用于增强酵母生长和生产力的方法 - Google Patents

用于增强酵母生长和生产力的方法 Download PDF

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CN112166197A
CN112166197A CN201980035632.2A CN201980035632A CN112166197A CN 112166197 A CN112166197 A CN 112166197A CN 201980035632 A CN201980035632 A CN 201980035632A CN 112166197 A CN112166197 A CN 112166197A
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Novozymes AS
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Abstract

本发明涉及使用过氧化物酶或包含过氧化物酶的组合物增强酵母生长和/或生产力的方法。

Description

用于增强酵母生长和生产力的方法
序列表的引用
本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及通过使酵母与有效量的过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触来增强酵母生长和/或生产力(例如在生产酵母期间和/或在酵母扩培期间)的方法。本发明还涉及用于产生发酵产物，如特别是乙醇的方法，其中过氧化物酶或过氧化物酶组合物被用于在发酵过程的早期加速酵母生长和增加乙醇滴度，以及降低乳酸滴度。
背景技术
发酵产物(例如乙醇)典型地是通过以下产生的：首先在干磨或湿磨过程中研磨含淀粉材料，然后使用酶将材料降解成可发酵糖，并且最后使用发酵生物将糖直接或间接转化为所希望的发酵产物。例如通过从其他液体和/或固体分离所希望的发酵产物(例如乙醇)的蒸馏，从发酵醪(通常被称为“啤酒醪”)回收液体发酵产物。剩余级分称为“全酒糟”。全酒糟典型地含有约10％至20％的固体。例如通过离心，将全酒糟分离为固体级分和液体级分。所分离的固体级分被称作“湿饼”(或“湿谷粒”)，而所分离的液体级分被称作“酒糟水(thin stillage)”。湿饼和酒糟水分别含有约35％和7％固体。湿饼(采用任选的额外的脱水)被用作动物饲料中的组分，或被干燥以提供用作动物饲料的组分的“干酒糟”(DDG)。通常蒸发酒糟水，以提供蒸发器冷凝物和浆料，或可替代地可以作为“逆流”被再循环至浆料槽。蒸发器冷凝物可以在被排放前送往甲烷转化器，和/或可以作为“蒸煮水”被再循环到浆料槽。可以在干燥方法(其可以依次包含一个或多个干燥器)之前或期间将浆料共混入DDG中或添加到湿饼中，以生产DDGS(干酒糟及其可溶物)。浆料通常含有约25％至35％的固体。还可以从酒糟水和/或浆料中提取油，作为副产物(用于生物柴油生产)，作为饲料或食品添加剂或产物，或其他生物可再生产物。
用于生产用作燃料的乙醇的酵母，如在玉米乙醇工业中，要求几种特性，以确保乙醇有效生产的成本。这些特性包括乙醇耐受性、低副产品产量、快速发酵、和限制残留在发酵中的剩余糖量的能力。这些特性对工业方法的可行性具有明显的作用。
尽管在过去数十年乙醇生产过程有显著的改善，但是仍然希望并需要以经济和商业相关的规模，提供改善的从含淀粉材料发酵乙醇的方法。
发明内容
如果酵母受到乳酸或传染生物产生的其他抑制化合物的挑战，则由含液化淀粉的材料产生的可发酵糖的乙醇发酵的性能可能会受到消极影响。为了使酵母在发酵中最有生产力，必须缩短酵母的停滞期并且以更快的速度开始乙醇生产。
本发明提供了通过使用过氧化物酶来加速酵母生长和/或生产力(例如，在发酵过程早期增加乙醇滴度)，导致发酵期间(特别是当发酵受到感染挑战时)乳酸滴度的整体减少来解决这些问题的方案。也可将本发明的方法和组合物用于通过增强酵母生长和/或生产力来培养(culture、cultivate)、扩培、或生产酵母。
在一方面，本发明涉及用于增强酵母生长和/或生产力的方法，该方法包括使酵母与有效量的过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触。
在一方面，本发明涉及用于生产酵母的方法，该方法包括在有效量的过氧化物酶或过氧化物酶组合物存在下在有益于酵母生长的条件下培养酵母。
在一些实施例中，相比于不与多肽接触的酵母的生长，该酵母的生长增加了10％至50％。在一些实施例中，相比于不与多肽接触的酵母的生产力，该酵母的生产力增加了10％至50％。
在一方面，本发明涉及包含如当前披露的方法产生的酵母的组合物和选自以下的组分：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、抗氧化剂、加工助剂、和/或其任何组合。在一些实施例中，该组合物被配制为膏状酵母、粉碎酵母、压缩酵母、或活性干酵母。在实施例中，组合物被配制为无活性干酵母(例如，营养酵母)。
在一方面，本发明涉及包含当前披露的酵母组合物的容器。在一些实施例中，该容器选自装载箱(tote)、加药撬块(dosage skid)、包(package)、袋(sack)、或发酵容器。
在一方面，本发明涉及在生物燃料发酵系统中扩培用于生物产品生产的酵母的方法，该方法包括将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入生物燃料发酵系统，其中该发酵系统包含一种或多种发酵容器、管道和/或组件。在实施例中，将过氧化物酶或过氧化物酶组合物以足以增强生物燃料发酵系统中酵母生长和/或生产力的浓度添加。
在实施例中，这些发酵容器中的至少一个是发酵罐，并且将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入发酵罐。在一些实施例中，在发酵最初的6小时内将该过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入发酵罐。在一些实施例中，与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的最初的24小时内生产乙醇的速率相比，在发酵最初的24小时内生产乙醇的速率增加了10％至50％。在一些实施例中，与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的在发酵最初的24小时内的酵母生长相比，在发酵最初的24小时内的酵母生长增加了10％至50％。
在实施例中，这些发酵容器中的至少一个是酵母扩培罐，并且将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入酵母扩培罐。在一些实施例中，与不具有过氧化物酶的发酵最初的24小时内生产的乙醇量相比，在最初的24小时内生产乙醇的速率增加了10％至50％。在一些实施例中，与不具有过氧化物酶的扩培24小时后的酵母生长相比，在过氧化物酶存在下，扩培相同时间的酵母生长增加了10％至50％。
在实施例中，该方法包括将酵母添加至扩培罐或发酵容器。在一些实施例中，酵母在添加至扩培罐或发酵容器之前与过氧化物酶接触。
在实施例中，生物燃料是乙醇。
在一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化以形成液化的醪；b)使用产碳水化合物源的酶将该液化的醪糖化以生产可发酵糖；c)在适于生产该发酵产物的条件下，使用发酵生物将糖发酵，其中在糖化步骤b)和/或发酵步骤c)之前或期间添加过氧化物酶。
在一些实施例中，步骤b)和c)同时进行。在一些实施例中，将含淀粉材料的浆料加热至高于糊化温度。在一些实施例中，在液化期间添加过氧化物酶。在一些实施例中，在糖化期间添加过氧化物酶，其中任选地在糖化最初的两小时内添加过氧化物酶。在一些实施例中，在发酵期间添加过氧化物酶，其中任选地在发酵最初的六小时内添加过氧化物酶。在实施例中，恰好在液化之后且在发酵罐或扩培罐之前引入过氧化物酶。在实施例中，将过氧化物酶在醪冷却系统的任何点引入。在实施例中，将过氧化物酶添加至热交换器。在实施例中，将过氧化物酶添加至混合槽。在一些实施例中，发酵产物是醇，优选乙醇。
在一些实施例中，发酵生物是酵母。
在一些实施例中，酵母属于选自以下的属：酵母属(Saccharomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、假丝酵母属(Candida)、耶氏酵母属(Yarrowia)、油脂酵母属(Lipomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、或德克拉酵母属(Dekkera)。在一些实施例中，该酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)(carlsbergiensis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、或其任何组合。在一些实施例中，酵母是酿酒酵母。在一些实施例中，酵母包含编码选自以下的酶的异源多核苷酸：α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、或蛋白酶。
在一些实施例中，过氧化物酶是选自以下的过氧化物酶或过氧化物分解酶：E.C.1.11.1.1NADH过氧化物酶；E.C.1.11.1.2NADPH过氧化物酶；E.C.1.11.1.3脂肪酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.5细胞色素c过氧化物酶；E.C.1.11.1.5；E.C.1.11.1.6过氧化氢酶；E.C.1.11.1.7过氧化物酶；E.C.1.11.1.8碘化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.9谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.10氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.11L-抗坏血酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.12磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.13锰过氧化物酶；E.C.1.11.1.14木质素过氧化物酶；E.C.1.11.1.15过氧化物氧还蛋白；E.C.1.11.1.16通用过氧化物酶；E.C.1.11.1.B2氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B6碘化物过氧化物酶(含有钒的)；E.C.1.11.1.B7溴化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B8碘化物过氧化物酶。在一些实施例中，过氧化物酶源自微生物，例如真菌生物，例如酵母或丝状真菌，或细菌；或植物。在一些实施例中，过氧化物酶选自：(i)源自嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株的过氧化物酶，如橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株，如本文的SEQ ID NO:1所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:1具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；(ii)源自嗜热链球菌属(Mycothermus)的菌株的过氧化物酶，如嗜热链球菌(Mycothermus thermophilus)的菌株，如本文的SEQ ID NO:2所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:2具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；或(iii)源自鬼伞属(Coprinus)的菌株的过氧化物酶，如灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)菌株，如本文的SEQ ID NO:3所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:3具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶。
在一方面，本发明涉及过氧化物酶用于扩培酵母的用途。在一方面，本发明涉及用于增加酵母的生长和/或生产力的过氧化物酶的用途。
在一方面，本发明涉及用于增加在生物燃料(例如，乙醇)生产过程期间在发酵最初的24小时内生产乙醇速率的过氧化物酶的用途。
在一方面，本发明涉及用于降低在生物燃料(例如，乙醇)生产过程的发酵或同时糖化和发酵步骤期间乳酸滴度的过氧化物酶的用途。
在一方面，本发明涉及用于降低在乙醇生产过程的发酵期间乳酸水平的过氧化物酶的用途。
在一方面，本发明涉及用于降低在酵母扩培期间乳酸水平的过氧化物酶的用途。
附图说明
图1显示示例性的干磨乙醇生产方法。
图2显示与缺乏过氧化物酶的对照和仅使用青霉素的对照相比，在各种过氧化物酶存在下具有20％干燥固体(DS)含量的液化玉米醪发酵24小时后的乙醇滴度(g/L)。
图3显示与缺乏过氧化物酶的对照和仅使用青霉素的对照相比，在各种过氧化物酶存在下具有20％干燥固体含量的液化玉米醪发酵24小时后的乳酸滴度(g/L)。
图4显示与缺乏过氧化物酶的对照和仅使用青霉素的对照相比，在各种过氧化物酶存在下具有20％干燥固体(DS)含量的液化玉米醪发酵24小时后的乙醇滴度(g/L)。
图5显示与缺乏过氧化物酶的对照和仅使用青霉素的对照相比，在各种过氧化物酶存在下具有20％干燥固体含量的液化玉米醪发酵24小时后的乳酸滴度(g/L)。
图6显示与缺乏过氧化物酶的对照和仅使用青霉素的对照相比，在各种过氧化物酶存在下具有32％干燥固体(DS)含量的液化玉米醪发酵60小时后的乙醇滴度(g/L)。
图7显示与缺乏过氧化物酶的对照和仅使用青霉素的对照相比，在各种过氧化物酶存在下具有32％干燥固体含量的液化玉米醪发酵60小时后的乳酸滴度(g/L)。
图8A、图8B、图8C、图8D、和图8E是显示在不具有过氧化物酶(对照；图8A)和在增加浓度的过氧化物酶(5uL T.a.过氧化氢酶(图8B)；25uL T.a.过氧化氢酶(图8C)；50uL T.a.过氧化氢酶(图8D)；和200uL T.a.过氧化氢酶(图8E))存在下的无菌营养培养基中酵母细胞生长的引用图。
图9是显示图8A、图8B、图8C、图8D、和图8E中显示的酵母平均细胞计数的图，使用Cytation软件计数。
图10是显示与不具有过氧化物酶的基线对照相比，某些过氧化物酶对14L扩培中的酵母生长的影响的图。
图11A是显示在具有和不具有过氧化物酶处理的20％DS中扩培6小时后的葡萄糖滴度(g/L)的图。
图11B是显示在具有和不具有过氧化物酶处理的20％DS中扩培6小时后的乙醇滴度(g/L)的图。
图12是显示与对照相比，用增加的过氧化物酶浓度(10uL、50uL、100uL、和450uL)处理的酵母的早期发酵动力学的图，通过Ankom压力监测器测量。
图13A是显示在32％DS下发酵60小时后，随后在各种浓度的过氧化物酶存在下扩培酵母的乳酸滴度(g/L)的图。
图13B是显示在32％DS下发酵60小时后，随后在各种浓度的过氧化物酶存在下扩培酵母的乙醇滴度(g/L)的图。
图13C是显示在32％DS下发酵60小时后，随后在各种浓度的过氧化物酶存在下扩培酵母的DP2滴度(g/L)的图。
定义
除非由上下文以另外的方式定义或清楚表明，本文使用的所有技术术语和科学术语具有如本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。
α-淀粉酶：α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是催化淀粉以及其他直链和支链1,4糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。本领域技术人员将知道如何确定α-淀粉酶活性。它可以根据在实例中描述的程序例如通过PNP-G7测定或酶检(EnzCheck)测定来确定。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。可以根据Venturi等人,2002,J.Basic Microbiol.[基础微生物学杂志]42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃，pH 4.8下，在含有0.01％
Figure BDA0002800891120000081
20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D-木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-低聚木糖的外切水解，以将连续的D-木糖残基从非还原端移除。可以在含有0.01％
Figure BDA0002800891120000082
20的100mM柠檬酸钠中，在pH 5，40℃下，使用1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物来确定β-木糖苷酶活性。一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH 5下，在含有0.01％
Figure BDA0002800891120000091
20的100mM柠檬酸钠中从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
过氧化氢酶：术语“过氧化氢酶”意指过氧化氢：过氧化氢氧化还原酶(EC1.11.1.6)，该酶催化2H2O2转化为O2+2H2O。出于本发明的目的，根据美国专利号5,646,025确定过氧化氢酶活性。一个单位的过氧化氢酶活性等于在测定条件下催化1微摩尔的过氧化氢氧化的酶的量。
cDNA：在此将术语“cDNA”定义为可以通过从成熟的剪接的mRNA分子逆转录制备的DNA分子，该mRNA分子是从真核细胞中获得。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从该链的还原端(纤维二糖水解酶I)或非还原端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(Teeri,1997,Trends in Biotechnology[生物技术趋势]15:160-167；Teeri等人,1998,Biochem.Soc.Trans.[生化学会会刊]26:173-178)。可以根据由以下所述的程序来确定纤维二糖水解酶活性：Lever等人,1972,Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279；van Tilbeurgh等人,1982,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]187:283-288；和Tomme等人,1988,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],170:575-581。
纤维素分解增强活性：在此将术语“纤维素分解增强活性”定义为由具有纤维素分解活性的多肽增强纤维素材料的水解的生物活性。出于本发明的目的，通过测量在以下条件下来自由纤维素分解蛋白水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g于PCS中的纤维素，其中总蛋白由50％-99.5％w/w纤维素分解蛋白和0.5％-50％w/w具有纤维素分解增强活性的蛋白构成，在50℃-65℃持续1-7天，与不具有纤维素分解增强活性的相等总蛋白装载的对照水解(1-50mg纤维素分解蛋白/g于PCS中的纤维素)相比较。在优选的方面，使用在总蛋白质重量的3％的米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或总蛋白质重量的3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 02/095014中所描述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下
Figure BDA0002800891120000101
1.5L(诺维信公司(Novozymes A/S)，丹麦巴格斯瓦尔德(
Figure BDA0002800891120000102
Denmark))的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量来增强由具有纤维素分解活性的蛋白质催化的纤维素材料的水解，优选地降低至少1.01倍、更优选地至少1.05倍、更优选地至少1.10倍、更优选地至少1.25倍、更优选地至少1.5倍、更优选地至少2倍、更优选地至少3倍、更优选地至少4倍、更优选地至少5倍、甚至更优选地至少10倍、以及最优选地至少20倍。
纤维素分解酶、纤维素分解组合物、或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”、“纤维素分解组合物”、或“纤维素酶”意指一种或多种(例如，几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等人,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies[纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略],2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481中综述。通常使用不溶性底物，包括Whatman№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常见的总纤维素分解活性测定是将Whatman№1滤纸用作底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC))(高斯(Ghose)，1987，纤维素酶活性的测量(Measurement of cellulase activities)，纯粹与应用化学(PureAppl.Chem.)59:257-68)确立的。
通过测量在以下条件下由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来测定纤维素分解酶活性：1-50mg纤维素分解酶蛋白/g预处理的玉米秸秆(“PCS”)中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)，在适合的温度(例如50℃、55℃、或60℃)下持续3-7天，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体，50mM乙酸钠(pH5)，1mM MnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过
Figure BDA0002800891120000111
HPX-87H柱(美国加州赫拉克勒斯伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.))进行糖分析。
编码序列：术语“编码序列”或“编码区”意指指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框决定，该开放阅读框通常以ATG起始密码子或替代起始密码子(如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的多核苷酸、和/或重组多核苷酸的序列。
控制序列：术语“控制序列”意指多肽表达所必需的核酸序列。控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，并且彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于，前导子序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列和转录终止子序列。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合β-1,3-1,4葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481)。还可以根据Ghose,1987,Pure andAppl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-268的程序，在pH 5，40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
表达：术语“表达”包括在多肽的生产中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。可以对表达进行测量—例如，来检测增加的表达—通过本领域已知的技术，如测量mRNA和/或翻译的多肽的水平。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据亨利萨特(Henrissat)B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类(Aclassification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities)，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；和亨利萨特B.和贝洛赫(Bairoch)A.，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类(Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中的非常弱的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶活性的测量值而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
可发酵的培养基：术语“可发酵的培养基”或“发酵培养基”是指包含一种或多种(例如，两种、几种)糖的培养基，如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性低聚糖，其中该培养基能够部分地被宿主细胞转化(发酵)为希望的产物，如乙醇。在某些情况下，发酵培养基源自天然来源，如甘蔗、淀粉、或纤维素。术语发酵培养基在本文理解为指在添加发酵生物之前的介质，例如，由糖化过程产生的介质，以及在同时糖化和发酵过程(SSF)中使用的介质。
发酵生物：术语“发酵生物”是指适于生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，如酵母和丝状真菌。适合的发酵生物能够将可发酵糖(如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖或木糖)直接或间接地发酵(即，转化)为所希望的发酵产物。
片段：术语“片段”意指从成熟多肽主要部分的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽；其中该片段具有酶活性。在一方面，片段含有酶的成熟多肽的至少85％，例如至少90％或至少95％的氨基酸残基。
葡糖淀粉酶：术语葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)被定义为催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的酶。出于本发明的目的，根据本文实例中所述的程序确定葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：23.2mM麦芽糖，缓冲液：0.1M乙酸盐，反应时间：5分钟)每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指可对半纤维素材料进行水解的一种或多种(例如，几种)酶。参见，例如Shallom和Shoham,2003,Current Opinion In Microbiology[微生物学当前观点]6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、和木糖苷酶。这些酶的底物(半纤维素)是支链和直链多糖的异质性组，这些多糖经由氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维相结合，从而将它们交联成稳健的网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基团的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于其一级序列的同源性，可以分配到GH和CE家族。一些家族(具有总体上类似的折叠)可以进一步分组为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中可得到这些以及其他碳水化合物活性酶的最详实和最新的分类。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&AppI.Chem.[理论与应用化学]59:1739-1752，在适宜温度例如40℃-80℃，例如50℃、55℃、60℃、65℃或70℃，以及适宜pH例如4-9，例如5.0、5.5、6.0、6.5或7.0下进行测量。
异源多核苷酸：术语“异源多核苷酸”在本文定义为对宿主细胞不是天然的多核苷酸；天然多核苷酸，其中对编码区已进行了结构修饰；天然多核苷酸，其表达由于通过重组DNA技术(例如不同的(外源)启动子)操纵DNA而被定量改变；或宿主细胞中的一种天然多核苷酸，该宿主细胞具有该多核苷酸的一个或多个额外拷贝以定量改变表达。“异源基因”是包含异源多核苷酸的基因。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
同源序列：在此将术语“同源序列”定义为在用感兴趣的多肽的tfasty检索(皮尔森(Pearson)，W.R.，1999，在生物信息学方法和协议(Bioinformatics Methods andProtocols)中，S.麦森纳(Misener)和S.A.克拉韦茨(Krawetz)，编辑，185-219页)中具有小于0.001的E值(或期望分数)的预测蛋白。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对包括在此描述的多核苷酸(例如，编码α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、或蛋白酶的多核苷酸)的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。术语“重组细胞”在本文中定义为包含一种或多种(例如，两种、几种)异源多核苷酸的非天然存在的宿主细胞。
同一性：参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trendsin Genetics[遗传学趋势]16:276-277)(优选地3.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃，于5X SSPE，0.3％SDS，200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC，0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的具有生物活性的多肽。在实施例中，成熟多肽是SEQ ID NO:1的多肽的20至717位氨基酸。SEQ ID NO:1的多肽的氨基酸1至19是预测信号肽。在实施例中，成熟多肽是SEQ ID NO:3的多肽的氨基酸23至351。SEQID NO:3的多肽的氨基酸1至22是预测信号肽。
在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：在此将术语“成熟多肽编码序列”定义为编码成熟多肽的核苷酸序列。
中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃，于5X SSPE，0.3％SDS，200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC，0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃，于5X SSPE，0.3％SDS，200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC，0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
修饰：术语“修饰”在此意指多肽的任何化学修饰以及对编码该多肽的DNA所进行的遗传操作。修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，连同一个或多个(几个)氨基酸侧链的替换。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：如本文使用的术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因或其受修饰以本来不存在于自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的。当核酸构建体含有表达编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
过氧化物酶：在此定义了术语“过氧化物酶”，包括具有过氧化物酶活性的酶和过氧化物分解酶。
过氧化物酶活性：在此将术语“过氧化物酶活性”定义为将过氧化物(例如，过氧化氢)转化为较少氧化的种类(例如，水)的酶活性。在此应该理解的是，具有过氧化物酶活性的多肽涵盖过氧化物分解酶(在下文定义)并且在本文中与“过氧化物酶”互换使用。
过氧化物分解酶：在此将术语“过氧化物分解酶”定义为一种供体：催化还原底物(2e-)+ROOR’→氧化底物+ROH+R’OH反应的过氧化物氧化还原酶；如催化苯酚+H2O2→醌+H2O反应的辣根过氧化物酶(E.C.编号1.11.1.x)，和催化H2O2+H2O2→O2+2H2O反应的过氧化氢酶。除过氧化氢之外，其他过氧化物也可以被这些酶分解。
多肽片段：在此将术语“多肽片段”定义为使一个或多个(几个)氨基酸从成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失的多肽，其中该片段具有生物活性。
预处理的玉米秸秆：术语“预处理的玉米秸秆”或“PCS”意指通过热和稀硫酸处理、碱预处理、中性预处理、或本领域已知的任何预处理从玉米秸秆得到的含纤维素材料。
蛋白酶：术语“蛋白酶”在本文中定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的每一个)。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(San Diego)的NC-IUBMB，学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于以下中的增刊1-5：Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]223:1-5(1994)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]232:1-6(1995)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]237:1-5(1996)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]250:1-6(1997)和Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]264:610-650(1999)。术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人,1991,Protein Engng.[蛋白质工程]4:719-737和Siezen等人,1997,Protein Science[蛋白质科学]6:501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。
蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。
具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶(外肽酶)或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。
在具体实施例中，用于在本发明的方法中使用的蛋白酶选自下组，该组由以下组成：
(a)属于EC 3.4.24金属内肽酶的蛋白酶；
(b)属于上述手册的M组的金属蛋白酶；
(c)尚未指定宗族的金属蛋白酶(指定：宗族MX)，或属于宗族MA、MB、MC、MD、ME、MF、MG、MH中任一种的金属蛋白酶(如上述手册的第989-991页所定义的)；
(d)其他家族的金属蛋白酶(如上述手册的第1448-1452页所定义的)；
(e)具有HEXXH基序的金属蛋白酶；
(f)具有HEFTH基序的金属蛋白酶；
(g)属于家族M3、M26、M27、M32、M34、M35、M36、M41、M43或M47中任一种的金属蛋白酶(如上述手册的第1448-1452页所定义的)；和
(h)属于家族M35的金属蛋白酶(如上述手册的第1492-1495页所定义的)。
蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白质水解活性(EC3.4)。存在几种蛋白酶活性类型，例如在Arg和Lys残基的羧基末端侧切割的胰蛋白酶样蛋白酶以及在疏水性氨基酸残基的羧基末端侧切割的糜蛋白酶样蛋白酶。
可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。测定温度的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。普通蛋白酶底物的实例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的Anson和Mirsky方法中，将变性的血红蛋白用作底物并且在用所讨论的蛋白酶进行测定孵育后，确定三氯乙酸可溶的血红蛋白的量作为蛋白酶活性的量度(Anson,M.L.和Mirsky,A.E.，1932，J.Gen.Physiol.[普通生理学杂志]16:59以及Anson,M.L.，1938，J.Gen.Physiol.[普通生理学杂志]22:79)。
出于本发明的目的，使用描述于“材料与方法”中的测定确定蛋白酶活性，例如动力学Suc-AAPF-pNA测定、Protazyme AK测定、动力学Suc-AAPX-pNA测定以及邻苯二甲醛(OPA)。对于Protazyme AK测定，当用蛋白酶孵育时，不可溶Protazyme AK(天青精-交联的酪蛋白)底物释放蓝色并且确定该颜色作为蛋白酶活性的量度。对于Suc-AAPF-pNA测定，当用蛋白酶孵育时，无色的Suc-AAPF-pNA底物释放黄色的对硝基苯胺并且确定该黄色作为蛋白酶活性的量度。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本文描述的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]1970,48,443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度，该算法如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite),Rice等人,TrendsGenet[遗传学趋势]2000,16,276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobriefoption)获得)用作同一性百分比并且计算如下：
(相同的残基X 100)/(参照序列的长度-比对中的空位总数)
出于本文描述的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性的程度，该算法如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件,Rice等人,2000，见上文)(优选3.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸X 100)/(参照序列的长度-比对中的空位总数)
信号肽：术语“信号肽”在本文中定义为以符合阅读框的方式连接(融合)至具有生物活性的多肽的氨基末端且指导该多肽进入细胞的分泌途径的肽。
子序列：在此将术语“子序列”定义为使一个或多个(几个)核苷酸从成熟多肽编码序列或其同源序列的5'端和/或3'端缺失的核苷酸序列，其中该子序列编码具有生物活性的一个多肽片段。
海藻糖酶：术语“海藻糖酶”意指将海藻糖降解成其单元单糖(即，葡萄糖)的酶。将海藻糖酶分类于EC 3.2.1.28(α,α-海藻糖酶)和EC。3.2.1.93(α,α-磷酸海藻糖酶)。EC类别基于国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的命名委员会(Nomenclature Committee)的推荐。EC类别的描述可见于互联网，例如，在“http://www.expasy.org/enzyme/”。海藻糖酶是催化如下反应的酶：
EC 3.2.1.28：
Figure BDA0002800891120000211
EC 3.2.1.93：
Figure BDA0002800891120000212
出于本发明的目的，海藻糖酶活性可根据以下所述的海藻糖酶测定方法测定。
原理：
Figure BDA0002800891120000221
T＝37℃,pH＝5.7,A340 nm,光路＝1cm
光度法停止率测定(Spectrophotometric Stop Rate Determination)
单位定义：
在pH 5.7，在37℃，一个单位每分钟将1.0毫摩尔的海藻糖转化为2.0毫摩尔的葡萄糖(在pH 7.5，测定的释放的葡萄糖)。
(参见Dahlqvist,A.(1968)Analytical Biochemistry 22,99-107)
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，几个)位置处包含改变，即取代、插入和/或缺失的具有酶或酶增强活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的变体可与参考多肽(例如，本文所述的酶)的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。在一些实施例中，变体与参考多肽(例如，本文所述的酶)的氨基酸序列具有小于100％的序列同一性。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE，0.3％SDS，200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC，0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃，于5X SSPE，0.3％SDS，200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC，0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。木聚糖酶活性可以在37℃在0.01％
Figure BDA0002800891120000231
X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH 6，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白(azurine)。
本文提及“约”值或参数包括指向该值或参数本身的实施例。例如，提及“约X”的描述包括实施例“X”。当与测量值组合使用时，“约”包括涵盖至少与测量该具体数值的方法相关的不确定性的范围，并且可以包括在给定的数值附近正或负两个标准差的范围。
同样，提及“源自”另一个基因或多肽X的基因或多肽包括该基因或多肽X。
如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式“一种/个(a/an)”、“或”以及“该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外清楚表明。
应该理解的是本文所述的实施例包括“由……实施例组成”和/或“基本由……实施例组成”。如本文所用，除了由于表达语言或必需含义情况下另有要求外，词语“包含(comprise)”或变形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”以包容性意义使用，即指定所述特征的存在，但不排除各种实施例中存在或加入了其他特征。
具体实施方式
本发明涉及过氧化物酶用于增强酵母生长和/或生产力的用途，例如在酵母扩培期间，如尤其是在生物燃料发酵系统中用于生物产品生产的扩培酵母时。本发明还涉及使用发酵生物从含淀粉材料生产发酵产物的方法，其中在酵母扩培期间和/或发酵期间添加过氧化物酶。
发明人出人意料地发现在过氧化物酶存在下培养酵母时酵母生长增加。本文呈现的数据出人意料地证明过氧化物酶在扩培和/或发酵期间的早期提早改善酵母的动力学，并且特别是与缺乏过氧化物酶的对照扩培相比，用过氧化物酶扩培的酵母在扩培最初的六个小时内消耗更多的葡萄糖并且显著增加乙醇滴度。出人意料地，当将此类扩培酵母转移至发酵中并用感染激发酵母时，如通过降低的乳酸滴定法测量的，用过氧化物酶处理的酵母能更有效地胜过感染。
I.增强发酵生物生长和/或生产力
在一方面，本发明涉及用于增强发酵生物生长和/或生产力的方法，该方法包括使发酵生物与有效量的过氧化物酶或包含具有过氧化物酶活性的多肽的组合物接触。
在实施例中，本发明涉及用于增强酵母生长和/或生产力的方法，该方法包括使酵母与有效量的过氧化物酶或包含具有过氧化物酶活性的多肽的组合物接触。
如本文所用，短语“增强发酵生物生长和/或生产力”和“增强酵母生长和/或生产力”涵盖增强发酵生物生长/酵母生长、增强发酵生物生产力/酵母生产力、或增强发酵生物生长/酵母生长和增强发酵生物生产力/酵母生产力两者。
短语“增强酵母生长”涵盖在好氧发酵和厌氧发酵两者期间增加的生长速率和生物量产量(例如，增加群中酵母细胞数)。应该理解，“增加的生长速率”涵盖持续生长速率的增加和/或最大瞬时生长速率的增加。应理解，为了简洁起见，除了以下说明致力于酵母外，“增强酵母生长”的以下说明的定义同样适用于短语“增强发酵生物生长”。还应理解，在披露方法的上下文中，相对于与本发明的过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母，评估在相同或相似条件下但不与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母的生长速率和/或生物量产量的增加。
过氧化物酶、组合物、和包含过氧化物酶的方法导致酵母生物量产量可检测的增加。在本发明的不同方面，与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母的生物量产量增加至少1％、3％、5％、10％、11％、13％、15％、17％、21％、24％、26％、32％、35％、40％、45％、50％、54％、58％、61％、63％、66％、70％、75％、77％、80％、85％、90％、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3倍、4倍、或5倍(与在相同或相似条件下但不与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母的生长相比)。
过氧化物酶、组合物、和包含过氧化物酶的方法导致酵母生长速率可检测的增加。在本发明的不同方面，与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母的生长速率增加至少1％、3％、5％、10％、11％、13％、15％、17％、21％、24％、26％、32％、35％、40％、45％、50％、54％、58％、61％、63％、66％、70％、75％、77％、80％、85％、90％、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3倍、4倍、或5倍(与在相同或相似条件下但不与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母的生长速率相比)。
术语“增强的酵母生产力”涵盖通过酵母产生发酵产物的速率的增加、通过酵母产生的发酵产物的绝对滴度的增加、以及通过酵母消耗营养物的量或速率的增加。例如，过氧化物酶、组合物、和包含过氧化物酶的方法可增加酵母代谢产物生产和/或酵母酶生产(例如，异源酶表达)的速率。应理解，为了简洁起见，除了以下说明致力于酵母外，“增强酵母生产力”的以下说明的定义同样适用于短语“增强发酵生物生产力”。还应理解，在披露方法的上下文中，相对于酵母发酵产物的速率和绝对滴度以及通过不与本发明的过氧化物酶接触的酵母消耗营养物的速率或量，评估酵母发酵产物的速率和绝对滴度的增加以及通过在相同或相似条件下的酵母消耗营养物的速率或量的增加。过氧化物酶和组合物以及涉及过氧化物酶的方法导致统计学上显著的酵母生产力的增加。
在本发明的方面，与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母的生产力增加1％、3％、5％、10％、11％、13％、15％、17％、21％、24％、26％、32％、35％、40％、45％、50％、54％、58％、61％、63％、66％、70％、75％、77％、80％、85％、90％、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3倍、4倍、或5倍(与在相同或相似条件下但不与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母的生产力相比)。
在本发明的方面，通过与本发明的过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母生产发酵产物的速率增加1％、3％、5％、10％、11％、13％、15％、17％、21％、24％、26％、32％、35％、40％、45％、50％、54％、58％、61％、63％、66％、70％、75％、77％、80％、85％、90％、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、或10倍(与通过在相同或相似条件下但不与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母生产发酵产物的速率相比)。
在本发明的方面，通过与本发明的过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母产生的发酵产物的绝对滴度增加1％、3％、5％、10％、11％、13％、15％、17％、21％、24％、26％、32％、35％、40％、45％、50％、54％、58％、61％、63％、66％、70％、75％、77％、80％、85％、90％、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、或10倍(与通过在相同或相似条件下但不与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母产生的发酵产物的滴度相比)。
在实施例中，通过与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母产生乙醇的速率增加1％、3％、5％、10％、11％、13％、15％、17％、21％、24％、26％、32％、35％、40％、45％、50％、54％、58％、61％、63％、66％、70％、75％、77％、80％、85％、90％、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、或10倍(与通过在相同或相似条件下但不与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母产生乙醇的速率相比)。
在实施例中，通过与本发明的过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母消耗葡萄糖或消耗葡萄糖量的速率增加1％、3％、5％、10％、11％、13％、15％、17％、21％、24％、26％、32％、35％、40％、45％、50％、54％、58％、61％、63％、66％、70％、75％、77％、80％、85％、90％、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、或10倍(与通过在相同或相似条件下但不与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母消耗葡萄糖或消耗葡萄糖量的速率相比)。
术语“接触”涵盖将过氧化物酶或包含过氧化物酶的组合物置于与酵母或存在酵母的环境物理接触的任何方法。例如，过氧化物酶或过氧化物酶组合物可与酵母组合物(例如，膏状酵母配制品)配置，可将过氧化物酶或过氧化物酶组合物添加至包含酵母的培养基(例如，营养培养基)，可将过氧化物酶或过氧化物酶组合物添加至包含酵母的发酵容器(例如，酵母扩培罐，生物反应器等)，或者可将过氧化物酶或过氧化物酶组合物添加至包含酵母的容器(例如，装载箱、加药撬块等)。
术语“有效量”意指，将至少增强统计学上显著的量的与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母生长和/或生产力的量(与在相同条件下但不与过氧化物酶或过氧化物酶组合物接触的酵母的生长和/或生产力相比)。有效量将取决于本领域普通技术人员已知的多种因素。此类因素包括，但不限于，发酵或扩培的规模、扩培循环数、起始酵母密度、希望的最终酵母密度、生长或发酵培养基的含量、生物反应器或发酵容器的体积、发酵的类型(例如，分批模式、补料分批模式等)、反应时间、反应温度、和反应pH。过氧化物酶的有效量范围是从0.01μg至5000μg浓缩产物、优选地从0.10μg至2500μg浓缩产物、更优选地从1μg至1000μg浓缩产物、和甚至更优选地从10μg至500μg浓缩产物。在实施例中，过氧化物酶的有效量范围是从10μg至450μg浓缩产物。
任何发酵生物，如特别是在“发酵生物”的标题下如本文所述的发酵生物可用于增强发酵生物生长和/或生产力的方法中。在实施例中，发酵微生物是酵母。在实施例中，酵母属于选自以下的属：酵母属、红酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、红冬孢酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属、油脂酵母属、隐球菌属、或德克拉酵母属。在实施例中，酵母是酿酒酵母、巴斯德酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、尖孢镰孢、或其任何组合。在实施例中，酵母是酿酒酵母。在实施例中，酵母包含编码选自以下的酶的异源多核苷酸：α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、或蛋白酶。
在实施例中，过氧化物酶是选自以下的过氧化物酶或过氧化物分解酶：E.C.1.11.1.1NADH过氧化物酶；E.C.1.11.1.2NADPH过氧化物酶；E.C.1.11.1.3脂肪酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.5细胞色素c过氧化物酶；E.C.1.11.1.5；E.C.1.11.1.6过氧化氢酶；E.C.1.11.1.7过氧化物酶；E.C.1.11.1.8碘化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.9谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.10氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.11L-抗坏血酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.12磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.13锰过氧化物酶；E.C.1.11.1.14木质素过氧化物酶；E.C.1.11.1.15过氧化物氧还蛋白；E.C.1.11.1.16通用过氧化物酶；E.C.1.11.1.B2氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B6碘化物过氧化物酶(含有钒的)；E.C.1.11.1.B7溴化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B8碘化物过氧化物酶。在实施例中，过氧化物酶源自微生物，例如真菌生物，例如酵母或丝状真菌，或细菌；或植物。在实施例中，过氧化物酶选自：(i)源自嗜热子囊菌属的菌株的过氧化物酶，如橙色嗜热子囊菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:1所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:1具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；(ii)源自嗜热链球菌属的菌株的过氧化物酶，如嗜热链球菌的菌株，如本文的SEQ IDNO:2所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:2具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；或(iii)源自鬼伞属的菌株的过氧化物酶，如灰盖鬼伞菌株，如本文的SEQ ID NO:3所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:3具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶。
II.发酵生物的生产
本发明的方面涉及用于发酵生物生产的方法，该方法包括在过氧化物酶或包含具有过氧化物酶活性的多肽的组合物存在下，在有益于发酵生物生长的条件下培养发酵生物。
在一方面，本发明涉及用于生产酵母的方法，该方法包括在过氧化物酶或包含具有过氧化物酶活性的多肽的组合物存在下，在有益于酵母生长的条件下培养酵母。该方法预期以任何规模(例如，商业规模)生产酵母。本领域技术人员将理解，有多种有益于酵母生长的条件可被优化以确保特别的酵母菌株(例如，用于商业生产)的最佳生长。例如，纯酵母培养物可在达到主要生产阶段之前以各种规模的几个阶段进行培养。在每个连续阶段中，可根据希望的生产酵母量使用生物反应器的尺寸。以下实例描述小规模酵母生产的示例性条件。在实施例中，主要生产以补料分批扩培，在好氧条件下在水性生长培养基中进行，该培养基含有氮、维生素、痕量金属、盐的同化来源和连续添加的碳水化合物源。优选地，用氨水和/或稀碱将发酵液的pH控制在从4.0至6.0。在整个扩培中，温度可维持在25℃至38℃之间。选择碳水化合物进料速率以实现高的比生长速率，使得进料速率不超过扩培器的氧气转移或冷却能力。扩培可能需要30到50个小时之间，并用含有60％到120％之间的干酵母固体的发酵液完成。扩培后，浓缩酵母细胞以根据应用(例如烘烤、酿造、生物燃料发酵等)进一步加工成需要的产物(例如，膏状酵母、粉碎酵母、活性或失活干酵母、压缩酵母等)。
III.发酵生物组合物
本发明的方面涉及包含发酵生物(例如，本文所述的发酵生物)和天然存在和/或非天然存在的组分的组合物。在实施例中，本发明涉及包含酵母菌株(例如，根据本文所述的方法产生的酵母菌株)的组合物和选自以下的组分：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、抗氧化剂、加工助剂、和/或其任何组合。在不同方面和实施例中，组合物中的发酵生物通过接触、培养(cultivating，culturing)、产生和/或扩培发酵生物与过氧化物酶或过氧化物酶组合物产生的发酵生物。在不同方面和实施例中，组合物中的发酵生物通过接触、培养(cultivating，culturing)、产生和/或扩培酵母与过氧化物酶或过氧化物酶组合物产生的酵母菌株。在不同方面和实施例中，包含发酵生物(例如本文所述的酵母菌株)和选自以下的组分的组合物进一步包含过氧化物酶：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、抗氧化剂、加工助剂、和/或其任何组合。
组合物的发酵生物可以是任何活的形式，包括粉碎的、干燥的，包括活性干燥和速溶的、压缩的、膏状(液体)形式等。在一个实施例中，发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是干酵母，例如活性干酵母或速溶酵母。在一个实施例中，发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是粉碎酵母。在一个实施例中，发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是压缩酵母。在一个实施例中，发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是膏状酵母。
在一个实施例中是组合物，该组合物包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和选自以下的一种或多种组分：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、抗氧化剂、加工助剂、和/或其任何组合。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的表面活性剂。在一些实施例中，包含发酵生物和表面活性剂的组合物进一步包括过氧化物酶。在一个实施例中，一种或多种表面活性剂是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、和/或非离子表面活性剂。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的乳化剂。在一些实施例中，包含发酵生物和乳化剂的组合物进一步包括过氧化物酶。在一个实施例中，乳化剂是山梨聚糖的脂肪酸酯。在一个实施例中，乳化剂选自下组：山梨聚糖单硬脂酸酯(SMS)、单双甘酯的柠檬酸酯、聚甘油酯、丙二醇的脂肪酸酯。
在一个实施例中，组合物包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和Olindronal SMS、Olindronal SK、或Olindronal SPL，包括欧洲专利号1,724,336(将其通过引用特此并入)中涉及的组合物。针对活性干酵母，这些产品可以从奥地利的布塞蒂公司(Bussetti)商购获得。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的树胶。在一些实施例中，包含发酵生物和树胶的组合物进一步包括过氧化物酶。在一个实施例中，树胶选自下组：槐树豆胶、瓜尔胶、黄芪胶、阿拉伯胶、黄原胶和阿拉伯树胶，具体地针对膏状、压缩和干酵母。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的溶胀剂。在一些实施例中，包含发酵生物和溶胀剂的组合物进一步包括过氧化物酶。在一个实施例中，溶胀剂是甲基纤维素或羧甲基纤维素。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的抗氧化剂。在一些实施例中，包含发酵生物和抗氧化剂的组合物进一步包括过氧化物酶。在一个实施例中，抗氧化剂是丁羟茴醚(BHA)和/或丁羟甲苯(BHT)、或抗坏血酸(维生素C)，具体地针对活性干酵母。
IV.容器
本发明的方面涉及包含本文所述的发酵生物组合物的容器，如尤其是本文第III部分所述的酵母组合物。
本发明预期任何装有发酵生物(例如，本文所述的发酵生物，例如在过氧化物酶存在下的包含接触、培养(cultivated，cultured)、产生和/或扩培的酵母的酵母组合物)的容器的用途。合适的容器的实例包括但不限于装载箱、加药撬块、包、袋、或发酵容器(如扩培或发酵罐)。在实施例中，容器是装载箱。在实施例中，容器是加药撬块。在实施例中，容器是包。在实施例中，容器是袋。在实施例中，容器是扩培罐。在实施例中，容器是发酵罐。
V.在生物燃料发酵系统中扩培用于生物产品生产的酵母
在一方面，本发明涉及在生物燃料发酵系统中扩培用于生物产品生产的酵母的方法，该方法包括将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入生物燃料发酵系统。术语“生物产品”和“发酵产物”在本文中可互换使用。将过氧化物酶以足以增强生物燃料发酵系统中酵母生长和/或生产力的浓度(即有效量)添加。
用于生物燃料发酵的系统和方法是本领域众所周知的。发酵系统可以包含一个或多个发酵容器、管道和/或组件，其被配置为执行发酵产物生产过程，例如图1中所示的示例性干磨乙醇生产过程。
本领域技术人员将理解，可以在多个不同位置将过氧化物酶或过氧化物酶引入扩培或发酵系统中或之前。
在实施例中，发酵系统中的至少一个发酵容器是发酵罐，并且将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入发酵罐中。在实施例中，在糖化开始之前将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入发酵罐。在实施例中，在发酵开始之前将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入发酵罐。在实施例中，在同时糖化和发酵开始之前将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入发酵罐。在实施例中，在糖化的第一分钟、最初的五分钟、最初的10分钟、最初的15分钟、最初的20分钟、最初的25分钟、最初的30分钟、最初的45分钟、第一小时、最初的90分钟、或最初的2小时内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。在实施例中，在发酵的第一分钟、最初的五分钟、最初的10分钟、最初的15分钟、最初的20分钟、最初的25分钟、最初的30分钟、最初的45分钟、第一小时、最初的90分钟、最初的2小时、最初的3小时、最初的4小时、最初的5小时、或最初的6小时内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。在实施例中，在同时糖化和发酵的第一分钟、最初的五分钟、最初的10分钟、最初的15分钟、最初的20分钟、最初的25分钟、最初的30分钟、最初的45分钟、第一小时、最初的90分钟、最初的2小时、最初的3小时、最初的4小时、最初的5小时、或最初的6小时内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。
在实施例中，这些发酵容器中的至少一个是酵母扩培罐，并且将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入酵母扩培罐。优选地，在酵母扩培的第一分钟、最初的五分钟、最初的10分钟、最初的15分钟、最初的20分钟、最初的25分钟、最初的30分钟、最初的45分钟、第一小时、最初的90分钟、最初的2小时、最初的3小时、最初的4小时、最初的5小时、或最初的6小时内添加过氧化物酶。
可将过氧化物酶或过氧化物酶组合物在糖化、发酵、同时糖化和发酵、或酵母扩培期间以单次推注，分开剂量添加，或者在糖化、发酵、同时糖化和发酵、或酵母扩培的第一个小时、最初的90分钟、或最初的2小时、最初的3小时、最初的4小时、最初的5小时、或最初的6小时内随时间滴定。
在实施例中，恰好在液化之后且在发酵罐或扩培罐之前引入过氧化物酶或过氧化物酶组合物。在实施例中，将过氧化物酶或过氧化物酶组合物在醪冷却系统的任何点引入。在实施例中，将过氧化物酶或过氧化物酶组合物添加至热交换器。在实施例中，将过氧化物酶或过氧化物酶组合物添加至混合槽。
与不具有过氧化物酶的扩培的酵母相比，过氧化物酶或过氧化物酶组合物向酵母扩培罐的添加增加了扩培期间酵母的生长和/或生产力。在过氧化物酶存在下扩培一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、或24小时内的扩培酵母的生长和/或生产力增加至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少12％、至少15％、至少25％、至少30％、至少33％、至少40％、至少50％、至少66％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、或至少100倍(与不具有过氧化物酶的扩培相同时间段的酵母的生长和/或生产力相比)。在实施例中，与不具有过氧化物酶的在酵母扩培最初的24小时内的酵母生长相比，在酵母扩培最初的24小时内的酵母生长增加了10％至50％。
与当在无过氧化物酶下进行酵母扩培、糖化、发酵或同时糖化和发酵时发酵最初的24小时内产生的乙醇量相比，过氧化物酶或过氧化物酶组合物向酵母扩培罐或发酵罐的添加增加了在发酵最初的24小时内产生的乙醇量。在一些实施例中，在酵母扩培、糖化、发酵、或同时糖化和发酵期间，在添加过氧化物酶后，发酵一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、或24小时内产生乙醇的量增加至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少12％、至少15％、至少25％、至少30％、至少33％、至少40％、至少50％、至少66％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、或至少5倍(与不添加过氧化物酶的在相同时间段内产生的乙醇量相比)。在优选的实施例中，与不具有过氧化物酶的发酵最初的24小时内生产乙醇的速率相比，在发酵最初的24小时内生产乙醇的速率增加了10％至50％。
与当在无过氧化物酶下进行酵母扩培、糖化、发酵或同时糖化和发酵时发酵最初的24小时内的乳酸滴度相比，过氧化物酶或过氧化物酶组合物向酵母扩培罐或发酵罐的添加降低了在发酵最初的24小时内的乳酸滴度。在一些实施例中，发酵第一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、或24小时内的乳酸滴度降低至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少12％、至少15％、至少25％、至少30％、至少33％、至少40％、至少50％、至少66％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％(与不添加过氧化物酶的发酵相同时间内的乳酸滴度相比)。在优选的实施例中，与不具有过氧化物酶的发酵最初的10％至50％小时内的乳酸滴度相比，在发酵最初的24小时内的乳酸滴度降低了10％至50％。
与不添加过氧化物酶的发酵结束时的乳酸绝对滴度相比，过氧化物酶或过氧化物酶组合物向酵母扩培罐或发酵罐的添加降低了发酵结束时的乳酸绝对滴度。与不添加过氧化物酶的发酵结束时的乳酸绝对滴度相比，过氧化物酶向酵母扩培罐或发酵罐的添加使发酵结束时的乳酸绝对滴度降低了至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少12％、至少15％、至少25％、至少30％、至少33％、至少40％、至少50％、至少66％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％。在优选的实施例中，与不具有过氧化物酶的发酵结束时的乳酸绝对滴度相比，在发酵结束时的乳酸绝对滴度降低了10％至50％。
可将酵母(例如，本文所述的酵母组合物)添加至扩培罐或发酵罐。引入发酵罐的酵母组合物可包含本文(例如第III部分或段落第IX部分)所述的酵母菌株。在一个实施例中，引入发酵罐的酵母组合物包含酵母菌株和过氧化物酶或过氧化物酶组合物。在具体实施例中，将至少一种被配制为膏状酵母、粉碎酵母、活性干酵母、或压缩酵母的酵母组合物引入发酵罐。可将至少一种被配制为膏状酵母、粉碎酵母、活性干酵母、或压缩酵母的酵母组合物与过氧化物酶或过氧化物酶组合物同时或顺序地引入发酵罐。
在以上实施例中，酵母组合物任选地进一步包括选自以下的天然或非天然存在的组分：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、抗氧化剂、加工助剂、或其任何组合。
包括在过氧化物酶存在下通过接触、培养(cultivating，culturing)、和/或扩培酵母产生的酵母，和本文的第IX部分所述的酵母(例如，酵母属菌株，酿酒酵母菌株等)的本文所述的任何酵母菌株可用于酵母组合物中。
酵母组合物可以任选地配制成包括一种或多种其他酶，或与一种或多种其他酶同时或顺序地引入。用于与发酵生物组合物或酵母组合物配制、或同时或顺序地引入发酵罐中的其他酶的实例包括但不限于：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。
在一些实施例中，酵母组合物进一步包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种其他酶。在实施例中，酵母组合物包含α-淀粉酶。在实施例中，酵母组合物进一步包含葡糖淀粉酶。在实施例中，酵母组合物进一步包含蛋白酶。在实施例中，酵母组合物进一步包含选自α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、和蛋白酶的至少一种、至少两种、或所有的三种酶的任何组合。
在实施例中，酵母组合物包含酵母菌株，该酵母菌株包含分别编码至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种额外的酶的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种异源多核苷酸。
在具体实施例中，酵母组合物包含酿酒酵母菌株，该酿酒酵母菌株包含编码选自以下的酶的至少一种、至少两种或至少三种异源多核苷酸：α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、和一种、两种、或所有三种以上酶的任何组合。
任何酵母菌株，如特别是本文所述的酵母菌株，例如在“发酵生物”的标题下，可在生物燃料系统中扩培用于生物产品生产的酵母的方法中使用。在实施例中，酵母属于选自以下的属：酵母属、红酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、红冬孢酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属、油脂酵母属、隐球菌属、或德克拉酵母属。在实施例中，酵母是酿酒酵母、巴斯德酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、尖孢镰孢、或其任何组合。在实施例中，酵母是酿酒酵母。
任何过氧化物酶可在生物燃料系统中扩培用于生物产品生产的酵母的方法中使用。在实施例中，过氧化物酶是选自以下的过氧化物酶或过氧化物分解酶：E.C.1.11.1.1NADH过氧化物酶；E.C.1.11.1.2NADPH过氧化物酶；E.C.1.11.1.3脂肪酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.5细胞色素c过氧化物酶；E.C.1.11.1.5；E.C.1.11.1.6过氧化氢酶；E.C.1.11.1.7过氧化物酶；E.C.1.11.1.8碘化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.9谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.10氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.11L-抗坏血酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.12磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.13锰过氧化物酶；E.C.1.11.1.14木质素过氧化物酶；E.C.1.11.1.15过氧化物氧还蛋白；E.C.1.11.1.16通用过氧化物酶；E.C.1.11.1.B2氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B6碘化物过氧化物酶(含有钒的)；E.C.1.11.1.B7溴化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B8碘化物过氧化物酶。在实施例中，过氧化物酶源自微生物，例如真菌生物，例如酵母或丝状真菌，或细菌；或植物。在实施例中，过氧化物酶选自：(i)源自嗜热子囊菌属的菌株的过氧化物酶，如橙色嗜热子囊菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:1所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:1具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；(ii)源自嗜热链球菌属的菌株的过氧化物酶，如嗜热链球菌的菌株，如本文的SEQ IDNO:2所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:2具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；或(iii)源自鬼伞属的菌株的过氧化物酶，如灰盖鬼伞菌株，如本文的SEQ ID NO:3所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:3具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶。
在生物燃料系统中扩培用于生物产品生产的酵母的方法可在任何生物燃料系统中使用。在实施例中，生物燃料是醇。在实施例中，醇是乙醇。在实施例中，醇是甲醇。在实施例中，醇是丁醇。
VI.减少乳酸和/或防止乳酸增加
在一方面，本发明涉及用于减少和/或防止生物燃料发酵系统中乳酸增加的方法，该方法包括将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入生物燃料发酵系统中。以足以减少和/或防止生物燃料发酵系统中乳酸增加的浓度添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物(例如，有效量)。
如本文使用的，短语“减少和/或防止乳酸增加”涵盖存在于发酵系统中的存在的乳酸的降低，以及防止系统中的乳酸水平的增加，例如由于系统中传染生物(例如，细菌)的乳酸生产。例如，过氧化物酶组合物或过氧化物酶可以使发酵系统中的乳酸水平降低至至少1％、3％、5％、10％、11％、13％、15％、17％、21％、24％、26％、32％、35％、40％、45％、50％、54％、58％、61％、63％、66％、70％、75％、77％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。
用于生物燃料发酵的系统和方法是本领域众所周知的。发酵系统可以包含一个或多个发酵容器、管道和/或组件，其被配置为执行发酵产物生产过程，例如图1中所示的示例性干磨乙醇生产过程。本领域技术人员将理解，可以在多个不同位置将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入发酵系统中。在实施例中，发酵系统中的至少一个发酵容器是发酵罐，并且将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入发酵罐中。在实施例中，在发酵开始之前将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入发酵罐。在实施例中，这些发酵容器中的至少一个是酵母扩培罐，并且将过氧化物酶或过氧化物酶组合物引入酵母扩培罐。在实施例中，恰好在液化之后且在发酵罐或扩培罐之前引入过氧化物酶或过氧化物酶组合物。在实施例中，将过氧化物酶或过氧化物酶组合物在醪冷却系统的任何点引入。在实施例中，将过氧化物酶或过氧化物酶组合物添加至热交换器。在实施例中，将过氧化物酶或过氧化物酶组合物添加至混合槽。
在实施例中，生物燃料是醇。在实施例中，醇是乙醇。在实施例中，醇是甲醇。在实施例中，醇是丁醇。
VII.过氧化物酶
本披露预期方法和包含任何过氧化物酶的组合物，如尤其是增强酵母生长和/或生产力的过氧化物酶。在一方面，本发明涉及使用过氧化物酶增强酵母生长和/或活性。在一方面，本发明涉及在过氧化物酶存在下培养(cultivating，culturing)、或产生、或扩培酵母。在一方面，本发明涉及在生物燃料系统中扩培用于生物产品生产的酵母的方法中使用过氧化物酶。在一方面，本发明涉及在用于产生发酵产物(如尤其是乙醇)的方法中使用过氧化物酶。
任何具有过氧化物酶活性的多肽可用作在本发明的方法中使用的酶或用作本发明的方法中使用的酶组合物(例如，过氧化物酶组合物)的组分。术语“过氧化物酶”和“具有过氧化物酶活性的多肽”在本文中可互换使用。过氧化物酶可作为酶活性存在于该酶组合物中和/或作为添加至该组合物中一种或多种(几种)蛋白组分。
过氧化物酶的实例是过氧化物酶和过氧化物分解酶，包括但不限于优选各项：
E.C.1.11.1.1NADH过氧化物酶；
E.C.1.11.1.2NADPH过氧化物酶；
E.C.1.11.1.3脂肪酸过氧化物酶；
E.C.1.11.1.5细胞色素c过氧化物酶；
E.C.1.11.1.6过氧化氢酶；
E.C.1.11.1.7过氧化物酶；
E.C.1.11.1.8碘化物过氧化物酶；
E.C.1.11.1.9谷胱甘肽过氧化物酶；
E.C.1.11.1.10氯化物过氧化物酶；
E.C.1.11.1.11L-抗坏血酸过氧化物酶；
E.C.1.11.1.12磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶；
E.C.1.11.1.13锰过氧化物酶；
E.C.1.11.1.14木质素过氧化物酶；
E.C.1.11.1.15过氧化物氧还蛋白；
E.C.1.11.1.16通用过氧化物酶；
E.C.1.11.1.B2氯化物过氧化物酶；
E.C.1.11.1.B6碘化物过氧化物酶；
E.C.1.11.1.B7溴化物过氧化物酶；
E.C.1.11.1.B8碘化物过氧化物酶：
EC编号和名称可以发现于例如www.brenda-enzymes.org。
在一方面，过氧化物酶是NADH过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是NADPH过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是脂肪酸过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是细胞色素c过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是过氧化氢酶。在另一方面，过氧化物酶是过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是碘化物过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是谷胱甘肽过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是氯化物过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是L-抗坏血酸过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是锰过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是木质素过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是过氧化物氧还蛋白。在另一方面，过氧化物酶是通用过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是氯化物过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是碘化物过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是溴化物过氧化物酶。在另一方面，过氧化物酶是碘化物过氧化物酶。
在优选的实施例中，过氧化物酶是E.C.1.11.1.7过氧化物酶。
过氧化物酶的实例包括但不限于：橙色嗜热子囊菌过氧化物酶(本文的SEQ IDNO:1)和编码橙色嗜热子囊菌，嗜热链球菌过氧化物酶(本文的SEQ ID NO:2)的cDNA序列和编码嗜热链球菌过氧化物酶的cDNA序列，以及灰盖鬼伞过氧化物酶(Baunsgaard等人,1993,Amino acid sequence of Coprinus macrorhizus peroxidase and cDNA sequenceencoding Coprinus cinereus peroxidase.A new family of fungal peroxidases[长根鬼伞过氧化物酶的氨基酸序列和编码灰盖鬼伞过氧化物酶的cDNA序列，一种新真菌过氧化物酶家族],Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]213(1):605-611(登录号P28314)或本文的SEQ ID NO:3)；辣根过氧化物酶(Fujiyama等人,1988,Structure of the horseradishperoxidase isozyme C genes[辣根过氧化物酶同工酶C基因的结构],Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]173(3):681-687(登录号P15232))；过氧化物氧还蛋白(Singh和Shichi,1998,A novel glutathione peroxidase in bovine eye.Sequence analysis,mRNAlevel,and translation[牛眼中的一种新颖谷胱甘肽过氧化物酶，序列分析、mRNA水平和翻译],J.Biol.Chem.[生物化学杂志]273(40):26171-26178(登录号O77834))；乳过氧化物酶(Dull等人,1990,Molecular cloning of cDNAs encoding bovine and humanlactoperoxidase[编码牛和人乳过氧化物酶的cDNA的分子克隆],DNA Cell Biol.[DNA与细胞生物学]9(7):499-509(登录号P80025))；嗜酸性粒细胞过氧化物酶(Fornhem等人,1996,Isolation and characterization of porcine cationic eosinophilgranuleproteins[猪阳离子嗜酸性粒细胞颗粒蛋白的分离与表征],Int.Arch.Allergy Immunol.[过敏与免疫学国际档案]110(2):132-142(登录号P80550))；通用过氧化物酶(Ruiz-Duenas等人,1999,Molecular characterization of a novel peroxidase isolatedfrom the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii[一种分离自木质素分解真菌杏鲍菇的新颖过氧化物酶的分子表征],Mol.Microbiol.[分子微生物学]31(1):223-235(登录号O94753))；芜菁过氧化物酶(Mazza和Welinder,1980,Covalent structure of turnipperoxidase 7.Cyanogen bromide fragments,complete structure and comparison tohorseradish peroxidase C[芜菁过氧化物酶7的共价结构，溴化氰片段、完整结构及与辣根过氧化物酶C的比较],Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]108(2):481-489(登录号P00434))；髓过氧化物酶(Morishita等人,1987,Chromosomal gene structure of humanmyeloperoxidase and regulation of its expression by granulocyte colony-stimulating factor[人类髓过氧化物酶的染色体基因结构及由粒细胞集落刺激因子调控其表达],J.Biol.Chem.[生物化学杂志]262(31):15208-15213(登录号P05164))；过氧蛋白(peroxidasin)和过氧蛋白同系物(Horikoshi等人,1999,Isolation of differentiallyexpressed cDNAs from p53-dependent apoptotic cells:activation of the humanhomologue of the Drosophila peroxidasin gene[从p53依赖性凋亡细胞中分离差异表达的cDNA：果蝇过氧蛋白基因的人类同系物的激活],Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理研究通讯]261(3):864-869(登录号Q92626))；木质素过氧化物酶(Tien和Tu,1987,Cloning and sequencing of a cDNA for a ligninase from Phanerochaetechrysosporium[来自黄孢原毛平革菌的木质素酶的cDNA克隆与测序],Nature[自然]326(6112):520-523(登录号P06181))；锰过氧化物酶(Orth等人,1994,Characterization ofa cDNA encoding a manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium:genomic organization of lignin and manganese peroxidase-encoding genes[编码来自黄孢原毛平革菌的锰过氧化物酶的cDNA的表征：木质素和锰过氧化物酶编码基因的基因组组织],Gene[基因]148(1):161-165(登录号P78733))；α-双加氧酶、双氧化酶、过氧蛋白、无脊椎动物细胞黏附蛋白、短peroxidockerin、乳过氧化物酶、髓过氧化物酶、非哺乳动物脊椎动物过氧化物酶、过氧化氢酶、过氧化氢酶-脂肪氧合酶融合、二血红素细胞色素c过氧化物酶、甲胺利用蛋白、DyP型过氧化物酶、卤代过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶过氧化物酶、混合抗坏血酸-细胞色素c过氧化物酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、通用过氧化物酶、其他II类过氧化物酶、III类过氧化物酶、烷基羟基过氧化物酶(alkylhydroperoxidase)D、其他烷基羟基过氧化物酶、无血红素、无金属卤代过氧化物酶、无血红素钒卤代过氧化物酶、锰过氧化氢酶、NADH过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化酶、半胱氨酸过氧化物酶、硫氧还蛋白依赖型巯基过氧化物酶、和AhpE样过氧化物氧还蛋白(Passard等人,2007,Phytochemistry[植物化学]68:1605-1611)。
过氧化物酶活性可以从任何属的微生物获得。在一方面，获得自给定来源的多肽是细胞外分泌的。
过氧化物酶活性可以是细菌多肽。例如，多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，如具有过氧化物酶活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Geobacillus)、或大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如具有过氧化物酶活性的大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、或脲原体属(Ureaplasma)多肽。
在实施例中，过氧化物酶源自以下菌株：嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
在另一个实施例中，过氧化物酶源自以下菌株：类马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)、或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)。
在另一方面，过氧化物酶源自以下菌株：不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)。
过氧化物酶活性还可是真菌多肽，并且更优选是酵母多肽，如具有过氧化物酶活性的源自以下菌株的多肽：假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属；或更优选地丝状真菌多肽，如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)。
在另一方面，过氧化物酶源自以下菌株：卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)。
在另一方面，过氧化物酶源自以下菌株：解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、成层梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)。
在另一方面，过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
在另一方面，过氧化物酶源自嗜热子囊菌属的菌株，如橙色嗜热子囊菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:1所示的过氧化物酶。在实施例中，过氧化物酶与本文的SEQ ID NO:1具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。在实施例中，过氧化物酶与本文的SEQ ID NO:1的多肽的氨基酸20至717具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。
在另一方面，过氧化物酶源自嗜热链球菌属的菌株，如嗜热链球菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:2所示的过氧化物酶。在实施例中，过氧化物酶与本文的SEQ ID NO:2具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。
在另一方面，过氧化物酶源自鬼伞属的菌株，如灰盖鬼伞过氧化物酶，如本文的SEQ ID NO:3所示的过氧化物酶。在实施例中，过氧化物酶与本文的SEQ ID NO:3具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。在实施例中，过氧化物酶与本文的SEQ ID NO:3的多肽的氨基酸23至351具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。
用来分离或克隆编码具有过氧化物酶活性的多肽的多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide toMethods and Application[PCR：方法和应用指南],Academic Press[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序，例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。
VIII.酶组合物
本发明还涉及包含本发明的过氧化物酶的组合物。优选地，这些组合物富含本发明的过氧化物酶。术语“富含”表示组合物的活性已增加，例如富集因子为至少1.1，例如至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少2.0、至少3.0、至少4.0、至少5.0、至少10。
在实施例中，组合物包含本发明的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种过氧化物酶。
任何过氧化物酶可被用于本发明的组合物(例如，过氧化物酶组合物)。在实施例中，过氧化物酶是选自以下的过氧化物酶或过氧化物分解酶：E.C.1.11.1.1NADH过氧化物酶；E.C.1.11.1.2NADPH过氧化物酶；E.C.1.11.1.3脂肪酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.5细胞色素c过氧化物酶；E.C.1.11.1.5；E.C.1.11.1.6过氧化氢酶；E.C.1.11.1.7过氧化物酶；E.C.1.11.1.8碘化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.9谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.10氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.11L-抗坏血酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.12磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.13锰过氧化物酶；E.C.1.11.1.14木质素过氧化物酶；E.C.1.11.1.15过氧化物氧还蛋白；E.C.1.11.1.16通用过氧化物酶；E.C.1.11.1.B2氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B6碘化物过氧化物酶(含有钒的)；E.C.1.11.1.B7溴化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B8碘化物过氧化物酶。在实施例中，过氧化物酶源自微生物，例如真菌生物，例如酵母或丝状真菌，或细菌；或植物。在实施例中，过氧化物酶选自：(i)源自嗜热子囊菌属的菌株的过氧化物酶，如橙色嗜热子囊菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:1所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:1具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；(ii)源自嗜热链球菌属的菌株的过氧化物酶，如嗜热链球菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:2所示的过氧化物酶，或与本文的SEQID NO:2具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；或(iii)源自鬼伞属的菌株的过氧化物酶，如灰盖鬼伞菌株，如本文的SEQ ID NO:3所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:3具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶。
这些组合物可以进一步包含多种酶活性，如一种或多种(例如，几种)选自下组的酶，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。在实施例中，组合物包含过氧化物酶和至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种额外的酶活性。在实施例中，组合物包含至少两种过氧化物酶和至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种额外的酶活性。在实施例中，组合物包含至少三种过氧化物酶和至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种额外的酶活性。在实施例中，组合物包含至少四种过氧化物酶和至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种额外的酶活性。
在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶和葡糖淀粉酶。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶和源自埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的葡糖淀粉酶(例如SEQ ID NO:4)或其变体。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶和源自粘褶菌属(Gloeophyllum)，如篱边粘褶菌(G.sepiarium)(例如SEQ ID NO:5)或密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)(例如SEQ ID NO:6)的葡糖淀粉酶或其变体。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶并且葡糖淀粉酶源自自密孔菌属(Pycnoporus)的菌株，特别是如描述于WO 2011/066576中的密孔菌属的菌株(其中的SEQ ID NO:2、4或6)，包括具有本文的SEQ ID NO:7的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)葡糖淀粉酶或其变体。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶和源自栓菌属(Triametes)的葡糖淀粉酶(如具有SEQ IDNO:8瓣环栓菌(Triametes cingulate)葡糖淀粉酶)或其变体。
在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶、葡糖淀粉酶以及α-淀粉酶。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶、葡糖淀粉酶以及源自根毛霉属，优选微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)的菌株，如具有接头(例如，来自黑曲霉)和淀粉结合域(例如，来自黑曲霉)的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体的α-淀粉酶。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及纤维素分解酶组合物。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及纤维素分解酶组合物，其中该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶和蛋白酶。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶和海藻糖酶。蛋白酶可源自橙色嗜热子囊菌。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、纤维素分解酶组合物和蛋白酶。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、纤维素分解酶组合物、蛋白酶和海藻糖酶。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶、葡糖淀粉酶(例如源自埃默森篮状菌、篱边粘褶菌或密粘褶菌的葡糖淀粉酶)、α-淀粉酶(例如源自微小根毛霉的，特别是具有接头和淀粉结合域(特别是源自黑曲霉)的，特别是具有如下取代的：G128D+D143N(使用SEQ ID NO:9进行编号))；源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，和蛋白酶(例如源自橙色嗜热子囊菌或大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus))。在实施例中，组合物包含本发明的过氧化物酶、葡糖淀粉酶(例如源自埃默森篮状菌、篱边粘褶菌或密粘褶菌的葡糖淀粉酶)、α-淀粉酶(例如源自微小根毛霉的，特别是具有接头和淀粉结合域(特别是源自黑曲霉)的，特别是具有如下取代的：G128D+D143N(使用SEQ ID NO:9进行编号))；源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，和蛋白酶(例如源自橙色嗜热子囊菌或大型亚灰树花菌)，和海藻糖酶。
任何海藻糖酶均可在本发明的组合物和方法中使用。在实施例中，海藻糖酶源自篮状菌属的菌株，如绳状篮状菌(Talaromyces funiculosus)的菌株，如本文的SEQ ID NO:28中所示的海藻糖酶，或与本文的SEQ ID NO:28具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的海藻糖酶，或雷塞氏篮状菌(Talaromyces leycettanus)的菌株，如本文的SEQ ID NO:29中所示的海藻糖酶，或与本文的SEQ ID NO:29具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的海藻糖酶。
可以根据本领域中已知的方法来制备组合物，并且组合物可以处于液体或干组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法将组合物稳定化。在实施例中，组合物包含一种或多种如本文披露的配制剂，优选一种或多种选自由以下组成的列表的化合物：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、高岭土和纤维素。
在实施例中，组合物包含一种或多种选自由以下组成的列表的组分：维生素、矿物质和氨基酸。
下面给出了本发明的组合物的优选的用途的实例。组合物的剂量以及使用组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。IX.用于生产发酵产物的方法
本发明还涉及使用发酵生物从含淀粉材料生产发酵产物的方法，其中在糖化和/或发酵之前和/或期间添加过氧化物酶或包含过氧化物酶的酶组合物。
由含经未经糊化的淀粉的材料生产发酵产物的工艺
在一方面，本发明涉及在含淀粉材料不糊化(即，不蒸煮)的情况下从含淀粉材料生产发酵产物的方法(通常被称为“生淀粉水解”方法)，其中添加了过氧化物酶。可在不使包含含淀粉材料以及水的水性浆料液化的情况下生产发酵产物如乙醇。在一个实施例中，本发明的方法包括：在低于初始糊化温度下、优选地在α-淀粉酶和/或产碳水化合物源的酶的存在下将(例如碾磨的)含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)糖化，以产生可以通过适合的发酵生物发酵成发酵产物的多种糖。在此实施例中，所希望的发酵产物例如乙醇是从未经糊化的(即，未蒸煮)，优选地经碾磨的谷粒如玉米中产生的。
因此，在一方面，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括使用产碳水化合物源的酶和发酵生物，在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度处，在本发明的变体蛋白酶的存在下将含淀粉材料同时糖化和发酵。糖化和发酵还可以是分开的。因而，在另一方面，本发明涉及生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
(b)在低于初始糊化温度的温度处使用产碳水化合物源的酶(例如葡糖淀粉酶)糖化含淀粉材料；和
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中至少使用葡糖淀粉酶和本发明的过氧化物酶或过氧化物酶组合物进行步骤(b)和/或(c)。在实施例中，将所述过氧化物酶或过氧化物酶组合物以足以增强酵母生长和/或生产力的浓度添加。注意，有意在此生淀粉过程中省略了步骤(a)，以使生淀粉过程的糖化步骤(b)和发酵步骤(c)相当于如下所述的常规过程的糖化步骤(b)和发酵步骤(c)，常规过程包括液化步骤(a)。
在实施例中，在糖化步骤(b)期间添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。优选地，在糖化的第一分钟、最初的五分钟、最初的10分钟、最初的15分钟、最初的20分钟、最初的25分钟、最初的30分钟、最初的45分钟、第一小时、最初的90分钟、或最初的2小时内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。在实施例中，在糖化的第一小时内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。在实施例中，在糖化90分钟内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。在实施例中，在发酵步骤(c)期间添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。优选地，在发酵的第一分钟、最初的五分钟、最初的10分钟、最初的15分钟、最初的20分钟、最初的25分钟、最初的30分钟、最初的45分钟、第一小时、最初的90分钟、最初的2小时、最初的3小时、最初的4小时、最初的5小时、或最初的6小时内添加过氧化物酶。
在一个实施例中，在步骤(b)中还添加α淀粉酶，特别是真菌α淀粉酶。步骤(b)和(c)可以同时进行。在实施例中，在同时糖化和发酵(SSF)期间添加过氧化物酶。优选地，在同时糖化和发酵的第一分钟、最初的五分钟、最初的10分钟、最初的15分钟、最初的20分钟、最初的25分钟、最初的30分钟、最初的45分钟、第一小时、最初的90分钟、最初的2小时、最初的3小时、最初的4小时、最初的5小时、或最初的6小时内添加过氧化物酶。
在实施例中，该方法进一步包括在适于进一步用于发酵的条件下扩培发酵生物。在实施例中，发酵生物是酵母，并且在酵母扩培期间添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。优选地，在酵母扩培的第一分钟、最初的五分钟、最初的10分钟、最初的15分钟、最初的20分钟、最初的25分钟、最初的30分钟、最初的45分钟、第一小时、最初的90分钟、最初的2小时、最初的3小时、最初的4小时、最初的5小时、或最初的6小时酵母内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。
可将过氧化物酶或过氧化物酶组合物在糖化、发酵、同时糖化和发酵、或酵母扩培期间以单次推注，分开剂量添加，或者在糖化、发酵、同时糖化和发酵、或酵母扩培的第一个小时、最初的90分钟、最初的2小时、最初的3小时、最初的4小时、最初的5小时、或最初的6小时内随时间滴定。
与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的扩培的酵母相比，在酵母扩培期间过氧化物酶或过氧化物酶组合物向酵母扩培罐的添加增加了扩培期间酵母的生长和/或生产力组合物。在过氧化物酶或过氧化物酶组合物存在下扩培最初的一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、或24小时内的扩培酵母的生长和/或生产力增加了至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少12％、至少15％、至少25％、至少30％、至少33％、至少40％、至少50％、至少66％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、或至少100倍(与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的扩培相同时间段的酵母的生长和/或生产力相比)。在实施例中，与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的在酵母扩培最初的24小时内的酵母生长相比，在酵母扩培最初的24小时内的酵母生长增加了10％至50％。
与当在无过氧化物酶或过氧化物酶组合物下进行酵母扩培、糖化、发酵或同时糖化和发酵时发酵最初的24小时内产生的乙醇量相比，过氧化物酶或过氧化物酶组合物向酵母扩培罐的添加增加了在酵母扩培、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间在发酵最初的24小时内产生的乙醇量。在一些实施例中，在酵母扩培、糖化、发酵、或同时糖化和发酵期间，在添加过氧化物酶后，发酵最初的一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、或24小时内产生乙醇的速率增加了至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少12％、至少15％、至少25％、至少30％、至少33％、至少40％、至少50％、至少66％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、或至少5倍(与不添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物的在相同时间段内产生乙醇的速率相比)。在优选的实施例中，与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的发酵最初的24小时内生产的乙醇量相比，在发酵最初的24小时内生产乙醇的速率增加了10％至50％。
如与当在无过氧化物酶或过氧化物酶组合物下进行酵母扩培、糖化、发酵或同时糖化和发酵时发酵最初的24小时内的乳酸滴度相比，过氧化物酶或过氧化物酶组合物向酵母扩培罐的添加降低了在发酵最初的24小时内酵母扩培、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间的乳酸滴度。在一些实施例中，发酵第一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、或24小时内的乳酸滴度降低了至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少12％、至少15％、至少25％、至少30％、至少33％、至少40％、至少50％、至少66％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％(与不添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物的发酵相同时间内的乳酸滴度相比)。在优选的实施例中，与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的发酵最初的24小时内的乳酸滴度相比，在发酵最初的24小时内的乳酸滴度降低了10％至50％。
与不添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物的发酵结束时的乳酸的绝对滴度相比，酵母扩培、糖化、发酵、或同时糖化和发酵期间过氧化物酶或过氧化物酶组合物的添加降低了发酵结束时的乳酸的绝对滴度。与不添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物的发酵结束时的乳酸绝对滴度相比，酵母扩培、糖化、发酵、或同时糖化和发酵期间过氧化物酶的添加使发酵结束时的乳酸绝对滴度降低至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少12％、至少15％、至少25％、至少30％、至少33％、至少40％、至少50％、至少66％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％。在优选的实施例中，与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的发酵结束时的乳酸绝对滴度相比，在发酵结束时的乳酸绝对滴度降低了10％至50％。
任何酵母菌株，如特别是本文所述的酵母菌株，例如在“发酵生物”的标题下，可作为发酵生物在从含淀粉材料生产发酵产物的方法中使用。在实施例中，酵母属于选自以下的属：酵母属、红酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、红冬孢酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属、油脂酵母属、隐球菌属、或德克拉酵母属。在实施例中，酵母是酿酒酵母、巴斯德酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、尖孢镰孢、或其任何组合。在实施例中，酵母是酿酒酵母。
任何过氧化物酶可在从含淀粉材料生产发酵产物的方法中使用。在实施例中，过氧化物酶是选自以下的过氧化物酶或过氧化物分解酶：E.C.1.11.1.1NADH过氧化物酶；E.C.1.11.1.2NADPH过氧化物酶；E.C.1.11.1.3脂肪酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.5细胞色素c过氧化物酶；E.C.1.11.1.5；E.C.1.11.1.6过氧化氢酶；E.C.1.11.1.7过氧化物酶；E.C.1.11.1.8碘化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.9谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.10氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.11L-抗坏血酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.12磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.13锰过氧化物酶；E.C.1.11.1.14木质素过氧化物酶；E.C.1.11.1.15过氧化物氧还蛋白；E.C.1.11.1.16通用过氧化物酶；E.C.1.11.1.B2氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B6碘化物过氧化物酶(含有钒的)；E.C.1.11.1.B7溴化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B8碘化物过氧化物酶。在实施例中，过氧化物酶源自微生物，例如真菌生物，例如酵母或丝状真菌，或细菌；或植物。在实施例中，过氧化物酶选自：(i)源自嗜热子囊菌属的菌株的过氧化物酶，如橙色嗜热子囊菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:1所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:1具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；(ii)源自嗜热链球菌属的菌株的过氧化物酶，如嗜热链球菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:2所示的过氧化物酶，或与本文的SEQID NO:2具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；或(iii)源自鬼伞属的菌株的过氧化物酶，如灰盖鬼伞菌株，如本文的SEQ ID NO:3所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:3具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶。
由含经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法
在一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的方法，这些方法包括：液化步骤，以及依序地或同时地进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化以形成液化的醪；
(b)使用产碳水化合物源的酶将该液化的醪糖化以生产可发酵糖；和
(c)在适于生产该发酵产物的条件下，使用发酵生物将该糖发酵；
其中过氧化物酶或过氧化物酶组合物在糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)之前或期间添加。在实施例中，将所述过氧化物酶或过氧化物酶组合物以足以增强酵母生长和/或生产力的浓度添加。
在实施例中，在糖化步骤(b)之前或期间添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。优选地，在糖化的第一分钟、最初的五分钟、最初的10分钟、最初的15分钟、最初的20分钟、最初的25分钟、最初的30分钟、最初的45分钟、第一小时、最初的90分钟、或最初的2小时内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。在实施例中，在发酵步骤(c)之前或期间添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。优选地，在发酵的第一分钟、最初的五分钟、最初的10分钟、最初的15分钟、最初的20分钟、最初的25分钟、最初的30分钟、最初的45分钟、或第一小时、最初的90分钟、最初的2小时、最初的3小时、最初的4小时、最初的5小时、或最初的6小时内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。
在一个实施例中，在步骤(b)中还添加α淀粉酶，特别是真菌α淀粉酶。步骤(b)和(c)可以同时进行。在实施例中，在同时糖化和发酵(SSF)期间添加过氧化物酶。优选地，在同时糖化和发酵的第一分钟、最初的五分钟、最初的10分钟、最初的15分钟、最初的20分钟、最初的25分钟、最初的30分钟、最初的45分钟、或第一小时、最初的90分钟、最初的2小时、最初的3小时、最初的4小时、最初的5小时、或最初的6小时内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。
在实施例中，该方法进一步包括在适于进一步用于发酵的条件下扩培发酵生物。在实施例中，发酵生物是酵母，并且在酵母扩培之前或期间添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。优选地，在酵母扩培的第一分钟、最初的五分钟、最初的10分钟、最初的15分钟、最初的20分钟、最初的25分钟、最初的30分钟、最初的45分钟、或第一小时、最初的90分钟、最初的2小时、最初的3小时、最初的4小时、最初的5小时、或最初的6小时酵母内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。在实施例中，在酵母扩培最初的4小时内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。在实施例中，在酵母扩培最初的6小时内添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物。
可将过氧化物酶或过氧化物酶组合物在糖化、发酵、同时糖化和发酵、或酵母扩培期间以单次推注，分开剂量添加，或者在糖化、发酵、同时糖化和发酵、或酵母扩培的第一个小时、最初的90分钟、最初的2小时、最初的3小时、最初的4小时、最初的5小时、或最初的6小时内随时间滴定。
与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的扩培的酵母相比，在酵母扩培期间过氧化物酶或过氧化物酶组合物向酵母扩培罐的添加增加了扩培期间酵母的生长和/或生产力组合物。在过氧化物酶或过氧化物酶组合物存在下扩培最初的一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、或24小时内的扩培酵母的生长和/或生产力增加了至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少12％、至少15％、至少25％、至少30％、至少33％、至少40％、至少50％、至少66％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、或至少100倍(与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的扩培相同时间段的酵母的生长和/或生产力相比)。在实施例中，与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的在酵母扩培最初的24小时内的酵母生长相比，在酵母扩培最初的24小时内的酵母生长增加了10％至50％。
与当在无过氧化物酶或过氧化物酶组合物下进行酵母扩培、糖化、发酵或同时糖化和发酵时发酵最初的24小时内产生的乙醇量相比，过氧化物酶或过氧化物酶组合物向酵母扩培罐的添加增加了在酵母扩培、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间在发酵最初的24小时内产生的乙醇量。在一些实施例中，在酵母扩培、糖化、发酵、或同时糖化和发酵期间，在添加过氧化物酶后，发酵最初的一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、或24小时内产生乙醇的量增加了至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少12％、至少15％、至少25％、至少30％、至少33％、至少40％、至少50％、至少66％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、或至少5倍(与不添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物的在相同时间段内生产的乙醇量相比)。在优选的实施例中，与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的发酵最初的24小时内生产的乙醇量相比，在发酵最初的24小时内生产乙醇的速率增加了10％至50％。
如与当在无过氧化物酶或过氧化物酶组合物下进行酵母扩培、糖化、发酵或同时糖化和发酵时发酵最初的24小时内的乳酸滴度相比，过氧化物酶或过氧化物酶组合物向酵母扩培罐的添加降低了在发酵最初的24小时内酵母扩培、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间的乳酸滴度。在一些实施例中，发酵第一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、或24小时内的乳酸滴度降低了至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少12％、至少15％、至少25％、至少30％、至少33％、至少40％、至少50％、至少66％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％(与不添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物的发酵相同时间内的乳酸滴度相比)。在优选的实施例中，与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的发酵最初的24小时内的乳酸滴度相比，在发酵最初的24小时内的乳酸滴度降低了10％至50％。
与不添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物的发酵结束时的乳酸的绝对滴度相比，酵母扩培、糖化、发酵、或同时糖化和发酵期间过氧化物酶或过氧化物酶组合物的添加降低了发酵结束时的乳酸的绝对滴度。与不添加过氧化物酶或过氧化物酶组合物的发酵结束时的乳酸绝对滴度相比，酵母扩培、糖化、发酵、或同时糖化和发酵期间过氧化物酶或过氧化物酶组合物的添加使发酵结束时的乳酸绝对滴度降低至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少12％、至少15％、至少25％、至少30％、至少33％、至少40％、至少50％、至少66％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％。在优选的实施例中，与不具有过氧化物酶或过氧化物酶组合物的发酵结束时的乳酸绝对滴度相比，在发酵结束时的乳酸绝对滴度降低了10％至50％。
任何酵母菌株，如特别是本文所述的酵母菌株，例如在“发酵生物”的标题下，可作为发酵生物在从含淀粉材料生产发酵产物的方法中使用。在实施例中，酵母属于选自以下的属：酵母属、红酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、红冬孢酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属、油脂酵母属、隐球菌属、或德克拉酵母属。在实施例中，酵母是酿酒酵母、巴斯德酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、尖孢镰孢、或其任何组合。在实施例中，酵母是酿酒酵母。
任何过氧化物酶可在从含淀粉材料生产发酵产物的方法中使用。在实施例中，过氧化物酶是选自以下的过氧化物酶或过氧化物分解酶：E.C.1.11.1.1NADH过氧化物酶；E.C.1.11.1.2NADPH过氧化物酶；E.C.1.11.1.3脂肪酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.5细胞色素c过氧化物酶；E.C.1.11.1.5；E.C.1.11.1.6过氧化氢酶；E.C.1.11.1.7过氧化物酶；E.C.1.11.1.8碘化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.9谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.10氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.11L-抗坏血酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.12磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.13锰过氧化物酶；E.C.1.11.1.14木质素过氧化物酶；E.C.1.11.1.15过氧化物氧还蛋白；E.C.1.11.1.16通用过氧化物酶；E.C.1.11.1.B2氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B6碘化物过氧化物酶(含有钒的)；E.C.1.11.1.B7溴化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B8碘化物过氧化物酶。在实施例中，过氧化物酶源自微生物，例如真菌生物，例如酵母或丝状真菌，或细菌；或植物。在实施例中，过氧化物酶选自：(i)源自嗜热子囊菌属的菌株的过氧化物酶，如橙色嗜热子囊菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:1所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:1具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；(ii)源自嗜热链球菌属的菌株的过氧化物酶，如嗜热链球菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:2所示的过氧化物酶，或与本文的SEQID NO:2具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；或(iii)源自鬼伞属的菌株的过氧化物酶，如灰盖鬼伞菌株，如本文的SEQ ID NO:3所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:3具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶。
将浆料加热至高于糊化温度并且可以添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀化)。在实施例中，浆料在步骤(a)中经受α-淀粉酶之前可以进行喷射蒸煮以进一步使所述浆料糊化。在实施例中，液化可以作为三步骤热浆料方法来执行。在pH 4-6，特别是在pH 4.5-5.5下，将浆料加热至60℃-95℃之间，优选70℃-90℃之间，如优选80℃-85℃之间，并且添加α-淀粉酶变体，任选地连同半纤维素酶、内切葡聚糖酶、蛋白酶、产碳水化合物源的酶(如葡糖淀粉酶)、磷脂酶、植酸酶、和/或普鲁兰酶，以开始液化(稀化)。通常在pH 4-6、特别是在从4.5至5.5之间的pH下进行液化过程。可以使用本领域熟知的条件来进行糖化步骤(b)。例如，完全糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在30℃到65℃之间的温度处，典型地约60℃处进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(SSF过程)中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、特别是从40℃-70℃，典型地约60℃的温度处并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，在该方法中，糖化不存在保持阶段，意味着发酵生物(例如酵母)和酶可以一起添加。SSF可以典型地在从25℃至40℃、例如从28℃至35℃、例如从30℃至34℃、优选地约32℃的温度处执行。在实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。
含淀粉材料
根据本发明，可使用任何合适的含淀粉材料。通常基于期望的发酵产物(特别是乙醇)来选择起始材料。适用于本发明的方法的含淀粉起始材料的实例包括谷类、块茎或谷物。具体地，含淀粉材料可为玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、树薯(tapioca)、高粱、燕麦、水稻、豌豆、豆类、或甘薯、或它们的混合物。还考虑了糯型(waxytype)与非糯型(non-waxy type)的玉米与大麦。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是玉米。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是小麦。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是大麦。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是黑麦。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是买罗高粱。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是西米。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是木薯。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是树薯。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是高粱。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是水稻，
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是豌豆。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是豆类。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是甘薯。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是燕麦。
发酵产物
术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物的发酵方法或过程生产的产物。发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。发酵产物可以是，但不限于：醇(例如，阿拉伯糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇[丙二醇]、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)、环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)、烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)、以及一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；激素；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；聚酮化合物；和维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)。
在一方面，发酵产物是醇。术语“醇”涵盖含有一个或多个羟基部分的物质。醇可以是但不限于：正丁醇、异丁醇、乙醇、甲醇、阿拉伯糖醇、丁二醇、乙二醇、甘油、丙三醇、1,3-丙二醇、山梨醇、木糖醇。参见例如，Gong等人，1999，Ethanol生产from renewableresources[由可再生资源生产乙醇]，在Biochemical Engineering/Biotechnology[生化工程/生物技术进展]中，Scheper,T.,编辑，Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany[施普林格出版社柏林海德堡，德国]，65:207-241；Silveira和Jonas,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]59:400-408；Nigam和Singh,1995,Process Biochemistry[生物化学工艺]30(2):117-124；Ezeji等人,2003,WorldJournal of Microbiology and Biotechnology[世界微生物学和生物技术杂志]19(6):595-603。
在优选的实施例中，发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。在实施例中，发酵产物是乙醇。
在另一方面，发酵产物是烷烃。烷烃可以是非支链或支链烷烃。烷烃可以是但不限于：戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、或十二烷。
在另一方面，发酵产物是环烷烃。环烷烃可以是但不限于：环戊烷、环己烷、环庚烷或环辛烷。
在另一方面，发酵产物是烯烃。烯烃可以是非支链或支链烯烃。烯烃可以是但不限于：戊烯、己烯、庚烯或辛烯。
在另一方面，发酵产物是氨基酸。有机酸可以是但不限于：天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、或苏氨酸。参见，例如Richard和Margaritis,2004,Biotechnology andBioengineering[生物技术和生物工程]87(4):501-515。
在另一方面，发酵产物是气体。气体可以是但不限于：甲烷、H2、CO2、或CO。参见，例如Kataoka等人，1997,Water Science and Technology[水科学与技术]36(6-7):41-47；以及Gunaseelan,1997,Biomass and Bioenergy[生物质与生物能源]13(1-2):83-114。
在另一方面，发酵产物是异戊二烯。
在另一方面，发酵产物是酮。术语“酮”涵盖含有一个或多个酮部分的物质。酮可以是但不限于：丙酮。
在另一方面，发酵产物是有机酸。有机酸可以是但不限于：乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸、或木糖酸。参见，例如Chen和Lee,1997,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]63-65:435-448。
在另一方面，发酵产物是聚酮化合物。
发酵生物
本文所述的发酵生物可以衍生自本领域技术人员已知的能够生产发酵产物(如乙醇)的任何宿主细胞。如本文所用的，菌株的“衍生物”衍生自参照菌株，如通过诱变、重组DNA技术、交配、细胞融合、或在酵母菌株之间的胞导。本领域的技术人员应该理解，遗传改变(包括本文示例的代谢修饰)可以参考适合的宿主生物及其相应的代谢反应或用于希望的遗传材料(如希望的代谢途径的基因)的适合的来源生物加以描述。然而，考虑到多种多样的生物的全基因组测序以及基因组学领域中高水平的技能，本领域的技术人员可以将本文提供的教导和指导应用于其他生物中。例如，可以通过掺入相同的或来自不同于参照物种的物种的类似编码核酸而容易地将本文示例的代谢改变应用于其他物种中。
发酵生物的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；毕赤酵母属的菌株，特别是树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773，或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)；假丝酵母属的菌株，特别是阿拉伯糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、迪丹斯假丝酵母(Candidadiddensii)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、萨纳瑞西斯假丝酵母(Candidasonorensis)、假热带假丝酵母(Candida tropicalis)、或产朊假丝酵母(Candidautilis)。其他发酵生物包括汉逊酵母属的菌株，特别是异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；克鲁维酵母属的菌株，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)；和裂殖酵母属的菌株，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
在实施例中，发酵生物是C6糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。
在实施例中，发酵生物是C5糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。
用于制备本文所述的重组细胞的宿主细胞可以来自任何适合的宿主，如酵母菌株，包括但不限于，酵母属、红酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、红冬孢酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属、油脂酵母属、隐球菌属、或德克拉酵母属菌种细胞。具体地，考虑了酵母属宿主细胞，如酿酒酵母、贝酵母或卡尔酵母细胞。优选地，该酵母细胞是酿酒酵母细胞。适合的细胞可以例如，衍生自可商购的菌株和多倍体或非整倍体工业菌株，包括但不限于，来自SuperstartTM、
Figure BDA0002800891120000681
C5 FUELTM、
Figure BDA0002800891120000683
等(莱蒙特集团(Lallemand))；RED STAR和ETHANOL
Figure BDA0002800891120000682
(弗曼迪斯/乐斯福集团(Fermentis/Lesaffre))；FALI(英联马利集团(AB Mauri))；Baker's Best Yeast、Baker's Compressed Yeast等(弗雷希曼酵母(Fleishmann's Yeast))；BIOFERM AFT、XP、CF和XR(北美生物产品公司(North American Bioproducts Corp.))；Turbo Yeast(格特链AB(Gert Strand AB))；和
Figure BDA0002800891120000684
(帝斯曼食品配料部(DSM Specialties))的那些。其他可用的酵母菌株可获自生物保藏，例如美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)或德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，如例如BY4741(例如ATCC201388)；Y108-1(ATCC PTA.10567)和NRRL YB-1952(美国农业研究菌种保藏中心(ARSCulture Collection))。还有其他适合作为宿主细胞的酿酒酵母菌株DBY746、[Alpha][Eta]22、S150-2B、GPY55-15Ba、CEN.PK、USM21、TMB3500、TMB3400、VTT-A-63015、VTT-A-85068、VTT-c-79093及其衍生物以及酵母属菌种1400、424A(LNH-ST)、259A(LNH-ST)及其衍生物。在一个实施例中，重组细胞是菌株酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州61604农业研究服务菌种保藏中心(NRRL)登录号NRRL Y-50973下保藏)的衍生物。
发酵生物可以是酵母属菌株，例如是使用美国专利号8,257,959-BB中所描述和涉及的方法产生的酿酒酵母菌株。
菌株也可以是酿酒酵母菌株NMI V14/004037(参见，WO 2015/143324和WO 2015/143317，各自通过引用并入本文)，菌株号V15/004035、V15/004036和V15/004037(参见，WO2016/153924，通过引用并入本文)，菌株号V15/001459、V15/001460、V15/001461(参见，WO2016/138437，通过引用并入本文)，或描述于PCT/US 2016/061887(通过引用并入本文)中的任何菌株的衍生物。
已经产生了根据本发明的发酵生物，以通过降低酶的成本来提高发酵产率并改善工艺经济性，因为提高方法性能所需的部分或全部必需酶是由发酵生物产生的。
本文所述的发酵生物可以利用以下表达载体，这些表达载体包含一个或多个(例如，两个、几个)异源基因的编码序列，这些编码序列被连接至一个或多个控制序列，这一个或多个控制序列指导在与这一个或多个控制序列相容的条件下在适合的细胞中的表达。可以在任何本文所述的细胞和方法中使用此类表达载体。本文所述的多核苷酸可以按多种方式操纵，以提供希望的多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
本发明的方面包含编码在糖化、发酵、和/或同时糖化和发酵中使用的酶的异源多核苷酸的发酵生物。合适的酶的实例包括但不限于：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。
在实施例中，发酵生物包含编码选自以下的酶的异源多核苷酸：α-淀粉酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、海藻糖酶、和其任何组合。在实施例中，发酵生物是酵母菌株，该酵母菌株包含编码选自以下的酶的异源多核苷酸：α-淀粉酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、海藻糖酶、和其任何组合。在实施例中，发酵生物是酵母属酵母菌株，该酵母菌属酵母菌株包含编码选自以下的酶的异源多核苷酸：α-淀粉酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、和其任何组合。在实施例中，发酵生物是酿酒酵母菌株，该酿酒酵母菌株包含编码选自以下的酶的异源多核苷酸：α-淀粉酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、海藻糖酶、和其任何组合。
在实施例中，发酵生物(例如酵母(例如酵母属菌株(如酿酒酵母菌株)))包含编码α-淀粉酶的异源多核苷酸。
在一个实施例中，细菌α-淀粉酶源自美国申请号62/514,636，2017年6月2日提交(代理人案号：14480-US-PRO，其披露内容通过援引以其全文并入本文)中所述的选自以下的α-淀粉酶：其中的SEQ ID NO:76的枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:82的枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:83的枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:84的枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、或其中的SEQ ID NO:85的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、其中的SEQID NO:89的Clostridium phytofermentansα-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:90的Clostridiumphytofermentansα-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:91的Clostridium phytofermentansα-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:92的Clostridium phytofermentansα-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:93的Clostridium phytofermentansα-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:94的Clostridiumphytofermentansα-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:10的热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)α-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:11的嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)α-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:97的嗜热裂孢菌α-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:98的Anaerocellumthermophilumα-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:99的Anaerocellum thermophilumα-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:100的Anaerocellum thermophilumα-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:101的除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)α-淀粉酶、或其中的SEQ ID NO:88的除虫链霉菌α-淀粉酶。
在一个实施例中，α-淀粉酶源自酵母α-淀粉酶，如美国申请号62/514,636，2017年6月2日提交(代理人案号：14480-US-PRO，其披露内容通过援引以其全文并入本文)中所述的选自以下的酵母α-淀粉酶：其中的SEQ ID NO:77的扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsisfibuligera)α-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:78的德巴利酵母属(Debaryomyces)occidentalisα-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:79的德巴利酵母属occidentalisα-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:80的Lipomyces kononenkoaeα-淀粉酶、其中的SEQ ID NO:81的Lipomyceskononenkoaeα-淀粉酶。
在一个实施例中，α-淀粉酶源自丝状真菌α-淀粉酶，如美国申请号62/514,636，2017年6月2日提交(代理人案号：14480-US-PRO，其披露内容通过援引以其全文并入本文)中所述的选自以下的丝状真菌α-淀粉酶：其中的SEQ ID NO:86的黑曲霉α-淀粉酶，其中的SEQ ID NO:87的黑曲霉α-淀粉酶。
考虑与本发明一起使用的另外的α-淀粉酶可以在WO2011/153516(将其内容并入本文)中找到。
编码适合的α-淀粉酶的另外的多核苷酸可以获得自任何属的微生物，包括在UniProtKB数据库(www.uniprot.org)内可容易获得的那些。
α-淀粉酶编码序列也可用于设计核酸探针以鉴定和克隆编码来自不同属或种的菌株的α-淀粉酶的DNA，如上文所述的。
还可以从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得编码α-淀粉酶的多核苷酸，如上文所述的。
用于分离或克隆编码α-淀粉酶的多核苷酸的技术在上文中描述。
在实施例中，发酵生物，例如酵母，例如酵母属菌株，如酿酒酵母菌株，包含编码葡糖淀粉酶的异源多核苷酸。
在实施例中，发酵生物，例如酵母，例如酵母属菌株，如酿酒酵母菌株，包含编码蛋白酶的异源多核苷酸。可用发酵生物表达的示例性蛋白酶，例如，酵母，例如酵母属菌株，如酿酒酵母菌株和本文所述的方法，包括但不限于美国申请号62/514,636，2017年6月2日提交(代理人案号：14480-US-PRO)(其披露内容通过援引以其全文并入本文)的表1中所示的蛋白酶，即其中的SEQ ID No:9-73中任意的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种(或与蛋白酶具有至少60％、至少65％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的蛋白酶的变体)。
可以将构建体或载体(或多个构建体或载体)引入细胞中，这样使得构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述；构建体或载体(或这些构建体或载体)包含一个或多个(例如，两个、几个)异源基因。
各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个(例如，两个、几个)合宜的限制位点以允许在此类位点插入或取代该多核苷酸。可替代地，可以通过将一种或多种多核苷酸或者包含该序列的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该一种或多种多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起该多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
表达载体可以含有任何适合的启动子序列，该启动子序列可被细胞识别以表达本文所述的基因。启动子序列含有转录控制序列，这些转录控制序列介导该多肽的表达。启动子可以是在选择的细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
本文所述的每种异源多核苷酸都可以被可操作地连接至对于该多核苷酸而言外源的启动子上。例如，在一个实施例中，编码己糖转运体的异源多核苷酸被可操作地连接至对于该多核苷酸而言外源的启动子上。这些启动子可以与所选的天然启动子相同或与其具有高度序列同一性(例如，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％)。
用于指导核酸构建体在酵母细胞中的转录的适合的启动子的实例包括但不限于获得自以下的基因的启动子：烯醇酶(例如，酿酒酵母烯醇酶或东方伊萨酵母烯醇酶(ENO1))、半乳糖激酶(例如，酿酒酵母半乳糖激酶或东方伊萨酵母半乳糖激酶(GAL1))、醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶或东方伊萨酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP))、磷酸甘油醛异构酶(例如，酿酒酵母磷酸甘油醛异构酶或东方伊萨酵母磷酸甘油醛异构酶(TPI))、金属硫蛋白(例如，酿酒酵母金属硫蛋白或东方伊萨酵母金属硫蛋白(CUP1))、3-磷酸甘油酸激酶(例如，酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶或东方伊萨酵母3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、PDC1、木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)、L-(+)-乳酸-细胞色素C氧化还原酶(CYB2)、翻译延长因子-1(TEF1)、翻译延长因子-2(TEF2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、和乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶(URA3)基因。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。
控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的适合的转录终止子序列。终止子序列被可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的3’-末端。可以使用在选择的酵母细胞中具有功能的任何终止子。终止子可以与所选的天然终止子相同或与其具有高度序列同一性(例如，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％)。
酵母宿主细胞的适合的终止子可以获得自以下的基因：烯醇酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母烯醇酶)、细胞色素C(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母细胞色素(CYC1))、甘油醛-3磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd))、PDC1、XR、XDH、转醛醇酶(TAL)、转酮醇酶(TKL)、核糖5-磷酸-酮醇异构酶(RKI)、CYB2、以及半乳糖基因家族(尤其是GAL10终止子)。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992,同上)描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例从以下获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是适合的前导子序列，其中转录时，该前导子序列是对由宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导子序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在选择的酵母细胞中具有功能的任何前导子序列。
酵母宿主细胞的适合的前导子获得自以下的基因：烯醇酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母烯醇酶(ENO-1))、3-磷酸甘油酸激酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母3-磷酸甘油酸激酶)、α-因子(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母α-因子)、以及醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶(ADH2/GAP))。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列；与多核苷酸3’末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号的序列。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何多腺苷酸化序列。对于酵母细胞有用的多腺苷酸化序列描述于以下文献：Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.[分子细胞生物学]15:5983-5990。
也可能令人希望的是添加调节序列，该调节序列允许相对于宿主细胞的生长而调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。
这些载体可以含有一个或多个(例如，两个、几个)允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。
这些载体可以含有一个或多个(例如，两个、几个)允许将该载体整合进宿主细胞的基因组中或在该细胞中独立于基因组而自主复制的元件。
对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。潜在整合位点包括本领域所描述的那些(例如，参见US2012/0135481)。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在酵母细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
可以将本文所述的多核苷酸的超过一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到酵母细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所述的元件以构建本文所述的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如Sambrook等人,1989,见上文)。
本领域已知的用于制备用于乙醇发酵的重组细胞的另外的程序和技术描述于例如WO 2016/045569中，将其内容通过引用特此并入。
发酵生物可以呈组合物的形式，该组合物包含发酵生物(例如，本文所述的酵母菌株)和天然存在和/或非天然存在的组分。
本文所述的发酵生物可以是任何活的形式，包括粉碎的、干燥的，包括活性干燥和速溶的、压缩的、膏状(液体)形式等。在一个实施例中，发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是干酵母，例如活性干酵母或速溶酵母。在一个实施例中，发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是粉碎酵母。在一个实施例中，发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是压缩酵母。在一个实施例中，发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是膏状酵母。
在一个实施例中是组合物，组合物包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和选自下组的一种或多种组分，该组由以下组成：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、以及抗氧化剂和其他加工助剂。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的表面活性剂。在一个实施例中，一种或多种表面活性剂是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、和/或非离子表面活性剂。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的乳化剂。在一个实施例中，乳化剂是山梨聚糖的脂肪酸酯。在一个实施例中，乳化剂选自下组：山梨聚糖单硬脂酸酯(SMS)、单双甘酯的柠檬酸酯、聚甘油酯、丙二醇的脂肪酸酯。
在一个实施例中，组合物包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和Olindronal SMS、Olindronal SK、或Olindronal SPL，包括欧洲专利号1,724,336(将其通过引用特此并入)中涉及的组合物。针对活性干酵母，这些产品可以从奥地利的布塞蒂公司(Bussetti)商购获得。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的树胶。在一个实施例中，树胶选自下组：槐树豆胶、瓜尔胶、黄芪胶、阿拉伯胶、黄原胶和阿拉伯树胶，具体地针对膏状、压缩和干酵母。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的溶胀剂。在一个实施例中，溶胀剂是甲基纤维素或羧甲基纤维素。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的抗氧化剂。在一个实施例中，抗氧化剂是丁羟茴醚(BHA)和/或丁羟甲苯(BHT)、或抗坏血酸(维生素C)，具体地针对活性干酵母。
发酵
基于例如植物材料的种类、可获得的可发酵糖、一种或多种发酵生物和/或所希望的发酵产物确定发酵条件。本领域的普通技术人员可以容易地确定适合的发酵条件。发酵可以在常规使用的条件下进行。优选的发酵过程是厌氧过程。
例如，发酵可以在高达75℃，例如40℃-70℃之间，如50℃-60℃之间的温度处进行。然而，还已知的是细菌具有低至室温左右(20℃左右)的显著较低的最适温度。适合的发酵生物的实例可以发现于上面的“发酵生物”部分中。
对于使用酵母生产乙醇，发酵可以持续24至96小时，特别是持续35至60小时。在实施例中，在20℃至40℃，优选26℃至34℃之间，特别是32℃左右的温度处进行发酵。在实施例中，pH是从pH3至6，优选pH 4至5左右。
发酵产物的回收
发酵或SSF之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以蒸馏浆料以提取所希望的发酵产物(例如，乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域熟知的其他方法来回收发酵产物。典型地，获得具有高达例如约96vol.％乙醇纯度的发酵产物，例如，乙醇。
因此，在一个实施例中，本发明的方法还包括蒸馏以获得发酵产物，例如，乙醇。发酵和蒸馏可以同时和/或分别/顺序进行；任选地，随后是用于进一步精制该发酵产物的一个或多个方法步骤。
蒸馏方法完成后，剩余材料被视为全酒糟。如本文所用，术语“全酒糟”包括在发酵产物例如乙醇的回收之后在蒸馏方法结束时保留的材料。任选地可以通过本领域已知的任何方法回收该发酵产物。
将全酒糟分离(脱水)为酒糟水和湿饼
在一个实施例中，通过一种或多种将酒糟水与湿饼分离的方法，将该全酒糟分离或分配成固相和液相。
将全酒糟分离为酒糟水和湿饼，以去除很大一部分的液体/水，可以使用任何适合的分离技术(包括离心、压榨和过滤)来实现。在优选的实施例中，通过离心进行分离/脱水。在工业中，优选的离心机是沉降式离心机，优选高速沉降式离心机。适合的离心机的一个实例是来自阿法拉伐公司(Alfa Laval)的NX 400陡锥系列，它是高性能沉降器。在另一个优选实施例中，使用其他常规分离设备(如板/框压滤机、带压滤机、螺旋压榨机、重力浓缩机和脱水机)或类似设备来进行分离。
酒糟水的加工
酒糟水是用于全酒糟离心的上清液的术语。典型地，酒糟水包含4％-6％的干固体(DS)(主要是蛋白质、可溶性纤维、细纤维、和细胞壁组分)，并且温度为约60℃-90℃。酒糟水流可以通过蒸发进行冷凝，以提供两种工艺流，包括：(i)蒸发器冷凝流，其包含在蒸发期间从酒糟水中去除的冷凝水，和(ii)浆料流，其包含更浓缩的非挥发性溶解的和未溶解的固体流，如由于去除了蒸发的水而从酒糟水中剩余下来的不可发酵糖和油。任选地，可从该酒糟水中去除油，或者可以作为蒸发方法的中间步骤去除油，该蒸发方法典型地使用一系列的几个蒸发阶段进行。可以将浆料和/或脱油浆料与湿谷粒(来自全酒糟分离步骤)一起引入干燥器中，以提供被称作含可溶物的干酒糟的产物，其也可用作动物饲料。
在实施例中，将浆料和/或脱油浆料喷入一个或多个干燥器中，以将该浆料和/或脱油浆料与全酒糟合并，以生产含可溶物的干酒糟。
可以将5vol-％-90vol-％之间，如10％-80％之间，如15％-70％之间，如20％-60％之间的酒糟水(例如，任选地水解的)再循环(作为逆流)到步骤(a)。再循环的酒糟水(即，逆流)可以占步骤(a)中形成的浆料的约1vol.-％-70vol.-％、优选15vol.-％-60vol.-％、尤其是从约30vol.-％至50vol.-％。
在实施例中，方法还包括任选地在已经从用本发明的LPMO处理的酒糟水流中提取油之后，将该酒糟水流的至少一部分再循环到浆料中。
湿饼的干燥以及干酒糟和含可溶物的干酒糟的生产
在已经从酒糟水分离含约25wt-％-40wt-％、优选30wt-％-38wt-％干固体的湿饼后(例如，脱水)，可以在转鼓式干燥机、喷雾干燥机、环式干燥机、流化床干燥机等上将其干燥，以生产“干酒糟”(DDG)。DDG是用于动物(如家畜、家禽和鱼)的有价值饲料成分。优选以小于约10-12wt.-％湿度的含量提供DDG，以避免发霉和微生物分解并且增加保质期。另外，高含湿量还使得运输DDG更昂贵。优选在不变性湿饼中的蛋白质的条件下干燥湿饼。湿饼可以与分离自酒糟水的浆料共混，并且被干燥为DDG及其可溶物(DDGS)。可以通过部分干燥湿饼，任选地在干燥方法之前、期间或之后添加浆料来生产部分干燥的中间产物，如有时被称作经修饰的湿酒糟。
液化期间存在的和/或添加的α-淀粉酶
根据本发明，在液化中，α-淀粉酶任选地与半纤维素酶、内切葡聚糖酶、蛋白酶、产碳水化合物源的酶(如葡糖淀粉酶)、磷脂酶、植酸酶、和/或普鲁兰酶一起存在和/或添加。
在液化步骤i)期间添加的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选的是细菌α-淀粉酶，如尤其是芽孢杆菌α-淀粉酶，如在液化期间使用的温度是稳定的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。
细菌α-淀粉酶
术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可例如源自芽孢杆菌属(有时也称作地芽孢杆菌属)的菌株。在实施例中，芽孢杆菌属α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、芽孢杆菌属TS-23、或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可源自其他芽孢杆菌属物种。
细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:10的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶、和WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、以及WO 2009/061380中披露为SEQ ID NO:1的芽孢杆菌属物种TS-23α-淀粉酶(所有序列都通过引用特此并入)。
在实施例中，细菌α-淀粉酶可为分别与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5以及WO 2009/061380中的SEQ ID NO:1所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。
在实施例中，α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQ IDNO:95所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少10％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。
在优选的实施例中，α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为成熟野生型或其成熟变体。成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体可以是在重组产生期间天然地截短的。例如，成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是在C-末端截短的，所以它是约491个氨基酸长(与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:10比较)，如从480至495个氨基酸长。
芽孢杆菌α-淀粉酶还可为变体和/或杂合体。这样的变体的实例可见于以下任一者中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、WO 02/10355以及WO 2009/061380(所有文件都通过引用特此并入)。具体的α-淀粉酶变体在美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中披露(通过引用特此并入)并包括具有以下情况的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(常常称作BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179、G180、I181和/或G182的任何一处的一个或两个氨基酸的缺失，优选WO 96/23873中披露的双缺失–参见例如第20页，第1-10行(通过引用特此并入)，优选与WO 99/19467中披露的SEQ IDNO:3所阐述的或本文的SEQ ID NO:10的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:10的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌(BSG)α-淀粉酶，其与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3所阐述的或本文的SEQ ID NO:10的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比在对应于位置R179、G180、I181和G182具有一个或两个氨基酸缺失，优选地其对应于R179和G180具有双缺失，或优选地位置181和182的缺失(被表示为I181*+G182*)，并且任选地，还包含N193F取代(被表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体或本文的SEQ ID NO:10中的S239的位置处具有取代。
在实施例中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，优选S242Q或A变体(使用本文的SEQ ID NO:10进行编号)。
在实施例中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的E188变体，优选E188P变体(使用本文的SEQ ID NO:10进行编号)。
其他涵盖的变体是WO 2009/061380中披露的芽孢杆菌属物种TS-23变体，尤其是WO 2009/061380的权利要求1中定义的变体(通过引用特此并入)。
细菌杂合α-淀粉酶
细菌α-淀粉酶也可以是杂合细菌α-淀粉酶，例如包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO99/19467的SEQ ID NO:4中所示)的445个C-末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO 99/19467的SEQ ID NO:5中所示)的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶。在优选的实施例中，杂合体具有下列取代中的一个或多个，尤其是全部：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。还优选的是具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。
在实施例中，细菌α-淀粉酶是嵌合α-淀粉酶的成熟部分，其披露于Richardson等人,2002,The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]277(29):.267501-26507，被称作BD5088或其变体。此α-淀粉酶与WO 2007134207中的SEQ ID NO:2所示的相同。成熟酶序列在位置1处的起始“Met”氨基酸之后开始。
热稳定的α-淀粉酶
根据本发明，将α-淀粉酶与具有大于80℃的熔点(DSC)的半纤维素酶(优选是木聚糖酶)组合使用。任选地，可以包括具有大于70℃、如大于75℃、特别是大于80℃的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶。热稳定的α-淀粉酶(如细菌α-淀粉酶)优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌或芽孢杆菌属物种TS-23。在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有至少15的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有至少20的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有至少25的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有至少30的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有至少40的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有至少50的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有至少60的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有在10-70之间的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有在15-70之间的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有在20-70之间的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有在25-70之间的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有在30-70之间的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有在40-70之间的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有在50-70之间的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有在60-70之间的T1/2(min)。
在实施例中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选地源自芽孢杆菌属，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌，如在WO 99/19467中披露为SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:10，其中在位置R179、G180、I181和/或G182处具有一个或两个氨基酸缺失，特别是R179和G180缺失、或具有I181和G182缺失，具有如下突变列表中的突变。在优选的实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双缺失I181+G182，以及任选的取代N193F，任选地进一步包括选自以下列表的突变：
Figure BDA0002800891120000851
Figure BDA0002800891120000861
在实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：
-I181*+G182*；
-I181*+G182*+N193F；
优选地
-I181*+G182*+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:10进行编号)。
在实施例中，细菌α-淀粉酶，如芽孢杆菌α-淀粉酶，如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶与本文的SEQ ID NO:95的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少10％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性。
在实施例中，细菌α-淀粉酶变体，如芽孢杆菌α-淀粉酶变体，如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:95的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少10％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的同一性。
应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式自然地产生。特别地，截短是这样的，使得WO99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQID NO:10中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短并且典型地是约491个氨基酸长，如从480至495个氨基酸长。
在液化期间存在的和/或添加的热稳定的半纤维素酶
根据本发明，具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)与α-淀粉酶(如细菌α-淀粉酶(以上描述的))组合存在于和/或被添加至液化步骤i)中。
半纤维素酶(优选地木聚糖酶)的热稳定性可以如“材料与方法”部分“通过差示扫描量热法测定Td对内切葡聚糖酶和半纤维素酶的测定”中所述测定。
在实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH10或GH11木聚糖酶具有大于82℃，如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如大于88℃、如大于90℃、如大于92℃、如大于94℃、如大于96℃、如大于98℃、如大于100℃、如在80℃和110℃之间、如在82℃和110℃之间、如在84℃和110℃之间的熔点(DSC)。
在优选的实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH10木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:96的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少11％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自网团菌属的菌株、如嗜热网团菌的菌株。
在优选的实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH11木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:97的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少12％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自网团菌属的菌株，如嗜热网团菌的菌株。
在优选的实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH10木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:98的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少13％、至少99％、如100％同一性，优选地源自霉状篮状菌属(Rasamsonia)的菌株，如丝衣霉状篮状菌(Rasomsonia byssochlamydoides)的菌株。
在优选的实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH10木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:99的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少14％、如100％同一性，优选地源自篮状菌属的菌株、如雷塞氏篮状菌的菌株。
在优选的实施例中，半纤维素酶、特别是木聚糖酶、尤其是GH10木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:100的多肽(优选地源自曲霉属的菌株、如烟曲霉的菌株)的成熟部分具有至少60％(如至少70％、如至少75％)的同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如15％的同一性。
在液化期间存在的和/或添加的热稳定的内切葡聚糖酶
根据本发明，在液化步骤i)中，具有大于70℃(如在70℃和95℃之间)的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶(“E”)可以与α-淀粉酶(如热稳定的细菌α-淀粉酶)和具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)组合存在和/或添加。
内切葡聚糖酶的热稳定性可以如WO 2017/112540(其通过引用以其整体并入本文)的“材料与方法”部分中“通过差示扫描量热法测定Td对内切葡聚糖酶和半纤维素酶的测定”标题下所述测定。
在实施例中，内切葡聚糖酶具有大于72℃、如大于74℃、如大于76℃、如大于78℃、如大于80℃、如大于82℃、如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如在70℃和95℃之间、如在76℃和94℃之间、如在78℃和93℃之间、如在80℃和92℃之间、如在82℃和91℃之间、如在84℃和90℃之间的熔点(DSC)。
在优选的实施例中，在本发明的方法中使用的或包含在本发明的组合物中的内切葡聚糖酶是糖苷水解酶家族5内切葡聚糖酶或GH5内切葡聚糖酶(参见在“www.cazy.org”网站的CAZy数据库)。
在实施例中，GH5内切葡聚糖酶来自家族EG II，如本文的SEQ ID NO:16中显示的雷塞氏篮状菌内切葡聚糖酶；本文的SEQ ID NO:17中显示的胶囊青霉(Penicilliumcapsulatum)内切葡聚糖酶、以及本文的SEQ ID NO:18中显示的褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)内切葡聚糖酶。
在实施例中，内切葡聚糖酶是家族GH45内切葡聚糖酶。在实施例中，GH45内切葡聚糖酶来自家族EG V，如本文的SEQ ID NO:19中显示的粪生粪壳菌或本文的SEQ ID NO:20中显示的土生梭孢壳霉内切葡聚糖酶。
在实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:16的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性。在实施例中，内切葡聚糖酶是源自篮状菌属的菌株，如雷塞氏篮状菌的菌株。
在实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:17的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自青霉菌属的菌株，如胶囊青霉的菌株。
在实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:18的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自长毛盘菌属的菌株，如褐孢长毛盘菌的菌株。
在实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:19的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自粪壳菌属的菌株，如粪生粪壳菌的菌株。
在实施例中，切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:20的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自梭孢壳属的菌株、如土生梭孢壳霉的菌株。
在实施例中，在液化步骤i)中在从1-10,000μg EP(酶蛋白)/g DS)如10-1,000μgEP/g DS的剂量添加内切葡聚糖酶。
在液化期间存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶
根据本发明，在液化中，任选的产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶，优选是热稳定的葡糖淀粉酶可以与α-淀粉酶和具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)、以及任选的具有大于70℃的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶、以及任选的支链淀粉酶和/或任选的植酸酶一起存在和/或添加。
术语“产碳水化合物源的酶”包括产生可发酵糖的任何酶。产碳水化合物源的酶能够产生碳水化合物，该碳水化合物可以被讨论中的一种或多种发酵生物用作能量源，例如，当在用于生产发酵产物(如乙醇)的本发明的工艺中使用时。产生的碳水化合物可以直接或间接转化成希望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可以使用碳水化合物源产生酶的混合物。具体实例包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生产者)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生产者)。
在优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是热稳定的。产碳水化合物源的酶，特别是热稳定的葡糖淀粉酶可以与α-淀粉酶和热稳定的蛋白酶一起或分开添加。
在一个具体并优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是热稳定的葡糖淀粉酶，优选真菌来源，优选丝状真菌，如来自青霉属的菌株，尤其是草酸青霉的菌株，特别是在WO2011/127802(将其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2的以及显示在本文的SEQ IDNO:21中的草酸青霉葡糖淀粉酶。
在实施例中，热稳定的葡糖淀粉酶与WO 2011/127802的SEQ ID NO:2或本文的SEQID NO:21中显示的成熟多肽具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在实施例中，产碳水化合物源的酶，特别是热稳定的葡糖淀粉酶是本文的SEQ IDNO:21中显示的草酸青霉葡糖淀粉酶。
在优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是披露为WO 2011/127802中的SEQ IDNO:2以及显示在本文的SEQ ID NO:21中的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，具有K79V取代(称为“PE001”)(使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列用于编号)。如WO 2013/036526(将其通过引用特此并入)中披露的，K79V葡糖淀粉酶变体相对于亲本对蛋白酶降解具有降低的敏感度。
涵盖的草酸青霉葡糖淀粉酶变体披露于WO 2013/053801(其通过引用特此并入)中。
在实施例中，这些变体具有对蛋白酶降解的降低的敏感度。
在实施例中，这些变体与亲本相比具有改进的热稳定性。
更具体地，在实施例中，葡糖淀粉酶具有对应于PE001变体的K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:21进行编号)，并且进一步包括至少一种以下取代或取代的组合：
T65A；Q327F；E501V；Y504T；Y504*；T65A+Q327F；T65A+E501V；T65A+Y504T；T65A+Y504*；Q327F+E501V；Q327F+Y504T；Q327F+Y504*；E501V+Y504T；E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V；T65A+Q327F+Y504T；T65A+E501V+Y504T；Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+Y504*；T65A+E501V+Y504*；Q327F+E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504*；E501V+Y504T；T65A+K161S；T65A+Q405T；T65A+Q327W；T65A+Q327F；T65A+Q327Y；P11F+T65A+Q327F；
R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；P11F+T65A+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+S105P+Q327W；T65A+S105P+Q327F；T65A+Q327W+S364P；T65A+Q327F+S364P；T65A+S103N+Q327F；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；S255N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
在优选的实施例中，草酸青霉葡糖淀粉酶变体具有K79V取代，使用本文的SEQ IDNO:21进行编号(PE001变体)，并且进一步包括以下突变中的一种：
P11F+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。
在实施例中，葡糖淀粉酶变体，如草酸青霉葡糖淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少60％(如至少70％、如至少75％)的同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％的同一性。
产碳水化合物源的酶(特别是麦芽糖酶)能以从0.1-100微克EP/g DS、如0.5-50微克EP/g DS、如1-25微克EP/g DS、如2-12微克EP/g DS的量添加。
在液化期间存在的和/或添加的支链淀粉酶
任选地，在液化步骤i)期间，普鲁兰酶可以与α-淀粉酶和具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选木聚糖酶)一起存在和/或添加。如以上提及的，蛋白酶、产碳水化合物源的酶、优选地热稳定的葡糖淀粉酶也可以任选地在液化步骤i)期间存在和/或添加。
支链淀粉酶可以在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)或同时糖化和发酵期间存在和/或添加。
普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41，普鲁兰糖6-葡聚糖-水解酶)是去分支酶，其特征在于它们在例如支链淀粉和普鲁兰糖中水解α-1,6-糖苷键的能力。
根据本发明的考虑的支链淀粉酶包括来自美国专利号4,560,651(通过引用特此并入)中披露的淀粉脱支芽孢杆菌(Bacillus amyloderamificans)的支链淀粉酶、WO 01/151620(通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2的支链淀粉酶、WO 01/151620(通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:4的脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)的支链淀粉酶，以及来自WO 01/151620(通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:6的嗜酸性支链淀粉芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)的支链淀粉酶，以及还有描述于FEMS Mic.Let.[FEMS微生物学通讯](1994)115,97-106中的支链淀粉酶。
根据本发明涵盖的另外的支链淀粉酶包括来自沃斯氏热球菌(Pyrococcuswoesei)、具体地来自WO 92/02614中披露的沃斯氏热球菌DSM No.3773的支链淀粉酶。
在实施例中，支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶。在实施例中，支链淀粉酶包括如披露于WO 2011/087836中的(将其通过引用特此并入)中的X47结构域。更具体地支链淀粉酶可以源自热球菌属的菌株，包括嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)和热水高温球菌(Thermococcus hydrothermalis)，如显示在WO 2011/087836中的在X47结构域之后的X4位点右侧截短的热水高温球菌支链淀粉酶。支链淀粉酶还可以是嗜热高温球菌和热水高温球菌支链淀粉酶杂合体或具有截短位点X4的、披露于WO 2011/087836(将其通过引用特此并入)中的热水高温球菌/嗜热高温球菌杂合酶。
在另一个实施例中，支链淀粉酶是包括披露于WO 2011/076123(诺维信公司)中的X46结构域的一种支链淀粉酶。
根据本发明，支链淀粉酶可以按有效量添加，包括约0.0001-10mg酶蛋白/克DS的优选量，优选0.0001-0.10mg酶蛋白/克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白/克DS。支链淀粉酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定描述于下文的“材料与方法”部分中。
适合的可商购支链淀粉酶产品包括PROMOZYME 400L、PROMOZYMETMD2(诺维信公司(Novozymes A/S)，丹麦)、OPTIMAX L-300(杰能科公司，美国)、以及AMANO 8安能满公司，日本)。
在液化期间存在的和/或添加的植酸酶
任选地，在液化中植酸酶可以与α-淀粉酶和具有大于80℃的熔点(DSC)的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)组合存在和/或添加。
根据本发明使用的植酸酶可以是能够从植酸(肌醇六磷酸盐)或其任何盐(植酸盐)中释放无机磷酸盐的任何酶。植酸酶可以根据其在初始水解步骤中的特异性进行分类，据此首先水解磷酸酯基团。本发明中使用的植酸酶可以具有任何特异性，例如是3-植酸酶(EC 3.1.3.8)、或6-植酸酶(EC 3.1.3.26)或5-植酸酶(无EC号)。在实施例中，植酸酶具有大于50℃最适温度，如在从50℃至90℃的范围。
植酸酶可以源自植物或微生物，如细菌或真菌，例如酵母或丝状真菌。
植物植酸酶可以来自麦麸、玉蜀黍、大豆或百合花粉。适合的植物植酸酶描述在Thomlinson等人，Biochemistry[生物化学]，1(1962)，166-171；Barrientos等人,Plant.Physiol.[植物生理学杂志],106(1994),1489-1495；WO 98/05785；WO 98/20139中。
细菌植酸酶可以来自芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属、哈夫尼菌属、假单胞菌属、布丘氏菌属或埃希氏菌属，特别是枯草芽孢杆菌、布氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、蜂房哈夫尼菌、布伽瓦尼布丘氏菌(Buttiauxella gaviniae)、乡间布丘菌(Buttiauxellaagrestis)、诺亚克布丘氏菌(Buttiauxella noackies)和大肠杆菌。适合的细菌植酸酶描述在Paver和Jagannathan,1982,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]151:1102-1108；Cosgrove,1970,Australian Journal of Biological Sciences[生物科学澳大利亚杂志]23:1207-1220；Greiner等人,Arch.Biochem.Biophys.[农业生物化学生物生理学],303,107-113,1993；WO 1997/33976；WO 1997/48812、WO 1998/06856、WO 1998/028408、WO2004/085638、WO 2006/037327、WO 2006/038062、WO 2006/063588、WO 2008/092901、WO2008/116878、和WO 2010/034835中。
酵母植酸酶可以源自酵母属或许旺酵母属，具体地物种酿酒酵母或许旺酵母。前面的酶已经描述为适合的酵母植酸酶描述于Nayini等人,1984,LebensmittelWissenschaft und Technologie[食品科学与技术]17:24-26；Wodzinski等人,Adv.Appl.Microbiol.[应用微生物学进展],42,263-303；AU-A-24840/95；
来自丝状真菌的植酸酶可以源自子囊菌(Ascomycota、ascomycetes)真菌门或担子菌门，例如曲霉属、嗜热真菌属(也称为腐质霉属)、毁丝霉属、红曲霉属、青霉菌属、隔孢伏革属、田头菇属(Agrocybe)、桩菇属(Paxillus)或栓菌属(Trametes)，具体地物种土曲霉、黑曲霉、黑曲霉泡盛曲霉(Aspergillus niger var.awamori)、无花果曲霉、烟曲霉、米曲霉、疏绵状嗜热丝孢菌(也称为疏棉状腐质霉)、嗜热毁丝霉、隔孢伏革菌、平田头菇(Agrocybe pediades)、安卡红曲霉、卷边网褶菌(Paxillus involtus)或绒毛栓菌(Trametes pubescens)。适合的真菌植酸酶描述在Yamada等人,1986,Agric.Biol.Chem.[农业和生物化学]322:1275-1282；Piddington等人，1993，Gene[基因]133:55-62；EP 684,313；EP 0 420 358；EP 0 684 313；WO 1998/28408；WO 1998/28409；JP 7-67635；WO 1998/44125；WO 1997/38096；WO 1998/13480中。
在优选的实施例中，植酸酶源自布丘氏菌属，如布伽瓦尼布丘氏菌、乡间布丘菌、或诺亚克布丘氏菌(Buttiauxella noackies)，如在WO 2008/092901(通过引用特此并入)中分别披露为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的那些。
在优选的实施例中，植酸酶源自柠檬酸杆菌属，如布氏柠檬酸杆菌，如在WO 2006/037328(通过引用特此并入)中披露的。
通过本领域已知的方法获得修饰的植酸酶或植酸酶变体，特别是通过以下中披露的方法：EP 897010；EP 897985；WO 99/49022；WO 99/48330、WO 2003/066847、WO 2007/112739、WO 2009/129489、和WO 2010/034835中。
含有产物的可商购的植酸酶包括BIO-FEED PHYTASETM、PHYTASE NOVOTMCT或L(均来自诺维信公司(Novozymes))、LIQMAX(杜邦公司(DuPont))或RONOZYMETMNP、
Figure BDA0002800891120000991
HiPhos、
Figure BDA0002800891120000992
P5000(CT)、NATUPHOSTMNG 5000(来自DSM)。
根据本发明，在糖化和/或发酵期间存在和/或添加产碳水化合物源的酶，优选葡糖淀粉酶。
在优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是真菌起源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉的菌株；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌的菌株，
糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶
根据本发明，产碳水化合物源的酶(特别的葡糖淀粉酶)可以任选地与α-淀粉酶、纤维素分解组合物、蛋白酶、海藻糖酶、和其任何组合一起，在糖化步骤(b)，发酵步骤(c)，或同时糖化和发酵(SSF)，或步骤(b)之前的预糖化时存在和/或添加。
在如下步骤期间存在和/或添加的产碳水化合物源的酶(例如，葡糖淀粉酶)：糖化步骤(b)；发酵步骤(c)；同时糖化和发酵；或步骤(b)之前的预糖化步骤，可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自由以下组成的组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人,1984,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3(5),第1097-1102页)，或其变体，如WO 92/00381、WO 00/04136和WO01/04273中披露的那些(来自诺维信公司，丹麦)；WO 84/02921中披露的泡盛曲霉葡糖淀粉酶；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业与生物化学](1991),55(4),第941-949页)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996),Prot.Eng.[蛋白质工程]9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人.(1995),Prot.Eng.[蛋白质工程]8,575-582)；N182(Chen等人(1994),Biochem.J.301[生物化学杂志],275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等人,1996,Biochemistry[生物化学],35:8698-8704)；和在A435和S436位置引入Pro残基(Li等人,1997,Protein Engng.[蛋白质工程]10,1199-1204)。
其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(以前命名为罗尔伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等人(1998)“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii[来自罗尔伏革菌的粗淀粉降解葡萄糖淀粉酶的纯化及性质]”Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是源自埃默森篮状菌(WO 99/28448)、雷塞氏篮状菌(美国专利号Re.32,153)、杜氏篮状菌(Talaromyces duponti)、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。在优选的实施例中，糖化和/或发酵期间使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。
涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。
涵盖的真菌葡糖淀粉酶包括WO 2006/069289中披露的瓣环栓菌(Trametescingulata)(其中的SEQ ID NO:8)、纸质刺孢孔菌(Pachykytospora papyracea)、和大白桩蘑(Leucopaxillus giganteus)；或WO 2007/124285中披露的红边隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)；或其混合物。根据本发明还涵盖杂合葡糖淀粉酶。实例包括WO 2005/045018中披露的杂合葡糖淀粉酶。具体实例包括实例1的表1和表4中披露的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用特此并入)。
在实施例中，葡糖淀粉酶源自密孔菌属的菌株，特别是如WO 2011/066576中所述的血红密孔菌的菌株(其中的SEQ ID NO 2、4或6)，特别是作为本文的SEQ ID NO:7所示的(对应于WO 2011/066576中的SEQ ID NO:4)，或来自粘褶菌属(Gloeophyllum)的菌株，如篱边粘褶菌(Gloeophyllum sepiarium)或密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)的菌株，特别是如WO 2011/068803中所述的粘褶菌属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)。在优选的实施例中，葡糖淀粉酶是WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:5(即，篱边粘褶菌葡糖淀粉酶)。在优选的实施例中，葡糖淀粉酶是本文的SEQ ID NO:6(即，WO2014/177546中作为SEQ ID NO:3披露的密粘褶菌葡糖淀粉酶)(所有参考文件通过引用由此并入)。
还涵盖葡糖淀粉酶，这些葡糖淀粉酶与上述葡糖淀粉酶中的任一种显示高同一性，即，分别与上述酶序列的成熟部分中的任一个，如本文的SEQ ID NO:4、5、6、7或8中的任一个显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶与本文的SEQ ID NO:4的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶与本文的SEQ ID NO:5的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶与本文的SEQ ID NO:6的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶与本文的SEQ ID NO:7的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶与本文的SEQ ID NO:8的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在实施例中，葡糖淀粉酶可以按如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/gDS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，例如0.1-2AGU/g DS。
在实施例中，可将葡糖淀粉酶以1-1,000μg EP/g DS，优选地10-500μg/gDS，尤其是25-250μg/g DS的量添加至糖化和/或发酵中。
在实施例中，葡糖淀粉酶作为进一步包含α-淀粉酶的共混物添加。在优选的实施例中，α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，尤其是酸性真菌α-淀粉酶。α-淀粉酶典型地具有副活性。
在实施例中，葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含WO 99/28448中作为SEQ ID NO:34或本文的SEQ ID NO:4披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶和在WO 06/069289中作为SEQ IDNO:2和/或本文的SEQ ID NO:8披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶。
在实施例中，葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含本文的SEQ ID NO:4中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、本文中作为SEQ ID NO:8披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及WO2006/069290的表5中作为V039或本文的SEQ ID NO:9披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶。
在实施例中，葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含本文中作为SEQ ID NO:5所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶以及本文中作为SEQ ID NO:9披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，具有以下取代：G128D+D143N。
在实施例中，α-淀粉酶可为源自根毛霉属的菌株，优选微小根毛霉的菌株，如WO2013/006756中的SEQ ID NO:3中所示的，或亚灰树花菌属(Meripilus)，优选大型亚灰树花菌的菌株。在优选的实施例中，α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，WO 2006/069290的表5中作为V039或本文的SEQ ID NO:9披露的。
在实施例中，微小根毛霉α-淀粉酶或具有接头和淀粉结合结构域(SBD)，优选黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶具有以下取代或取代组合中的至少一种：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192RV410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:9进行编号)。在优选的实施例中，葡糖淀粉酶共混物包含篱边粘褶菌葡糖淀粉酶(例如，WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或本文的SEQID NO:5)和微小根毛霉α-淀粉酶。
在优选的实施例中，葡糖淀粉酶共混物包含WO 2011/068803中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:5所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶，以及WO 2013/006756中的SEQ IDNO:3和本文的SEQ ID NO:9披露的、具有接头和淀粉结合结构域(SBD)，优选黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉，具有以下取代：G128D+D143N。
包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER、SANTMEXTRA L、SPIRIZYMETMPLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETMB4U、SPIRIZYMETMULTRA、SPIRIZYMETMEXCEL、SPIRIZYME ACHIEVETM、和AMGTME(来自诺维信公司)；OPTIDEXTM300、GC480、GC417(来自杜邦-丹尼斯科公司(DuPont-Danisco))；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自帝斯曼公司(DSM))；G-ZYMETMG900、G-ZYMETM和G990ZR(来自杜邦-丹尼斯科公司)。
β-淀粉酶
β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)是传统地给予外切作用的麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1,4-α-糖苷键水解。麦芽糖单位以逐步方式依次从非还原链末端去除，直到该分子被降解，或在支链淀粉的情况下，直到到达分支点。释放的麦芽糖具有β端基异构构型，因此名称为β-淀粉酶。
β-淀粉酶已从多种植物和微生物中分离(W.M.Fogarty和C.T.Kelly,Progress inIndustrial Microbiology[工业微生物学进展],第15卷,第112-115页,1979)。这些β-淀粉酶表征为具有从40℃至65℃范围内的最适温度并且具有从4.5至7范围内的最适pH。来自大麦的可商购β-淀粉酶是来自丹麦的诺维信公司的NOVOZYMTMWBA和来自美国的杰能科国际公司SPEZYMETMBBA 1500。
产麦芽糖淀粉酶
在糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶还可以是产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能水解直链淀粉和支链淀粉为α-构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶可商购自诺维信公司。产麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628中，将其通过引用而特此并入。在优选的实施例中，能以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加产麦芽糖淀粉酶。
在糖化和/或发酵或SSF期间存在的和/或添加的纤维素酶或纤维素分解酶组合物
本发明的方面涉及在本发明的方法中使用纤维素分解组合物。在某些方面，在糖化、发酵、和/或同时糖化和发酵期间存在和/或添加纤维素分解组合物。纤维素分解组合物可与α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、海藻糖酶、和/或其任何组合物在糖化、发酵、和/或同时糖化和发酵期间同时或顺序地存在和/或添加。在本发明的方法中使用的纤维素分解组合物可以源自任何微生物。如本文所用，“源自任何微生物”意指该纤维素分解组合物包含一种或多种在微生物中表达的酶。例如，源自里氏木霉的菌株的纤维素分解组合物意指该纤维素分解组合物包含一种或多种在里氏木霉中表达的酶。
在实施例中，纤维素分解组合物源自曲霉属的菌株，如黄曲霉、黑曲霉或米曲霉的菌株。
在实施例中，纤维素分解组合物源自金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，如卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的菌株。
在实施例中，纤维素分解组合物源自腐质霉属(Humicola)的菌株，如特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株。
在实施例中，纤维素分解组合物源自青霉属的菌株，如埃默森青霉菌或草酸青霉菌的菌株。
在实施例中，纤维素分解组合物源自篮状菌属的菌株，如金黄篮状菌或埃默森篮状菌的菌株。
在实施例中，纤维素分解组合物源自木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在优选的实施例中，纤维素分解组合物源自里氏木霉的菌株。
纤维素分解组合物可以包括以下多肽(包括酶)中的一种或多种：具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBHI和CBHII、或其中两种、三种、或四种的混合物。
在优选的实施例中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，其相对ED50负载值小于1.00，优选小于0.80，如优选小于0.60，如在0.1-0.9之间，如在0.2-0.8之间，如0.30-0.70。
纤维素分解组合物可以包含一些半纤维素酶，例如像木聚糖酶和/或β-木糖苷酶。半纤维素酶可以来自生产纤维素分解组合物的生物或其他来源，例如，半纤维素酶可以对生产纤维素分解组合物的生物例如像里氏木霉而言是外源的。
在优选的实施例中，纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量小于10wt.％，如小于纤维素分解组合物的5wt.％。
在实施例中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶。
在实施例中，纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-葡糖苷酶。
在另一个实施例中，纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶和CBH。
在另一个实施例中，纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶以及CBHI。
在另一个实施例中，纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶和CBHI。
在另一个实施例中，纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBHI以及CBHII。
在另一个实施例中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、CBHI、和CBHII。
纤维素分解组合物还可以包含选自由以下组成的组的一种或多种酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素。
在实施例中，纤维素酶是选自由以下组成的组的一种或多种酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。
在实施例中，内切葡聚糖酶是内切葡聚糖酶I。
在实施例中，内切葡聚糖酶是内切葡聚糖酶II。
β-葡糖苷酶
在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解组合物可以包含一种或多种β-葡糖苷酶。在一个实施例中，β-葡糖苷酶可以是源自曲霉属的菌株的一种，如源自米曲霉的，如在WO 2002/095014中披露的一种或在WO 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或源自烟曲霉的，如在WO 2005/047499或本文的SEQ ID NO:22中披露的一种或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，如在WO 2012/044915或共同未决的PCT申请PCT/US 11/054185(或美国临时申请号61/388,997)中披露的一种，如具有以下取代的一种：F100D、S283G、N456E、F512Y。
在另一个实施例中，β-葡糖苷酶源自青霉属的菌株，如披露于WO 2007/019442中的巴西青霉(Penicillium brasilianum)的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在实施例中，β-葡糖苷酶是选自由以下组成的组的烟曲霉β-葡糖苷酶或其同系物：
(i)β-葡糖苷酶，其包含SEQ ID NO:22的成熟多肽；
(ii)β-葡糖苷酶，其包含与本文的SEQ ID NO:22的成熟多肽具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列；
(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的核苷酸序列；和
(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下，与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交。
在实施例中，β-葡糖苷酶是变体，该变体在对应于本文的SEQ ID NO:22的成熟多肽的位置100、283、456以及512的一个或多个(几个)位置处包括取代，其中该变体具有β-葡糖苷酶活性。
在实施例中，变体的亲本β-葡糖苷酶是(a)包含本文的SEQ ID NO:22的成熟多肽的多肽；(b)与本文的SEQ ID NO:22的成熟多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(c)多肽，其由多核苷酸编码，该多核苷酸在高或非常高严格条件下与以下杂交：(i)WO 2013/148993中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)WO 2013/148993中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(d)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与WO 2013/148993中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％同一性；或(e)本文的SEQ ID NO:22的成熟多肽的片段，该片段具有β-葡糖苷酶活性。
在实施例中，β-葡糖苷酶变体与亲本β-葡糖苷酶的氨基酸序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性。
在实施例中，变体与本文的SEQ ID NO:22的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性。
在实施例中，β-葡糖苷酶来自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如烟曲霉β-葡糖苷酶(本文的SEQ ID NO:22)，其包括一个或多个选自由以下组成的组的取代：L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E、和F512Y；如具有以下取代的其变体：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
在实施例中，取代的数目在1与4之间，如1、2、3或4个取代。
在实施例中，变体在对应于位置100的位置处包括取代、在对应于位置283的位置处包括取代、在对应于位置456的位置处包括取代和/或在对应于位置512的位置处包括取代。
在优选的实施例中，β-葡糖苷酶变体包括以下取代：本文的SEQ ID NO:22中的Phe100Asp、Ser283Gly、Asn456Glu、Phe512Tyr。
在优选的实施例中，β-葡糖苷酶的相对ED50负载值小于1.00，优选小于0.80，如优选小于0.60，如在0.1-0.9之间，如在0.2-0.8之间，如0.30-0.70。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽
在一个实施例中，根据本发明所使用的纤维素分解组合物可以包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在一个实施例中，酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，如衍生自嗜热子囊菌属，如橙色嗜热子囊菌的菌株的一种，例如WO2005/074656中以SEQ ID NO:2描述的那种；或源自梭孢壳属，如土生梭孢壳霉的菌株，如WO2005/074647中作为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所描述的该多肽；或源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的一种，如WO 2010/138754中作为SEQ ID NO:2描述的多肽；或源自青霉属的菌株，如埃默森青霉菌的菌株的一种，如在WO 2011/041397中披露的或本文的SEQ ID NO:23的一种。
在实施例中，具有纤维素分解增强活性的青霉属物种GH61多肽或其同系物选自下组，该组由以下组成：
(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含本文的SEQ ID NO:23的成熟多肽；
(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含与本文的SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列；
(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的核苷酸序列；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下，与WO 2013/148993中SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交。
纤维二糖水解酶I
在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解组合物可以包含一种或多种CBHI(纤维二糖水解酶I)。在一个实施例中，纤维素分解组合物包括纤维二糖水解酶I(CBHI)，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如在WO 2011/057140中披露的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:24的Cel7A CBHI，或源自木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在实施例中，烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同系物选自下组，该组由以下组成：
(i)包含本文的SEQ ID NO:24的成熟多肽的纤维二糖水解酶I；
(ii)纤维二糖水解酶I，其包含与本文的SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列；
(iii)由以下多核苷酸编码的纤维二糖水解酶I，该多核苷酸包含与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的核苷酸序列；和
(iv)由以下多核苷酸编码的纤维二糖水解酶I，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下，与WO 2013/148993中SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交。
纤维二糖水解酶II
在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解组合物可以包含一种或多种CBHII(纤维二糖水解酶II)。在一个实施例中，纤维二糖水解酶II(CBHII)是如源自以下的纤维二糖水解酶II：曲霉属种的菌株(如烟曲霉的菌株)，如本文的SEQ ID NO:25中的纤维二糖水解酶II，或木霉属种的菌株，如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，如土生梭孢壳霉的菌株，如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
在实施例中，烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同系物选自下组，该组由以下组成：
(i)包含本文的SEQ ID NO:25的成熟多肽的纤维二糖水解酶II；
(ii)纤维二糖水解酶II，其包含与本文的SEQ ID NO:25的成熟多肽具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列；
(iii)由以下多核苷酸编码的纤维二糖水解酶II，该多核苷酸包含与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的核苷酸序列；和
(iv)由以下多核苷酸编码的纤维二糖水解酶II，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下，与WO 2013/148993中SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交。
纤维素分解组合物
如以上提及的，纤维素分解组合物可以包括多种不同的多肽(如酶)。
在实施例中，纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物，还包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)和米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
在另一个实施例中，纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物，还包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)和烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)。
在另一个实施例中，纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物，还包含在WO 2011/041397中披露的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
本发明的酶组合物可以处于任何适于使用的形式，例如像除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或作为酶的来源的宿主细胞(例如，木霉属宿主细胞)。
酶组合物可以是干粉或颗粒、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体或稳定化受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，将液体酶组合物稳定化。
在优选的实施例中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，其相对ED50负载值小于1.00，优选小于0.80，如优选小于0.60，如在0.1-0.9之间，如在0.2-0.8之间，如0.30-0.70。
在实施例中，纤维素分解酶组合物(即，在步骤ii)的糖化和/或步骤iii)的发酵或SSF期间)从0.0001-3mg EP/g DS、优选地0.0005-2mg EP/g DS、优选地0.001-1mg/g DS、更优选的从0.005-0.5mg EP/g DS、甚至更优选的0.01-0.1mg EP/g DS剂量添加。
在液化和/或糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的蛋白酶
在本发明的实施例中，在液化中，可以将任选的蛋白酶(如热稳定的蛋白酶)与α-淀粉酶(如热稳定的α-淀粉酶)，和具有大于80℃的熔点(DSC)的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)、以及任选地内切葡聚糖酶、产碳水化合物源的酶(特别是葡糖淀粉酶、任选地支链淀粉酶、任选地磷脂酶C和/或任选地植酸酶)一起存在和/或添加。
在本发明的实施例中，任选地蛋白酶可在糖化步骤(b)、发酵步骤(c)、同时糖化和发酵、步骤(b)之前的预糖化中，任选地与α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、纤维素分解组合物、和海藻糖酶一起存在和/或添加。
蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。
在优选的实施例中，根据本发明使用的热稳定的蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)。
为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。
蛋白酶底物的实例为酪蛋白，例如Azurine-Crosslinked Casein(天青精交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。下文在WO 2017/112540(其通过引用并入本文)的“材料和方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中优选的测定是所谓的“AZCL-酪蛋白测定”。
在实施例中，如通过在WO 2017/112540中“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定进行确定，热稳定的蛋白酶具有JTP196变体(来自WO 2017/112540的实例2)或蛋白酶Pfu(本文的SEQ ID NO:26)的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的蛋白酶活性。
对于在本发明的方法或组合物中使用的热稳定的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。
在一个实施例中，蛋白酶是真菌来源的。
在优选的实施例中，热稳定的蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在实施例中，在本发明的方法或组合物中使用的热稳定的蛋白酶是真菌起源的，如真菌金属蛋白酶，如源自嗜热子囊菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCCNo.0670(分类为EC 3.4.24.39)的真菌金属蛋白酶。
在实施例中，热稳定的蛋白酶是披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2所示的金属蛋白酶的成熟部分的变体或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1以及本文的SEQ ID NO:27所示的成熟部分的变体，进一步具有选自以下列表的突变：
-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L+T141 C+M161 C；
-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D142L。
在优选的实施例中，热稳定的蛋白酶是披露为以下的成熟金属蛋白酶的变体：披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ IDNO:1或本文的SEQ ID NO:27的成熟部分，该变体具有以下突变：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
在实施例中，蛋白酶变体与披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:27的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的同一性。
热稳定的蛋白酶还可源自任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本发明定义的热稳定性特性。
在实施例中，热稳定的蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，例如强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株(pfu蛋白酶)。
在实施例中，蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(Takara ShuzoCompany))的SEQ ID NO:1、和本文的SEQ ID NO:26所示的一种。
在实施例中，热稳定的蛋白酶是披露在本文的SEQ ID NO:26或是与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:26具有至少80％同一性、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的蛋白酶。强烈火球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio,Japan)。
强烈火球菌蛋白酶是根据本发明的热稳定的蛋白酶。如WO 2017/112540的实例2中所述的进行测定，发现商业产品强烈火球菌蛋白酶(Pfu S)在pH 4.5具有110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)的热稳定性(参见实例5)。
在一个实施例中，热稳定的蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的、超过20％的热稳定性值，如实例2中所述的进行测定。
在实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、如超过105％、如超过110％、如超过115％、如超过120％的热稳定性。
在实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的，在20％与50％之间、如在20％与40％之间、如20％与30％的热稳定性。
在实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的，在50％与115％之间、如在50％与70％之间、如在50％与60％之间、如在100％与120％之间、如在105％与115％之间的热稳定性。
在实施例中，如WO 2017/112540的实例2中所述的进行测定，该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃的相对活性的、超过10％的热稳定性值。
在实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃的相对活性的，超过10％，如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。
在实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃的相对活性的，在10％与50％之间、如在10％与30％之间、如在10％与25％之间的热稳定性。
在实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在80℃的残余活性；和/或
在实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在84℃的残余活性。
“相对活性”以及“残余活性”的测定是如在WO 2017/112540的实例2中描述的进行的。
在实施例中，如使用WO 2017/112540的实例3中披露的Zein-BCA测定确定的，该蛋白酶在85℃可以具有高于90，如高于100的热稳定性。
在实施例中，蛋白酶在85℃具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。
在实施例中，蛋白酶在85℃具有在60％-120％之间，例如在70％-120％之间，例如在80％-120％之间，例如在90％-120％之间，例如在100％-120％之间，例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。
在实施例中，如通过在WO 2017/112540的“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定进行确定，热稳定的蛋白酶具有JTP196蛋白酶变体或蛋白酶Pfu的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的活性。
适合用于本发明的方法中使用的额外的蛋白酶示于美国申请号62/514,636，2017年6月2日提交的(代理人案号：14480-US-PRO)(其披露内容通过援引以其全文并入本文)的表1的SEQ ID No:9-73中(或与蛋白酶具有至少60％、至少65％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的蛋白酶)。
在各种实施例中，蛋白酶可以用发酵生物，例如酵母，例如酵母属菌株，如酿酒酵母菌株和本文所述的方法表达。在某些实施例中，蛋白酶用发酵生物，例如酵母，例如酵母属菌株，如酿酒酵母菌株在用于产生发酵产物(如特别地乙醇)的方法的糖化、发酵、同时糖化和发酵步骤中表达。
糖化和/或发酵中使用的海藻糖酶
根据本发明，海藻糖酶可以任选地与α-淀粉酶、纤维素分解组合物、蛋白酶、海藻糖酶、和其任何组合一起，在糖化步骤(b)，发酵步骤(c)，或同时糖化和发酵(SSF)，或步骤(b)之前的预糖化时存在和/或添加。
海藻糖酶是将海藻糖降解成其单元单糖(即，葡萄糖)的酶。根据本发明，海藻糖酶可为一个单独的海藻糖酶，或多种中的两种任何来源(如植物，哺乳动物或微生物来源，如细菌或真菌来源)的海藻糖酶的组合。在优选的实施例中，海藻糖酶是哺乳动物来源的，如猪海藻糖酶。在另一个优选的实施例中，海藻糖酶是真菌来源的，优选酵母来源。在优选实施方案中，海藻糖酶源自酵母属的菌株，如酿酒酵母的菌株。
将海藻糖酶分类于EC 3.2.1.28(α,α-海藻糖酶)和EC。3.2.1.93(α,α-磷酸海藻糖酶)。EC类别基于国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的命名委员会(NomenclatureCommittee)的推荐。EC类别的描述可见于互联网，例如，在“http://www.expasy.org/ enzyme/”。海藻糖酶是催化如下反应的酶：
EC 3.2.1.28：
α,α-海藻糖+H2O＝2D-葡萄糖；
EC 3.2.1.93：
α,α-海藻糖6-磷酸+H2O<＝>D-葡萄糖+D-葡萄糖6-磷酸；
在本发明的上下文中，这两种酶都被称为“海藻糖酶”。在优选的实施例中，海藻糖酶分类为EC 3.2.1.28。在另一个实施例中，海藻糖酶分类为EC 3.2.1.93。实施例中，海藻糖酶是中性海藻糖酶。在另一个实施例中，海藻糖酶是酸性海藻糖酶。
在如下步骤期间存在和/或添加的海藻糖酶：糖化步骤(b)；发酵步骤(c)；同时糖化和发酵；或步骤(b)之前的预糖化步骤，可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。
中性海藻糖的实例包括但不限于来自以下的海藻糖酶：酿酒酵母(Londesborouh等人,(1984)Characterization of two trehalases from baker’s yeast[面包酵母两种海藻糖酶的表征]Biochem J[生物化学杂志]219,511-518；洛氏毛霉(Mucor roxii)(Dewerchin等人,(1984),“Trehalase activity and cyclic AMP content during earlydevelopment of Mucor rouxii spores”[洛氏毛霉孢子早期发育过程中的海藻糖酶活性和环状AMP含量],J.Bacteriol.[细菌学杂志],158,575-579)；布拉克须霉(Phycomycesblakesleeanus)(Thevelein等人,(1983),“Glucose-induced trehalase activation andtrehalose mobilization during early germination of Phycomyces blakesleeanusspores”[布拉克须霉孢子早期萌发过程中葡萄糖诱导的海藻糖酶活化和海藻糖动员]J.Gen Microbiol.[通用与应用微生物学杂志]129,719-726)；尖孢镰孢(Fusariumoxysporium)(Amaral等人,(1996),“Comparative study of two trehalase activitiesfrom Fusarium oxysporium var Linii”[尖孢镰孢林氏变种的两种海藻糖酶活性的比较研究]Can.J Microbiol.[加拿大微生物学报]41:1057-1062)；
中性海藻糖酶的实例包括，但不限于，来自以下的海藻糖酶：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Parvaeh等人,(1996)Purification and biochemicalcharacterization of the ATH1 gene product,vacuolar acid trehalase fromSaccharomyces cerevisae”[酿酒酵母液泡酸性海藻糖酶ATH1基因产物的纯化和生化特性]FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]391,273-278)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)(Hecker等人,(1973),“Location of trehalase in the ascospores ofNeurospora:Relation to ascospore dormancy and germination”.[海藻糖酶在链孢菌属的囊孢子中的位置：与囊孢子休眠和萌发的关系]J.Biochem.[细菌学杂志]115:592-599)；金黄毛壳菌(Chaetomium aureum)(Sumida等人,(1989),“Purification and someproperties of trehalase from Chaetomium aureum MS-27.[来自金黄毛壳菌MS-27的海藻糖酶的纯化及部分性质]J.Ferment.Bioeng.[发酵与生物工程杂志]67,83-86)；构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(d’Enfert等人,(1997),“Molecular characterization ofthe Aspergillus nidulans treA gene encoding an acid trehalase required forgrowth on trehalose.[编码在海藻糖上生长所需的酸性海藻糖酶的构巢曲霉treA基因的分子表征]Mol.Microbiol.[分子微生物学]24,203-216)；灰腐质霉(Humicola grisea)(Zimmermann等人,(1990).”“Purification and properties of an extracellularconidial trehalase from Humicola grisea var.thermoidea[来自灰腐质霉高温变种胞外分生孢子海藻糖酶的纯化及特性]”,Biochim.Acta[生物化学与生物物理学报]1036,41-46)；灰腐质霉(Cardello等人(1994),“A cytosolic trehalase from thethermophilhilic fungus Humicola grisea var.thermoidea”[来自嗜热真菌灰腐质霉高温变种的胞液型海藻糖酶],Microbiology UK[英国微生物学]140,1671-1677；嗜热柱顶孢霉(Scytalidium thermophilum)(Kadowaki等人,(1996),“Characterization of thetrehalose system from the thermophilic fungus Scytalidium thermophilum[来自嗜热真菌嗜热柱顶孢霉的海藻糖系统的表征]”Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1291,199-205)；和尖孢镰孢(Amaral等人,(1996),“Comparative study of twotrehalase activities from Fusarium oxysporium var Linii”[尖孢镰孢林氏变种的两种海藻糖酶活性的比较研究]Can.J Microbiol.[加拿大微生物学报]41:1057-1062)。
还已知海藻糖酶来自大豆(Aeschbachet等人,(1999),“Purification of thetrehalase GmTRE1 from soybean nodules and cloning of its cDNA”[纯化来自大豆根瘤的海藻糖酶GmTRE1并克隆其cDNA],Plant Physiol[植物生理学杂志]119,489-496)。
海藻糖酶也存在于哺乳动物的小肠和肾中。
在实施例中，海藻糖酶源自篮状菌属的菌株，如绳状篮状菌的菌株的菌株，如本文的SEQ ID NO:28中所示的海藻糖酶，或与本文的SEQ ID NO:28具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的海藻糖酶，雷塞氏篮状菌的菌株，如本文的SEQ IDNO:29中所示的海藻糖酶，或本文的SEQ ID NO:29具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的海藻糖酶，或Talaromyces cellulyticus的菌株，如具有登录号Uniprot：A0A0B8MYG3的海藻糖酶，或与其具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的海藻糖酶的变体。
在实施例中，海藻糖酶源自毁丝霉属的菌株，如嗜热毁丝霉的菌株，如WO 2012/027374(其通过引用以其整体并入本文)Dyadic)中披露的海藻糖酶，或与海藻糖酶具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的海藻糖酶变体，或来自属于如通过CAZY数据库(可在万维网上获得)定义的具有高的热稳定性和宽的pH范围的家族37糖苷水解酶(“GH37”)的Myceliophthora sepedonium的菌株，或与海藻糖酶具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的海藻糖酶的变体。
在实施例中，海藻糖酶源自木霉属菌株，如里氏木霉的菌株，如WO 2013/148993(其通过引用以其整体并入本文)中披露的，或与海藻糖酶具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的海藻糖酶的变体。
在实施例中，海藻糖酶源自曲霉属的菌株，如文氏曲霉(Aspergillus wentii)的菌株，如具有登录号Uniprot：A0A1L9RM22的海藻糖酶，或与海藻糖酶具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的海藻糖酶。
可商购的海藻糖酶包括可从美国SIGMA获得的猪海藻糖酶(产品#A8778)。
海藻糖酶可以在发酵期间以任何有效剂量添加或存在，其包括但不限于每升发酵培养基1-500Sigma单位，优选每升发酵培养基10-100Sigma单位。
V.本发明的另外方面
在本发明的另外方面，其涉及用于增加酵母的生长和/或生产力的过氧化物酶或过氧化物酶组合物的用途。
在本发明的另外方面，其涉及过氧化物酶或过氧化物酶组合物用于增加酵母扩培期间酵母的生长和/或生产力的用途。
在本发明的另外方面，其涉及过氧化物酶或过氧化物酶组合物用于增加乙醇发酵期间酵母的生长和/或生产力的用途。
在本发明的另外方面，其涉及过氧化物酶或过氧化物酶组合物用于增加在生物燃料生产过程期间在发酵最初的24小时内生产乙醇的速率的用途。
在本发明的另外方面，其涉及过氧化物酶或过氧化物酶组合物用于降低生物燃料发酵系统中乳酸水平的用途。
在本发明的另外方面，其涉及过氧化物酶或过氧化物酶组合物用于降低发酵培养基中乳酸水平的用途。
在本发明的另外方面，其涉及过氧化物酶或过氧化物酶组合物用于降低在生物燃料生产过程的发酵或同时糖化和发酵步骤期间的乳酸滴度的用途。
在本发明的另一方面，其涉及过氧化物酶或过氧化物酶组合物用于降低酵母扩培期间的乳酸水平的用途。
在本发明的另外方面，其涉及过氧化物酶或过氧化物酶组合物用于降低在生物燃料生产过程的发酵或同时糖化和发酵步骤期间的乳酸滴度的用途。
本领域技术人员将理解，本节中描述的方面和实施例适用于任何过氧化物酶例如本文第VII部分中描述过氧化物酶。
在实施例中，过氧化物酶是选自以下的过氧化物酶或过氧化物分解酶：E.C.1.11.1.1NADH过氧化物酶；E.C.1.11.1.2NADPH过氧化物酶；E.C.1.11.1.3脂肪酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.5细胞色素c过氧化物酶；E.C.1.11.1.5；E.C.1.11.1.6过氧化氢酶；E.C.1.11.1.7过氧化物酶；E.C.1.11.1.8碘化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.9谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.10氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.11L-抗坏血酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.12磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.13锰过氧化物酶；E.C.1.11.1.14木质素过氧化物酶；E.C.1.11.1.15过氧化物氧还蛋白；E.C.1.11.1.16通用过氧化物酶；E.C.1.11.1.B2氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B6碘化物过氧化物酶(含有钒的)；E.C.1.11.1.B7溴化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B8碘化物过氧化物酶。
优选地，过氧化物酶来源自微生物，例如真菌生物，例如酵母或丝状真菌，或细菌；或植物。
在优选的实施例中，过氧化物酶选自：(i)源自嗜热子囊菌属的菌株的过氧化物酶，如橙色嗜热子囊菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:1所示的过氧化物酶，或与本文的SEQID NO:1具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；(ii)源自嗜热链球菌属的菌株的过氧化物酶，如嗜热链球菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:2所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:2具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；或(iii)源自鬼伞属的菌株的过氧化物酶，如灰盖鬼伞菌株，如本文的SEQID NO:3所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:3具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶。
在以下段落中进一步总结了本发明：
1.一种用于增强酵母生长和/或生产力的方法，该方法包括使酵母与有效量的过氧化物酶接触。
2.一种用于生产酵母的方法，该方法包括在有益于酵母生长的条件下培养如权利要求1所述的酵母。
3.如段落1或2所述的方法，其中相比于不与多肽接触的酵母的生长，该酵母的生长从10％增加至50％。
4.如段落1至3中任一项所述的方法，其中相比于不与多肽接触的酵母的生产力，该酵母的生产力从10％增加至50％。
5.一种组合物，该组合物包含如段落1至4中任一项所述的方法生产的酵母，以及选自以下的至少一种组分：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、抗氧化剂、和其任何组合。
6.如段落5所述的组合物，该组合物被配制为膏状酵母、压缩酵母、粉碎酵母、或活性干酵母。
7.一种容器，该容器包含如段落5或6所述的组合物，其中该容器任选地选自装载箱、加药撬块、包、袋、或发酵容器。
8.一种在生物燃料发酵系统中扩培用于生物产品生产的酵母的方法，该方法包括将包含过氧化物酶的酶组合物引入生物燃料发酵系统中，其中该发酵系统包含一种或多种发酵容器、管道和/或组件，并且其中以足以增强该生物燃料发酵系统中酵母生长和/或生产力的浓度添加该过氧化物酶。
9.如段落8中任一项所述的方法，其中这些发酵容器中的至少一个是发酵罐，并且将酶组合物引入该发酵罐。
10.如段落8或9所述的方法，其中在发酵最初的6小时内将该酶组合物引入发酵罐。
11.如段落8至10中任一项所述的方法，其中与在不具有过氧化物酶的最初的24小时内生产的乙醇量相比，在发酵最初的24小时内生产乙醇的速率增加了10％至50％。
12.如段落8至11中任一项所述的方法，其中与在不具有过氧化物酶的发酵最初的24小时内的酵母生长相比，在发酵最初的24小时内的酵母生长增加了10％至50％。
13.如段落8至12中任一项所述的方法，其中这些发酵容器中的至少一个是酵母扩培罐，并且将该酶组合物引入该酵母扩培罐。
14.如段落8至13中任一项所述的方法，其中与在不具有过氧化物酶的最初的24小时内生产的乙醇量相比，在发酵最初的24小时内生产乙醇的速率增加了10％至50％。
15.如段落8至14中任一项所述的方法，其中与在不具有过氧化物酶的扩培24小时后的酵母生长相比，在过氧化物酶存在下，扩培相同时间的酵母生长增加了10％至50％。
16.如段落8至15中任一项所述的方法，该方法进一步包括将酵母添加至该扩培罐或该发酵容器。
17.如段落16所述的方法，其中该酵母在被添加至扩培罐或发酵容器之前与过氧化物酶接触。
18.如段落8至17中任一项所述的方法，其中该生物燃料是乙醇。
19.一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化以形成液化的醪；
b)使用产碳水化合物源的酶将该液化的醪糖化以生产可发酵糖；
c)在适于生产该发酵产物的条件下，使用发酵生物将该糖发酵，
其中在糖化步骤b)和/或发酵步骤c)之前或期间添加过氧化物酶。
20.如段落19所述的方法，其中步骤b)和c)同时进行。
21.如段落19或20所述的方法，其中将该含淀粉材料的浆料加热至高于糊化温度。
22.如段落19至21中任一项所述的方法，其中在液化期间添加该过氧化物酶。
23.如段落19至22中任一项所述的方法，其中在糖化期间添加该过氧化物酶，其中任选地在糖化最初的2小时内添加该过氧化物酶。
24.如段落19至23中任一项所述的方法，其中在发酵期间添加该过氧化物酶，其中任选地在发酵最初的6小时内添加该过氧化物酶。
25.如段落19至24中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，优选乙醇。
26.如段落19至25中任一项所述的方法，其中该发酵生物是酵母。
27.如段落1至26中任一项所述的方法，其中该酵母属于选自以下的属：酵母属、红酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、红冬孢酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属、油脂酵母属、隐球菌属、或德克拉酵母属。
28.如段落1至27中任一项所述的方法，其中该酵母是酿酒酵母、巴斯德酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、尖孢镰孢、或其任何组合。
29.如段落1至28中任一项所述的方法，其中该酵母是酿酒酵母。
30.如段落1至29中任一项所述的方法，其中该酵母包含编码选自以下的酶的异源多核苷酸：α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、或蛋白酶。
31.如段落1至30中任一项所述的方法，其中在酵母扩培期间添加该过氧化物酶。
32.如段落31所述的方法，其中与在不具有过氧化物酶的酵母扩培最初的24小时内的酵母生长相比，在酵母扩培最初的24小时内的酵母生长增加了10％至50％。
33.如段落19至32中任一项所述的方法，其中与在不具有过氧化物酶的发酵最初的24小时内生产的乙醇量相比，在发酵最初的24小时内生产乙醇的速率增加了10％至50％。
34.如段落19至33中任一项所述的方法，其中与在不具有过氧化物酶的发酵结束时的乳酸绝对滴度相比，在发酵结束时的乳酸绝对滴度降低了10％至50％。
35.如段落19至34中任一项所述的方法，其中与在不具有过氧化物酶的发酵最初的24小时内的乳酸滴度相比，在发酵最初的24小时内的乳酸滴度降低了10％至50％。
36.如段落1至35中任一项所述的方法，其中该过氧化物酶是选自以下的过氧化物酶或过氧化物分解酶：E.C.1.11.1.1NADH过氧化物酶；E.C.1.11.1.2NADPH过氧化物酶；E.C.1.11.1.3脂肪酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.5细胞色素c过氧化物酶；E.C.1.11.1.5；E.C.1.11.1.6过氧化氢酶；E.C.1.11.1.7过氧化物酶；E.C.1.11.1.8碘化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.9谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.10氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.11L-抗坏血酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.12磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.13锰过氧化物酶；E.C.1.11.1.14木质素过氧化物酶；E.C.1.11.1.15过氧化物氧还蛋白；E.C.1.11.1.16通用过氧化物酶；E.C.1.11.1.B2氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B6碘化物过氧化物酶(含有钒的)；E.C.1.11.1.B7溴化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B8碘化物过氧化物酶。
37.如段落1至36中任一项所述的方法，其中该过氧化物酶源自微生物，例如真菌生物，例如酵母或丝状真菌，或细菌；或植物。
38.如段落1至37中任一项所述的方法，其中该过氧化物酶选自：(i)源自嗜热子囊菌属的菌株的过氧化物酶，如橙色嗜热子囊菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:1所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:1具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；(ii)源自嗜热链球菌属的菌株的过氧化物酶，如嗜热链球菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:2所示的过氧化物酶，或与本文的SEQID NO:2具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；或(iii)源自鬼伞属的菌株的过氧化物酶，如灰盖鬼伞菌株，如本文的SEQ ID NO:3所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:3具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶。
39.如段落36至39中任一项所述的过氧化物酶用于扩培酵母的用途。
40.如段落36至39中任一项所述的过氧化物酶在增加酵母的生长和/或生产力中的用途。
41.如段落36至39中任一项所述的过氧化物酶用于在生物燃料生产过程期间在发酵最初的24小时内增加生产乙醇的速率的用途。
42.如段落36至39中任一项所述的过氧化物酶用于在生物燃料生产方法的发酵或在同时糖化和发酵步骤期间降低乳酸滴度的用途。
本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明几方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。所有参考文献针对描述通过引用具体结合。
提供以下实例以说明本发明的某些方面，但不旨在以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。
材料与方法
T.a.过氧化氢酶：具有过氧化物酶活性分类为E.C.1.11.1.6过氧化氢酶并且具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的橙色嗜热子囊菌多肽。
M.t.过氧化氢酶：具有过氧化物酶活性分类为E.C.1.11.1.6过氧化氢酶并且具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的嗜热链球菌多肽。
C.c.过氧化物酶：具有过氧化物酶活性分类为E.C.1.11.1.7过氧化物酶并且具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的灰盖鬼伞多肽。
α-淀粉酶369(AA369)：具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(本文的SEQ ID NO:22)，被截短为491个氨基酸。
葡糖淀粉酶SA(GSA)：包括以下的共混物：在WO 99/28448中披露为SEQ ID NO:34的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、在WO 06/69289中披露为SEQ ID NO:2的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及以本文的SEQ ID NO:9披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的具有以下取代G128D+D143N的微小根毛霉α-淀粉酶(AGU:AGU:FAU-F中活性比为约20:5:1)。
REDSTAR/ETHANOL REDTM(“ER”)：从美国富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentis/Lesaffre)获得的酿酒酵母。
蛋白酶Pfu：本文的SEQ ID NO:26所示的源自强烈火球菌的蛋白酶。
6％YPD培养基：将酵母提取物、蛋白胨、和葡萄糖(代替右旋糖)在去离子水中溶解，然后无菌过滤；葡萄糖占总溶液的6％。
营养培养基：定义的营养培养基由复合碳水化合物、微量金属、和离子组成，与典型的玉米醪相似；用于酵母性能的标准化测量。
Cytation：使用结合了明场和相差显微镜的Biotek CYTATION 5进行。使用集成成像软件来开发基于细胞形状和大小的典型细胞计数方法。
清洁玉米醪：在本实验室中，玉米醪通过在85℃下使用AA369和蛋白酶Pfu液化磨细的玉米2小时来制备。
受感染的玉米醪：用从感染的商业玉米乙醇生产植物分离出的细菌混合物接种MRS培养基。MRS培养物在32℃下过夜生长长达24小时。然后将培养物引入清洁的玉米醪中，并且然后孵育长达24小时，以及然后与20％甘油等分，并且在4℃下保存。在实验之前，将等分样解冻，并且然后以1％w/w的比率称入清洁的玉米醪中。
实例
实例1-用于增强乙醇发酵期间酵母细胞生产和稳健性的过氧化物酶
此实例证明发酵中过氧化物酶的添加增强了乙醇发酵早期的酵母细胞的生产和稳健性，并且特别是在发酵最初的24小时内显著增加乙醇生产并且降低乳酸滴度。
发酵规程
将以1％w/w的感染率注入清洁的醪中的感染的玉米醪称入添加有200ppm尿素的大容器中。将pH调节至约pH 5.0，并且用自来水将％干燥固体(DS)调节至20％DS或32％DS。然后将调节的醪称入15mL法尔肯管(Falcon tube)中，其中最终反应体积为5g。对所有处理，将商业葡糖淀粉酶共混物GSA以0.6AGU/g干固体施用。对单个对照处理，以25ppm施用青霉素。T.a.过氧化氢酶或C.c.以10、50、100、和200ppm施用。添加额外的自来水以标准化处理体积。将Red Star或ER(活性干酵母)在32℃下在自来水中再水化约30分钟，并且然后以0.25g/L投料。将所有样品用顶部具有用于释放CO2的小孔的盖子盖住。在32℃下孵育约24小时(对于20％DS样品)或约60小时(对于32％DS样品)之前，将每个样品剧烈涡旋约15秒。一式三份运行处理。使用离子交换H柱通过HPLC测量目标化合物。测量标准是：麦芽三糖(DP3)、麦芽糖(DP2)、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、乳酸、甘油、乙酸和乙醇。滴度以g/L报道。这些条件用于进行三个分开的研究，结果概述如下。
结果
在第一项研究中，与缺乏过氧化物酶的对照和青霉素对照(图2)相比，发酵期间过氧化物酶的添加显著增加了乙醇滴度。此外，与对照相比，三个处理显示降低的乳酸滴度(图3)。
在第二项研究中，与缺乏过氧化物酶的对照和青霉素对照(图4)相比，发酵期间过氧化物酶的添加显著增加了乙醇滴度。在这种情况下，乳酸滴度不显示下降，而是与对照相比显示几乎相等(图5)。
在第三项研究中，与缺乏过氧化物酶的对照和青霉素对照(图6)相比，发酵期间过氧化物酶的添加显著增加了乙醇滴度。然而，C.c.过氧化物酶似乎不如T.a.过氧化氢酶那样耐受乙醇。如在第一项研究中所见，与对照相比，乳酸滴度降低(图7)。
实例2-用于酵母细胞生长的过氧化物酶
此实例证明过氧化物酶增强酵母细胞生长，并且可用于扩培酵母(例如，用于以商业规模生产酵母，用于乙醇发酵等)。
50mL扩培规程
乙醇红色活性干酵母(ADY)在32℃下在自来水中再水化约30分钟。将50mL YPD培养基无菌等分到带挡板的无菌的125mL烧瓶中。在无菌培养基中接种一圈充满再水合酵母(约10uL)。然后将T.a.过氧化氢酶以5、25、50、和200uL的产物施用。将无酶的处理用作对照A。加入额外的无菌水作为液体平衡。将处理在32℃下用100rpm旋转振动孵育约1小时。通过使用明场显微镜技术和细胞计数软件在Cytation上检查细胞来进行酵母细胞的测量。Cytation制备由将20uL稀释样品放入底部透明的黑色384孔板的孔中组成。每孔取20张图像，然后在所有图像间平均计数。样品一式四份。
14L扩培规程
在大规模扩培之前，酵母(酿酒酵母)最初在营养培养基中扩培以允许细胞达到某个密度。在30℃搅拌下，在液体营养培养基中进行2L规模扩培长达24小时。将2L扩培的一部分用于接种酵母细胞生产的14L反应器。在酵母接种前，将0.5mL/L浓缩的液体T.a.过氧化氢酶产物或3mL/L的浓缩M.t.过氧化氢酶产物以14L规模引入。14L反应在30℃至35℃搅拌长达50小时下，在液体营养培养基中进行，随时间滴定。
结果
显示无菌营养培养基中酵母细胞生长的Cytation图像在下图(图8A、图8B、图8C、图8D、和图8E)中显示。由于T.a.过氧化氢酶产物的的滴定增加，因此酵母细胞数也增加，即酵母细胞生物量的生成。使用软件和明场显微镜技术进行计数。如图8E和图9所示，由于细胞经常聚集在一起，因此较大的种群密度有可能被低估。
据报道，在14L扩培中，与对照相比，反应结束时酵母细胞生物量增加10％(图10)。这表明T.a.过氧化氢酶或M.t.过氧化氢酶的添加可以增加酵母细胞的生长(使用相等的营养物输入)。
实例3-用于扩培期间酵母细胞的生产和稳健性的过氧化物酶
此实例证明过氧化物酶增强了酵母生长和/或生产率，例如，在过氧化物酶存在下扩培的酵母在扩培最初的6小时内消耗了更多的葡萄糖并且产生了更高的乙醇滴度。出乎意料的是，当将扩培酵母转移至发酵中并用感染激发酵母时，如通过降低的乳酸滴定法测量的，用过氧化物酶处理的酵母能更有效地胜过感染。
扩培规程
将干净的醪稀释至20％干燥固体(DS)，然后添加1000ppm尿素和商业葡糖淀粉酶共混物GSA。然后将底物称入125mL带挡板的摇瓶中。将浓缩的T.a.过氧化氢酶产物以10uL至高达450uL施用至处理中。所有处理的最终工作体积是50g。将青霉素和无处理用作对照。将Ethanol Red或Red Star的活性干酵母再水化，并且然后在所有处理中以相同的细胞密度接种。将样品在32℃下搅拌孵育约6小时。进行HPLC测量并且分析可溶性碳水化合物和有机酸。
发酵规程
将以1％w/w的感染率注入清洁的醪中的感染的玉米醪称入添加有1000ppm尿素的大容器中。将pH调节至约pH 5.0，并且用自来水将％干燥固体(DS)调节至32％DS。然后将调解的醪称入Ankom罐。对所有处理以商业相关的等同量施用商业葡萄糖淀粉酶，GSA。在发酵期间不使用其他的过氧化氢酶。将扩培处理以工作发酵体积的5％转移到发酵处理中，总工作量为50g。发酵处理一式三份地进行。使用Ankom压力监测器盖罐子，并且在整个发酵过程中记录气体释放，以psi报道。使用离子交换H柱通过HPLC测量目标化合物。测量标准是：麦芽三糖(DP3)、麦芽糖(DP2)、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、乳酸、甘油、乙酸和乙醇。滴度以g/L报道。
结果
在过氧化氢酶存在下扩培的酵母消耗更多的葡萄糖(图11A)，并且在扩培期间产生更高的乙醇滴度(图11B)。当扩培转移到发酵中时，用过氧化氢酶处理产生的排气速率比未处理或青霉素处理的对照更快(图12)。其结果是，当酵母受到感染系统的攻击时，如通过更低的乳酸滴度测得的，用过氧化氢酶处理的酵母能够更有效地克服和竞争感染(图13A)。即使在约60小时的时间时测量的发酵，所有处理中的乙醇滴度都相当平坦(图13B)。然而，DP2滴度随过氧化氢酶剂量增加而下降(图13C)。
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Claims (15)

1.一种用于增强酵母生长和/或生产力的方法，该方法包括使酵母与有效量的过氧化物酶接触。
2.一种用于生产酵母的方法，该方法包括在有益于酵母生长的条件下培养如权利要求1所述的酵母。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中相比于不与多肽接触的酵母的生长，该酵母的生长从10％增加至50％。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中相比于不与多肽接触的酵母的生产力，该酵母的生产力从10％增加至50％。
5.一种组合物，该组合物包含如权利要求1至4中任一项所述的方法生产的酵母，和选自以下的至少一种组分：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、抗氧化剂、和其任何组合。
6.如权利要求5所述的组合物，该组合物被配制为膏状酵母、压缩酵母、粉碎酵母、或活性干酵母。
7.一种容器，该容器包含如权利要求5或6所述的组合物，其中该容器任选地选自装载箱、加药撬块、包、袋、或发酵容器。
8.一种在生物燃料发酵系统中扩培用于生物产品生产的酵母的方法，该方法包括将包含过氧化物酶的酶组合物引入生物燃料发酵系统中，其中该发酵系统包含一种或多种发酵容器、管道和/或组件，并且其中以足以增强该生物燃料发酵系统中酵母生长和/或生产力的浓度添加该过氧化物酶。
9.一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化以形成液化的醪；
b)使用产碳水化合物源的酶将该液化的醪糖化以生产可发酵糖；
c)在适于生产该发酵产物的条件下，使用发酵生物将该糖发酵，
其中在糖化步骤b)和/或发酵步骤c)之前或期间添加过氧化物酶。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在酵母扩培期间添加该过氧化物酶。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该过氧化物酶是选自以下的过氧化物酶或过氧化物分解酶：E.C.1.11.1.1NADH过氧化物酶；E.C.1.11.1.2NADPH过氧化物酶；E.C.1.11.1.3脂肪酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.5细胞色素c过氧化物酶；E.C.1.11.1.5；E.C.1.11.1.6过氧化氢酶；E.C.1.11.1.7过氧化物酶；E.C.1.11.1.8碘化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.9谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.10氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.11L-抗坏血酸过氧化物酶；E.C.1.11.1.12磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶；E.C.1.11.1.13锰过氧化物酶；E.C.1.11.1.14木质素过氧化物酶；E.C.1.11.1.15过氧化物氧还蛋白；E.C.1.11.1.16通用过氧化物酶；E.C.1.11.1.B2氯化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B6碘化物过氧化物酶(含有钒的)；E.C.1.11.1.B7溴化物过氧化物酶；E.C.1.11.1.B8碘化物过氧化物酶。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该过氧化物酶源自微生物，例如真菌生物，例如酵母或丝状真菌，或细菌；或植物。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中该过氧化物酶选自：(i)源自嗜热子囊菌属的菌株的过氧化物酶，如橙色嗜热子囊菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:1所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:1具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；(ii)源自嗜热链球菌属的菌株的过氧化物酶，如嗜热链球菌的菌株，如本文的SEQ ID NO:2所示的过氧化物酶，或与本文的SEQID NO:2具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶；或(iii)源自鬼伞属的菌株的过氧化物酶，如灰盖鬼伞菌株，如本文的SEQ ID NO:3所示的过氧化物酶，或与本文的SEQ ID NO:3具有至少60％、优选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的过氧化物酶。
14.如权利要求11至13中任一项所述的过氧化物酶在增加酵母生长和/或生产力中的用途。
15.如权利要求11至13中任一项所述的过氧化物酶用于在生物燃料生产方法的发酵或同时糖化和发酵步骤期间降低乳酸滴度的用途。
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