[go: up one dir, main page]

CN1120310A - 在粘膜表面转运免疫原的聚合粘膜粘合剂 - Google Patents

在粘膜表面转运免疫原的聚合粘膜粘合剂 Download PDF

Info

Publication number
CN1120310A
CN1120310A CN94191614A CN94191614A CN1120310A CN 1120310 A CN1120310 A CN 1120310A CN 94191614 A CN94191614 A CN 94191614A CN 94191614 A CN94191614 A CN 94191614A CN 1120310 A CN1120310 A CN 1120310A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mucoadhesive
antigen
immunity
virus
adjuvant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN94191614A
Other languages
English (en)
Inventor
J·D·邓肯
D·P·谢弗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SECRETECH Inc
Original Assignee
SECRETECH Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SECRETECH Inc filed Critical SECRETECH Inc
Publication of CN1120310A publication Critical patent/CN1120310A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A61K9/006—Oral mucosa, e.g. mucoadhesive forms, sublingual droplets; Buccal patches or films; Buccal sprays
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/5555—Muramyl dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4891—Coated capsules; Multilayered drug free capsule shells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

一种诱导动物对感染媒介产生免疫反应的药物组合物，它含有对抗该感染媒介的抗原、粘膜粘合剂和任选的佐剂，以提高动物对抗原的免疫反应，抗原最好来自流感病毒。该药物组合物经口服给动物，可用于使动物免疫的方法中。

Description

在粘膜表面转运免疫原的聚合粘膜粘合剂
本发明是1993年9月13日提交的(代理案号为05060-0003-01000)序号为08/119578的申请的部分继续申请，后者又是1993年3月11日提交的(代理号为05060-0003-00000)的序号为08/029668的申请的部分继续申请。所有这些申请的全部内容在这里提出作为参考文献。
口服免疫原成本低，安全并可促进顺应性。现已部分证明，刺激小肠的免疫活性组织和细胞会通过普遍的粘膜免疫系统刺激其它的粘膜表面的保护性免疫应答。在某些场合下，这种刺激也会导致血清反应。然而，现今在医疗中口服疫苗的应用只局限于少数疫苗。
有代表性的是，口服免疫需要相当高剂量的免疫原引起保护性免疫反应，并且有些疫苗在口服时不能引起反应。此外，尝试经减毒作用增加疫苗的安全性以及应用合成的和亚单位制剂，通常生成的抗原制剂比整个的全抗原功效差。
已将包括有胞壁酰二肽和氟化物的各种佐剂与实验性口服疫苗合用，以便尝试经刺激免疫细胞的反应能力而提高免疫反应。另一种佐剂途径是把抗原包到颗粒内，从而使抗原成为容易被免疫系统细胞吸收的形式。例如将抗原掺入到或结合于聚合微粒、毫微粒或脂质体中，常常比可溶性抗原更具免疫原性，这些颗粒状抗原由于落入到粘膜中，或选择性地被肠粘膜的M细胞捕获而更加有效。
口服  免疫原后的免疫反应也可由于使用的免疫原选择性地结合于上皮细胞(例如流感血凝素、霍乱弧菌)或将免疫原偶联到选择性地与这些细胞结合的化合物(例如肠内细菌的粘附蛋白，如志贺菌病或假单胞菌病；类毒素如霍乱或百日咳类毒素，或花粉粒)上而提高。
但仍然需要一些方法和组合物以在服用免疫原后增强在粘膜表面的免疫反应。
本发明的目的是在服用免疫原后增强在粘膜表面的免疫反应。本发明的一个实施方案是将免疫原与聚合粘膜粘合剂缔合，而诱导或增加了经口服或其它的粘膜途径免疫后的免疫反应。药物转运(特别是用透皮和口含方法)的粘膜粘合剂和其它生物粘合剂的理论和实用价值是本领域中皆知的，但免疫原与粘膜粘合剂一起使用以增强免疫反应迄今是未知的。
本发明的另一实施方案是用佐剂与免疫原和聚合粘膜粘合剂诱导或增加经口服或经其它粘膜途径免疫后的免疫反应。免疫原与粘膜粘合剂合用口服时佐剂的有效性以前也是未知的。
在制药领域内皆知给宿主皮下注射免疫原可产生可接受的免疫反应。此外，粘膜给药，尤其是口服免疫原虽然常常不太理想，但仍能在某些场合下产生免疫反应。本发明的免疫组合物和免疫方法是当给缩主的粘膜表面施用免疫原时，可以增强宿主的免疫反应，应用这种给药方式，本发明可以在一些情况下，获得全身性免疫反应，其强度和持续时间很接近于用同样抗原给宿主皮下注射时所达到的效果，而获得的粘膜免疫反应比单独皮下注射抗原或粘膜施用抗原时的反应更强。
实施本发明是用含有已知人用或兽用的各种常规免疫原的免疫组合物，以刺激宿主的免疫反应。这里所用的术语“免疫原”是指给到机体内可刺激体液的、粘膜的或细胞介导的免疫性的物质。术语“免疫原”和“抗原”在此是通用的。
这里所用的术语“免疫反应”是指接触到免疫原后，所产生的对外来抗原反应性的特异性改变，如通过在粘膜或血清中抵抗免疫原的抗体增加，或者通过度量细胞介导的免疫性例如细胞素活性或增生所表明的。
本发明产生的免疫反应常规上是测定粘膜的免疫性的改变，例如用ELISA测定唾液IgA的变化或测定全身免疫性的变化，例如用ELISA测定抗体水平的变化，或测定细胞免疫性的变化，例如测定T细胞的增生反应。在对流感病毒进行免疫的情况下，也可以用测定血清血凝素抑制滴度(HI)的方法。在流感的情况下，当使用这些分析方法时本发明可使小鼠获得的免疫反应与皮下注射等量的同样物质后在大致相同的时间内获得的免疫反应在强度上大约是相同的。
经口服或其它粘膜途径进行本发明的免疫之后，可用于刺激普遍的粘膜免疫系统的免疫原种类包括(非限制性)：1)能够经粘膜表面而产生免疫反应的各种传染性疾病的抗原，尤其是包括天然的粘膜免疫原(例如流感病毒、肠内细菌如大肠杆菌、霍乱弧菌扣螺旋杆菌的抗原)，这些粘膜免疫原可通过与粘膜上的配体和受体特异的相互作用而结合到粘膜上皮细胞上；2)减毒的活肠内病原体(例如脊髓病毒或轮状病毒)；3)合成的颗粒状抗原(例如含抗原的微球和毫微球)；4)与粘膜结合的过敏原(例如豚草花粉)；和5)自身抗原和组织抗原(例如髓鞘质碱性蛋白、CD4、黑色素瘤特异性蛋白)。
免疫原制剂，可以是完全免疫原，改性免疫原，合成免疫原或上述免疫原的亚单位，可来自病毒(例如流感、HIV、轮状病毒或肝炎病毒)、细菌(例如志贺菌病、百日咳杆菌或衣原体)、原核寄生生物(例如引起疟疾的疟原虫)，毒素(例如霍乱毒素或内毒素)、过敏原(例如豚草花粉)或组织标志物(例如黑色素瘤CD4，或髓鞘质碱性蛋白)。
本发明优选的实施方案中所用的免疫原来自病毒。本发明适用于可望用疫菌抵抗的多种病毒。本发明尤其适用于抵抗普通呼吸或肠道病毒。为说明起见，这里用流感病毒加以说明。然而本发明无意只限于流感病毒，也不局限于在所述的实施方案中所用的流感病毒株。可用本发明抵抗的其它病毒例如包括副流感病毒，呼吸合胞体病毒、鼻病毒，冠状病毒和腺病毒。
对于流感病毒，选择产生疫苗的病毒部分地取决于希望能获得预防的流感病毒株式亚型。为了能获得对特定流感病毒株有用的疫苗，最好用具有至少一个抗原决定簇的流感病毒株作为疫苗的原料，这种病毒株同可用疫苗抵抗的病毒株相同。
应当认识到，本发明可以使用各种动物的流感病毒型和亚型，以及某种亚型的不同株系。该流感病毒有代表性的是可感染动物，例如鸡、鸭和猪的病毒。本发明尤其适用于包括人的灵长类动物，例如可用人流感亚型HON1、H3N8、H2N2(大流行性亚洲病毒)、H3N2(大流行性香港病毒)H1N1(大流行性俄罗斯病毒)，或由抗原性的不连续变异引起的其它病毒亚型，以及由抗原性的连续变异造成的亚型。一种用于本发明的某亚型毒株的实例是流感病毒A/Udorn/307/72(H3N2)，为B.R.Murphy博士(美国国立卫生研究所，Bethesda，Md)所赠。该亚型是人流感病毒株，也可感染鼠猴和小鼠。该A/Udorn/307/72亚型非常适用于动物实验，例如小鼠感染模型。
在本发明中粘膜粘合剂与免疫原一起使用以增加该免疫原向粘膜免疫系统的转运功效。在制药工业上现有各种粘膜粘合剂用于药物转运，如成膜剂和粘度增加剂，在食品工业中也有应用，并被食品与药品管理局认定一般是安全的。实例包括：羧甲基纤维素钠，Carbopol，聚亲碳剂，藻酸钠和羟丙基甲基纤维素。
本发明者确信对于口服免疫粘膜粘合剂与粘蛋白层的相互作用，可以使粘膜粘合剂和任何相连的免疫原结合于与所有肠粘膜相连的粘蛋白上。这种缔合可增加所连化合物与粘膜相互作用的功效，是通过(1)将化合物从肠的中心腔移到粘膜上皮相连的相对不动的粘液层上，从而增加了化合物具有与小肠粘膜的免疫细胞及其免疫活性细胞相互作用潜力的时间；(2)化合物从腔中体积的流体和物质上分布到与粘膜邻近的粘蛋白比较薄的膜层上，从而提高了化合物的有效浓度；(3)由于聚集于该粘蛋白层上，该聚合粘蛋白阻碍了扩散作用而使免疫原免受肠内PH变化和分解代谢酶的影响，使免疫原不致于失活，该免疫原与粘膜粘合剂聚合物的相互作用可使免疫原免受相变化和胆汁盐的清洁作用的影响。最后，粘膜粘合物的亲水性质致使该脱水粘膜粘合剂将水从其直接环境中除去。粘膜上皮层的这种脱水作用会增加免疫原的生物利用度。此外，免疫原与聚合物的缔合也可使免疫原稳定化。虽然这些因素可以解释粘膜粘合剂的有效性，但本发明者无意只限制于这些解释上。
该已知的粘膜粘合剂是聚合物，它通过一种或多种机制结合于聚合的带负电荷的粘蛋白上，这些机制包括疏水性相互作用，范德华力，带电荷基团的相互作用，聚合物掺合作用和直链缔合使用，特异性残基的结合和受体与配体的相互作用。所有已知的粘膜粘合剂都是聚合物，这当然在文献中是已知的，但单体型粘膜粘合剂也是可能的。
粘膜粘合剂本身一般没有免疫原作用，许多种对人是安全的。现今它们用作拟粘液剂，如外科粘胶，愈伤助剂，止泻剂和抗便秘剂，以及用于药物转运。粘膜粘合剂已成功地用于药物的透皮转运系统，包括肽类药物以及药物的鼻腔给药(例如利尿剂和胰岛毒)，以及在口腔中药物(如甾类)的控释和定位转运。粘膜粘合剂虽然在胃肠道免疫中用作储存佐剂，并经研究证明是肽类药物的潜在控释转运系统，但是在以前未被用于疫苗的粘膜转运。
作为粘膜粘合剂的化合物的实例可考虑包括有：羧甲基纤维素钠、聚(丙烯酸)，西黄蓍胶，聚(甲基乙烯醚共聚马来酸酐)，聚(环氧已烷)，甲基纤维素，藻酸钠，羟丙基甲基纤维素，刺梧桐树胶，甲基乙基纤维素，可溶性淀粉，明胶，果胶，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(羟乙基丙烯酸甲酯)，羟丙基纤维素，Carbopl，聚亲碳剂。这些粘膜粘合剂可用于本发明的组合物和方法中。优选的粘膜粘合剂是羧甲基纤维素钠和其它纤维素类，聚亲碳剂和Carbopol。羧甲基纤维素钠是尤其优选的粘膜粘合剂。也要认识到这些粘膜粘合剂的混合物也是可以用的。
本发明的免疫组合物也可包括足以增强宿主免疫反应的强度和持续时间用量的，或增强宿主的定量反应(例如通过刺激不同的免疫球蛋白的抗体而不是被免疫原刺激的那些抗体)的佐剂。佐剂应有效地引发细胞介导的和体液的对抗原的免疫反应，而对宿主系统无全身性或局部刺激。佐剂最好有低热原性。可以使用已知的人用或兽用佐剂组合物。这些佐剂可以基于乳剂，有或没有分枝杆菌，或者佐剂基于抗原吸附于铝盐，尤其是氢氧化铝或磷酸铝上。这些佐剂中的油佐剂，可以基于矿物油、动物油或植物油。油佐剂用于增加家畜对抗原疫苗的体液反应，某些油佐剂已试验用于人。有代表性的佐剂是Freund完全佐剂和Freund不完全佐剂。
最近开发的适宜的佐剂，包括脂质体，免疫刺激复合物(IS-COMs)和角鲨烯或角鲨烯乳剂。也可以用有佐剂活性的表面活性剂。在ISCOMs和Pluronic嵌段共聚物中这些佐剂包括皂草苷样QuilA分子，用来制备稳定的角鲨烯乳剂。皂草苷是广泛分布于植物中的表面活性剂。
胞壁酰二肽(MDP)或胞壁酰三肽(MTP)的类似物，例如具有佐剂活性和减低的副作用的MDP苏氨酸类似物和脂多聚糖(LPS)也适用作为佐剂。LPS证明对小鼠可产生良好的效果。MDP的合成类似物和脂质A的一磷酰衍生物也已知有佐剂活性和减低的热原性。另一个适宜的肽是合成的胞壁酰肽MTP-PE(N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-[1，2-二棕榈酰-Sn-甘油基-3-(羟磷酰氧基)]乙酰胺。尤其适宜的制剂是Syntex佐剂制剂-1或SAF-1，它是将在由Pluronic L-121三嵌段聚合物构成的载体中的MDP的苏氨酰类似物与角鲨烯和少量的吐温80相结合，吐温80是乳化清洁剂。用于人的优选佐剂是MDP及其类似物，有或没有角鲨烯，皂草苷和脂质A的一磷酰衍生物。
其它化合物证明在与抗原共同口服时有佐剂活性。这些佐剂包括牛胆汁、聚阳离子，如DEAE-4，葡聚糖和聚鸟氨酸，十二烷基苯硫酸钠，脂质结合物质，链霉素、维生素A以及其它可影响粘膜表面的结构或功能完整性的试剂。
本发明组合物和方法中佐剂与免疫原和粘膜粘合剂组合时，可观察到免疫反应的进一步增强。再者，虽然没有任何现成的理论说明，但该粘膜粘合剂可以使免疫原和佐剂容易呈递给反应细胞，从而以协同方式增强这些物质的效应。
可用于服用抗原的粘膜粘合剂，所接触的粘膜表面包括有胃肠道粘膜(包括胃、小肠、大肠、结肠和直肠)；口腔粘膜(包括口腔和食道粘膜和扁桃体表面)；呼吸道粘膜(包括鼻、喉头、气管和支气管粘膜)；生殖器粘膜(包括阴道、子宫颈和尿道粘膜)以及眼粘膜。给宿主服用本发明组合物的优选途径是口服、鼻腔、直肠和扁桃体拭子。尤其优选的用药途径是口服，因为用法简单，相对无损伤性。要认识到各种用法可联合使用。例如开始是口服，辅助以鼻腔给药，反之也行。
要认识到本发明的免疫组合物也可用于疫苗中。该疫苗可以是含有作为免疫原的抗原的治疗物质，所述的抗原来自一种或多种病原微生物，给予人或动物后可刺激自动免疫，并使机体免受被这些或有关微生物的感染或减低感染程度。该疫苗可为活疫苗，灭活疫苗，减毒疫苗、亚单位或混合疫苗。
本发明组合物可掺加到各种适宜的转运系统中。例如，抗原，粘膜粘合剂和佐剂可与药用液体载体，例如水、缓冲食盐水溶液，或可食性动物或植物油合用。组合物可与一种或多种适宜的药用赋形剂或芯材，例如纤维素，纤维素衍生物，蔗糖、明胶、淀粉1500，NuTab，乳糖、麦芽糊精，滑石粉，卡波夕耳、硬脂酸镁、藻酸盐，Actisol，PEG400，Myvacet，三醋精、糖浆、油、山梨糖醇、甘露糖醇和Plasdone合用，并不只限于所举出的这些物质；也可用其它的或另外的赋形剂或芯材。
也要认识到，本发明组合物制成的剂型中也可含有能中和胃酸的化学试剂。适宜的中和剂包括H2拮抗剂、碳酸氢钠，碳酸钙和氢氧化铝。
本发明组合物可以酏剂、溶液、悬浮液、糖浆剂、气雾剂等剂型使用。组合物也可制成适于口服的剂型单位，如小颗粒剂、颗粒剂、药珠、片剂、硬明胶胶囊和软明胶胶囊。
免疫组合物可加以处理，以保护抗原、粘膜粘合剂和佐剂使其在到达靶部位之前免受降解作用。一种实施方案是将剂型单位如片剂或胶囊剂用常规方法，包括(但不限于)衣锅包衣；流化床包衣(例如Wurster法)或顶喷雾法包衣；喷雾干燥和乳化或微囊方法包上肠溶衣。还可任选地使用亚包衣剂，例如羟丙基甲基纤维素，Opadry或Dryclean。肠衣适用于各种剂型单位。肠溶衣剂可以是各种用于保护抗原和使抗原在肠内释放的药用材料。亚包衣剂或肠溶衣剂的选择和用量是本领域的常规技术，部分取决于剂型，例如片剂或胶囊剂。适宜的肠溶衣剂有HPMCP5s(羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸脂，CAP(乙酸邻苯二甲酸纤维素)，Eudragit Aguateric，Coa-teric，Surlease Shellac和蜡。
免疫原、粘膜粘合剂和佐剂合用的用量应能使宿主对传染物产生免疫反应。这可由血清阳转，即在免疫前后的抗体水平的估测加以确定。如果宿主对抗原预先有抗体滴度，则免疫的成功取决于该特异性抗体水平的增加程度，如果在血清阳转和保护作用之间没有相关性，则可监测细胞介导的免疫反应。
每个剂量单位中抗原、粘膜粘合，剂和佐剂的含量取决于所需的剂量和给药频度。若组合物中抗原为流感病毒、粘膜粘合剂为羧甲基纤维素，佐剂为胞壁酰二肽，则单个剂量单位可含有：抗原量为大约10μg到150μg血凝素(HA)，优选为大约5μg到45μgHA；粘膜粘合剂量大约为10μg到1g，优选为1μg到50μg；佐剂量大约为1μg到2μg，优选为大约10μg到200μg，抗原∶粘膜粘合剂∶佐剂的相对重量比此时大约为5-45∶1000-50000∶0-200。精确的组合物必然根据选用的抗原、粘膜粘合剂和佐剂、被免疫的动物种类和其它因素而变化，本领域的技术人员能够找到最佳配方。加强剂量所包含的抗原量要足够增强起始的免疫反应。采用的每个方案都得根据抗原和宿主的情况。对于儿童和以前未接触过疫苗的人更适宜用多剂量。一个实施方案是每个剂量单位含有的流感抗原量要能有效保护动物使其在接触到该病毒后不会感染疾病。
剂量的定义是提高个体免疫反应所必需的免疫原量。例如，血清中同源中和抗体水平是个体对同源流感病毒株感染的易感性的表征，血清血凝抑制滴度大约为1∶32或1∶4或更高时，被认为可抵抗同源病毒的自然感染。因此，流感抗原的优选剂量是按标准方法测定可以使血清血凝滴度大约是1∶32或1∶40或更高的剂量。
免疫原的保护作用也可用血清血凝素抑制作用水平的提高或者在免疫后发现的粘膜抗体滴度的增高来表示，在流感的治疗时，免疫后7-21天内血清中HI滴度增加4倍被认为是有保护性的。7-21天内粘膜抗体滴度(例如唾液中IgA或洗鼻水中IgA)增高4倍量，也被某些认为对流感有保护作用。因此，本发明免疫组合物的优选剂量可使人体的特异性抗体水平提高到这样的程度。可调整免疫剂量直到获得可检测出的抗体滴度，优选获得中和抗体滴度。
要认识到本发明所用的免疫原可对抗各种寄生虫、细菌或病毒的各种型与亚型，以及某种亚型的不同株系。寄生虫、细菌或病毒有代表性的是可感染动物，例如狗、猫、家禽、猪、马和牛，尤其是哺乳类，例如包括人类的灵长类、免疫原可在给粘膜粘合剂或佐剂之前或之后给药，但一般是免疫原粘膜粘合剂和佐剂。
本发明免疫原给合物的制备可简单地将免疫原、粘膜粘合剂和佐剂加以混合而无共价键结合，或者是将诸成分偶联在一起。因此本组合物还有容易制备的优点。
下面的实施例将更详细地说明本发明。
实施例1
疫苗抗原
流感病毒A/Udorn/307/72(H3N2)，BK6，Egg3，克隆3A(7-25-89)为B.R.Murphy博士(NIH，Bethesda，MD)所赠。该病毒在鸡胚中传代一次，尿囊液作为储备病毒存放于-130℃(感染滴度为每0.2ml有2.53×107蚀斑形成单位(P.F.U)。10天的鸡胚(400-500)用0.1ml的储备病毒感染，该病毒以1∶1000稀释于补充有SPG的L-15介质(2.18M蔗糖，0.038M KH2PO4，0.072MK2HPO4和0.049M谷氨酸单钠中。于35-36℃温育48小时后，收集尿囊液，于3700gav离心20分钟使澄清化。再于1000000gav离心45分钟自上清液中收集病毒。将小丸于0℃于0.5ml磷酸盐缓冲食盐水溶液(PBS)中放置过夜，再用PBS稀释至6ml剧烈混合，于1300gav离心15分钟以除去聚集物。该操作重复三次。第三次离心后，将小丸超声化，再离心。将收集的含有病毒悬浮液的上清液加到10-60％于PBS连续蔗糖梯度顶部，于无摇摆旋转器上离心2小时(1000000gav)。收集病毒带，用PBS1∶1稀释，病毒与福尔马林(1∶4000V/V)于37℃温育72小时被灭活。于4℃下对PBS过夜透析，如上述离心得小丸，再悬浮于PBS或水中使每ml含量蛋白质5mg，存放于-80℃。用考马斯蓝结合试验(Pierce，Rockford，IL，USA)测定蛋白质中经氢氧化钠破坏了的病毒。
制备具有粘膜粘合剂的疫苗
按制造厂提供的简便方法制备各种粘膜粘合剂的凝胶，用于本实验的羧甲基纤维素钠(CMC)购自Agualon(Wilmington，DE)。将CMC凝胶制成2％水溶液。Carbopol和聚亲碳剂(Polycarbophil)丙烯酸聚合物购自B.F.Goodrich(克利弗兰，俄亥俄)。由这些聚合物制备凝胶是将Carbopol制成0.25％水悬浮液，聚亲碳剂制成0.5％水悬浮液。这些溶液在加入数滴IN NaOH后pH大约从3升至4。当pH达到4时，该丙烯酸聚合物悬浮液变成凝胶。藻酸钠购自Kelco(为Merck&Co.，Inc(圣迭哥，(A)的分支)，将凝胶制成2％水溶液。Zilactin购自Zila药厂(凤凰城，AZ)。在免疫之前立即制备1∶10的Zilactin水溶液。
流感病毒溶液(每10μl磷酸盐缓冲食盐水溶液中含50μg病毒蛋白)与粘膜粘合剂凝胶以1∶50(疫苗∶凝胶)的比例混合(每个剂量含10μl疫苗溶液和490ul粘膜粘合剂)。在所有情况下，混合只需简单搅拌大约1～2分钟，直到肉眼观察成均相溶液即可，并且在免疫前立即混合。
小鼠的免疫
BALB/C小鼠(8周龄，雌鼠)得自Charles River或Jackson实验室，5只一组。用灌胃针头给小鼠灌胃疫苗(于粘膜粘合剂中)500μl。一个对照组是流感疫苗(于0.1M NaHCO3溶液中)也灌胃给药。
对照组的全身免疫是用游离抗原(50μg/小鼠)(于生理食盐溶液中)经皮下注射进行的。
样品的收集
免疫后在选定的时间和免疫之前自小鼠尾静脉取血。离心分离出血浆，冷冻。腹腔注射氯化氨基甲酰胆碱(1μg/小鼠)，刺激分泌出唾液，用毛细管收集。加入大豆胰蛋白酶抑制剂，苯基甲基磺酰氟、叠氮化钠和胎牛血清各2ug，澄清后贮存于-80℃。
ELISA
为了测定抗原特异性抗体，于用浓度为4μg/ml的纯化的A/U-dorn流感病毒覆盖的96孔聚苯乙烯微量滴板(Dynatech，Alexandri-a，Va，USA)上进行ELISA。血清和唾液的终点滴度用辣根过氧化物酶标记的抗小鼠Ig或IgA的山羊IgG(Southern Biotechnolvgy As-sociates Birmingham，Al，USA)和底物2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉)磺酸(Sigma，St.Louis，MO，USA)进行测定。显出的颜色用Vmax光度计(Molecular Devices，Polo Alto，CA，USA)于414nm进行测定。
HI测定
血凝抑制(HI)反应是用小鼠血清以PBSA按1∶5的比例稀释后进行的，并且经处理除去非特异性抑制剂(于56℃加热30分钟；与15％酸处理过的高岭土温育30分种；与10％鸡红血球悬浮液温育30分钟)。在96孔微量滴板上对血清作两倍稀释。每孔中加入病毒悬浮液(8HA单位，用等体积加入)，室温下温育30分钟。每井中加入0.5％鸡红血球悬浮液，室温下温育45-60分钟。HI滴度被表示为完全抑制了红血球的血凝作用的最高稀释的倒数。
实施例2
疫苗抗原
流感病毒A/Udorn/307/72(H3N2)，BK6，Fgg3，克隆3A(7-25-89)为B.R.Murphy博士(NIH，Bethesda，MD)所赠。该病毒在鸡胚申请传代一次，尿囊液作为储备病毒于-130℃存放(感染滴度为每0.2ml有2.53×107蚀斑形成单位(p.f.u)。10天的鸡胚(400-500)用0.1ml的储备病毒感染，该病毒以1∶1000稀释于补充有SPCT的L-15介质(2.18M蔗糖，0.038M KH2PO4，0.072MK2HPO4和0.049M谷氨酸单钠)中。于35-36℃温育48小时后，收集尿囊液于370gav离心20分钟使澄清化。小丸于0.5ml磷酸盐缓冲食盐水溶液(PBS)于O℃放量过夜，用PBS稀释至6ml，剧烈混合，于1300gav离心15分种以除去聚集物。该操作重复3次。第3次离心后，将小丸超声，再离心。将收集的含有病毒的悬浮液的上清液加到10-60％于PBS的连续蔗糖梯度顶部，于无摇摆旋转器上离心(1000000gav)2小时。收集病毒带，用PBS1∶1稀释，病毒与福尔马林(1∶4000V/V)于37℃温育72小时被灭活。于4℃下对PBS过夜透析，如上述离心得到小丸，再悬浮于PBS或水中使每ml中含蛋白质5mg，存放于-80℃。用考马斯蓝结合试验(Pierce，Rock-ford，IL.USA)测定蛋白质中经氢氧化钠破坏了的病毒。
制备具有粘膜粘合剂的疫苗
按照制造厂提供的简便方法制备各种粘膜粘合剂的凝胶。用于本实验的羧甲基纤维素钠(CMC)为7MF购自Agualon(Wilming-fon，DE)，将CMC凝胶制成2％水溶液。Carbopol和聚亲碳剂(Poly-carbophil)丙烯酸聚合物购自B.F.Goodrich(克利弗兰，俄亥俄)。由这些聚合物制备凝胶是将Carbopol制成0.25％水悬浮液，聚亲碳剂制成0.5％水悬浮液。这些溶液在加入数滴氢氧化钠(IN)溶液后pH大约从3升到4。当PH达到4时，该丙烯酸聚合物悬浮液变成凝胶。藻酸钠购自Kelco(为Merck&Co.，Inc(圣迭哥，(A)的分支)，将凝胶制成2％水溶液。Zilactin购自Zila药厂(凤凰城，AZ)。在免疫之前立即制备1∶10的Zilactin水溶液。
流感病毒溶液(每10μl磷酸盐缓冲食盐水溶液中含50μg病毒蛋白)与粘胶粘合剂凝胶以1∶50(疫苗∶凝胶)的比例混合(每个剂量含40μl疫苗溶液和490μl粘膜粘合剂)。在所有情况下，混合只需简单搅拌大约1～2分钟，直到肉眼观察成均相溶液即可，并且在免疫前立即混合。
小鼠的免疫
BALB/C小鼠(8周龄，雌鼠)得自Charles River或Jackson实验室，5只一组。用灌胃针头给小鼠灌胃疫苗(于粘膜粘合剂中)500μl。一个对照组是流感疫苗(于0.1M NaHCO3溶液中)也灌胃给药。
对照组的全身免疫是用游离抗原(50μg/小鼠)于生理食盐溶液中)经皮下注射进行的。
样品的收集
免疫后在选定的时间和免疫之前自小鼠尾静脉取血。离心分离出血浆，冷冻。腹腔注射氯化氨基甲酰胆碱(1μg/小鼠)，刺激分泌出唾液，用毛细管收集。加入大豆胰蛋白酶抑制剂，苯基甲基磺酰氟、叠氮化钠和胎牛血清各2μg，澄清后贮存于-80℃。
ELISA
为了测定抗原特异性抗体，于用浓度为4μg/ml的纯化的A/U-dorn流感病毒覆盖的96孔聚苯乙烯微量滴板(Dynatech，Alexandri-a，Va，USA)上进行ELISA。血清和唾液的终点滴度用辣概括过氧化物酶标记的抗小鼠Lg或Ig的山羊IgG(Sorthern BiotechnolvgyAssociates Birmingham，Al，USA)和底物2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉)磺酸(Sigma，St.Louis，MO，USA)进行测定。显出的颜色用Vmax光度广场(Molecular Devices，Polo Alto，CA，USA)于414nm进行测定。
HI测定
血凝抑制(HI)反应是用小鼠血清以PBSA按1∶5的比例稀释后进行的，并且经处理除去非特异性抑制剂(于56℃加热30分钟；与15％酸处理过的高岭土温育30分种；与10％鸡红血球悬浮液温育30分钟)。在96孔微量滴板上对血清作两倍稀释。每井中加入病毒悬浮液(8HA单位，用等体积加入)，室温下温育30分钟。每孔中加入0.5％鸡红血球悬浮液，室温下温育45-60分钟。HI滴度被表示为完全抑制了红血球的血凝作用的最高稀释的倒数。
结果
如表1所示，所有组的小鼠在口服于粘膜粘合剂中的病毒制剂免疫后，血清免疫球蛋白，血凝素滴度和唾液中IgA滴度均较高。在本实施例中粘膜粘合剂羧甲基纤维素导致了最好的免疫反应。
                                               表1
                              滴度 血清中HI滴度
           血清          唾液
    0日      28日     0日    28日     0日     28日
口服对照(用碳酸氢盐，无粘膜粘合剂     8,000     32,000     10     40     10     ＜10
皮下注射对照(于PBS中，无粘膜粘合剂)     8,000     512,000     10     10     ＜10     160
羧甲基纤维素/水，2.0％(W/V)     16,000     512,000/1,024,000     ＜10     ＞80     ＜10     160
Carbopol/水，0.25％(W/V)，pH4.0     8,000     128,000     ＜10     ＞80     ＜10     160
聚亲碳剂/水，0.5％(W/V)，pH4.0.     8,000     256,000     ＜10     ＞80     ＜10     40
2.0％(W/V)藻酸钠水溶液 8,000 128,000 ＜10 ＞80 ＜10 40
Zilactin的1∶10(V/V)水溶液     8,000     64,000     ＜10     20     ＜10     ＜10
5只小鼠/组，用所采集血清数据库进行的测定表明了用50μg流感病毒A/Udorn(只用它时为对照组)，或单独用或与各种粘膜粘合剂混合经皮下注射或口管饲法免疫前和免疫后的28天在唾液中的抗体滴度(用ELISA法测IgG)和血清中抗体滴度(用ELISA法和血凝素抑制滴度测定总Ig)。
实施例3
为了确定达到最佳免疫反应所需的粘膜粘合剂浓度，小鼠通过口管饲法用在各种浓度的羧甲基纤维素(取代型号7MF)粘膜粘合剂中制备的病毒制剂进行免疫。此外，2组小鼠通过口管饲法用在取代的羧甲基纤维素(型号为9M31FPH或12M31P)流感A/Udorn病毒进行免疫中制成的。10组小鼠，每组5只，雌性BALB/C小鼠，免疫方法是用如实施例2所述制备的含有福尔马林化流感病毒(A/Udorn)的粘膜粘合剂制剂，不同的是在收获病毒时以0.02％(W/V)的浓度将防腐剂硫柳汞加到尿囊液中，并且在病毒制备的所有后续步骤中都保持同样的浓度。小鼠被免疫后，采集血清，测定血凝素抑制滴度。虽然皮下注射游离病毒免疫后第14天和第28天血清血凝素抑制滴度呈阳性，但在浓度为0.05％到4.0％(W/V)的粘膜粘合剂羧甲基纤维素存在下在口服免疫后，没有得到血清血凝素抑制滴度。唾液中IgA和抗体水平未能用ELISA方法测到。
实施例4
在口管饲法灌胃时小鼠胃中内容物对免疫结果的影响通过改变小鼠的饲养环境进行了研究。四组小鼠，每组5只雌性BALB/C小鼠，置于禁食或禁水的环境中，之后经口管饲法用含有2％(W/V)羧甲基纤维素粘膜粘合剂和50μg福尔马林化流感病毒A/Udorn制剂(制法如实施例3所述)的制剂进行免疫。亦即病毒是在防腐剂(0.02％硫柳汞)存在下制成的。小鼠被免疫后，按照实施例2所述方法采血并测定血清血凝素滴度。这些实验组(包括可自由摄取食物和水的对照组)在第14天未得到血清血凝素抑制滴度。用ELISA法未测定出唾液中IgA和抗体含量。
实施例5
实施例2表明，口服按照实施例2所述的方案制备的流感病毒(A/Udorn)进行免疫时，在粘膜粘合剂(包括羧甲基纤维素)存在下，产生了阳性的血清血凝素滴度。反之，实施例3和4，表明，按照实施例3制备的流感A/Udorn病毒，在羧甲基纤维素存在下口服免疫后未产生阳性的血清血凝素滴度，但皮下注射游离病毒免疫时，却产生了阳性的血清血凝素滴度。按照实施例3制备流感病毒所用的方案包括使用防腐剂硫柳汞。按实施例2所述的制备病毒时若省略该防腐剂，会在病毒储液中造成细菌污染。因此，要对病毒储液进行培养以确定是否有细菌污染。有硫柳汞存在时制备的储液证明没有细菌污染，而没有硫柳汞存在时制备的病毒储液会有细菌污染。仔细地分析该病毒制剂证明细菌的污染是克雷白杆菌和黄单胞杆菌。
含有克雷白杆菌和黄单胞杆菌的流感病毒A/Udorn/307/72(H3N2)，BK6，Egg3，克隆3A(7-25-89)存放于美国典型培养物保藏中心(Rockville，马里兰)。
实施例6
在羧甲基纤维素存在下，病毒储液的细菌污染对免疫结果的影响通过对按实施例3制备的病毒储液免疫小鼠的比较进行了确定，并已知没有污染，并且已知该储液被克雷白杆菌和黄单胞杆菌污染。小鼠被免疫后，采血，用ELISA法测定血清血凝素抑制滴度和血清抗流感总免疫球蛋白抗体，所有步骤如实施例2所述。
结果
如表2所示，按实施例2制备的流感病毒储液中没在硫柳汞并已知被细菌污染时，经皮下注射或口服给药时，用ELISA法或血清血凝素抑制作用测定，表明对引发小鼠的免疫反应是有效的。当在粘膜粘合剂和细菌污染物存在下，口服免疫所引发的免疫反应比用只含细菌污染物而没有粘膜粘合剂的免疫原引发的免疫反应要高，这表明细菌污染物和粘膜粘合剂对于有效地引发免疫反应都是需要的。反之，按照实施例3有硫柳汞存在下制备的病毒储液已知没有细菌污染，皮下注射免疫原时，能够引发免疫反应，但在口服免疫原时，即使在粘膜粘合剂羧甲基纤维素存在下，也不能引发明显的免疫反应。而且，用ELISA检测法对1、2、4、组测定所得到的结果合并后，总和与第5组的ELISA结果相比较时，表明本发明的免疫原，佐剂和粘膜粘合剂之间是有协同作用的。
                                                 表2
   组别号     免疫原          ELISA测定       血清血凝素抑制滴度
    0日      28日   0日     28日
在硫柳汞存在下，按实施例2制备的无细菌病毒储液
    1 口服50μg流感病毒与500μl NaHCO3进行免疫     16,000     16,000     ＜4     ＜4
2 口服50μg流感病毒与羧甲基纤维素进行免疫 16,000 32,000 ＜4 ＜4
皮下注射50μg流感病毒进行免疫     16,000     128,000     ＜4     32/64
在没有硫柳汞存在下，按实施例1制备的有细菌污染的病毒储液
    4 口服50μg流感病毒与500μlNaHCO3进行免疫     8,000     32,000     ＜4     ＜4
    5 口服50μg流感病毒与羧甲基纤维素进行免疫     8,000     128,000     ＜4     64
                                      表2(续)
  组别号     免疫原           ELISA 测定      血清血凝素抑制滴度
    0日     28日     0日     28日
    6 皮下注射50μg流感病毒进行免疫     16,000     128,000     ＜4     128
每组5只小鼠，用所采集血清数据库进行的测定表明了用在无硫柳汞存在并已知被细菌污染的情况下制备的(实施例1方案)，或在有硫柳汞存在但没有细菌污染的情况下制备的(实施例2方案)50μg流感A/Udorn病毒(只用它时为对照)进行免疫之前和免疫后28天血清中的抗体滴度(用ELISA法和血凝素抑制滴度测定总Ig)。病毒与或不与粘膜粘合剂羧甲基纤维素，取代型号7MF(2％水溶液W/V)混合，经皮下注射或口管饲法给药。实施例7
如实施例6所示，已知被细菌污染的病毒制剂当在有粘膜粘合剂羧甲基纤维素存在下时能够引发免疫反应。但口服的病毒制剂未被细菌污染、即使有粘膜粘合剂羧甲基纤维素存在下，也不引发免疫反应。细菌的功能可能是实施例6的佐剂作用，用包括有其它佐剂的配方进行了试验。在粘膜粘合剂羧甲基纤维素存在下，测定了佐剂脂多糖和胞壁酰二肽的作用。为此，将小鼠用50μg流感病毒制剂口服免疫，该制剂已知未被细菌污染、加入500μl2％的羧甲基纤维素，加入或不加入作为佐剂的LPS或MDP。
结果
如表3所示，将来自克雷白杆菌或埃氏大肠杆菌的LPS加到羧甲基纤维素粘膜粘合剂制剂中，引发了如用血清血凝素滴度或唾液IgA滴度测得的阳性免疫反应。加入胞壁酰二肽也引发了如用血清血凝素滴度或唾液IgA测得的免疫反应，但唾液IgA滴度水平略低于用LPS得到的滴度水平。
                                          表3
   组别号     免疫原       血清血凝素抑制滴度      唾液IgA滴度
0日 14日 28日 0日 28日
皮下免疫
    1 50μg流感病毒 ＜4 128 256 ＜10 10
用羧甲基纤维素和脂多糖或胞壁酰二肽口服免疫
    2 具有500μl2％(W/V)CMC的50μg流感病毒 ＜4 ＜4 ＜4 ＜10 ＜10
    3 具有500μl2％(W/V)CMC和1mg LPS(克雷白杆菌)的50μg流感病毒 ＜4 64 64 ＜10 ＞80
    4 具有500μl2％(W/V)1CMC和1mg LPS(埃氏大肠杆菌)的50μg流感病毒 ＜4 128 128 ＜10  ＞80
                                   表3(续)
  组别号     免疫原       血清血凝素抑制滴度      唾液IgA滴度
  0日    14日    28日    0日     28日
5 具有500μl2％(W/V)CMC和200μg MDP的50μg流感病毒 ＜4 64 64 ＜10 20
每组5只小鼠，经皮下注射或口管饲法用混有或未混有粘膜粘合到羧甲基纤维素(取代型号7MF)的2％(W/V)水溶液的50μg流感A/Udorn病毒(只用它时为对照)免疫之前和免疫后的14和28天在血清中的抗体滴度(血凝素抑制滴度)和在免疫之前和免疫后28天在唾液中的抗体滴度(用ELISA测定IgA)。

Claims (20)

1.一种免疫组合物，包含有免疫量的抗原和含量足以能诱导或增强对抗原的免疫反应的粘膜粘合剂。
2.权利要求1的组合物，其中抗原是流感病毒抗原。
3.权利要求1的组合物，其中粘膜粘合剂选自羧甲基纤维素钠和其它纤维素类，聚亲碳剂和Carbopol。
4.一种免疫组合物，包含有(a)免疫量的抗原，和(b)含量足以能诱导或增强对抗原的免疫反应的粘膜粘合剂和佐剂。
5.权利要求4的组合物，其中抗原是流感病毒抗原。
6.权利要求4的组合物，其中粘膜粘合剂选自羧甲基纤维素钠和其它纤维素类，聚亲碳剂和Carbopol。
7.权利要求4的组合物，其中佐剂选自胞壁酰二肽，角鲨烯，皂草苷和脂质A的一磷酰衍生物。
8.一种使动物免疫的方法，其中该方法包括给动物服用的免疫量的权利要求1的组合物。
9.权利要求8的方法，其中抗原是流感病毒抗原。
10.权利要求8的方法，其中粘膜粘合剂选自羧甲基纤维素钠和其它纤维素类，聚亲碳剂和Carbopol。
11.权利要求8的方法，其中服用该免疫组合物的方法是口服、鼻腔、直肠或扁桃体拭子给药。
12.一种使动物免疫的方法，其中该方法包括给动物服用免疫量的权利要求4的组合物。
13.权利要求12的方法，其中抗原是流感病毒抗原。
14.权利要求12的方法，其中粘膜粘合剂选自羧甲基纤维素钠和其它纤维素类，聚亲碳剂和Carbopol。
15.权利要求12的方法，其中佐剂选自胞壁酰二肽，角鲨烯、皂草苷和脂质A的一磷酰衍生物。
16.权利要求12的方法，其中服用该免疫组合物的方法是口服、鼻腔、直肠或扁桃体拭子给药。
17.一种使动物免疫的方法，其中该方法包括给动物口服免疫量的权利要求4的组合物。
18.权利要求17的方法，其中抗原为流感病毒抗原。
19.权利要求18的方法，基中给动物服用的抗体是包肠溶衣的剂型单位。
20.权利要求19的方法，基中抗原、粘膜粘合剂和佐剂同时给动物服用。
CN94191614A 1993-03-11 1994-03-11 在粘膜表面转运免疫原的聚合粘膜粘合剂 Pending CN1120310A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2966893A 1993-03-11 1993-03-11
US08/029,668 1993-03-11
US11957893A 1993-09-13 1993-09-13
US08/119,578 1993-09-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1120310A true CN1120310A (zh) 1996-04-10

Family

ID=26705210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN94191614A Pending CN1120310A (zh) 1993-03-11 1994-03-11 在粘膜表面转运免疫原的聚合粘膜粘合剂

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0688205A1 (zh)
JP (1) JPH08508247A (zh)
CN (1) CN1120310A (zh)
AU (1) AU692440B2 (zh)
BR (1) BR9405996A (zh)
CA (1) CA2158040A1 (zh)
WO (1) WO1994020070A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1561230B (zh) * 2001-07-26 2011-09-07 奥塔戈创新公司 抗原组合物
CN102905726A (zh) * 2010-06-03 2013-01-30 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 包含抗原和Toll样受体激动剂的口服疫苗
CN103347494A (zh) * 2010-10-08 2013-10-09 R·P·舍勒科技有限责任公司 使用淀粉的口服疫苗快速溶解剂型

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6656481B1 (en) 1996-09-06 2003-12-02 Mitsubishi Chemical Corporation Vaccinal preparations
GB9722682D0 (en) * 1997-10-27 1997-12-24 Scherer Ltd R P Pharmaceutical products
FR2775601B1 (fr) 1998-03-03 2001-09-21 Merial Sas Vaccins vivants recombines et adjuves
EP2275133A1 (en) * 1999-02-26 2011-01-19 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Use of bioadhesives and adjuvants for the mucosal delivery of antigens
AU755502C (en) * 1999-03-24 2003-08-14 Secretary Of State For Defence, The Immunostimulants
GB0000891D0 (en) 2000-01-14 2000-03-08 Allergy Therapeutics Ltd Formulation
JP2002154989A (ja) * 2000-11-14 2002-05-28 Lion Corp 眼科用組成物、及び生体粘膜への薬物の滞留性向上組成物
JP4137640B2 (ja) 2001-03-09 2008-08-20 アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック 新規プロテオソーム−リポサッカリドワクチンアジュバント
AU2002252378B2 (en) * 2001-03-19 2007-10-18 Intercell Usa, Inc. Transcutaneous immunostimulation
DE10125731A1 (de) * 2001-05-17 2003-03-06 A I D Autoimmun Diagnostika Gm Darreichungsform von immunologischen Wirkstoffen
MXPA05009079A (es) * 2003-02-28 2006-05-19 Alk Abello As Forma de dosificacion que tiene una matriz de sacarido.
US8012505B2 (en) 2003-02-28 2011-09-06 Alk-Abello A/S Dosage form having a saccharide matrix
JP2009209086A (ja) * 2008-03-04 2009-09-17 Masami Moriyama 粘膜投与型ワクチン
WO2010032141A2 (en) 2008-09-17 2010-03-25 Hunter Immunology Limited Non-typeable haemophilus influenzae vaccines and their uses
EP2413961B1 (en) * 2009-03-31 2016-08-17 Japan As Represented By The Director-General Of National Institute Of Infectious Diseases Method for prophylaxis of influenza using vaccine for intranasal administration
JP2011057605A (ja) * 2009-09-09 2011-03-24 Masami Moriyama 粘膜投与型ワクチン
CN102665422B (zh) * 2009-12-23 2015-01-28 疫苗基因集团 通过口服施用重组乳酸乳球菌微型胶囊的免疫保护方法
WO2013074696A1 (en) * 2011-11-14 2013-05-23 Novartis Ag Immunogenic complexes of polyanionic carbomers and env polypeptides and methods of manufacture and use thereof
JP5650780B2 (ja) 2012-04-04 2015-01-07 日東電工株式会社 ワクチン組成物
CA2923026A1 (en) * 2013-10-03 2015-04-09 Nitto Denko Corporation Nasal mucosal vaccine composition
EP3435981A4 (en) * 2016-04-01 2019-11-06 Colorado State University Research Foundation COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVED BORROWING IMMUNITY
NL2018155B1 (en) 2017-01-11 2018-07-25 Intervet Int Bv Oral vaccine against ruminant respiratory disease

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59163313A (ja) * 1983-03-09 1984-09-14 Teijin Ltd 経鼻投与用ペプチドホルモン類組成物
DE3601923A1 (de) * 1986-01-23 1987-07-30 Behringwerke Ag Nasal applizierbares arzneimittel, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung
EP0283085B1 (en) * 1987-03-17 1992-11-11 Akzo N.V. Adjuvant mixture
US4944942A (en) * 1987-08-27 1990-07-31 Mobay Corporation Intranasal vaccination of horses with inactivated microorganisms or antigenic material
US5158761A (en) * 1989-04-05 1992-10-27 Toko Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Spray gel base and spray gel preparation using thereof
US5352448A (en) * 1992-07-20 1994-10-04 Purdue Research Foundatioin Oral administration of antigens

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1561230B (zh) * 2001-07-26 2011-09-07 奥塔戈创新公司 抗原组合物
CN102905726A (zh) * 2010-06-03 2013-01-30 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 包含抗原和Toll样受体激动剂的口服疫苗
CN103347494A (zh) * 2010-10-08 2013-10-09 R·P·舍勒科技有限责任公司 使用淀粉的口服疫苗快速溶解剂型
US9956169B2 (en) 2010-10-08 2018-05-01 R.P. Scherer Technologies, Llc Oral vaccine fast-dissolving dosage form using starch

Also Published As

Publication number Publication date
AU6361694A (en) 1994-09-26
WO1994020070A1 (en) 1994-09-15
CA2158040A1 (en) 1994-09-15
JPH08508247A (ja) 1996-09-03
EP0688205A1 (en) 1995-12-27
BR9405996A (pt) 1995-12-19
AU692440B2 (en) 1998-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1120310A (zh) 在粘膜表面转运免疫原的聚合粘膜粘合剂
Moyle et al. Mucosal immunisation: adjuvants and delivery systems
TWI421091B (zh) 包含以聚肌苷酸-聚胞苷酸為主之佐劑的黏膜免疫物質
Silin et al. Oral vaccination: where we are?
KR101342641B1 (ko) 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 함유하는 면역보강제 조성물
JP2003522802A (ja) プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチン
CN101163500B (zh) 含有聚-γ-谷氨酸的用作佐剂的合成物
CN1842345A (zh) 口服的固体剂型疫苗
Bakkari et al. Toll-like receptor-4 (TLR4) agonist-based intranasal nanovaccine delivery system for inducing systemic and mucosal immunity
US9585955B2 (en) Lipid and nitrous oxide combination as adjuvant for the enhancement of the efficacy of vaccines
Vacher et al. Recent advances in mucosal immunization using virus-like particles
CN1404399A (zh) 调节包括与粘膜体表面接触的疫苗抗原的物质的作用的新的非抗原性粘膜佐剂制剂
US11628208B2 (en) System and method for microneedle delivery of microencapsulated vaccine and bioactive proteins
EP2575869B1 (en) Peptide particle formulation
Xu et al. Immunogenicity of antigen adjuvanted with AS04 and its deposition in the upper respiratory tract after intranasal administration
US9585954B2 (en) Mucosal immunization
JP2003528818A (ja) 皮膚経路を介したワクチン接種による粘膜免疫の誘導
CN107200788B (zh) 一种季鏻化壳聚糖及其作为疫苗免疫佐剂的应用
CN1161154C (zh) 用于疫苗的免疫增强制剂
CN110974953A (zh) 一种免疫佐剂及其用途
AU2012229234B2 (en) Vaccine formulation of mannose coated peptide particles
CN108368260A (zh) 含有角鲨烯的基于两亲性聚氨基酸聚合物的疫苗佐剂组合物
KR102743672B1 (ko) 점막에서 항원 특이적 면역 반응을 증진시키는 신규한 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 점막 백신 보조제
WO2023240278A2 (en) Uses of glycolipids as a vaccine adjuvant and methods thereof
US20230293666A1 (en) Mannose conjugated chitosan-based influenza nanovaccine formulations and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C01 Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication