CN102665422B - 通过口服施用重组乳酸乳球菌微型胶囊的免疫保护方法 - Google Patents
通过口服施用重组乳酸乳球菌微型胶囊的免疫保护方法 Download PDFInfo
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Abstract
在一个实施例，本发明以可食用微型胶囊形态提供了一种非持续存在的活重组乳酸乳球菌作为疫苗，用于针对例如高致病性H5N1禽流感病毒等病原体。本发明的肠溶包衣胶囊，在让小鼠和鸡口服后，诱导产生了高浓度的血凝素特异血清免疫球蛋白G和粪便免疫球蛋白A，并当小鼠面对致命剂量的H5N1病毒时，为其提供了完善的保护。因此，本发明示范了一种广泛适用的平台技术，用于生产和施用针对细菌和病毒感染的可食用疫苗。
Description
此申请要求美国序号61/289，663，（提交于2009年12月23日）的优先利益及国际申请号PCT/US2010/041792（提交于2009年12月23日）的优先利益，所有内容及披露皆被参考纳入此申请。
技术领域
本发明大致涉及接种疫苗。在一个实施例，本发明提供了使用转基因的乳酸乳球菌种作为口服疫苗的成分和方法。
背景技术
高致病性禽流感H5N1病毒被认为对全球人类和动物健康构成巨大威胁。这种病毒极易发生抗原漂移，并已经在人类对象引起多次具有非常高死亡率的爆发（1）。接种疫苗被认为是防止病毒的蔓延及迅速变异最可取的抵抗方法。为所有受影响的物种发展疫苗来放慢跨物种传播也是非常可取的。然而，因为制造困难和一般要求对每个受试者多次注射，传统使用灭活病毒制成的流感疫苗几乎无法用于H5N1品种（2、3）。新的疫苗制剂，包括各种亚单位疫苗（4）、DNA疫苗（5、6）和重组腺病毒疫苗（7、8）现正被研究；但他们都因需要使用注射法而将不可能用于野生鸟类，而对人类和农场动物则既昂贵又麻烦。在这方面，安全和有效的口服疫苗将是理想的；因为它们可以添加到接种对象的食品或饮料内。
安全、有效、方便使用的食用疫苗已被追求了很长时间。使用可食用的植物如番茄、马铃薯来表达抗原，以供人类和牲畜口服免疫接种先前已提出（9-11）。最近，大米被用作抗原的表达和运载工具，并发现在小鼠中传递预防霍乱的免疫力（12）。使用食用植物作疫苗的表达和运载工具为多种传染病提供了许多优点，尤其是那些病原体相对保守的疾病。这是因为通常需要1年以上才能生产表达稳定的转基因植物。相比之下，传染病毒迅速变异或转移的疾病如流感病毒，同时可食用及能在几周内改造的表达工具则更可取。为这个主要原因而选定了乳酸菌（LAB）：它一般被视为安全（GRAS）而又被广泛食用或在食品中使用。使用重组乳酸乳球菌及各种抗原编码为口服药的研究中曾报告这种方法（13-16），继而产生的各种免疫反应被认为与抗原类型、抗原表达量和抗原在肠道中表达时间相关（17、18）。
发明内容
发展安全和有效的流感疫苗供人类和动物使用是防止致命爆发和全球流感大流行的必要条件。本发明发现表达禽流感HA基因的转基因乳酸菌如乳酸乳球菌种，可作为口服疫苗用以保护H5N1禽流感病毒的感染。
在这项研究中，在精心设计的乳酸链球菌素A-诱发表达的乳酸乳球菌种的基础上，构建了若干个H5N1流感血凝素（HA）抗原表达载体。它们或在细胞质中表达抗原（L2）、或分泌抗原（L3）、或在细胞壁上展示抗原（L4）。在一个实施例，这些载体是用粘膜粘附聚合物和表面肠溶包衣制定成使用形态。在分别口服了有肠溶包衣的展示抗原的表达载体和分泌抗原的表达载体后，大大提高了所产生的免疫反应，引致已接种的小鼠在一个致死剂量的病毒挑战下完全地受保护。
在一个实施例，受试者口服在此披露的转基因乳酸乳球菌种后，诱导了强烈HA特异的体液免疫和粘膜免疫反应使其能承受致死剂量的H5N1病毒感染。
附图说明
图1显示了重组乳酸乳球菌载体的免疫印迹分析（A、B和C）及L4的免疫荧光分析（D）（200倍）。
图2显示了酶联免疫吸附试验法检测的HA特异性抗体滴度。使用肠溶胶囊和非肠道活菌为小鼠（2A及2B）口服免疫接种。（A）以重组HA蛋白作为包被抗原，使用亲和素生物素系统-酶联免疫吸附试验测定HA特异性血清免疫球蛋白G。（B）由粪粒测定HA特异的粘膜免疫球蛋白A。（C）使用口服或皮下注射法以L4向鸡免疫接种。使用亲和素生物素系统-酶联免疫吸附试验测定鸡血清免疫球蛋白G。*代表相对PBS、L1和胶囊-L1对照的显著统计学差异。（*p<0.05）。数据为一式两份实验的平均值正负标准偏差。
图3显示了由有肠溶包衣的重组乳酸乳球菌所诱导的细胞介导免疫反应。*代表相对PBS、L1和胶囊-L1对照的显著统计学差异。表示的数据为一式三份实验的平均值正负标准偏差。
图4显示了口服传递不同的疫苗制剂后对H5N1禽流感病毒致命挑战的免疫保护。最终免疫接种后2周，在鼻腔内以H5N1禽流感病毒感染小鼠。（A）感染后6天小鼠的平均体重损失（%）。（B）感染后0-14天存活小鼠的百分率。N=每组5只小鼠。
具体实施方式
应使用下列术语来形容本发明。在本文没有作具体限定下，用于描述本发明的术语应给予本领域内普通技术人员所理解的一般意思。
在本文内，“食用疫苗”一词是指通过口服途径服用和生效的疫苗配方。
在本文内，“保护性免疫反应”一词是指因服用疫苗而产生，可以使动物在10倍致死剂量挑战下免于死亡的免疫反应。
在本文中，“异源抗原”一词是指来自异源病原体如病毒、细菌的抗原。
在本文内，“粘膜粘附聚合物”一词是指与覆盖粘膜上皮的粘液层及构成粘液重要组成部分的粘蛋白相互作用的合成或天然聚合物。最近被开发的一种药物传递系统使用会粘附到相关组织或组织表面包衣的粘膜粘附聚合物来针对各种吸收性粘膜，如眼、鼻、肺、口腔、阴道等。这种药物传递系统被称为粘膜粘附药物传递系统。这种药物传递系统可用于传递本发明的治疗剂。天然存在的粘膜粘附聚合物包括但不仅限于透明质酸和壳聚糖。
使用粘膜粘附剂型作跨粘膜路线的药物传递能绕过肝胃肠对口服法的第一关淘汰，从而提高生物利用度并产生更长的治疗效果。在一般情况下，有两大类的粘膜粘附聚合物：亲水聚合物和水凝胶。含有羧基的亲水聚合物表现出非常良好的粘膜粘附性能，有代表性的例子包括但不仅限于聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、甲基纤维素（MC）、羧甲基纤维素钠（SCMC）、羟丙基纤维素（HPC）和其他纤维素衍生物。水凝胶是通过粘附覆盖上皮的粘液吸收水而膨胀的高分子生物材料类。在一般情况下，水凝胶是一类由于亲水性高分子链的物理或化学交联而可以在不溶解的情况下吸收大量水份的高分子材料。本领域的普通技术员能随时从各种已知的单体、预聚物或现有的亲水聚合物中构建水凝胶。能用于形成水凝胶的聚合物生物材料通常具有阴离子基团（如聚丙烯酸和其交联改性物等）和/或阳离子基团（如壳聚糖及其衍生物）。
需要以下相继的现象才会发生生物粘附或粘膜粘附。第一阶段涉及因一个良好润湿的粘膜粘附物表面或因粘膜粘附物肿胀而建立起的粘膜粘附物和膜之间的亲密接触。在第二阶段，建立接触后，粘膜粘附物渗透到组织表面的缝隙或粘液与粘膜粘附物的链进行相互渗透。
在分子水平上，粘膜粘附可以用基于分子间的相互作用解释。两个分子之间的相互作用是由引力和斥力组成。相互吸引经由范德华力、静电相互作用、氢键和疏水相互作用产生。相互排斥作用则因为静电和空间位阻斥力而发生。要发生粘膜粘附，相互吸引应该比非特定的排斥更大。
影响粘膜粘附的因素包括：
1.聚合物的相关因素：
i)分子质量;ii)活性聚合物的浓度;iii)高分子链的灵活性;iv)空间构象;及v)膨胀。
2.与环境有关的因素：
i)聚合物基体界面的pH值;ii)使用的力度；及iii)最初接触时间。
3.生理因素：
i)粘蛋白更新率及ii）疾病状态。
通过口服途径传递治疗药物的系统在设计上必须意识到胃肠道的生理。给药途径的解剖及生理主宰传递的许多要求。例如，传递系统必须能够承受唾液，因为唾液中含有用于分解任何放入口中物件的消化酶和其他试剂。胃，作为人体的主要消化器官，含有许多消化酶及具有非常低的pH值。胃的pH值被测量为从1.4到2.1。这种苛刻的环境对蛋白质造成破坏和变性。当胃内包含食物时，胃的pH值变化至4。
一旦通过胃的苛刻环境后，传递系统到达被分为三个区域的小肠。第一个区域，是最靠近胃的十二指肠随后是空肠和回肠。越向后，小肠吸收进入血液流的营养成分则越少。长度约10英寸的十二指肠组成小肠的前5％，而空肠则是随后的40％。整个小肠长度为5米，而在此器官内的逗留时间一般为2-4小时。
小肠内壁是由外膜、肌层、蜂窝组织和粘膜层组成。只有粘膜和蜂窝组织层在药物传递方面是重要的。营养成分经过粘膜细胞层和蜂窝组织层输入人体并进入血液。
基于上述考虑，本领域内的普通技术员能随时制订对本发明有用的传递系统。本发明包括与粘蛋白和/或覆盖在粘膜上皮表面的粘液层相互作用的合成或自然产生的粘膜粘附聚合物。它也包括下一代的粘膜粘附聚合物。例如，研究人员越来越有兴趣使用更能够区分在消化道不同地区的细胞类型的选择性分子来针对胃肠道的不同地区。这个概念是专门基于能可逆地与胃肠道细胞表面结合的某些材料。这些下一代的粘膜粘附聚合物以更大的特异性运作，因为它们是基于受体-配体般的相互作用；分子强烈和迅速地直接结合到粘膜细胞表面，而不是粘液本身。其中一类满足这些独特要求的分子是凝集素。
在本文中，“肠溶包衣”或“肠溶”，是指用于控制口服药物在消化系统中被吸收的位置的屏障。肠溶包衣预防在到达小肠前释放药物。肠溶包衣因为是选择性不溶物质而奏效：它们不会在胃的酸性汁液内溶解，但当它们到达pH值较高的小肠则会溶解。用作肠溶包衣的材料包括但不仅限于脂肪酸、蜡、紫胶、塑料及植物纤维。在一个实施例，肠溶包衣的成分包括但不仅限于邻苯二甲酸醋酸纤维素（CAP）、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸共聚物、醋酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基醋酸琥珀酸纤维素（羟丙甲纤维素醋酸琥珀酯）、聚醋酸乙烯酞酸酯（PVAP）、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、海藻酸钠及硬脂酸。本领域中的普通技术员能随时以任何已知的肠溶包衣材料和方法将本发明的细菌制定成使用的形态。
在一个实施例，本发明以胶囊形式提供活、不持续存在的重组乳酸乳球菌（l.lactis）作為一种可食用的疫苗。在一个实施例，这种疫苗是针对高致病性的流感病毒而生产。
曾经被提出用于生产和呈现抗原的不同抗原载体系统包括重组植物、细菌、或基于病毒的载体（9、16）。此外，各种聚合物和脂质微球已被用于在肠道内保护和控制蛋白抗原的释放。在本发明中，这两种方法已被合并来用于生产在小鼠及或许鸡内对H5N1型病毒感染有效的口服疫苗。重组乳酸乳球菌载体能理想地产生大量抗原及口服传递到肠道。考虑到胃的环境对乳酸乳球菌存活仍然是有点恶劣，而开发了一个小得足够（毫米）让小鼠或鸡咽下的肠溶聚合物胶囊剂型。
在一个实施例，肠溶聚合物胶囊制剂对疫苗整体的免疫原性产生很大的改善，使得被注射致死剂量H5N1禽流感病毒的小鼠被完整地保护及存活。
用于生产和传递抗原，基因工程活载体系统在制造和处理方面有许多优势。大约20年前，以植物为基础的疫苗发展被启动并显示出利用植物表达乙肝病毒表面蛋白和病毒颗粒作为疫苗的可行性（9-11）。最近，有一个使用米粒作为传递工具的研究。蛋白质抗原被证明在没有冷凍的环境下可以在大米内得到很好的保护并稳定的保持（12）。口服疫苗在一般室温环境下有良好的稳定性，对分配疫苗给世界偏远地区显然是重要的。
另外，以细菌为基础的系统如沙门氏菌、博德特氏菌和李斯特菌，也被广泛研究作为抗原的表达和传递载体。由于其中大多数原本是致病性菌株，所以它们可能更有免疫原性或诱导更强的免疫反应。相比之下，基于乳酸菌（LAB）的载体被认为是较安全，但可能对人体免疫系统有较小的免疫原性。一些研究提示，某些LAB载体在消化道持续存在的能力对疫苗的有效性是至关重要。格朗热特（Grangette）等人进行了对持续存在的LAB（植物乳杆菌）和非持续存在的LAB（乳酸乳球菌）的直接比较并发现植物乳杆菌能更有效地引出抗原特异性免疫（22）。许多其他研究采用基于干酪乳杆菌，这种可以在人类胃肠道持续存在的微生物，作为载体。然而，因为需要防生物污染的特别考虑，使用持续存在的细菌作为食用疫苗的载体可能不是可取的。
本发明的独特之处是成功采用非持续存在的乳酸乳球菌（24）为载体、将之加装到粘膜粘附聚合物上并包装入肠溶包衣微型胶囊以创造针对抗原如流感病毒（H5N1）的可食用疫苗。它证明，虽然乳酸乳球菌存活率在胃肠道迅速减少，但是用包封法暂时保护，被运载和服用后不久生产的抗原，已足够引起显著的粘膜和全身免疫反应使得所有接种的小鼠活过致命的H5N1病毒注射挑战。
载体系统本身可能就有特异性的免疫刺激效应。LAB已被证明可以启动炎症反应和激活单核细胞和其他抗原提呈细胞（25）。在本发明中，观察到只有抗原表达设计差异的相同载体系统造成不同的免疫反应。抗原通过PgsA域锚定细胞壁表面的载体在各方面均提供最佳的反应。因此，本发明的数据支持浦（Poo）等基于枯草杆菌PsgBCA复合酶N-端跨膜区而开发的PsgA融合系统的研究（26）。对于禽流感病毒株，从小鼠血清的分析支持以80中和滴度作为疗效终点（27）。在本发明中，胶囊-L2的中和滴度为80而H5N1型病毒感染后的存活率为40％。相比之下，胶囊-L3和胶囊-L4的中和滴度分别为148和167；这些胶囊对H5N1禽流感病毒的挑战提供了百分百的保护。以H5N1禽流感在鸡身上作挑战的类似计划正等待监管机构批准。
载体内的流感HA抗原基因是从A/chicken/Henan/12/2004(H5N1)克隆的。L2和L3载有全长的HA基因，而L4载则有HA内的HA1部分。他们都诱发了显着的体液免疫和全身免疫反应。以往的研究表明，HA1区应包含几乎所有的HA抗原表位（28-30）。然而，由于HA1是更容易发生突变和抗原性变化（31），设计能迅速适应以容纳病毒进化的活载体疫苗是重要的。此处使用的乳酸链球菌素A诱发重组乳酸乳球菌抗原表达载体在设计上非常灵活又可以优化作为表达和提呈抗原。它也是一个为大规模生产而精心设计的稳定系统（32、33）。所开发的聚合物微型胶囊剂型也能容易及以低成本制造。虽然这是一个简单的设计，但其对疫苗有效性的提高是非常显著。
在一个实施例，本发明提供一个使用表达禽流感病毒HA基因的基因改造乳酸菌，如乳酸乳球菌，作为口服疫苗来防止H5N1禽流感病毒感染的的方法。在一个实施例，口服重组乳酸乳球菌微囊能诱发显著的HA-特异性体液和黏膜免疫反应；而最重要的是，它提供对H5N1禽流感病毒挑战的保护。
在一个实施例，该方法包括一个能很容易给药予人类和动物群体的口服给药方案。在另一个实施例，该方法具有产生粘膜免疫反应的能力。
本发明提供了一种用于诱导针对抗原的免疫反应的方法，包括对动物或人类给予表达抗原的转基因乳酸菌的步骤。乳酸菌的例子包括但不仅限于球菌、链球菌、乳酸杆菌、明串珠菌、球菌、短杆菌和丙酸杆菌。在一个实施例，该乳酸菌是乳球菌属就如描述在美国专利第5，580，787号，6，333，188号，7，553，956号。在另一实施例，乳酸菌种是乳酸乳球菌。
本发明的转基因乳酸菌在给予受试者后有诱导免疫反应的能力。由本发明的细菌诱导的免疫反应包括但不仅限于体液免疫反应、细胞免疫反应和粘膜免疫反应。例如，本发明的细菌有诱导全身性免疫球蛋白G反应和粘膜免疫球蛋白A反应的能力。在另一个实施例，本发明的细菌有诱导细胞免疫反应的能力（见例如图3）。
在一个实施例，本发明的转基因乳酸菌有诱导保护性免疫反应的能力；护性免疫反应即是可以从病原体（如病毒或细菌）的致命挑战中保护已接种的受试者的免疫反应。
在一般情况下，本发明的乳酸菌经基因改造以表达一个或多个抗原。在另一实施例，所述的抗原是异源抗原。异源抗原的例子包括但不仅限于细菌、原虫、真菌和病毒抗原。异源抗原的来源包括但不仅限于流感病毒、幽门螺旋杆菌、沙门氏菌、轮状病毒、呼吸道冠状病毒等，就如描述在美国专利第6，551，830号，7，432，354号和7，339，461号。
在一个实施例，病毒抗原，如禽流感病毒H5N1血凝素，可以在转基因乳酸菌内表达。
本发明的转基因乳酸菌，可以用本领域普通技术人员随时能够确定的数量和服用法服用。本发明的疫苗，能以不同形式给药和制定，例如，以溶液或悬浮液作口服，或以适合的固体形态在口服前在液体中溶解或悬浮。制剂也可能被乳化，或把成分与辅料混合，例如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、纤维素、硬脂酸镁、钠糖精、碳酸镁及类似品。这些组合物采用的形态是溶液、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂、滴鼻剂或粉末。
本发明的疫苗的形态也可以是注射剂。合适的辅料会包括，例如，生理盐水或缓冲液（pH值约7至8）或其他生理性、等渗性的溶液，其中可能还含有葡萄糖、甘油或类似及其组合。然而，应避免会破坏或溶解脂膜的试剂如强力洗剂、醇类和其他有机溶剂。此外，如果需要的话，该疫苗可含有少量的辅助物质，如润湿或乳化剂、PH缓冲剂和/或在本领域已知能提高疫苗有效性的佐剂。
总体而言，本发明的疫苗可以经由口服、皮下注射、皮内注射或肌肉注射有效的疫苗剂量来产生所需的免疫反应。疫苗将以一个与药剂剂型相容的方式和有效预防和/或治疗的数量服用。服用的数量取决于被治疗的受试者、受试者的免疫系统发展所需免疫反应的能力、以及所需要的保护程度。本领域内的技术员能鉴于受试者和使用的抗原而随时地厘定要给予的疫苗精确数量。
在一个实施例，本发明的转基因乳酸菌可以用数个给药方式给予受试者，如口服、或鼻腔给药、肌肉注射、皮下注射和阴道敷用，就如描述在美国专利第7541044号和7476686号。
本发明的转基因乳酸菌可以用数个方式制定，如封装在酸敏感微胶囊、肠溶微胶囊和胶囊、聚合物水凝胶、或粘性聚合物贴剂内。在一个实施例，疫苗载体可以通过使用粘膜粘附聚合物跨粘膜传递。跨粘膜传递允许治疗剂快速被吸收进入全身循环，并避免了首过代谢和/或一些身体的天然防御机制。
本发明还提供了表达异源抗原的转基因乳酸菌。上述已有乳酸菌和异源抗原的例子。在一个实施例，这些乳酸菌可以用作口服疫苗。
应当指出，本领域内的普通技术人员能够随时调整或取代本发明的各种参数。例如，本领域内的普通技术人员能毫不迟疑地认识到，本发明不仅限于如上所述的乳酸菌或病毒抗原血凝素。本发明是同样适用于使用其他在领域内已知的细菌和/或抗原。例如，本发明可以使用其他益生菌；这些被认为是使宿主健康的活微生物。乳酸菌和双歧杆菌是最常被用作益生菌的微生物类型，但本领域内普遍已知的某些酵母和细菌也可被使用。可使用的细菌例子包括但不限于，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双歧乳酸菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、动物双岐杆菌、短双岐杆菌、婴儿双岐杆菌、长双岐杆菌、大肠埃希氏菌、副干酪乳杆菌、约氏乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、布拉酵母菌。
此外，通过标准试验可以很容易地确定和调整胶囊的数量和大小的参数、粘膜粘附聚合物的品种和采用的肠溶包衣。例如，以各种生物反应或动物存活率作为实验读数，任何一个或所有这些参数都可用标准的体外或体内滴定实验确定或调整。
在一个实施例，本发明提供了一种用于诱导针对抗原的免疫反应的组合物，该组合物包含表达抗原的转基因细菌，所述的细菌是用粘膜粘附聚合物制定成使用形态。在一个实施例，该细菌是乳酸菌如乳酸乳球菌。在一般情况下，抗原可以是一种细菌抗原或病毒抗原。例如，病毒抗原是H5N1禽流感病毒的血凝素。在一个实施例，使用的粘膜粘附聚合物是亲水性聚合物或水凝胶。亲水性聚合物的例子包括但不仅限于，聚醋酸乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素。在一个实施例，该细菌是以肠溶固体剂型制定。
本发明还提供一种用于诱导针对抗原的免疫反应的方法，包括向受试者（比如人类或非人类的动物）授予上述组合物的步骤。在一般情况下，诱发的免疫反应包括体液免疫反应、粘膜免疫反应、细胞免疫反应、或保护性免疫反应。在一个实施例，该组合物是以口服法服用。在另一个实施例，该组合物是以肠溶固体剂型制定。
本发明还提供了所述转基因细菌的用途；在本文所述，被用作药物在受试者身上诱发针对抗原的免疫反应。在一个实施例，该药物是以口服法服用。在一般情况下，该药物可以应用于，如人类、动物、鱼、鸟、和兽药等用途。
本发明还提供了一种表达异源抗原的转基因乳酸菌，所述的细菌是用粘膜粘附聚合物制定成使用形态。上述已有粘膜粘附聚合物的例子。在一个实施例，该乳酸菌是乳球菌属。在另一实施例，乳酸菌是乳酸乳球菌种。在一般情况下，该异源抗原可以是一种细菌抗原或病毒抗原。在一个实施例，该异源抗原是H5N1禽流感病毒的血凝素。在另一个实施例，本发明还提供了一个包括上述表达异源抗原的转基因乳酸菌的组合物。
本发明还提供了一个用于诱导受试者的免疫反应的试剂盒，所述的试剂盒包括本文所述的转基因细菌。
参考随后的具体实例将可以更好地理解本发明，但熟悉本领域的人能够轻易了解详述的具体实验只具说明性，并不意味着它限制本文所述的发明；跟随其后的权利要求书才对本发明作出限定。
本申请书，引用了各种参考资料或出版物。为了更充分地描述本发明涉及的现有技术水平，公开的这些参考资料或出版物将以其整体纳入到本申请书的参考部分内。
实施例1
材料和方法
重组乳酸乳球菌载体
构建三种不同的抗原表达质粒，并命名为pNZ8150-HA、pN8110-HA和pNZ8110-pgsA-HA1。从荷兰(NIZO)购买pNZ8148质粒。将质粒透过电穿孔法转化NZ9000乳酸乳球菌种。选择高效表达的克隆并以具有质量体积百分比0.5％（wt/vol）葡萄糖的M17培养液在摄氏30度下培养。使用每毫升10微克浓度的氯霉素。
免疫印迹分析和免疫荧光显微镜
增加乳酸链球菌素A至每毫升10毫微克的终浓度来诱导所有的重组乳酸乳球菌表达抗原。持续增长3个小时。收获L1、L2、L4的乳酸乳球菌细胞，用500微升的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗净3次和重悬。等分的样品与6倍的上样缓冲液混合及煮10分钟。以提取物为材料进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（10％丙烯酰胺）并转移到聚偏氟乙烯膜上（PVDF，Millipore,美国）。根据制造商（Amersham Bioscience,瑞典）的建议进行抗体反应和检测（增强化学发光法）。收集L3的上清液进行免疫印迹分析。为进行免疫荧光染色，在诱导后，收获L4乳酸乳球菌细胞并在摄氏4度与多克隆小鼠抗HA抗体孵育30分钟，随后是荧光素异硫氰酸标记的抗鼠免疫球蛋白G。使用奥林巴斯荧光显微镜检查由此产生的细胞沉淀。
制备乳酸乳球菌的肠溶包衣胶囊剂型
以每毫升1011菌落形成单位（CFU）的浓度将重组乳酸乳球菌配制成溶液。将10微升含1x109菌落形成单位的重组乳酸乳球菌溶液与0.5毫克的牛血清白蛋白和甲基纤维素（MC）混合、风干并打包成肠溶包衣胶囊（微型胶囊，每个大约4×1毫米）。
乳酸乳球菌在模拟胃液和肠液的存活率分析
将胶囊浸泡在pH值1.0的模拟胃液内低速搅动两小时，然后放入到pH值6.8的磷酸盐缓冲液内45分钟以释放胶囊的内容。使用梯度稀释法计算存活细胞。
动物和动物的免疫接种
从SLC（上海、中国）购买6周龄雌性BALB/c小鼠。把老鼠安置在上海交通大学的无特定病原体（SPF）动物中心。每剂药之前，它们被禁食6小时，然后用21号喂食管给予10微升的重组乳酸乳球菌溶液或1粒胶囊。初次给药后的第2、4、6周重复免疫接种。L4代表性地被选定用于鸡实验，在第1、2、7、14、21、28、29天以每只鸡108菌落形成单位的剂量使用皮下注射和口服免疫接种方法接种7日龄雌性SPF鸡。
酶联免疫吸附试验
最后一次给药后10天，收集小鼠或鸡的血清。以亲和素-生物素系统（ABS）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HA特异的抗体反应。以每毫升10微克的甲型流感病毒（A/chicken/Henan/12/2004(H5N1)）重组HA蛋白包被96孔板。与此同时，收集每组6只老鼠的粪便颗粒并悬浮在250微升的无菌磷酸盐缓冲液，以每分钟15000转的转速离心10分钟，再向上清液进行对免疫球蛋白A的间接酶联免疫吸附测试。取得比同样稀释的阴性对照样本平均光密度加一个标准差高一倍的最高稀释被表达为平均抗体滴度。
干扰素-γ酶联免疫斑点法
最终免疫接种后一周，以制造商（R&D System，美国）建议的方法使用酶联免疫斑点试剂盒向小鼠干扰素-γ进行干扰素-γ酶联免疫斑点法检测。简单地说，向小鼠干扰素-γ微孔板每孔添加200微升的无菌培养液并室温孵育20分钟。吸出每个孔中的培养液后，向每孔加入100微升的1x106个脾脏细胞。以每毫升10微克的HA特定肽（ISVGTSTLNQRLVP）在湿润的摄氏37度CO2培养箱内刺激48小时。对照孔并没有以HA特定肽刺激。孵育后，吸干及清洗每个孔，顺序以生物素标记的抗小鼠干扰素-γ抗体、碱性磷酸酶标记的链霉亲和底物溶液处理孔板以揭示班点。
中和试验
如之前所述（20），以微量中和法测定中和抗体滴度的终点。简单地说，使用从霍乱弧菌制备的受体破坏酶（RDE）处理2倍系列稀释的血清后，与35微升的50%组织细胞感染量（TCID50）的H5N1禽流感病毒混合并孵育，然后往小猎犬肾上皮细胞（MDCK）添加和培养1小时。进一步在摄氏37度、5％CO2的情况下培养受H5N1禽流感病毒感染的细胞72小时并以血凝试验测定中和滴度。为进行HA测试，向每50微升的细胞培养上清液加入50微升的0.5％公鸡红血细胞并在室温下培养30分钟。依据里-明二氏法测定TCID50（21）。能抑制50％H5N1禽流感病毒入侵的抗血清稀释的倒数被定义为中和滴度（IC50）。
H5N1禽流感病毒的挑战
为进行挑战实验，最后一次免疫接种后两周，将20微升10×50%致死剂量的H5N1禽流感病毒以鼻内给药法挑战已麻醉的小鼠。感染后，监测小鼠的体重和患病迹象14天。挑战实验是严格地在加上强化条件的生物安全第3等级下进行。
统计学分析
以单向方差分析对实验和控制数据进行统计学分析。p值小于0.05被视为具有统计学意义。
实施例二
重组乳酸乳球菌载体
构建表达H5N1流感HA抗原的重组乳酸乳球菌载体
构建四个不同的乳酸乳球菌载体并命名为L1、L2、L3及L4。表1列出了每个载体的描述和每个载体内的特定HA表达质粒。免疫印迹分析表明，作为对照载体的L1不表达任何HA（图1A），而L2所表达的HA蛋白（64千道尔顿）主要出现在细胞裂解物内（图1A）。由于在L3的HA基因前克隆了一段usp45信号序列，因此L3所表达的HA大多在细胞培养上清内发现（图1B）。L4载有融合HA1蛋白（38千道尔顿）与PgsA表面展示基序（44千道尔顿）编码的质粒；因此而表达的蛋白的分子质量为82千道尔顿（图1C）。此外，免疫荧光染色证实了HA1蛋白（L4）的细胞壁锚分布（图1D）。
制备肠溶胶囊及在模拟胃肠(GI)环境内释放乳酸乳球菌
每个肠溶胶囊（微型胶囊）封装约109菌落形成单位的重组乳酸乳球菌载体，每个大小约4×1毫米。命名样品为胶囊-L1、胶囊-L2、胶囊-L3及胶囊-L4。以pH值1.0的模拟胃液处理胶囊样本以及溶液样本2小时，然后在pH值6.8的模拟肠道缓冲液内释放45分钟。表2列出了活乳酸乳球菌细胞计数（CFU）的结果。胶囊组表现出较强的耐酸性并在pH值1.0存活；而在处理后，溶液组的活载体计数则显示存活率有巨大的损失（>20000倍）。
口服后HA特异的免疫球蛋白G和免疫球蛋白A反应
以口服重组乳酸乳球菌溶液或肠溶胶囊，在第0、2、4、6周为小鼠接种四次。在最后接种10天后，测定HA特异的血清免疫球蛋白G和粪便免疫球蛋白A。所有测试组的log2（血清免疫球蛋白滴度）的平均值如图2A所示。所有表达HA的载体（溶液和胶囊）导致生产显著的HA-特异血清免疫球蛋白G，而磷酸盐缓冲液和L1样本则没有。在一般情况下，胶囊组比溶液组有较高的滴度。服用了胶囊-L4的组别达到最高的抗体滴度。用粪粒检测粘膜免疫球蛋白A抗体的生产以研究HA特异的粘膜免疫反应（图2B）。再次，所有肠溶胶囊组产生显著的免疫球蛋白A抗体反应。胶囊-L4提供了最好的结果。在第1和2、7、14、21、28、29天对7日龄鸡进行皮下注射或口服免疫接种的实验；最后接种10天后，对血清进行了分析。两个传递机制均取得显著的血清抗体滴度；虽然以皮下注射处理的鸡较口服接种组别略高（图2C）。
小鼠内的中和抗体滴度
使用微量中和法（MN）测定每个组的中和抗体滴度。所有肠溶胶囊组（胶囊-L2，胶囊-L3及胶囊-L4）的中和滴度值均高于80，表明产生良好的抗体中和活动（表3）。
抗原特异的T细胞反应
干扰素-γ酶联免疫斑点法也被用于研究口服重组乳酸乳球菌后造成的HA-特异性T细胞反应。收集每个组的脾脏细胞（106细胞）并以每毫升10微克的HA抗原表位肽（ISVGTSTLNQRLVP）刺激。计算因而导致表达干扰素-γ的T细胞数量并绘制在图3。口服的肠溶包衣重组乳酸乳球菌再次产生HA-特异性的T细胞反应。封装组（胶囊-L2，胶囊-L3及胶囊-L4）远远地比各自的溶液组有效。
H5N1禽流感病毒的挑战
最终免疫接种后两周，将致死剂量的高致病性H5N1禽流感病毒以鼻内给药法挑战小鼠并密切监测小鼠的体重和死亡率14天。病毒挑战后，所有的老鼠经历了一定程度的身体消瘦（图4A）；但用胶囊L3和胶囊L4接种的小鼠，8天后逐渐恢复并百分之百生存。相比之下，原本的小鼠（磷酸盐缓冲液处理）和空质粒载体接种的小鼠都在挑战内10天死亡（图4B）。
表1重组乳酸乳球菌载体
*乳酸乳球菌NZ9000:以MG1363为基础的转基因菌种,拥有可以使用乳酸链球菌素诱导并包含nisR和nisK基因的基因表达框。
表2模拟胃液处理后的相对活乳酸乳球菌数
表3H5N1禽流感病毒与免疫血清的中和试验
实施例三
进一步改善
可以用上述的各种生物反应或动物存活作为实验读数，进行标准的体外或体内滴定实验来调整或降低本发明使用的细菌剂量。
同类的滴定实验也可以用于测定包衣胶囊大小对诱导免疫反应的影响。可用上述的体外或体内实验来探讨各种大小的胶囊对诱导细胞免疫反应、粘膜免疫反应和/或保护性免疫反应的影响。
同样地，同类的滴定实验也可以测定使用不同包衣材料或粘膜粘附聚合物的影响。可用上述的体外或体内实验探讨不同包衣材料的胶囊或用不同粘附聚合物制定成使用形态的细菌对诱导细胞免疫反应、粘膜免疫反应和/或保护性免疫反应的影响。
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Claims (8)
1.一种用于诱发受试体内针对抗原的保护性免疫反应的组合物，所述组合物包括表达病毒抗原的转基因乳酸乳球菌，其特征在于：所述乳酸乳球菌表达的病毒抗原是H5N1禽流感病毒的血凝素，并且所述乳酸乳球菌是用粘膜粘附聚合物制成使用的形态并以口服方式施用。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述保护性免疫反应是指可以从病毒的致命挑战中保护受试体的免疫反应。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述粘膜粘附聚合物是亲水性聚合物或水凝胶。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述亲水性聚合物是聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基纤维素。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述乳酸乳球菌是以肠溶固体制剂形态制定。
6.一种组合物在制备用于诱发人类或非人类动物受试体内针对抗原的保护性免疫反应的药物的应用，所述组合物包括表达病毒抗原的转基因乳酸乳球菌，其特征在于：所述乳酸乳球菌表达H5N1禽流感病毒的血凝素，并且所述乳酸乳球菌是用粘膜粘附聚合物制成使用的形态，所述药物以口服方式施用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述保护性免疫反应是指可以从病毒的致命挑战中保护受试体的免疫反应。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述组合物以肠溶固体形态制定。
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