CN110974953A

CN110974953A - 一种免疫佐剂及其用途

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Publication number: CN110974953A
Application number: CN201911282242.3A
Authority: CN
Inventors: 张云涛; 徐静; 单璞; 高金爽; 邓霞; 王志标
Original assignee: China National Biotec Research Institute Co ltd
Current assignee: China National Biotec Research Institute Co ltd
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2020-04-10

Abstract

本发明公开了一种免疫佐剂，所述免疫佐剂包含选自盐类壳聚糖溶液、季铵化壳聚糖溶液或羟基化壳聚糖溶液中的一种或几种；其中，所述盐类壳聚糖溶液的pH值为4.5～5.5，所述季铵化壳聚糖溶液的pH值为5.8～8，所述羟基化壳聚糖溶液的pH值为5.8～8。本发明筛选出的特定壳聚糖衍生物能够增强不同抗原体液免疫应答及黏膜免疫应答反应，具有良好的佐剂作用，为壳聚糖衍生物佐剂作用机理的研究奠定基础，有望替代壳聚糖用于黏膜佐剂的开发。

Description

一种免疫佐剂及其用途

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种免疫佐剂及其用途。

背景技术

佐剂(Adjuvant)对于疫苗的作用非常重要，免疫佐剂的使用有时可极大地提高疫苗的保护效果，增强机体免疫系统对抗原的特异性免疫应答反应。目前获批的人用疫苗佐剂包括铝佐剂、MF59佐剂、AS系列佐剂(AS04、AS03、 AS01)、病毒体佐剂、ISA51佐剂、CpG佐剂等。

铝佐剂是世界上第一个被批准用于人用疫苗的佐剂，自1926年首次使用以来，在美国已有33个批准上市的疫苗含有铝佐剂，在全世界至少146种获得许可的疫苗中含有铝佐剂。已经使用的含铝化合物有氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂和硫酸铝钾，目前常用的为前两种。

MF59佐剂是一种水包油型乳剂，由4.3％的角鲨烯、0.5％的吐温80(Tween 80)、0.5％的司盘85(Span 85)和柠檬酸缓冲液组成，液滴直径约160nm左右。 MF59佐剂流感疫苗

于1997年被欧盟批准用于老年人预防流感，是继铝佐剂之后近70年来第一个被获批的人用疫苗佐剂，目前已被30多个国家批准使用。

AS04是由免疫增强剂MPL和铝盐结合而成。目前已有两种含AS04的疫苗批准用于人类：人乳头瘤病毒16/18(HPV-16/18)疫苗(CervarixTM)和乙肝 (HBV)疫苗

第三个针对单纯疱疹病毒的疫苗，已进入临床III 期试验阶段。由于MPL是TLR4受体激动剂，故AS04仅对表达TLR4(人类中主要是DCs和单核细胞)的细胞有直接作用，不表达TLR4的类浆细胞样树突状细胞对AS04无反应。AS04的免疫刺激作用局限于注射部位，通过TLR4直接激活抗原提呈细胞(APC)，诱导APC成熟，摄取抗原并迁移到引流淋巴结，主要产生以IL-2和IFN-γ为标志的Th1型免疫应答。

AS03与MF59类似，为另一种获准用于人体的新型流感疫苗，由两种可生物降解的油(5％角鲨烯、5％DL-α-生育酚)和1.8％Tween80，以PBS缓冲液为载体组成。在欧洲已被批准用于流感疫苗，并在2009年H1N1流感大流行爆发中作为佐剂疫苗(Pandemrix^TM)广泛使用。目前也被用于H5N1流感病毒疫苗和H7N9流感病毒疫苗临床试验阶段的研制。

ISA51属于Montanide公司研发的ISATM系列油包水型佐剂，由矿物油加表面活性剂组成。该佐剂与抗原按体积1:1混合后能提高特异性抗体滴度及CTL 应答，这种免疫增强效应与抗原储存库效应、炎症(刺激募集APC)、淋巴细胞捕获(刺激淋巴细胞在引流淋巴结堆积)有关。现已上市的重组人表皮生长因子 (epidermal growth factor，EGF)偶联疫苗

用于治疗非小细胞肺癌，免疫人体后产生的特异性EGF抗性能与自身EGF结合，从而降低血液中EGF的浓度，阻断肿瘤表面EGF受体结合路径。缺点是孕妇或哺乳期妇女不能接种该疫苗。ISA51常用于肿瘤疫苗和HIV疫苗的研究，目前该佐剂正用于流感疫苗的临床试验。

AS01是含有单磷酰脂质A(3-O-desacyl-4'-monophosphoryl lipid A，MPL)和皂素(QS-21)两种免疫刺激剂的脂质体佐剂。2015年7月，由GSK公司研制的 RTS，S/AS01被欧洲药监局批准成为全球第一个，也是目前唯一被批准可在人体应用的疟疾疫苗。RTS，S/AS01以AS01为佐剂，以重组恶性疟原虫环子孢子 (plasmodium falciparumcircumsporozoite)蛋白-乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen)融合蛋白(RTS,S)为抗原，其商品名为Mosquirix^TM。其既诱导前红细胞阶段疟原虫的特异性抗体，也可诱导疟原虫特异性细胞免疫反应。特异性抗体可阻止疟原虫进入肝细胞，特异性细胞免疫反应可认定并清除感染疟原虫的肝细胞。另外，已上市的以AS01为佐剂的带状疱疹疫苗(商品名shingrix) 也表现出优于减毒活疫苗的有效性。

黏膜免疫可动员机体免疫系统，保护机体免受通过黏膜表面和其他途经的感染，同时可替代注射疫苗无菌针头的使用而引起关注。然而，目前经黏膜免疫的疫苗还很少，主要有口服脊髓灰质炎病毒活疫苗(OPV)、口服轮状病毒活疫苗、口服霍乱疫苗、口服痢疾活疫苗、口服伤寒Ty21a疫苗。近年来国际上黏膜疫苗研制已经成为一个热点，包括脂质微粒、CpG寡核苷酸、阳离子微粒、 PLG微球及壳聚糖等黏膜佐剂或递送系统均在疫苗中进行了评价。鼻黏膜具有独特的免疫优势：鼻腔黏膜上皮层覆盖大量微绒毛，与抗原接触面积大；鼻腔内血管丰富，抗原摄入后可以直接进入血液和淋巴循环；代谢酶相对少，抗原不易被水解破坏；无需使用针头及注射器等潜在感染源。因此，与其他黏膜免疫途径相比，鼻黏膜免疫是最佳的黏膜免疫途径。

很多危害较大的传染病如艾滋病、流感、结核病、诺如病毒性腹泻、甲型肝炎等都可由病原体通过黏膜表面侵入机体，对于这些疾病的预防，仅依靠传统的疫苗注射方式递送抗原，难以诱导有效的黏膜免疫，因此研制新型黏膜疫苗具有重要意义。目前已批准上市的黏膜疫苗主要是减毒和灭活黏膜疫苗，用于预防脊髓灰质炎、霍乱、伤寒、流感等疾病。但不可忽视的是减毒疫苗株存在毒力逆转的风险，可引起人为致病；而灭活疫苗、亚单位疫苗又有免疫原性低，免疫反应不足的缺点；所以选择适宜的佐剂和载体，开发安全有效的黏膜疫苗仍是未来研究的重要方向。壳聚糖经过改性修饰可生成各类水溶性衍生物，这些衍生物在保持壳聚糖生物相容性、生物降解性等优势基础上，又各自具备不同的理化特性和免疫刺激活性，这为黏膜疫苗佐剂和载体的开发提供新的选择。

壳聚糖(Chitosan)是近年来发现的一种用于口鼻黏膜疫苗的佐剂和载体。其化学名为(1,4)-2氨基-2-脱氧-β-D葡聚糖；分子式为：[C₈H₁₃NO₅]_n1[C₆H₁₁NO₄]_n2， n2/(n1+n2)＞60％。壳聚糖主要由甲壳素(Chitin)经脱乙酰基处理而成(一般在 60％以上)，是一种高分子线性聚阳离子多糖，主要由N-乙酰-D-氨基葡萄糖和 D-氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成。壳聚糖有很好的安全性，对小白鼠的半数致死量为16g/kg，与糖和盐相同。其次作为聚阳离子，壳聚糖一方面可用于荷载负电荷蛋白抗原，另一方面也可与黏膜表面的黏蛋白结合，延长抗原在黏膜表面的滞留时间。同时，壳聚糖自身也是一种有效的免疫增强剂，能激发非特异性免疫应答。这些特性使壳聚糖成为开发安全有效的口鼻黏膜疫苗最佳的候选佐剂和载体之一。然而，壳聚糖因分子间氢键的相互作用，仅在pH＜6.5 时才能溶解，这大大限制了壳聚糖的应用。进一步研究发现，对壳聚糖的化学基团进行修饰可使其表面电荷发生改变，这不仅可增强其溶解性，还能使其表现出不同的生物学活性，从而达到更好的免疫调节效果。因此壳聚糖衍生物的合成与应用已成为新的热点。

壳聚糖结构中的活性基团包括C2位上的氨基以及C3、C6位上的羟基，易于化学改性修饰。目前对壳聚糖的化学修饰研究主要包括烷基化、酰基化、羧甲基化、酯化、季铵化、接枝等反应。壳聚糖经化学修饰后不仅显著提高了水溶性，同时还保留了生物相容性、生物降解性和免疫刺激性的优势，为黏膜疫苗，尤其是经口、鼻途径递送的疫苗提供了新型候选佐剂和递送载体。

但是，由于壳聚糖衍生物种类繁多，其理化性质也有很大差别，有些壳聚糖衍生物无法起到良好的增强免疫应答的作用。因此，需要寻找到合适的壳聚糖衍生物作为免疫佐剂来解决上述问题。

发明内容

本发明的一个方面，是针对现有技术中壳聚糖衍生物免疫佐剂的免疫调节效果差的缺陷，提供了一种免疫佐剂及其用途。

本发明提供的技术方案为：

一种免疫佐剂，所述免疫佐剂包含选自盐类壳聚糖溶液、季铵化壳聚糖溶液或羟基化壳聚糖溶液中的一种或几种；

其中，所述盐类壳聚糖溶液的pH值为4.5～5.5，所述季铵化壳聚糖溶液的 pH值为5.8～8，所述羟基化壳聚糖溶液的pH值为5.8～8。

壳聚糖衍生物作为佐剂的作用机制可能包括：壳聚糖衍生物对细胞间紧密连接的影响、DC(树突状细胞)对壳聚糖衍生物疫苗的摄取情况分析、壳聚糖衍生物对BMDC(骨髓来源树突状细胞)成熟的影响、壳聚糖衍生物对THP-1 细胞(人急性单核细胞白血病细胞)Ⅰ型干扰素表达的影响。

在本发明的实施方式中，发明人研究了不同pH值的壳聚糖衍生物溶液作为免疫佐剂对免疫应答反应的增强效果，从而寻找到了特定的壳聚糖衍生物用于疫苗制剂的佐剂。上述壳聚糖衍生物包括但不限于，季铵化(季铵盐HTCC)、羟基化(乙二醇壳聚糖GC，甲基乙二醇壳聚糖MGC)、羧基化(羧甲基壳聚糖 CMC)及盐类壳聚糖(乳酸盐CL，醋酸盐CA，盐酸盐CH)。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述盐类壳聚糖溶液为壳聚糖醋酸盐溶液(CA)，所述季铵化壳聚糖溶液为壳聚糖季铵盐溶液(HTCC)，所述羟基化壳聚糖溶液为甲基乙二醇壳聚糖溶液(MGC)。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述盐类壳聚糖溶液的pH值为5，所述季铵化壳聚糖溶液的pH值为7，所述羟基化壳聚糖溶液的pH值为8。

本发明所述免疫佐剂可用于任意合适的免疫接种方式，包括但不限于注射免疫(包括皮下免疫、皮内免疫、静脉接种等)、经口免疫、气雾免疫、黏膜免疫等。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述免疫为黏膜免疫。更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述免疫为通过鼻腔、阴道、肛门、口咽或舌下的黏膜进行的免疫。更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述免疫为通过鼻腔黏膜进行的免疫。

本发明所述壳聚糖衍生物，包括其盐类壳聚糖、季铵化壳聚糖或羟基化壳聚糖，可通过本领域公知的方法制备，例如，《壳聚糖及其衍生物制备与应用》， 2017，中国水利水电出版社中记载的方法。也可购买商品化产品。

本发明的另一个方面，是提供了一种上述免疫佐剂在制备预防或治疗性疫苗，或制备增强免疫应答水平的产品中的用途。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述疫苗为乙肝疫苗或流感疫苗。更优选地，所述流感疫苗为甲型H1N1流感疫苗。

上述增强免疫应答水平的产品可以为含有上述免疫佐剂化合物的试剂盒。

本发明的另一个方面，是提供了一种疫苗制剂，所述疫苗制剂包括抗原、上述免疫佐剂、以及制剂所需的辅料和缓冲系统。

上述抗原可以为任意合适的抗原，例如，乙肝抗原、流感抗原、肿瘤相关抗原等。在本发明中，所述术语“抗原”是指通过MHC分子处理和呈递，能够通过抗体或通过T细胞受体(TCR)特异性结合的分子。抗原还能够通过免疫系统识别和/或能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。抗原可具有一种或多种表位或抗原位点。

上述疫苗制剂所需的辅料可以为，例如，稳定剂或保护剂、防腐剂、助溶剂、稀释剂、吸收促进剂、pH控制剂、渗透压控制剂、推进剂等常用辅料；缓冲系统可以为，例如，无菌水、磷酸盐缓冲液、氯化钠缓冲液、植物油、最低基础培养基(MEM)、含有HEPES缓冲液的MEM等。

作为优选，上述疫苗制剂可以为灭活疫苗、减毒疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗、蛋白质疫苗或多肽疫苗的制剂。

作为优选，上述疫苗制剂可以为口服剂、栓剂、注射剂、喷雾剂剂型适用的任意合适的给药方式，优选为鼻腔喷雾或鼻滴的给药方式。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗原和所述免疫佐剂的体积比为8：1。

在本发明中，所述免疫佐剂可以为单一成分的免疫佐剂，也可以为含有至少一种其他免疫佐剂的组合物，这些都视为包含在本发明的保护范围之内。多种免疫佐剂可适于改变个体的免疫应答。

本发明的有益效果为：

本发明筛选出的特定壳聚糖衍生物能够增强不同抗原体液免疫应答及黏膜免疫应答反应，具有良好的佐剂作用，为壳聚糖衍生物佐剂作用机理的研究奠定基础，有望替代壳聚糖用于黏膜佐剂的开发。

附图说明

图1为本发明免疫佐剂乙肝疫苗免疫小鼠后血清anti-HBs滴度结果图；

图2为本发明免疫佐剂乙肝疫苗免疫小鼠后血清中anti-HBs IgG2a/IgG1比值结果图；

图3为本发明免疫佐剂乙肝疫苗免疫小鼠ELISPOT检测IFN-γ、IL-2、IL-4 斑点数结果图；

图4为本发明免疫佐剂乙肝疫苗免疫小鼠后支气管肺泡灌洗液sIgA滴度结果图；

图5为本发明免疫佐剂鼻喷流感疫苗免疫小鼠后血清血凝抑制抗体滴度和阳转率结果图；

图6为本发明免疫佐剂鼻喷流感疫苗免疫小鼠后血清IgG滴度结果图；

图7为本发明免疫佐剂鼻喷流感疫苗免疫小鼠后支气管肺泡灌洗液sIgA滴度结果图；

图8为不同pH值的CL鼻喷乙肝疫苗免疫小鼠后血清anti-HBs滴度和阳转率结果图，其中，A为anti-HBs滴度结果图，B为转阳率结果图；

图9为不同pH值的鼻喷乙肝疫苗免疫小鼠后血清anti-HBs滴度和阳转率结果图，其中，A为anti-HBs滴度结果图，B为转阳率结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种免疫佐剂及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。以下就本发明中所出现的名词做以解释。

术语“免疫佐剂”是指当施用于受试者或动物时可诱导和/或增强针对抗原的免疫应答的化合物。其也意指通常作为促进、延长、或增强针对特定抗原的特定免疫应答的质量的物质。在本发明的上下文中，术语“免疫佐剂”是指通过影响先天免疫应答的瞬态反应增强先天免疫应答和通过抗原呈递细胞，特别是树突状细胞的活化和成熟增强适应性免疫应答的更长期效果的化合物。

术语“抗原”是指通过MHC分子处理和呈递，能够通过抗体或通过T细胞受体(TCR)特异性结合的分子。抗原还能够通过免疫系统识别和/或能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。抗原可具有一种或多种表位或抗原位点。

术语“黏膜免疫”在本发明中是指通过粘膜免疫系统进行的免疫。黏膜免疫系统是由分布于胃肠道、泪道、唾液分泌管、呼吸道、泌尿道和乳腺黏膜内的淋巴组织组成的，占据了机体淋巴组织的大部分。其中胃肠道的黏膜免疫系统尤令人关注，特征如下：具有特殊的集合淋巴结(又称Peyer’spatches)；具有黏膜归巢(muoz～alhoming)受体，即淋巴细胞通过再循环又回到黏膜的模式；是IAe B细胞和记忆T细胞定位的所在地；所分泌的免疫球蛋白主要是S～IAe等。这些性质一方面能使宿主不受病原体的伤害，另一方面会使机体对普通的食物抗原和正常的微生物产生免疫耐受。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：1％壳聚糖及其衍生物溶液的制备

主要材料来源：

壳聚糖、壳聚糖醋酸盐购自HEPPE MEDICAL CHITOSAN GmbH公司

壳聚糖季铵盐购自南通绿神生物工程有限公司

甲基乙二醇壳聚糖购自SIGMA公司

(1)1％壳聚糖季铵盐(HTCC)溶液的制备

将准确称取的0.5克壳聚糖季铵盐置于放有磁力搅拌子的烧杯中，加入50ml0.3％的醋酸溶液，磁力搅拌器200rpm搅拌30至45分钟，将溶解后壳聚糖季铵盐溶液4000rmp离心10分钟，最后将离心后上清液过0.45μm滤膜，2-8℃保存备用。

(2)1％甲基乙二醇壳聚糖(MGC)溶液及壳聚糖醋酸盐(CA)溶液的制备

将准确称取的0.5克甲基乙二醇壳聚糖、壳聚糖醋酸盐，分别置于50ml离心管中，加入50ml纯水，并在涡旋振荡器混匀至完全溶解，4000rmp离心10 分钟，最后将离心后上清溶液过0.45μm滤膜，2-8℃保存备用。

(3)1％壳聚糖(CS)溶液的制备

将准确称取的0.5克壳聚糖置于放有磁力搅拌子的烧杯中，加入37.5mL 0.4％的醋酸溶液，磁力搅拌器200rpm搅拌1.5至2小时，然后补加12.5ml水，在150rpm 转速下继续搅拌4至4.5小时，将溶解后壳聚糖溶液4000rmp离心10分钟，最后将离心后上清溶液过0.45μm滤膜，2-8℃保存备用。

实施例2：壳聚糖衍生物作为乙肝疫苗佐剂的黏膜免疫效果评价

将实施例1中的壳聚糖及其衍生物作为疫苗佐剂，以重组乙型肝炎亚单位疫苗(酿酒酵母表达HBsAg，北京天坛生物制品股份有限公司生产)作为抗原。以制备1ml以壳聚糖或其衍生物为佐剂的疫苗为例，取100μl的壳聚糖或其衍生物溶液，加入100μl PBS后混匀，再加入200μl生理盐水，最后加入550μl的 HBsAg溶液后迅速混匀，置于2-8℃保存。用于滴鼻免疫小鼠，检测小鼠血清中 anti-HBs，具体方法如下：

实验动物：BALB/c小鼠，6-8周龄，13只/组，雌性，购自维通利华实验动物技术有限公司。

药物浓度：由上述实施例1中制备的壳聚糖及其衍生物：10mg/ml；HBsAg 溶液：181.7μg/ml。对照溶剂：生理盐水(Normal Saline，NS)。

混合后药物浓度：壳聚糖或其衍生物：1mg/ml；HBsAg：100μg/ml。

给药剂量：壳聚糖或其衍生物：20μg/mouse(小鼠)；HBsAg：2μg/mouse (小鼠)。

分组：1)HTCC组：HTCC+HBsAg；2)MGC组：MGC+HBsAg；3)CA 组：CA+HBsAg4)CS组：CS+HBsAg；5)HBsAg+Al；6)单抗原组：HBsAg； 7)空白对照组：NS。

免疫方式：鼻腔免疫，先用0.4％的戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉小鼠，0.4ml/只，待小鼠进入麻醉状态后，滴鼻免疫，10μl/鼻孔，20μl/只。

免疫方案：动物按照免疫分组基础免疫后3周加强免疫，末次免疫后1周每组随机取出3只小鼠，进行脾淋巴细胞的酶联免疫斑点实验(enzyme-linked immunespot assay，ELISPOT)。末次免疫后3周每组剩余10只小鼠摘除眼球采血并制备BALF，以酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)定量检测血清anti-HBs和sIgA。

ELISA法定量检测血清中anti-HBs效价：

将血清用样品稀释液(含1％BSA的0.02M pH 7.4PBS溶液)进行10倍系列稀释(1-1/1000)。按照乙型肝炎病毒表面抗体定量测定试剂盒说明书以ELISA 测定各组血清anti-HBs。具体步骤如下：

加样：分别在相应孔中加入待测血清及标准品各50μl。

加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外，轻轻振荡混匀。

孵育：用封板膜封板后，置37℃孵育1小时。

洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量拍干。

显色：每孔加入显色剂A、B液各50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15 分钟。

测定：每孔加终止液50μl，轻轻振荡混匀，10min内测定结果。设定酶标仪波长于450nm(参比波长630nm)，测定各孔OD值。

结果解释：以标准品(10mIU/ml、20mIU/ml、40mIU/ml、80mIU/ml、100 mIU/ml、160mIU/ml)的抗体含量及其对应的OD值做双对数曲线，求出线性回归方程。将待测样品OD值的对数值代入回归方程，求得相应抗体含量。

ELISPOT检测IFN-γ、IL-2、IL-4的斑点形成数

小鼠脾淋巴细胞的制备

小鼠颈椎脱臼法处死，浸入75％乙醇中。将灭菌的三角纱布放入一次性平皿中，加入5ml含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。无菌操作取出小鼠脾，放入平皿内的纱布上。

用弯头镊子将脾裹入纱布内，并隔着纱布将脾碾碎。

15ml离心管内放入3ml淋巴细胞分离液，用移液器将小皿中的脾细胞溶液缓慢转移至离心管内。4℃800g离心20分钟。

离心结束后，移液器吸出淋巴细胞层，放入新离心管中，加入10ml含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，颠倒洗涤。4℃280g离心20分钟。

倾倒上清液，加入0.8ml含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞。

细胞计数，用培养基调整细胞浓度至5×10⁶cells/ml，细胞存活率需＞90％。

IFN-γ、IL-2、IL-4分泌细胞形成的斑点数检测

包被：第一天用IFN-γ、IL-2、IL-4包被抗体用无菌PBS稀释，分别包被 PVDF膜96孔板，每孔100μl，4℃包被过夜。

封闭：第二天弃去包被液，用无菌PBS洗5遍，拍干。每孔加200μl含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温静置30分钟以上。

加细胞：将每只小鼠的脾淋巴细胞浓度调至5×10⁶cells/ml，每孔加入100 μl细胞悬液(即5×10⁵cells)。空白孔加100μl培养基。实验组设3个复孔、1 个阴性对照孔，实验孔加10μl刺激物(IFN-γ、IL-2检测的HBsAg特异性CTL 表位多肽终浓度为5μg/ml；IL-4检测的HBsAg蛋白终浓度为5μg/ml)，阴性孔不加刺激物。阳性对照孔加10μl ConA(终浓度5μg/ml)刺激。置于37℃5％CO₂细胞培养箱孵育20小时。

加检测抗体：第三天弃去孔内细胞及培养基，用PBS洗5遍，拍干。

生物素标记的检测抗体用ELISPOT稀释液稀释后，每孔100μl，室温避光孵育2小时。

加酶：弃去孔内液体，用PBS洗5遍，拍干。链霉素标记的ALP用稀释液稀释后，每孔100μl，室温避光孵育1小时。

显色：弃去孔内液体，用PBS洗5遍，拍干。每孔加入100μl显色液 (BCIP/NBT)，室温避光显色15～30分钟，以能看到清晰的斑点为准，将显色液倒掉，自来水冲洗终止反应，拍干。避光倒扣放置，待膜自然晾干。

读板：ELISPOT板完全干燥后放置于酶联免疫斑点分析仪内，调节参数，斑点计数并质控。检测分泌三种因子SFCs频数。

结果解释：ELISPOT斑点数＝样本孔平均斑点数-未刺激的对照孔斑点数。

BALF中特异性sIgA检测

制备BALF

小鼠颈椎脱臼法处死后进行颈部解剖，暴露气管并在气管近口端结扎。将装有0.3ml无菌PBS的注射器针头插入气管，用PBS反复冲洗3遍，回收至EP 管中。回收的BALF2000rpm离心5分钟，取上清。置2～8℃保存，两天内检测特异性sIgA，或置-20℃保存，待检。

间接ELISA法检测特异性sIgA

包被：将HBsAg用包被液稀释至2μg/ml，加到96孔酶标板中，100μl/ 孔，4℃包被过夜。

洗板：洗板机350μl/孔洗板5次，拍干。

封闭：每孔加入封闭液200μl，37℃封闭1小时，洗板5次，拍干。

加样：每个样品起始稀释度为1/10在板内2倍系列稀释，共11个稀释度 (1/10-1/10240)，100μl/孔，并设阳性对照(含特异性sIgA抗体的BALF)、阴性对照(NS-1组、NS-2组BALF)、稀释液对照及空白对照各2孔。37℃孵育1 小时，洗板5次，拍干。

加酶标二抗：用二抗稀释液稀释至工作浓度(1:20000)，100μl/孔(空白对照孔除外)，37℃孵育1小时，洗板5次，拍干。

显色：每孔加入显色剂A、B液各50μl，37℃避光显色15分钟。

终止：每孔加入终止液50μl。

测定：设定酶标仪波长于450nm处(参比波长630nm)，测定各孔OD值。

结果解释：计算P/N值(P/N值＝样品OD值/阴性对照平均OD值)。

P/N≥2.1者为阳性；P/N＜2.1者为阴性。各样品呈阳性结果的最大稀释度即该样品的抗体滴度，以最大稀释度计算log值作统计分析。

实验结果：

如图1所示，以HBsAg为抗原，壳聚糖三种衍生物作为滴鼻免疫佐剂接种小鼠后可产生较高水平的anti-HBs，有佐剂的五组阳转率都达到100％，高于S 组(未阳转)，说明衍生物、壳聚糖和铝佐剂都可增强HBsAg免疫原性。另一方面，HTCC、MGC和CA与CS比较，无统计学差异(p＞0.05)，免疫效果相当。

含有佐剂的五组乙肝疫苗免疫三针后，比较各组小鼠免疫血清中 IgG2a/IgG1比值。HTCC、MGC、CA和CS鼻喷乙肝的IgG2a/IgG1平均值均高于铝佐剂乙肝疫苗，说明衍生物和CS提高了IgG2a应答比例，且MGC鼻喷乙肝与铝佐剂乙肝疫苗的差异具有统计学意义(p＜0.05)。另一方面，衍生物和 CS鼻喷乙肝IgG2a/IgG1＜1，说明仍是以Th2型免疫应答为主(如图2所示)。

末次免疫后1周，分离小鼠脾淋巴细胞，经CTL多肽刺激后，含佐剂组IFN- γSFCs均显著高于S组(p＜0.05)，鼻喷疫苗组IFN-γSFCs水平高于铝佐剂乙肝疫苗，其中MGC鼻喷乙肝(p＜0.01)、CS鼻喷乙肝(p＜0.05)与铝佐剂乙肝疫苗有显著性差异，但CS及衍生物疫苗各组间无统计学差异(p＞0.05，如图3的A)。

IL-2SFCs检测结果与IFN-γ类似，佐剂组IL-2SFCs显著高于S组(p＜0.05)。鼻喷疫苗组高于铝佐剂乙肝疫苗，其中CA、CS组显著高于HTCC(p＜0.05)、 AL组(p＜0.001，如图3的B所示)。

IL-4细胞因子水平可以反映出Th2型免疫应答能力。与IL-2、IFN-γ检测结果相同，佐剂组IL-4SFCs仍然显著高于S组(p＜0.05)，但不同的是铝佐剂乙肝疫苗组IL-4SFCs水平最高，与CA和CS无显著差异(p＞0.05)，显著高于HTCC(p＜0.001)、MGC(p＜0.01)，CS及衍生物各组间无统计学差异(p ＞0.05，如图3的C所示)。

可以看出，铝佐剂乙肝疫苗明显表现为高水平的IL-4SFCs和低水平的IL-2 和IFN-γSFCs，而CS及衍生物鼻喷乙肝疫苗IFN-γ、IL-2、IL-4SFCs比例更均衡。

末次免疫3周后采集小鼠BALF，用间接ELISA的方法检测HBsAg特异性 sIgA。三种衍生物和CS鼻喷乙肝都可以检测到抗原特异的sIgA，各组间无统计学差异(p＞0.05)，说明都能诱导有效的黏膜免疫。在铝佐剂乙肝疫苗组与滴鼻免疫的S组BALF中都未检测到特异性sIgA(如图4所示)。

实施例3：壳聚糖衍生物作为流感疫苗黏膜免疫佐剂的IgG及血凝抑制效价评价

将实施例1中制备的壳聚糖及其衍生物作为疫苗佐剂，以H1N1流感疫苗 (H1N1流感病毒裂解液，北京天坛生物制品股份有限公司)为抗原。二者按照实施例2中乙肝疫苗的配制方法制备疫苗，滴鼻免疫小鼠，检测血清特异性IgG 及血凝抑制效价，具体方法如下：

实验动物：BALB/c小鼠，6-8周龄，10只/组，雌性，购自维通利华实验动物技术有限公司。

药物浓度：由上述实施例1中制备的壳聚糖及其衍生物：10mg/ml；H1N1 裂解液HA终浓度为562μg/ml。

对照溶剂：生理盐水(Normal saline，NS)。

混合后药物浓度：壳聚糖或其衍生物：1mg/ml；H1N1裂解液HA终浓度： 225μg/ml。

给药剂量：壳聚糖或其衍生物：20μg/mouse(小鼠)；H1N1：4.5μg/mouse (小鼠)。

分组：(1)HTCC组：HTCC+H1N1；(2)MGC组：MGC+H1N1；(3) CA组：CA+H1N1(4)CS组：CS+H1N1；(5)单抗原组：H1N1；(6)空白对照组：NS。

免疫方案：动物按照免疫分组基础免疫后3周加强免疫，末次免疫后3周摘眼球采血，采用间接ELISA法检测血清特异性IgG。

所用试剂配制或来源：

抗原包被液：50mmol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6，称取无水Na₂CO₃ 1.696g， NaHCO₃2.856g，加水溶解至1000mL，pH9.6。

洗涤液(10×PBST，pH7.4)：称取NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄ 29g，KH₂PO₄ 2g，Tween-20 10mL，加超纯水至1000ml，调至pH 7.4，使用时稀释10倍即可。

封闭液：1％BSA，用50mmol/L PBS pH 7.4溶解。

底物液A、底物液B及终止液：购自万泰生物药业股份有限公司

受体破坏酶(receptor destroying enzyme，RDE)：购自日本生研。

鸡红细胞：购自维通利华实验动物技术有限公司。

间接ELISA法检测血清特异性IgG：

包被：将H1N1裂解液用包被液稀释至5μg/ml，加到96孔酶标板中，100μl/ 孔，4℃包被过夜。

洗板：洗板机350μl/孔，洗板5次，拍干。

加样：每个样品起始稀释度为1/4000在板内2倍系列稀释，共11个稀释度 (1/4000-1/4096000)，100μl/孔，并设阳性对照(含特异性IgG抗体的血清)、阴性对照(NS组血清)、稀释液对照及空白对照各2孔。37℃孵育1小时，洗板5次，拍干。

加酶标羊抗鼠二抗：用二抗稀释液稀释至工作浓度(1：10000)，100μl/孔 (空白对照孔除外)，37℃孵育1小时，洗板5次，拍干。

显色：每孔加入显色剂A、B液各50μl，37℃避光显色15分钟。

终止：每孔加入终止液50μl。

结果解释：计算P/N值(P/N值＝样品OD值/阴性对照平均OD值)。P/N≥2.1 者为阳性；P/N＜2.1者为阴性。各样品呈阳性结果的最大稀释度计算以2为底的log值，即该样品的抗体滴度。

血凝抑制效价检测：

受体破坏酶(receptor destroying enzyme，RDE)处理：以RDE四倍稀释待测血清，即3份RDE加入1份血清，37℃水浴过夜，第二天经56℃水浴灭活1 小时后冷却。

加入待测血清：取96孔V形微量反应板，用移液器在第2～7行各加入25μl PBS，第8行加入50μlPBS。在第1行加入50μl RDE处理后血清，充分混匀后移出25μl加至第2行，依次类推，倍比稀释至第6行，弃去25μl，第7行设为病毒对照，第8行为红细胞对照。

加入抗原和鸡红细胞：配制4单位抗原，在第1～7行各加入25μl 4单位抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，自上向下依次向各孔加入50μl 1％的鸡红细胞悬液。室温20～25℃下静置30分钟。

结果判定：在红细胞对照出现完全沉淀、病毒对照出现完全凝集的情况下，将反应板作45°倾斜观察，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数计算以2为底的log值，即为该血清HI抗体滴度。

实验结果：

流感HI抗体滴度能够特异性的反映免疫血清对流感病毒的保护力。以 H1N1病毒裂解液为免疫抗原，壳聚糖三种衍生物作为流感疫苗佐剂可产生较高的血凝抑制抗体滴度。其中，含有佐剂的鼻喷流感HI抗体滴度显著高于HA 组(p＜0.001，如图5的A所示)。CA和CS鼻喷流感抗体滴度最高，其中CA 显著高于HTCC和MGC(p＜0.05)。以HI抗体滴度≥40为阳转标准，CA和 CS鼻喷流感阳转率都达到100％，HTCC和MGC鼻喷流感阳转率为50％，HA 组未阳转(如图5的B所示)。

末次免疫后3周，使用间接ELISA法检测血清中特异性IgG。与HI抗体滴度趋势一致，体系稳定的CA鼻喷流感IgG滴度显著高于HTCC和MGC(p＜ 0.05)以及HA组(p＜0.01)，与CS和i.m.组无显著差异。粒径相对不稳定的 HTCC和MGC鼻喷流感IgG滴度与i.m.和HA组无统计学差异(p＞0.05)(如图6所示)。

实施例4壳聚糖衍生物作为流感疫苗佐剂产生黏膜免疫sIgA的效果

按实施例2中的步骤及方法制备免疫用疫苗，实验分组参照实施例3，并增加一组单H1N1肌肉注射组作为对照组(4.5ug/只/次)，5只/组，免疫方案一致，末次免疫3周后采集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)，采用间接ELISA法检测 BALF中特异性sIgA。

所用试剂配制或来源：

封闭液：1％BSA，用50mmol/L PBS pH 7.4溶解。

底物液A、底物液B及终止液：购自万泰生物药业股份有限公司。

具体操作过程：

包被：将H1N1流感裂解原液用包被液稀释至5μg/ml，加到96孔酶标板中， 100μl/孔，4℃包被过夜。

洗板：洗板机350μl/孔，洗板5次，拍干。

加样：每个样品起始稀释度为1/30在板内2倍系列稀释，共11个稀释度 (1/30-1/30720)，100μl/孔，并设阳性对照(含特异性IgA抗体的BALF)、阴性对照(NS-1组、NS-2组BALF)、稀释液对照及空白对照各2孔。37℃孵育1 小时，洗板5次，拍干。

加酶标二抗：用二抗稀释液稀释至工作浓度(1：20000)，100μl/孔(空白对照孔除外)，37℃孵育1小时，洗板5次，拍干。

显色：每孔加入显色剂A、B液各50μl，37℃避光显色15分钟。

终止：每孔加入终止液50μl。

结果解释：计算P/N值(P/N值＝样品OD值/阴性对照平均OD值)P/N≥2.1 者为阳性；P/N＜2.1者为阴性。对于阴性样品以原倍起始，在酶标板内2倍系列稀释，重复实验。终止结果以各样品呈阳性结果的最大稀释度即该样品的抗体滴度，以最大稀释度计算2为底的log值。若样品结果为阴性，以最终实验的起始稀释度/2计算log值。

实验结果：从间接ELISA检测结果可以看出，含佐剂的各组疫苗BALF中都有特异性sIgA，以壳聚糖或其衍生物为佐剂的流感疫苗诱导产生的sIgA水平显著高于单H1N1组，且肌肉注射组并未检测到sIgA(如图7所示)，说明壳聚糖及其衍生物可诱导流感疫苗产生较强的黏膜免疫增强效果。

实施例5：不同pH值的壳聚糖衍生物作为免疫佐剂的免疫增强效果

配制含不同pH值PBS缓冲液的壳聚糖衍生物鼻喷乙肝疫苗，制剂稳定性方面：HTCC和MGC为佐剂的鼻喷乙肝可以在酸性、中性和碱性条件下都保持稳定；GC仅在酸性条件下带正电，所以GC乙肝疫苗在酸性pH值(pH5和 pH5.8)时粒径稳定；CL为佐剂的疫苗在酸性和中性条件下稳定；CA为佐剂的乙肝疫苗仅在pH 5的条件下不沉淀。

免疫增强作用方面：

比较粒径稳定的pH5和pH5.8 PBS配制的CL鼻喷乙肝，血清anti-HBs检测发现，pH5.8 CL鼻喷乙肝与CS组无统计学差异(p＞0.05)，免疫效果相当。而pH5 CL组anti-HBs滴度显著低于CS组(p＜0.01)，与HBsAg组无统计学差异(p＞0.05)。两种CL鼻喷乙肝的阳转率也差异较大，pH5.8 CL鼻喷乙肝阳转率可以达到80％，pH5 CL鼻喷乙肝阳转率为20％。因此，pH5.8 CL乙肝疫苗体内免疫效果更好(如图8所示)。

再将体系稳定的pH5 CA鼻喷乙肝与pH5.8 CL鼻喷乙肝比较。以CS鼻喷乙肝为对照，pH5 CA鼻喷乙肝与其无显著差异(p＞0.05)，而CS组anti-HBs 显著高于pH5.8 CL组(p＜0.05，如图9的A所示)。CL、CA组anti-HBs阳转率分别为70％、90％(如图9的B所示)。从阳转率比较，pH5 CA鼻喷乙肝也优于pH5.8 CL鼻喷乙肝。故在壳聚糖盐类衍生物中，CA最适合作为鼻喷疫苗佐剂。

不同pH值HTCC鼻喷疫苗免疫原性比较

比较了5.8、7和8三个pH值PBS配制的HTCC鼻喷乙肝疫苗的免疫原性 (如图9所示)，3种HTCC鼻喷乙肝anti-HBs滴度均高于HBsAg组，差异有统计学意义(p＜0.001)，与CS之间没有统计学差异(p＞0.05)，免疫效果相当。在3种HTCC鼻喷乙肝中，pH7 HTCC鼻喷乙肝anti-HBs滴度略高于其他两组，阳转率达到100％，免疫效果最佳，故筛选得pH7 HTCC鼻喷疫苗做后续研究。

不同pH值MGC鼻喷疫苗免疫原性比较

MGC与HTCC类似，所配制的鼻喷乙肝疫苗在酸性、中性、碱性条件下都保持均一粒径，因此比较pH5.8、7、8三种PBS配制的MGC鼻喷乙肝。从血清anti-HBs滴度来看(如图9所示)，MGC鼻喷乙肝均显著高于HBsAg组(p ＜0.001)，和CS组没有统计学差异(p＞0.05)，比较三种MGC鼻喷乙肝anti-HBs 滴度和阳转率，pH8 MGC鼻喷乙肝抗体滴度最高且阳转率为100％，故选择pH8 MGC鼻喷疫苗做后续研究。

不同pH值GC鼻喷疫苗免疫原性比较

因pH5和pH5.8两种酸性GC鼻喷乙肝可以保持不沉淀的稳定体系，故对它们进行免疫增强作用比较(如图9所示)。两种GC鼻喷乙肝的anti-HBs滴度显著低于CS组(p＜0.001)，阳转率低于50％。因此，由pH5和pH5.8的PBS 配制的两种GC乙肝疫苗，体内免疫效果都不理想，说明GC不适宜作为鼻喷疫苗的佐剂，淘汰GC。

综上所述，通过衍生物的理化性质和免疫增强效果两个方面的比较，筛选出HTCC、MGC、CA三种壳聚糖衍生物作为鼻喷疫苗佐剂研究。

从两个方面初步筛选七种候选衍生物(壳聚糖季铵盐HTCC、乙二醇壳聚糖 GC、甲基乙二醇壳聚糖MGC、羧甲基壳聚糖CMC、壳聚糖乳酸盐CL、壳聚糖醋酸盐CA和壳聚糖盐酸盐CH)，首先从理化性质，筛选得到带正电荷且与 HBsAg形成稳定纳米体系的HTCC、GC、MGC、CL和CA，淘汰了带负电荷的CMC(-19.63mV)，以及与HBsAg配伍后体系沉淀的CH。

然后使用其余五种衍生物配制鼻腔乙肝，比较免疫增强效果。HTCC、MGC 鼻喷乙肝anti-HBs阳转率为100％，免疫效果与CS相当。在盐类衍生物中，CA 鼻喷乙肝anti-HBs阳转率为90％高于CL(70％)，免疫增强效果更好，故淘汰 CL。GC鼻喷乙肝anti-HBs阳转率低于50％，免疫增强效果差，故淘汰GC。综上，本部分初步筛选得到HTCC、MGC和CA三种衍生物进行后续研究。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种免疫佐剂，其特征在于，所述免疫佐剂包含选自盐类壳聚糖溶液、季铵化壳聚糖溶液或羟基化壳聚糖溶液中的一种或几种；

其中，所述盐类壳聚糖溶液的pH值为4.5～5.5，所述季铵化壳聚糖溶液的pH值为5.8～8，所述羟基化壳聚糖溶液的pH值为5.8～8。

2.根据权利要求1所述的免疫佐剂，其特征在于，所述盐类壳聚糖溶液为壳聚糖醋酸盐溶液，所述季铵化壳聚糖溶液为壳聚糖季铵盐溶液，所述羟基化壳聚糖溶液为甲基乙二醇壳聚糖溶液。

3.根据权利要求1或2所述的免疫佐剂，其特征在于，所述盐类壳聚糖溶液的pH值为5，所述季铵化壳聚糖溶液的pH值为7，所述羟基化壳聚糖溶液的pH值为8。

4.根据权利要求1或2所述的免疫佐剂，其特征在于，所述免疫为黏膜免疫，优选为通过鼻腔、阴道、肛门、口咽或舌下的黏膜进行的免疫，更优选为通过鼻腔黏膜进行的免疫。

5.如权利要求1-4中任意一项所述的免疫佐剂在制备预防或治疗性疫苗，或制备增强免疫应答水平的产品中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述疫苗为乙肝疫苗或流感疫苗，所述流感疫苗优选为甲型H1N1流感疫苗。

7.一种疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂包括抗原、如权利要求1-4中任意一项所述的免疫佐剂、以及制剂所需的辅料和缓冲系统。

8.根据权利要求7所述的疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂为灭活疫苗、减毒疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗、蛋白质疫苗或多肽疫苗的制剂。

9.根据权利要求7或8所述的疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂的给药方式为鼻腔喷雾或鼻滴的方式。

10.根据权利要求7所述的疫苗制剂，其特征在于，所述抗原和所述免疫佐剂的体积比为8：1。