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CN111978369A - 一种制备多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备多肽的方法，以Fmoc保护的天然氨基酸或非天然氨基酸或硫代氨基酸为原料，使用不饱和锍盐作为羧基活化剂，在碱存在下，于水或有机溶剂中，经过不饱和锍盐活化的胺酯交换反应形成肽键；然后使用含有吗啡啉的N,N‑二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基，以游离氨基；重复上述步骤，得到目标多肽产物。本发明采用α,β‑和β,γ‑不饱和取代锍盐作为羧基活化试剂，在碱存在下，发生固相肽键的生成反应。本发明使用安全低毒的锍盐作为活化试剂，适合实验室多肽合成和工业化生产。

Description

一种制备多肽的方法
技术领域
本发明属于有机化学领域，涉及一种多肽的制备方法，具体来说是一种通过不饱和锍盐活化羧基，在碱存在下，与固相氨基发生酰胺化反应的多肽固相合成方法。
背景技术
1984年的诺贝尔化学奖授予了美国Rockfeller大学的R.Bruce Merrifield教授，以表彰其在多肽固相合成技术的研究中做出的突破性贡献。多肽合成是一个通过添加氨基酸重复形成酰胺键(肽键)的过程。固相多肽合成一般将第一个氨基酸的C端(羧基端)共价连接在树脂上，脱除其N端(氨基端)的Fmoc或 Boc保护后，将羧基活化的第二个氨基酸加入体系进行酰胺化反应，并依次重复以上从C端向N端合成的操作。因此，直接影响固相多肽合成收率的反应包括两个，即N端的脱保护和肽键的形成。其中Fmoc和Boc两种保护基团的脱除已经分别建立起了快速高效的方法。而肽键的形成相关研究虽然也较为丰富，但或多或少的都存在一定的缺陷。
固相多肽合成中常用的肽键形成反应主要包括对称酸酐法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等。对称酸酐法常用DCC作为活化试剂，但是该反应需在DCM中进行，而部分氨基酸在DCM中溶解性较差，同时也容易形成消旋副产物。混合酸酐法常用氯甲酸异丙酯和氯甲酸异丁酯。酰氯法只适用于Fmoc 法多肽合成。活化酯法使用HOBt与氨基酸形成活化酯再进行反应。原位法一般使用DIC、PyBop、HATU或HCTU等缩合剂原位产生酸酐或活化酯并在树脂上形成肽键。但是，最常用的HATU和HCTU缩合剂有毒性较高、工业生产易燃易爆且对水敏感等缺点。这些方法各有优劣，其中原位法是目前较便捷也最为常用的方法。但是原位法常用试剂也有对水汽敏感、用量大和价格昂贵等缺点。因此，开发一种相对稳定、价格低廉并高效的酰胺化反应用于多肽固相合成具有重要科学意义和经济效益。
发明内容
针对多肽固相现有技术中的上述问题，本发明提供了一种制备多肽的方法，所述的这种制备多肽的方法要解决现有技术中固相多肽合成中常用的肽键形成反应复杂、副产品多，时间长的技术问题。
本发明提供了一种制备多肽的方法，包括如下步骤：
1)以Fmoc保护的天然氨基酸或非天然氨基酸或硫代氨基酸为原料，使用不饱和锍盐作为羧基活化剂，在碱存在下，于水或有机溶剂中，经过不饱和锍盐活化的胺酯交换反应形成肽键；
2)然后使用吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基，以游离氨基；
3)重复步骤1)和步骤2)，得到目标多肽产物。
进一步的，所述的用于多肽合成的氨基酸C端为羧基或硫代羧基。
进一步的，所述的吗啡啉的体积百分比浓度为50％。
进一步的，所述的不饱和锍盐活化剂选自乙烯基锍盐、乙炔基锍盐、丙炔基锍盐或者乙腈基锍盐及其衍生物中的任意一种，所述的锍盐的阴离子选自溴离子、碘离子、三氟甲磺酸根离子或者四氟硼酸根离子中的任意一种。
进一步的，所述的碱选自无机碱或者有机碱，所述的无机碱为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠或者氢氧化钾中的任意一种，所述的有机碱为二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和N-甲基吗啡啉中的任意一种。
进一步的，所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二氯甲烷、甲醇、乙腈或者二甲基亚砜中的任意一种。
本发明的一种用于多肽固相合成的酰胺化反应，包括新型的羧基活化试剂及其反应条件。本发明采用α,β-和β,γ-不饱和取代锍盐作为羧基活化试剂，在碱存在下，发生固相肽键的生成反应。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明适用于多肽固相合成的酰胺化反应技术，通过胺酯交换反应实现肽键的逐个形成，以达到合成多肽的目的。本发明使用安全低毒的锍盐作为活化试剂，适合实验室多肽合成和工业化生产。
附图说明
图1显示了使用核磁共振技术分析的水溶液中不同碱的反应收率。
图2显示了使用液相色谱-质谱联用技术分析的多肽固相合成的收率。
图3显示了使用核磁共振技术分析的不同碱存在下的反应效率。
图4显示了使用液相色谱技术分析的不同有机碱存在下固相酰胺化反应效率。
具体实施方式
以下实施例用于进一步详细说明本发明，但本发明绝非仅限于此。
实施例1
1.称取Rink amide MBHA树脂于接肽管中，加入二氯甲烷(DCM)，鼓氮气溶胀10min。加入50％(v/v)吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，鼓氮气30min，脱去Fmoc保护基团，并重复1次。用DMF和DCM交替洗涤树脂之后，将配好的Fmoc-AA-OH(5eq,DMF)溶液，锍盐A(5eq，DMF)溶液，N,N- 二异丙基乙胺(DIPEA)(10eq)混匀后加入树脂中鼓氮气2h。抽掉反应液，用 DMF和DCM交替洗涤树脂。
作为对比，目前常用的多肽固相合成方法在步骤1使用Fmoc-AA-OH(5eq, DMF)溶液，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)， 5eq，DMF)溶液，DIPEA(10eq)混匀后加入树脂中鼓氮气2h。
2.加入50％(v/v)吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，鼓氮气30min，脱去Fmoc保护基团，并重复一次。用DMF和DCM交替洗涤树脂，按上述接氨基酸至多肽合成完毕。
3.将多肽从树脂上切下：取20mg树脂于离心管中，加入0.5ml的TFA/TIPS/H2O/EDT(v:v:v:v＝94:1:2.5:2.5)剪切液震荡反应2h,树脂过滤除去，用氮气把剪切液吹干，然后加入0.5ml冷的乙醚沉淀两分钟；离心弃去上清液，沉淀的多肽于空气中挥发至干。
4.多肽的纯化：将反应完全的反应液离心，过膜，使用高效液相色谱纯化。使用液相色谱-质谱联用技术可以直接分析产物的收率。如附图2所示，显示了两种使用以上方法合成的二肽的收率。
结论：图1显示了使用本方法合成的未经过纯化的粗产品二肽的液谱纯度分析图谱，分别为79％和78％，证明了本方法固相合成多肽的可行性。图2显示了使用本方法和传统HATU法固相合成的未经过纯化的粗产品二肽的谱纯度分析图谱，分别为85％和82％，说明了本方法固相合成多肽的效率与传统方法相当。
上述反应的技术路线如下：
Figure RE-GDA0002675854310000041
具体的，本发明所使用的多肽固相合成树脂为市售的Rink amide MBHA Resin。所使用的原料为Fmoc保护的20中天然氨基酸或其他非天然氨基酸。这些氨基酸原料的C端为羧基或硫代羧基。所使用的氨基酸原料当量为树脂负载量的1.2-5倍摩尔数。所使用的锍盐活化剂包括乙烯基、乙炔基、丙炔基和乙腈基锍盐及其衍生物，锍盐的阴离子包括溴离子、碘离子、三氟甲磺酸根离子和四氟硼酸根离子。所使用的锍盐活化剂当量为树脂负载量的1.2-5倍摩尔数。
表1水溶液中不同锍盐反应效率的筛选
Figure RE-GDA0002675854310000051
表1
Figure RE-GDA0002675854310000052
5.本发明所使用的无机碱包括碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化钾，所使用的有机碱包括二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、 1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和N-甲基吗啡啉。所使用的碱当量为树脂负载量的 1.2-5倍摩尔数。图3显示了使用核磁共振技术分析的不同碱存在下的反应效率。图4显示了使用液相色谱技术分析的不同有机碱存在下固相酰胺化反应效率。
表2水溶液中不同碱反应效率的筛选
Figure RE-GDA0002675854310000053
Figure RE-GDA0002675854310000054
Figure RE-GDA0002675854310000061
表3固相酰胺化不同碱反应效率的筛选
Figure RE-GDA0002675854310000071
Figure RE-GDA0002675854310000072

Claims (6)

1.一种制备多肽的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)以Fmoc保护的天然氨基酸或非天然氨基酸或硫代氨基酸为原料，使用不饱和锍盐作为羧基活化剂，在碱存在下，于水或有机溶剂中，经过不饱和锍盐活化的胺酯交换反应形成肽键；
2)然后使用含有吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基，以游离氨基；
3)重复步骤1)和步骤2)，得到目标多肽产物。
2.根据权利要求1所述的一种制备多肽的方法，其特征在于：所述的用于多肽合成的氨基酸C端为羧基或硫代羧基。
3.根据权利要求1所述的一种制备多肽的方法，其特征在于：所述的不饱和锍盐活化剂选自乙烯基锍盐、乙炔基锍盐、丙炔基锍盐或者乙腈基锍盐及其衍生物中的任意一种，所述的锍盐的阴离子选自溴离子、碘离子、三氟甲磺酸根离子或者四氟硼酸根离子中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种制备多肽的方法，其特征在于：所述的碱选自无机碱或者有机碱，所述的无机碱为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠或者氢氧化钾中的任意一种，所述的有机碱为二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和N-甲基吗啡啉中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的一种制备多肽的方法，其特征在于：所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二氯甲烷、甲醇、乙腈或者二甲基亚砜中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的一种制备多肽的方法，其特征在于：所述的吗啡啉的体积百分比浓度为50％。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114057827A (zh) * 2021-12-02 2022-02-18 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 一种标记蛋白的方法
CN114349822A (zh) * 2021-12-31 2022-04-15 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 一种基于乙烯基锍盐的生物大分子修饰方法
CN114702547A (zh) * 2021-11-17 2022-07-05 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 通过对氨基酸侧链修饰获得的穿膜性多肽

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0331988A1 (en) * 1988-03-08 1989-09-13 Sanshin Kagaku Kogyo Co., Ltd. Sulfonium compounds, as well as process for producing active esters and amides used for the production of amides
JPH03176428A (ja) * 1989-12-01 1991-07-31 Sanshin Chem Ind Co Ltd エステル化剤およびエステル化方法
WO2013148727A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-03 The Regents Of The University Of California Preparation of functionalized polypeptides, peptides, and proteins by alkylation of thioether groups

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0331988A1 (en) * 1988-03-08 1989-09-13 Sanshin Kagaku Kogyo Co., Ltd. Sulfonium compounds, as well as process for producing active esters and amides used for the production of amides
JPH03176428A (ja) * 1989-12-01 1991-07-31 Sanshin Chem Ind Co Ltd エステル化剤およびエステル化方法
WO2013148727A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-03 The Regents Of The University Of California Preparation of functionalized polypeptides, peptides, and proteins by alkylation of thioether groups

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
姚其正主编: "《药物合成反应》", 30 September 2012 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114702547A (zh) * 2021-11-17 2022-07-05 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 通过对氨基酸侧链修饰获得的穿膜性多肽
CN114702547B (zh) * 2021-11-17 2023-11-07 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 通过对氨基酸侧链修饰获得的穿膜性多肽
CN114057827A (zh) * 2021-12-02 2022-02-18 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 一种标记蛋白的方法
CN114057827B (zh) * 2021-12-02 2023-10-13 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 一种标记蛋白的方法
CN114349822A (zh) * 2021-12-31 2022-04-15 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 一种基于乙烯基锍盐的生物大分子修饰方法
CN114349822B (zh) * 2021-12-31 2023-10-20 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 一种基于乙烯基锍盐的生物大分子修饰方法

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