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CN114057827B - 一种标记蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了选择需要标记的蛋白，使用带有羧基或者硫代羧基的功能分子作为底物，使用不饱和锍盐作为羧基活化剂，在碱性缓冲溶液下，标记的蛋白发生固相肽键的生成反应；在缓冲溶液中，经过不饱和锍盐活化的胺酯交换反应和蛋白上的氨基形成特异性修饰反应；通过western blot或质谱手段鉴定特异性修饰情况。本发明使用含有羧基或硫代羧基的功能分子为底物，使用不饱和锍盐作用羧基活化剂，在不同类型的缓冲溶液中，能通过胺酯交换反应标记不同种类的各类蛋白。本发明使用安全低毒的锍盐活化酯作为标记分子，高效高选择性地可对蛋白标记，可用于基于活性的蛋白分析以及药物偶联抗体的中抗体分子的标记。

Description

一种标记蛋白的方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及一种蛋白的标记方法，具体来说是一种通过不饱和锍盐活化羧酸，在不同生理环境的缓冲溶液下，对蛋白进行共价标记的方法。
背景技术
通过位点特异性对天然蛋白质进行共价标记是最常用的方法。相比于基因工程，其拥有实验周期更短，实验中存在不确定性因素少等优点，因而成为了更受科研工作者们青睐的蛋白质标记方法。但由于生命体的环境相对温和，因而并不是所有有机化学反应均适用于蛋白标记。因此需要注意如下几点问题：其一，蛋白质标记的化学反应必须耐受生物环境条件(pH 6-8，≤37℃，水性溶剂)；其二，蛋白质反应过程中底物浓度通常较低(μM及或nM级别)；其三，大多数在有机合成中广泛使用的保护基策略无法使用；其四，在复杂体系下保持对POI(protein of interest,POI)的高选择性。
其中，半胱氨酸是活性最高的氨基酸残基，因此也成为了迄今为止研究最广泛的蛋白质残基标记之一。但由于半胱氨酸在人类约20000种蛋白质中只有约200000个，占残基总数的1.9％，而且其中许多半胱氨酸之间形成了二硫键，这些半胱氨酸的残基便难以通过亲核反应标记。相比而言，赖氨酸残基则有650000个，占残基总数的5.9％。同时，标记半胱氨酸的各类底物包括α-卤代烃、迈克尔受体、二硫化物、异恶唑啉鎓、全氟芳基试剂和炔烃，这些化合物和硫醇之间的反应通常较为剧烈，难以区域选择性标记特定位点。而赖氨酸的平均pKa为10.5(半胱氨酸的平均pKa为8.0)，这便导致了绝大多数的赖氨酸残基在生理条件下是质子化的。因而，蛋白附近微环境的变化为特异性共价标记赖氨酸提供了潜在可能。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提供了一种标记蛋白的方法，所述的这种蛋白标记的方法要解决现有技术中蛋白标记常用的赖氨酸修饰选择性较差、修饰底物可溶性不高等问题。
本发明提供了一种蛋白标记的方法，包括如下步骤：
1)选择需要标记的蛋白，使用带有羧基或者硫代羧基的功能分子作为底物，使用不饱和锍盐作为羧基活化剂，在碱存在下，标记的蛋白发生固相肽键的生成反应；
2)在缓冲溶液中，经过不饱和锍盐活化的胺酯交换反应和蛋白上的氨基形成特异性修饰反应；
3)通过western blot或质谱手段鉴定特异性修饰情况。
进一步的，所述的用于标记的蛋白为经过纯化的蛋白、或者加入了细胞裂解液的蛋白、或者为在细胞培养环境中的蛋白中任意一种。
进一步的，所述的缓冲溶液为二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二氯甲烷、甲醇、乙腈或者二甲基亚砜中的任意一种。
进一步的，所述的缓冲溶液可以为硼酸-氢氧化钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中的任意一种。
进一步的，所述的不饱和锍盐为α,β-或者β,γ-不饱和取代锍盐。
进一步的，所述的带有羧基或者硫代羧基的功能分子为羧酸或者硫代羧酸。
进一步的，所述的不饱和锍盐活化剂选自乙烯基锍盐、乙炔基锍盐、丙炔基锍盐或者乙腈基锍盐及其衍生物中的任意一种，所述的锍盐的阴离子选自溴离子、碘离子、三氟甲磺酸根离子或者四氟硼酸根离子中的任意一种。
进一步的，所述的用于标记的蛋白可为带有赖氨酸残基或N端裸露的任意蛋白。
本发明公开了一种用于生物相容环境下标记蛋白的方法，该方法对分离纯化得到的蛋白中的赖氨酸和复杂细胞环境(裂解液和细胞培养环境)中的赖氨酸实现特异性靶向标记。该方法使用含有羧基或硫代羧基的功能分子为底物，使用α,β-和β,γ-不饱和锍盐作用羧基活化剂，在不同类型的缓冲溶液中，在碱存在下，发生固相肽键的生成反应，通过胺酯交换反应标记不同种类的各类蛋白。本发明使用安全低度的锍盐活化酯作为标记分子，高效高选择性地可对蛋白标记，可用于基于活性的蛋白分析以及药物偶联抗体的中抗体分子的标记。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明适用于多肽固相合成的酰胺化反应技术，通过胺酯交换反应实现肽键的逐个形成，以达到合成多肽的目的。本发明使用安全低毒的锍盐作为活化试剂，适合实验室多肽合成和工业化生产。
附图说明
图1显示了使用锍盐活化酯蛋白质组的标记情况。
图2显示了使用NHS活化酯蛋白质组的标记情况。
图3显示了使用各种活化酯对A549的毒性研究。
图4显示了使用各种活化酯在细胞内的定位情况。
具体实施方式
以下实施例用于进一步详细说明本发明，但本发明绝非仅限于此。
实施例1
1.培养A549细胞系于10cm细胞培养皿中至其生长密度达到80％-90％后弃去培养基，加入2mL PBS洗涤三次后，用细胞刮小心地将细胞从培养皿中刮下，收集于2mL ep管中。使用40％功率超声裂解细胞，每超声1s停1s，超声时长5min。
2.在13000rpm下离心10min，收集上清液后，分别取1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL的1μL BSA与所取上清液1μL置于96孔板中，加入考马斯亮兰150μL，使用多功能酶标仪测定490nm处的吸收值。随后绘制蛋白浓度与吸光值的标准曲线，并换算得出上清液中的蛋白浓度。
3.用pH＝10的硼酸缓冲液将蛋白浓度稀释至2mg/mL，取1mL裂解液并加入终浓度为50μM的S-二甲基-2-炔丙基锍盐以及50μM对炔基丙氧基(硫代)苯甲酸后并反应4小时。反应结束后，使用5mL在-80℃中预冷的冰丙酮于-20℃沉淀2h。随后在4℃离心机中离心10min5000rpm。
4.弃去上清后，用200μL 1.2％SDS重悬沉淀。重悬得到的溶液用双蒸水稀释至总体积为1mL。随后加入预混的55μM生物素叠氮紫外光切探针、100μM叔丁基2,2,2-三氯乙酸亚胺酯、1mM三(2-氯乙基)磷酸酯和1mM硫酸铜反应2h，从而在带有炔基的探针上标记可光切除生物素。反应结束后，使用5mL在-80℃中预冷的冰丙酮于-20℃沉淀2h。随后在4℃离心机中离心10min5000rpm。
5.弃去上清后，用200μL体积百分比浓度为1.2％SDS重悬沉淀。重悬得到的溶液用双蒸水稀释至总体积为1mL。之后加入湿体积50μL的链霉亲和素琼脂糖珠共同孵育3h。孵育完成后，弃去上清后，用500μL含有6M尿素的Tris水溶液(pH＝8.5)重悬链霉亲和素琼脂糖珠。
6.在溶液中先加入10mM三(2-氯乙基)磷酸酯反应30min，使蛋白中的二硫键充分还原；随后加入20mM碘乙酰胺反应20min，使得蛋白中未标记的半胱氨酸烷基化。
7.随后加入2μg溶于1.5mL Tris(pH＝8.5)胰酶酶解17小时，使蛋白被充分切割为肽段。去除上清后，用1mL 70％乙腈重悬琼脂糖珠并在365nm下切去biotin，重复一次。用C18柱脱盐后，旋干液相。溶解剩余肽段并上样分析。
8.在真空中干燥后，将获得的样品加载到带有Easy-nLC 1200色谱泵的ThermoEasy-Spray分析柱(75μm内径×500mm)C18柱上。对于每次分析，我们在10μl 0.1％甲酸中溶解肽段并将8Μl上样到柱子上运行。在155分钟(5-40％乙腈)梯度上分离每次运行中的肽。完：质量分析器在350-1500的m/z范围内，质量分辨率为60000(在m/z＝200时)在数据相关模式下，1.6m/z隔离窗口。使用HCD碰撞模式，选择20个最强的离子以15000的分辨率进行MS/MS分析。在相同的设置参数下，通过Orbitrap Exploris 480分析体外标记的肽。
9.对于蛋白质组分析实验中鉴定的所有赖氨酸，基序(±7个氨基酸)用R包确定，解析所有鉴定的蛋白质的UniProtKB条目。
结论：图1显示了使用本方法标记的A549细胞系在硼酸缓冲液中探测到的可被标记的赖氨酸位点数目和特异性分析，相比于图2所示的传统NHS活化酯，该反应有着更好的选择性和反应特性。
图3显示了使用本方法发展的三种活化酯探针和商用活化酯sulfo-NHS-Ac对细胞内蛋白标记的潜在毒性，发现其在100μM内没有细胞毒性，基本不影响细胞的增殖活力。
图4显示了使用本方法发展的三种活化酯探针在细胞内的定位情况以及它们的穿膜情况。图中显示了PhCOSH-yne-S+、PhCOOH-yne-S+相比于C5-S+均有良好的穿膜性。而在培养基中预先加入sulfo-NHS-Ac后，PhCOSH-Yne-S+、PhCOOH-Yne-S+的荧光信号强度均有所减弱。图中显示了锍盐活性酯主要位于细胞核中，少部分位于细胞质中。

Claims (4)

1.一种蛋白标记的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)选择需要标记的蛋白，所述的用于标记的蛋白为带有赖氨酸残基或N端裸露的任意蛋白；使用对炔基丙氧基(硫代)苯甲酸作为底物，使用S-二甲基-2-炔丙基锍盐作为羧基活化剂，在碱性缓冲液下，标记的蛋白发生酰胺键的缩合反应；
2)在缓冲溶液中，经过不饱和锍盐活化的胺酯交换反应和蛋白上的氨基形成特异性修饰反应；
3)通过western blot或质谱手段鉴定特异性修饰情况。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白标记的方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为水、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二氯甲烷、甲醇、乙腈或者二甲基亚砜中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白标记的方法，其特征在于：所述的碱性缓冲溶液为硼酸-氢氧化钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种蛋白标记的方法，其特征在于：所述的不饱和锍盐活化剂选自乙烯基锍盐、乙炔基锍盐、丙炔基锍盐或者乙腈基锍盐中的任意一种，所述的锍盐的阴离子选自溴离子、碘离子、三氟甲磺酸根离子或者四氟硼酸根离子中的任意一种。
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