CN111480645A - 一种脂肪干细胞的储存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪干细胞的储存方法，步骤如下：自脂肪组织中分离并培养脂肪干细胞；将脂肪干细胞加入装有脂肪干细胞储存液的细胞冻存管中，将管口密封；将密封的细胞冻存管进行冷冻；其中每100mL所述脂肪干细胞储存液由以下成分和含量组成：0.6‑4g羧化多聚‑L‑赖氨酸、1‑10g海藻糖、1‑3mL DMSO、6‑10mL甘油、20‑30mL无血清培养基、0.2‑2mL低分子右旋糖酐、2‑5g葡萄糖、青霉素80‑100U/mL、链霉素75‑100μg/mL，余量为缓冲液。本发明提供的一种脂肪干细胞的储存方法，能够显著提高复苏后的脂肪干细胞的活率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种脂肪干细胞的储存方法。
背景技术
脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，不仅在体内体外具有多向分化潜能，在不同的诱导因子作用下可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可以分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子。
脂肪干细胞是一种存在于脂肪组织中的间充质干细胞，在皮下白色脂肪组织中约占细胞总量的10-20％，与其他来源干细胞相比，ADSCs在分离培养上有很大优势：(1)取材方便：脂肪组织储备丰富，取材痛苦小；目前一次吸脂术可获得200mL脂肪，分离出约1×106干细胞，为骨髓分离量的40倍；(2)分离简单：外周脂肪经机械剪切，胶原酶消化和简单梯度离心就可获得ADSCs；(3)易于培养：ADSCs呈成纤维细胞样生长，具有很强的体外扩增能力，多次传代(10～20代)后，细胞增殖速度无明显减慢，传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代中衰老细胞约占15％。
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，目前的细胞冻存方法，容易对细胞造成氧化损伤，导致复苏后的细胞活率低。因此，提供一种脂肪干细胞的储存方法，保证细胞活率，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种脂肪干细胞的储存方法，使复苏后的脂肪干细胞活率高。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种脂肪干细胞的储存方法，具体步骤如下：
(1)自脂肪组织中分离并培养脂肪干细胞；
(2)将步骤(1)所述脂肪干细胞加入装有脂肪干细胞储存液的细胞冻存管中，将管口密封；
(3)将步骤(2)所述密封的细胞冻存管进行冷冻。
进一步，每100mL所述脂肪干细胞储存液由以下成分和含量组成：
0.6-4g羧化多聚-L-赖氨酸、1-10g海藻糖、1-3mL DMSO、6-10mL甘油、20-30mL无血清培养基、0.2-2mL低分子右旋糖酐、2-5g葡萄糖、青霉素80-100U/mL、链霉素75-100μg/mL，余量为缓冲液。
优选地，每100mL所述脂肪干细胞储存液由以下成分和含量组成：
2g羧化多聚-L-赖氨酸、5g海藻糖、1.5mL DMSO、8mL甘油、25mL无血清培养基、1mL低分子右旋糖酐、3g葡萄糖、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL，余量为缓冲液。
进一步，所述缓冲液为PBS缓冲液或HEPES缓冲液。
进一步，所述细胞冻存管中脂肪干细胞的浓度为0.5x106-2x106个/mL。
优选地，所述细胞冻存管中脂肪干细胞的浓度为1x106个/mL。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种脂肪干细胞的储存方法，其中，羧化多聚-L-赖氨酸(polyamino-acid carboxylated poly-l-lysine)，简称CPLL，是一种两性高分子化合物，通过ε-聚-L-赖氨酸水溶液与琥珀酸酐反应后，胺基基团被转化为羧基集团而合成。羧化多聚-L-赖氨酸具有防冻功能，经过特定配方混合后制成的冷冻液，能够提升细胞解冻后的存活率和增殖率；二甲基亚砜(DMSO)，是良好的细胞冷冻剂，在低温冻存时，可以长期保持细胞的活力与功能；无血清培养基，是重要细胞营养成分，同时对细胞在不同温度环境下提供保护；海藻糖，由两个葡萄糖分子以1，1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用海藻糖对生物体具有的保护作用；右旋糖酐是目前最佳的血浆代用品之一，在冻存时右旋糖酐葡萄糖可作为冻存保护剂来减少冰晶形成，在回输时能改善微循环，预防或消除血管内红细胞聚集和血栓形成等，也有扩充血容量作用。本发明提供的一种脂肪干细胞的储存方法，能够显著提高复苏后的脂肪干细胞的活率。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
羧化多聚-L-赖氨酸、海藻糖、DMSO、甘油、无血清培养基、低分子右旋糖酐、葡萄糖、青霉素和链霉素均为购买获得。
实施例1
一种脂肪干细胞的储存方法，具体步骤如下：
(1)自脂肪组织中分离并培养脂肪干细胞；
(2)将步骤(1)所述脂肪干细胞加入装有脂肪干细胞储存液的细胞冻存管中，将管口密封；脂肪干细胞的浓度为1x106个/mL；
其中，每100mL所述脂肪干细胞储存液由以下成分和含量组成：
2g羧化多聚-L-赖氨酸、5g海藻糖、1.5mL DMSO、8mL甘油、25mL无血清培养基、1mL低分子右旋糖酐、3g葡萄糖、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL，余量为PBS缓冲液；
(3)将步骤(2)所述密封的细胞冻存管进行冷冻。
实施例2
一种脂肪干细胞的储存方法，具体步骤如下：
(1)自脂肪组织中分离并培养脂肪干细胞；
(2)将步骤(1)所述脂肪干细胞加入装有脂肪干细胞储存液的细胞冻存管中，将管口密封；脂肪干细胞的浓度为0.5x106个/mL；
其中，每100mL所述脂肪干细胞储存液由以下成分和含量组成：
0.6g羧化多聚-L-赖氨酸、1g海藻糖、1mL DMSO、6mL甘油、20mL无血清培养基、0.2mL低分子右旋糖酐、2g葡萄糖、青霉素80U/mL、链霉素75μg/mL，余量为PBS缓冲液；
(3)将步骤(2)所述密封的细胞冻存管进行冷冻。
实施例3
一种脂肪干细胞的储存方法，具体步骤如下：
(1)自脂肪组织中分离并培养脂肪干细胞；
(2)将步骤(1)所述脂肪干细胞加入装有脂肪干细胞储存液的细胞冻存管中，将管口密封；脂肪干细胞的浓度为2x106个/mL；
其中，每100mL所述脂肪干细胞储存液由以下成分和含量组成：
4g羧化多聚-L-赖氨酸、10g海藻糖、3mL DMSO、10mL甘油、30mL无血清培养基、2mL低分子右旋糖酐、5g葡萄糖、青霉素90U/mL、链霉素85μg/mL，余量为HEPES缓冲液；
(3)将步骤(2)所述密封的细胞冻存管进行冷冻。
实施例4
冻存后脂肪干细胞的复苏方法包括：将冻存后的装有脂肪干细胞储存液的细胞冻存管置于37℃水浴锅中，慢慢晃动直至冻存液完全融解，得到复苏后的脂肪干细胞。
采用实施例1-3的脂肪干细胞储存液(实验组1-3)和常规储存液(对照组：70％DMEM/1640基础培养基，20％胎牛血清和10％DMSO)对脂肪干细胞进行冻存，细胞按照1x106个/ml密度冻存，冻存3个月后进行复苏；采用台盼蓝和活-死细胞染色试剂盒方法检测细胞活率；对复苏后的TIL细胞进行培养(37℃，5％CO2)，培养5天后通过CFSE流式细胞仪检测法，检测细胞增殖情况；结果如下表所示。
| 细胞活率(％) | 细胞增殖倍数 | |
| 实验组1 | 95.44 | 41 |
| 实验组2 | 92.34 | 36 |
| 实验组3 | 90.09 | 34 |
| 对照组 | 58.47 | 18 |
上述结果表明，本发明的脂肪干细胞储存液能够防止冻存过程中的脂肪干细胞损伤、保持脂肪干细胞复苏后的高活率。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (6)
1.一种脂肪干细胞的储存方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)自脂肪组织中分离并培养脂肪干细胞；
(2)将步骤(1)所述脂肪干细胞加入装有脂肪干细胞储存液的细胞冻存管中，将管口密封；
(3)将步骤(2)所述密封的细胞冻存管进行冷冻。
2.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞的储存方法，其特征在于，每100mL所述脂肪干细胞储存液由以下成分和含量组成：
0.6-4g羧化多聚-L-赖氨酸、1-10g海藻糖、1-3mL DMSO、6-10mL甘油、20-30mL无血清培养基、0.2-2mL低分子右旋糖酐、2-5g葡萄糖、青霉素80-100U/mL、链霉素75-100μg/mL，余量为缓冲液。
3.根据权利要求2所述的一种脂肪干细胞的储存方法，其特征在于，每100mL所述脂肪干细胞储存液由以下成分和含量组成：
2g羧化多聚-L-赖氨酸、5g海藻糖、1.5mL DMSO、8mL甘油、25mL无血清培养基、1mL低分子右旋糖酐、3g葡萄糖、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL，余量为缓冲液。
4.根据权利要求2或3所述的一种脂肪干细胞的储存方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液或HEPES缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞的储存方法，其特征在于，所述细胞冻存管中脂肪干细胞的浓度为0.5x106-2x106个/mL。
6.根据权利要求5所述的一种脂肪干细胞的储存方法，其特征在于，所述细胞冻存管中脂肪干细胞的浓度为1x106个/mL。
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