CN108882699A - 冷冻保存组合物以及其使用方法 - Google Patents

Abstract

冷冻保存组合物包括羧化聚氨基酸，以及至少一种有机两性试剂或多醣。还提供了冷冻保存的方法。

Description

冷冻保存组合物以及其使用方法

技术领域

本揭示內容有关适合生物样本的冷冻保存的组合物，以及特别地，包括羧化聚氨基酸，以及至少一种有机两性试剂或多醣的冷冻保存组合物。使用所述冷冻保存组合物的方法也描述在本文中。

背景技术

冷冻保存是通过冷却至低于零度的温度来保存生物样本如细胞或整个组织的过程。在如此低的温度，任何生物活力，包括通常会导致细胞死亡的生化反应，通常会被有效地阻止。冷冻保存有许多不同的研究和临床应用。举例来说，频繁的研究需要将细胞或组织样本以某种方式存储一段时间，以便保留其恢复生物活力的潜力，例如在细胞培养样本和杂交瘤(hybridoma)的情况下。另外，临床需要频繁保存和储存细胞，同时保留其潜在的生物活力，例如在自体骨髓移植，脐带血储存和人类配子储存的情况下。

然而，传统的冷冻保存技术可能会因冰晶的形成和解冻浓缩溶液的离子强度的增加而受到阻碍，这两者都会对生物样本造成损害。在冷冻保存的情况下维持细胞样本的生物活力的一种技术是使用二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂，其功能是增加在冷却过程和随后的加热过程中皆存活的细胞的数量。DMSO通常以5％至15％v/v(体积/体积)(0.74至2.5摩尔)的终浓度使用。据信DMSO至少部分通过破坏冰晶形成过程起作用，从而减少细胞膜的物理破坏。但是，DMSO是有毒的，也可引起各种副作用。例如，接受过已保存在DMSO中的自体细胞移植的患者可能会出现副作用，包括头痛，恶心和皮疹。(Davis，J M等人，Blood，75(3)，1990，第781-786页)。另外，一些细胞受到与DMSO长时间接触的不利影响。

在冷冻保存的情况下维持细胞样本的生物活力的另一种技术是使用甘油作为冷冻保护剂。甘油通常以5至20％v/v的终浓度使用。尽管甘油对细胞的毒性通常低于DMSO，但甘油会引起渗透问题，特别是解冻后可影响细胞活力。

在冷冻保存情况下保持细胞样本的生物活力的另一种技术是使用聚乙二醇(PEG)。但是，大多数研究表明PEG与DMSO结合时效率最高，因此不能消除与DMSO相关的不良特性。此外，PEG经受超声降解，其副产物对哺乳动物细胞有毒。因此，本领域需要在与冷冻保存相关的冷冻和解冻循环期间保护细胞和组织。

发明内容

本揭示內容提供包括羧化聚氨基酸，以及至少一种有机两性试剂或多醣的冷冻保存组合物。在具体例中，所述羧化聚氨基酸是羧化聚赖氨酸。在具体例中，所述有机两性试剂是选自四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶。在具体例中，所述多醣是葡聚醣。

在具体例中，根据本揭示內容的冷冻保存组合物对慢速冷冻保存有用并且包括自约0.1％至约20％v/v(体积/体积)的羧化聚氨基酸以及自约0.1％至约20％w/v(重量/体积)的有机两性试剂。在具体例中，用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括自约0.1％至约20％v/v的羧化聚氨基以及自约0.1％至约20％w/v的多醣。在具体例中，用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括自约0.1％至约20％v/v的羧化聚氨基酸，自约0.1％至约20％w/v的有机两性试剂，以及自约0.1％至约20％w/v的多醣。在具体例中，本文所述用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括自约1％至约10％v/v的羧化聚氨基酸以及自约1％至约10％w/v的有机两性试剂。在具体例中，所述用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括自约0.1％至约10％v/v的羧化聚氨基以及自约1％至约10％w/v的多醣。在具体例中，所述用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括自约0.1％至约10％v/v的羧化聚氨基酸，自约0.1％至约10％w/v的有机两性试剂，以及自约0.1％至约10％w/v的多醣。在具体例中，所述用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括羧化聚氨基酸与有机两性试剂的比率为约1.1:1至约3:1，在具体例中自约1.3:1至约1.7:1，在具体例中约1.5:1。在具体例中，所述用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括羧化聚氨基酸与有机两性试剂和多醣的比率为约1.1:1:1至约3:1:1，在具体例中自约1.3:1:1至约1.7:1:1，在具体例中约1.5:1:1。

在具体例中，用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括约7.5％或更少v/v的羧化聚氨基酸，自约5％或更少w/v的有机两性试剂，以及约5％或更少w/v的多醣。在具体例中，用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括约7.5％或更少v/v的羧化聚赖氨酸，约5％或更少w/v的四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶，以及约5％或更少w/v的葡聚醣。

也提供将生物样本储存在可保活力的条件下的方法，其包括添加冷冻保存组合物至生物样本，以及在所述生物样本上进行慢速冷冻保存，其中所述冷冻保存组合物包括羧化聚赖氨酸，以及至少一种有机两性试剂或多醣。在具体例中，所述冷冻保存组合物包括自约1％至约10％v/v的羧化聚赖氨酸，其具有大于50％的被封闭的氨基，自约1％至约10％w/v四氢嘧啶，以及自约0％至约10％w/v的葡聚醣。

在具体例中，根据本揭示內容的冷冻保存组合物对快速冷冻保存有用并且包括自约25％至约55％v/v的羧化聚氨基酸，自约25％至约55％w/v的有机两性试剂，以及任选自约25％至约55％w/v的多醣。在具体例中，所述羧化聚氨基酸是羧化聚赖氨酸。在具体例中，所述有机两性试剂是选自四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶。在具体例中，所述用于快速冷冻保存的冷冻保存组合物并不包括多醣。在具体例中，所述用于快速冷冻保存的冷冻保存组合物包括多醣。在具体例中，所述多醣是葡聚醣。

在具体例中，用于快速冷冻保存的冷冻保存组合物包括自约30％至约52.5％v/v的羧化聚氨基酸，自约25％至约35％w/v的有机两性试剂，以及任选的自约25％至约35％w/v的多醣。在具体例中，用于快速冷冻保存的冷冻保存组合物包括羧化聚氨基酸与有机两性试剂的比率为约1.1:1至约3:1，在具体例中自约1.3:1至约1.7:1，在具体例中约1.5:1。在具体例中，用于快速冷冻保存的冷冻保存组合物包括羧化聚氨基酸与有机两性试剂和多醣的比率为约1.1:1:1至约3:1:1，在具体例中自约1.3:1:1至约1.7:1:1，在具体例中约1.5:1:1。

也描述了将生物样本储存在可保活力的条件下的方法，其包括添加冷冻保存组合物至生物样本，以及在所述生物样本上进行快速冷冻保存，其中所述冷冻保存组合物包括羧化聚赖氨酸，以及至少一种有机两性试剂或多醣。在具体例中，所述冷冻保存组合物包括自约25％至约55％v/v的羧化聚赖氨酸，其具有大于50％的被封闭的氨基，自约25％至约35％w/v四氢嘧啶，以及任选自约25％至约35％w/v的葡聚醣。

附图说明

图1为说明本文所述至少一个具体例的冷冻保存组合物中TIG-3-20成纤维细胞的细胞恢复率的条形图。

图2为说明本文所述至少一个具体例的冷冻保存组合物中TIG-3-20成纤维细胞的细胞活力的条形图。

图3为说明本文所述至少一个具体例的冷冻保存组合物中通过树突状细胞的酯化钙黄绿素(Calcein AM)的细胞活力的条形图。

图4为说明本文所述至少一个具体例的冷冻保存组合物中天然杀伤92(NK-92)细胞的细胞恢复率的条形图。

图5a和5b是说明NK-92细胞的细胞活力的条形图。

图6a和6b为说明本文所述冷冻保存组合物中NK-92细胞解冻后的增殖和形态的放大图像。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本揭示內容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。应该进一步理解的是，诸如在常用字典中定义的那些术语应该被解释为具有与其在相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不会被理解为理想化或过度形式化的意义，除非明确如此定义。

本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不意图限制本揭示內容。在提供一定范围的值的情况下，应该理解的是除非上下文另有明确规定，否则每个中间值到下限单位的十分之一，在所述范围的上限和下限之间，以及任何其他规定或中间值所述范围包含在本揭示內容内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包含在本揭示內容内容中，受限于所述范围中的任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除这些包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在本揭示內容内容中。

如本文所使用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”，“一(an)”和“所述(the)”旨在也包括复数形式。此外，就在详细描述和/或权利要求书中使用术语“包括(including)”，“包括(includes)”，“具有(having)”，“具有(has)”，“具有(with)”或其变体的范围而言，这样的术语旨在是包括以类似于术语“包含(comprising)”的方式。

如在本说明书和所附权利要求中所使用的，术语“或”通常以包括“和/或”的意义使用，除非内容另有明确规定。

术语“约”或“近似”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1或多于1个标准偏差内。或者，“约”可意指给定值或范围的高达20％，高达10％，高达5％或高达1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指数值的一个数量级内，优选在5倍内，并且也优选在2倍内。如果在申请和权利要求书中描述了特定的值，除非另有说明，否则应该假定术语“约”在特定值的可接受的误差范围内。

如本文所使用，“生物样本”指的是样本其包括组织、细胞、器官、生物流体、多肽、核酸或其他生物物质。在一些具体例中生物样本可进一步包括防腐剂。在一些具体例中，样本可获得自个体。在一些具体例中样本可以是诊断的样本获得自个体。作为非限制性实例，样本可以是配子、精子、卵、胚胎、合子(zygote)、软骨细胞、红细胞、血液、血液的部分或片断、肝细胞、成纤维细胞、干细胞、脐带血细胞、成体干细胞、诱导性多能干细胞、自体细胞、自体干细胞、骨髓细胞、造血细胞、造血干细胞、体细胞、生殖系细胞、分化细胞、体干细胞、胚胎干细胞、血清、痰、脑脊液、尿液、眼泪、肺泡隔离物、胸膜液、心包液、囊液、肿瘤组织、活组织检查、唾液、抽吸物或其组合。在一些具体例中，可以通过切除，活组织检查或取卵来获得样本。

如本文所使用，短语“低温保护剂”是指在冷冻和解冻期间通过减少细胞和组织的损伤来促进低温保护过程的化学溶液或化学溶液。所述低温保护剂保护细胞和组织免受与在零度以下和/或冷冻下储存相关的损伤，例如由于冰晶形成造成的细胞膜损伤。

“冷冻保存的细胞”或“冷冻保存的组织”是通过冷却至零度以下的温度而保存的细胞或组织。冷冻保存的细胞包括真核细胞和原核细胞。冷冻保存的细胞和组织包括例如动物、昆虫、鸟、鱼、爬行动物和植物细胞或组织。

本揭示內容的组合物因此是低温保护，冷冻保存或两者皆是。

如本文所使用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语还包括它们的后代，它们是任何后代。据了解，由于故意或无意的突变，所有后代可能不完全相同。“细胞”可以是原核生物或真核生物，并包括所有物种，例如，哺乳动物、鱼类、鸟类、爬行动物、昆虫、真菌、细菌等。在表达异源核酸序列的情况下，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，并且其包括任何能够复制载体或表达由载体编码的异源基因的可转化生物体。宿主细胞可以并且已经被用作载体或病毒的接受者。宿主细胞可以是“转染的(transfected)”或“转化的”，其是指将外源核酸如重组蛋白编码序列转移或引入宿主细胞的过程。转化的细胞包括主要受试细胞及其后代。

“羧化聚氨基酸”包括任何聚氨基酸，例如同时具有氨基和羧基重复单元的聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酰胺等，其中聚氨基酸的至少一部分氨基被羧化(或乙酰化)与羧酸酐进行反应。通过氨基羧化至大于50％的程度，并且在具体例中为约50至99％，在具体例中为约52至90％，在其它具体例中为约55至75％，又在其他具体例中约57至67％，又在其他具体例中约为60％。基于聚氨基酸中氨基的摩尔量，大约50％的氨基将通过与52至53摩尔％的无水羧酸反应而被封闭。在正常的反应条件下，当与100摩尔％的无水羧酸反应时，90-95％的氨基会被封闭。

可用于羧化聚氨基酸的合适的羧酸酐包括，但不限于乙酸酐、柠檬酸酐、琥珀酸酐、戊二酸酐、苹果酸酐、富马酸酐和马来酸酐。其中，琥珀酸酐和乙酸酐是特别有用的。

在具体例中，羧化聚氨基酸可以来源于聚赖氨酸。聚赖氨酸意在包括ε-聚-L-赖氨酸或ε-聚-D-赖氨酸或α-聚-L-赖氨酸。聚赖氨酸可以包括约1,000至20,000道尔顿的平均分子量，并且特别是约1,000至20,000道尔顿。

“两性”试剂是一种能够作为酸或碱的试剂，取决于它所涉及的反应。“有机两性试剂”是含有酸性(例如羧基)和碱性(例如氨基)官能团的有机分子。因此，例如，有机两性试剂包括结合到烃骨架的相同或不同碳原子上的氨基(NH₂)和羧基(COOH)。其他官能团包括例如氨基(NH₂)，羧基(COOH)，羰基(CO)，羟基(OH)或巯基(SH)或芳基如苯基。在具体例中，有机两性试剂可以是四氢嘧啶，羟基四氢吡啶，四氢嘧啶衍生物，羟基四氢吡啶衍生物，其类似物，变体或组合。在一些具体例中，有机两性试剂是四氢嘧啶和/或羟基四氢吡啶。

如本文所使用，术语“多醣”是指通过糖苷键连接在一起的单醣或d-糖单元的链。它们的结构从线性到高度分支。一些非限制性实例包括淀粉、糖原、纤维素、几丁质、壳聚醣、木聚醣、阿拉伯木聚醣、甘露聚醣、岩藻依聚醣、半乳甘露聚醣、胼胝质、昆布多醣、金藻海带多醣(chrysolaminarin)、支链淀粉、葡聚醣、糊精、麦芽糖糊精、透明质酸、菊糖、低聚果糖、聚右旋糖、聚蔗糖、普拉兰糖(pullanan)等。在具体例中，冷冻保存组合物可包括至少一种多醣，其选自葡聚醣，聚蔗糖和透明质酸。在特别的具体例中，冷冻保存组合物可包括葡聚醣。在具体例中，冷冻保存组合物可以包括选自葡聚醣，聚蔗糖和透明质酸的至少一种多醣。在特定的具体例中，该冷冻保存组合物可以包括葡聚醣。

葡聚醣是分子量≥1000道尔顿的多醣，其具有α-连接的D-吡喃葡萄糖基重复单元的线性骨架。三类葡聚醣可以通过它们的结构特征来区分：

第1类葡聚醣含有用α(1→2)、α(1→3)和α(1→4)→α(1→3)的D-葡萄糖支链的小侧链修饰的α(1→6)连接的D-吡喃葡萄糖基骨架连锁。根据微生物生产菌株和培养条件，第1类葡聚醣的分子量、空间排列、分支的类型和程度以及分支链的长度不同。异麦芽糖和异麦芽三糖是具有1级葡聚醣骨架结构的寡糖。

第2类葡聚醣(交替聚醣)含有α(1→3)连接的分支与α-(1→3)和α(1→6)连接的D-吡喃葡萄糖基单元交替的骨架结构。

第3类葡聚醣(变形链球菌)具有连续的α(1→3)连接的D-吡喃葡萄糖基单元与α(1→6)连接的分支的主链结构。一维和二维NMR光谱技术已被用于葡聚醣的结构分析。

在具体例中，羧化聚氨基酸和至少一种有机两性试剂或所述多醣可以在诸如盐水和右旋糖之类的生理溶液中以及用于冷冻保存的培养基例如达尔伯克氏(Dulbecco)改良伊格尔(Eagle)培养基(DMEM)中组合。

冷冻保存或低温保护包括在生物活力有效停止的零度以下的温度储存生物样本，包括细胞、组织和器官。这允许以最小的样本降解和/或生物样本的长期储存来储存生物样本。冷冻保存可以以各种不同的方式进行。例如，冷冻保存可以以较慢的速率进行，在本文中称为“慢速冷冻保存”，其中生物样本的温度降至零度以下的温度通常在数分钟、数小时、数天等时进行。作为另一个例子，可以以更快的冷冻保存速度进行冷冻保存，在本文中称为“快速冷冻保存”，其包括例如玻璃化和/或超快速冷冻，其中生物样本的温度降低到零度以下的温度，通常以秒或几分之一秒(例如毫秒)进行，并且温度在显著低于与慢速冷冻保存相关的温度。在具体例中，慢速冷冻保存过程可以在0℃至-100℃的温度范围内发生，而快速冷冻保存过程可以在低于-100℃的温度发生。

本文所述冷冻保存组合物可用于任何类型的冷冻保存方法，其中包括例如慢速慢速冷冻保存或快速冷冻保存，包括其玻璃化、和/或超速冻结。

在具体例中，根据本揭示內容的冷冻保存组合物可为适合使用在慢速冷冻保存中.在这种具体例中，冷冻保存组合物可包括自约0.1％至约20％v/v的羧化聚氨基酸、自约0.1％至约20％w/v的有机两性试剂并且任选地、自约0.1％至约20％w/v的多醣。在一些具体例中，有机两性试剂和多醣在组合物中以同等或相同的量存在，在特别的具体例中，自约3％至约8％w/v。

在一些具体例中，羧化聚氨基酸与有机两性试剂在组合物中存在的比率为自约1.1:1至约3:1，以及特别地自约1.5:1。在一些具体例中，羧化聚氨基酸与有机两性试剂和多醣在组合物中存在的比率为自约1.1:1:1至约3:1:1，以及特别地自约1.5:1:1。

在另外的慢速冷冻保存具体例中，冷冻保存组合物可包括自约0.1％至约20％v/v的羧化聚赖氨酸，自约0.1％至约20％w/v的四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶，以及任选地，自约0.1％至约20％w/v的葡聚醣。

在另外的慢速冷冻保存具体例中，冷冻保存组合物可包括约7.5％或更少v/v的羧化聚氨基酸与自约5％或更少w/v的有机两性试剂和/或约5％或更少w/v的多醣组合。

在另外的慢速冷冻保存具体例中，冷冻保存组合物可包括约7.5％或更少v/v的羧化聚赖氨酸，约5％或更少w/v的四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶，以及约5％或更少w/v的葡聚醣。

在另外的慢速冷冻保存具体例中，冷冻保存组合物可包括自约1％至约10％v/v的羧化聚赖氨酸，自约1％至约10％w/v的四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶，以及任选地，自约1％至约10％w/v的葡聚醣。在这种具体例中，所述四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶和葡聚醣在组合物中以同等或相同的量存在，在特别的具体例中，自约3％至约8％w/v。在一些具体例中，羧化聚赖氨酸与四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶和葡聚醣在组合物中存在的比率为自约1.1:1:1至约3:1:1，以及特别地自约1.5:1:1。

在慢速冷冻保存具体例中，冷冻保存组合物可进一步包括溶剂。任何适合冷冻保存的溶剂都可以加入根据本发明的组合物中。一些非限制性实例包括达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，伊格尔最低限度必需培养基(EMEM)、X-VIVO、水、盐水，右旋糖及其组合。在具体例中，组合物包括DMEM。在其他具体例中，组合物包括EMEM。

在另外的慢速冷冻保存具体例中，冷冻保存组合物可包括额外的低于5％w/v的冷冻保护剂。另外的防冻剂的一些非限制性实例包括海藻糖、甘油、聚乙二醇、二甲基亚砜等。在其他慢速冷冻保存具体例中，冷冻保存组合物可为不含额外的冷冻保护剂，包括，但不限于海藻糖、甘油、聚乙二醇、二甲基亚砜、或这些组合中的任何组合。

在具体例中，冷冻保存生物样本的方法包括获得或收集生物样本，以及将生物样本与适合慢速冷冻保存的冷冻保存组合物接触。在具体例中，冷冻保存组合物包括自约0.1％至约20％v/v的羧化聚氨基酸、自约0.1％至约20％w/v的有机两性试剂以及任选自约0.1％至约20％w/v的多醣。在具体例中，羧化聚氨基酸具有用羧基封闭的大于50％的被封闭的氨基。在具体例中，组合物包括羧化聚赖氨酸、四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶、以及葡聚醣。

在其他具体例中，根据本揭示內容的冷冻保存组合物可为适合使用在快速冷冻保存中，如玻璃化和/或超快速冷冻。在这种具体例中，冷冻保存组合物可包括自约25％至约55％v/v的羧化聚氨基酸、自约25％至约55％w/v的有机两性试剂以及任选自约25％至约55％w/v的多醣。在一些具体例中，有机两性试剂和多醣在组合物中以同等或相同的量存在，在特别的具体例中，自约25％至约35％w/v。在一些具体例中，羧化聚氨基酸与有机两性试剂在组合物中存在的比率为自约1.1:1至约3:1，以及特别地自约1.5:1。在一些具体例中，羧化聚氨基酸与有机两性试剂和多醣在组合物中存在的比率为自约1.1:1:1至约3:1:1，以及特别地自约1.5:1:1。

在额外的快速冷冻保存具体例中，冷冻保存组合物可包括自约25％至约55％v/v的羧化聚赖氨酸、自约25％至约55％w/v的四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶、以及任选地，自约25％至约55％w/v的葡聚醣。在这种具体例中，羧化聚赖氨酸可代表组合物的最大浓度或主要化合物。

在额外的快速冷冻保存具体例中，冷冻保存组合物可包括自约25％至约55％v/v的羧化聚赖氨酸、自约25％至约55％w/v的四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶、以及任选地，自约25％至约55％w/v的葡聚醣。在这种具体例中，所述四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶和葡聚醣在组合物中以同等或相同的量存在，在特别的具体例中，自约25％至约35％w/v。在一些具体例中，羧化聚赖氨酸与四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶和葡聚醣在组合物中存在的比率为自约1.1:1:1至约3:1:1，以及特别地自约1.5:1:1。

在额外的快速冷冻保存具体例中，冷冻保存组合物可进一步包括溶剂。任何适合冷冻保存的溶剂都可以加入根据本揭示內容的组合物中。一些非限制性实例包括尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、伊格尔最低限度必需培养基(EMEM)、X-VIVO、水、盐水、葡萄糖以及其组合。在具体例中，组合物包括DMEM。在具体例中，组合物包括EMEM。

在额外的快速冷冻保存具体例中，冷冻保存组合物可包括额外的低于5％w/v的冷冻保护剂。另外的防冻剂的一些非限制性实例包括海藻糖、甘油、聚乙二醇、二甲基亚砜等。在具体例中，快速冷冻保存组合物可为不含额外的冷冻保护剂，包括，但不限于海藻糖、甘油、聚乙二醇、二甲基亚砜或它们的组合中的任何一种。

在具体例中，冷冻保存生物样本的方法包括获得或收集生物样本，以及将生物样本与适合快速冷冻保存的冷冻保存组合物接触。在具体例中，冷冻保存组合物包括自约25％至约55％v/v的羧化聚氨基酸、自约25％至约55％w/v的有机两性试剂以及任选自约25％至约55％w/v的多醣。在具体例中，羧化聚氨基酸具有大于50％的被封闭的氨基，以及特别地约60％的被封闭的氨基。在具体例中，组合物包括羧化聚赖氨酸、四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶、以及葡聚醣。

在其他具体例中，不管冷冻保存的速度如何，冷冻保存组合物可进一步包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释于药学上可接受的赋形剂中以获得冷冻保护组合物中所需比率的药剂。如本文所使用的药学上可接受的赋形剂，包括适合于所需特定制剂的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体赋形剂、分散或悬浮助剂、表面活力剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington的药学的科学与实践(TheScience and Practice of Pharmacy)，第21版，A.R.Gennaro(Lippincott，Williams&Wilkins，Baltimore，Md.，2006；通过引用方式并入本文)公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂，其中赋形剂可用于制备本发明的冷冻保护剂组合物。除了任何常规赋形剂与物质或其衍生物不相容的情况外，例如通过产生任何不希望的生物效应或以有害的方式与药物组合物的任何其它组分相互作用，其应用被认为是在本揭示內容的范围。

在一些具体例中，药学上可接受的赋形剂为至少95％、96％、97％、98％、99％或100％纯。在一些具体例中，赋形剂被批准用于人类和兽医用途。在一些具体例中，赋形剂被美国食品和药物管理局批准用于人。在一些具体例中，赋形剂是药物级。在一些具体例中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。

在另一个具体例中，组合物包括粘度增强剂。在某些具体例中，粘度增强剂是纤维素或纤维素衍生物。在具体实例中，粘度增强剂是羧甲基纤维素。在具体实例中，粘度增强剂是甲基纤维素。在某些具体例中，粘度增强剂是乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或羟丁基纤维素中的一种或多种。其他示例性粘度增强剂包括合成聚合物(例如丙烯酰胺、丙烯酸酯)。在具体例中，粘度增强剂是蜡或脂肪醇(例如鲸蜡醇)。

在某些具体例中，组合物进一步包括一种或多种治疗剂、激素、生长因子、脂质、细胞因子、寡核苷酸、多核苷酸、蛋白质、多肽、肽、小分子、化学治疗剂等(例如，多酚、脂肪醇)。

在具体例中，本文体现的冷冻保存组合物允许极度冷却和解冻速率，克服高冷冻保护剂(CPA)浓度的毒性，允许使用小体积的生物介质并且优于传统的冷冻保存剂。

将理解，例如，冷冻保存的细胞或组织的解冻率将受到各种因素的影响。例如，冷冻保存的细胞的体积、处理时间、环境温度、孵育室的使用温度、容纳细胞的容器的传热性质、加入到所述冷冻保存的细胞中的冷冻溶液的体积、以及类似因素可能影响解冻率。还可以理解的是，低温保存细胞的特定样本中的细胞可能不会以相同速率或在相同时间段内全部解冻。用于解冻冷冻保存细胞的方法在本领域中是众所周知的(参见例如Freshney R I，动物细胞培养(Culture of Animal Cells)：基本技术手册(A Manual of BasicTechnique)，第4版，2000，Wiley-Liss，Inc.，第19章)。

待解冻的冷冻保存的细胞可以是存在于组合物中，其占体积约0.1ml、0.5ml、1ml、约2ml、约3ml、约4ml、约5ml、约10ml、约20ml、约30ml、约40ml、约50ml、约100ml、约200ml、约300ml、约400ml、约500ml、约1L、或更多。冷冻保存的细胞可以是存在于组合物中，其占体积自约0.1ml、0.5ml、1ml至约10ml、自约10ml至约20ml、自约20ml至约30ml、自约30ml至约40ml、自约40ml至约50ml、自约50ml至约100ml、自约100ml至约200ml、自约200ml至约300ml、自约300ml至约400ml、自约400ml至约500ml、或自约500ml至约1L。包括细胞的组合物可包含组织样本，例如血液样本、脂肪样本。

通常，解冻步骤涉及在低于约0℃(零下温度)的温度从储存获得冷冻保存的细胞并使其解冻至高于0℃的温度。解冻步骤可涉及获得冷冻保存的细胞在约-205℃至约-195℃的温度储存。解冻步骤可涉及获得冷冻保存的细胞在约-80℃至约-60℃范围内的温度储存。解冻步骤可涉及通过将细胞在各自具有较暖温度范围的培养器中转移(以例如控制解冻速率)来逐步加温冷冻保存的细胞。例如，解冻步骤可能首先涉及从第一个零度以下的温度(例如从约-205℃到约-195℃)储存获得冷冻保存的细胞，并且将冷冻保存的细胞转移到第二个(通常是温暖的)但通常在零度以下的储存温度，例如在解冻之前达到约-80℃至约-60℃的温度。任何数量的阶段，例如2、3、4、5、6或更多阶段，都被设想为以这种方式控制解冻速度。解冻步骤还可涉及通过将细胞在温度控制室(例如水浴、加热块、烘箱等)中温育并逐渐升温室(例如以受控速率)逐渐升温冷冻保存的细胞，同时冷冻保存的细胞存在于室中。

解冻步骤可以包括在约15℃至约30℃范围内的温度孵育冷冻保存的细胞。解冻步骤可以包括在约30℃至约45℃范围内的温度孵育冷冻保存的细胞。这种温育可以通过将容纳冷冻保存的细胞的容器在温度控制的培养箱(例如温度控制的水浴器、温度控制的烘箱等)中孵育来进行。其他孵育方法对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

解冻步骤可以在约30秒、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时或更多时间内完成。解冻步骤可在约1分钟至约5分钟的范围内完成。解冻步骤可以在约5分钟至约10分钟的范围内完成。解冻步骤可以在约10分钟至约30分钟的范围内完成。解冻步骤可以在约30分钟至约60分钟的范围内完成。

解冻的步骤可涉及以一定的速度加温冷冻保存的细胞，其每分钟约1℃、每分钟约2℃、每分钟约3℃、每分钟约4℃、每分钟约5℃、每分钟约10℃、每分钟约20℃、每分钟约30℃、每分钟约40℃、每分钟约50℃、每分钟约60℃、每分钟约70℃、每分钟约80℃、每分钟约90℃、每分钟约100℃、每分钟约200℃、或更多。解冻的步骤可涉及以一定的速度加温冷冻保存的细胞，其每分钟约1℃至每分钟约5℃。解冻的步骤可涉及以一定的速度加温冷冻保存的细胞，其自每分钟约5℃至每分钟约25℃。解冻的步骤可涉及以一定的速度加温冷冻保存的细胞，其自每分钟约25℃至每分钟约50℃。解冻的步骤可涉及以一定的速度加温冷冻保存的细胞，其自每分钟约50℃至每分钟约100℃。解冻的步骤可涉及以一定的速度加温冷冻保存的细胞，其自每分钟约100℃至每分钟约200℃。解冻的速度可以是连续的，例如恒定的速率，直到细胞完全解冻。解冻速度也可以是不连续的，例如，在某些温度范围内，相对于在解冻过程中其他温度范围内的所述速率，速率可能更快，例如，在解冻期间，在约-200℃至约0℃的范围内比在约0℃至约45℃的范围内速率可能更快。

虽然不是必需的或必需的，但细胞可以在冷冻保存过程中的任何阶段进行洗涤。在具体例中，细胞在收获后洗涤。在具体例中，细胞在解冻后洗涤。在具体例中，细胞在移植前洗涤。这样的洗涤可以使由细胞收集过程或冷冻保存过程导致的细胞碎片的存在最小化。细胞的洗涤可以使用本领域中任何已知的方法进行。例如，细胞可以用生理盐水或其他合适的洗涤溶液洗涤。在具体例中，洗涤溶液使用量至少等于所述洗涤细胞体积。洗涤可以包括将细胞悬浮在洗涤溶液中，然后离心细胞以收集洗涤的细胞。在其他具体例中，将细胞离心而不添加任何洗涤溶液，并且将细胞沉淀物再悬浮于生理盐水或另一合适溶液中以供进一步使用，例如移植。洗涤步骤可以执行一次或多次。在某些具体例中，洗涤步骤可以重复2、3、4、5、6、7或更多次。通常，洗涤步骤不进行超过两到三次。在具体例中，在某些具体例中，只进行一次洗涤。

当冷冻细胞时，要冷冻保存的细胞的浓度可以根据各种因素而变化，包括例如细胞或组织的类型，下游应用等。某些细胞类型的浓度可以较低，例如，对于卵母细胞，浓度可以低至约1-30个细胞/ml或更低。细胞的浓度可为约10⁰个细胞/ml、约10¹个细胞/ml、约10²个细胞/ml、约10³个细胞/ml、约10⁴个细胞/ml、约10⁵个细胞/ml、约10⁶个细胞/ml、约10⁷个细胞/ml、约10⁸个细胞/ml、约10⁹个细胞/ml、或更多。细胞的浓度范围可以是，例如，自约10⁰个细胞/ml至约10¹⁰个细胞/ml、自约10⁰个细胞/ml至约10¹个细胞/ml、自约10¹个细胞/ml至约10²个细胞/ml、自约10²个细胞/ml至约10³个细胞/ml、自约10³个细胞/ml至约10⁴个细胞/ml、自约10⁴个细胞/ml至约10⁵个细胞/ml、自约10⁵个细胞/ml至约10⁶个细胞/ml、自约10⁶个细胞/ml至约10⁷个细胞/ml、自约10⁷个细胞/ml至约10⁸个细胞/ml、或自约10⁸个细胞/ml至约10⁹个细胞/ml。

本揭示內容的方法和组合物可以用于任何低温保存的细胞，通常是真核细胞。然而，本揭示內容的方法和组合物也可用于与原核细胞一起使用。本揭示內容的方法和组合物也可用于植物细胞、昆虫细胞等。

细胞可以是可单离自任何组织或器官的原代细胞(例如结缔组织，神经，肌肉，脂肪或上皮组织)。细胞可能是间充质细胞、外胚层细胞或内胚层细胞。细胞还可以存在于单离的结缔、神经、肌肉、脂肪或上皮组织中，例如组织外植体，例如通过吸脂获得的脂肪组织。结缔组织可以是例如骨、韧带、血液、软骨、肌腱或脂肪组织。例如，肌肉组织可以是血管平滑肌，心脏平滑肌或骨骼肌。上皮组织可为例如血管、颌下腺导管、附着牙龈、舌背、硬腭、食管、胰腺、肾上腺、脑下垂体、前列腺、肝脏、甲状腺、胃、小肠、大肠、直肠、肛门、胆囊、甲状腺滤泡、室管膜(ependyma)、淋巴管、皮肤、汗腺管、体腔间皮、卵巢、输卵管、子宫、子宫内膜、子宫颈(内子宫颈(endocervix))、子宫颈(宫颈外膜(ectocervix))、阴道、大阴唇、直小管(tubuli recti)、睾丸网(rete testis)、输出小管(ductuli efferentes)、附睾、输精管、射精管、球囊尿道腺体、精囊、口咽、喉、声带、气管、呼吸性细支气管、角膜、鼻、肾近曲小管、肾脏升支细段(ascending thin limb)、肾远曲小管、肾集合管、肾盂、输尿管、膀胱、前列腺尿道、膜尿道、阴茎尿道或外部尿道口。

细胞可以是任何哺乳动物细胞。细胞可以是任何人类细胞。细胞包括:淋巴细胞、B细胞、T细胞、细胞毒性T细胞、天然杀伤T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、超分级嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、网状细胞、血小板、肥大细胞、血小板、巨核细胞、树突细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、副甲状腺主细胞、嗜酸细胞(oxyphil cells)、肾上腺细胞、嗜铬细胞、松果体细胞、松果腺细胞、神经胶质细胞、成胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小神经胶质细胞、巨细胞神经分泌细胞、星状细胞、卜歇(boettcher)细胞；垂体细胞、促性腺激素、促肾上腺皮质激素、甲状腺激素、生长激素细胞(somatotrope)、促乳素细胞(lactotroph)、肺细胞、I型肺细胞、II型肺细胞、克拉拉(Clara)细胞；杯状细胞、肺泡巨噬细胞、心肌细胞、周细胞、胃细胞、胃主细胞、壁细胞、杯状细胞、帕内特(Paneth)细胞、G细胞、K细胞、S细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝细胞(liver cell)、肝细胞(hepatocyte)、库弗氏细胞(Kupffer cell)、骨细胞(bone cell)、成骨细胞、骨细胞(osteocyte)、破骨细胞、成牙本质细胞、成牙骨质细胞、成釉细胞、软骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、皮肤细胞、毛细胞(hair cell)、毛细胞(trichocyte)、角质形成细胞、黑素细胞、痣细胞、肌细胞(muscle cell)、肌细胞(myocyte)、成肌细胞、肌管、脂肪细胞、成纤维细胞、腱细胞、足细胞、近肾小球细胞(juxtaglomerular cell)、肾小球内系膜细胞(intraglomerular mesangial cell)、肾小球外系膜细胞(extraglomerular mesangialcell)、肾细胞、肾细胞、黄斑密度细胞、精子、支持细胞细胞(sertoli cell)、莱迪希氏细胞(eydig cell)、卵母细胞及其混合物。

细胞也可以从患病组织单离，例如癌症。因此，细胞可以是癌细胞。例如，细胞可以是单离的或来自任何以下类型的癌症：乳腺癌；胆道癌；膀胱癌；包括成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤的脑癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；血液肿瘤包括急性淋巴细胞和骨髓性白血病；T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤；毛细胞白血病；慢性骨髓性白血病，多发性骨髓瘤；AIDS相关白血病和成人T细胞白血病/淋巴瘤；包括Bowen病(Bowen's disease)和佩吉特氏病(Paget's disease)的上皮内肿瘤；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金病和淋巴细胞性淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌包括鳞状细胞癌；包括由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞产生的卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌包括黑素瘤、梅克尔细胞(Merkel cell)癌、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌；睾丸癌包括生发肿瘤(germinaltumor)如精原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、基质肿瘤和生殖细胞肿瘤；甲状腺癌包括甲状腺腺癌和髓质癌；和包括腺癌和肾母细胞瘤(Wilms'tumor)在内的肾癌。

细胞可以包括脐带血细胞、干细胞、脐带细胞、羊膜细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、癌干细胞、祖细胞、自体细胞、同系细胞(isograft cell)、同种异体移植(allograft)细胞、异种移植细胞、骨髓细胞或遗传工程细胞。细胞可以是诱导的祖细胞。细胞可以是从已经用干细胞相关基因转染以诱导细胞中的多能性的个体(例如供体个体)单离的细胞。细胞可以是已经从个体单离的细胞，用干细胞相关基因转染以诱导多能性，并沿着预定的细胞谱系分化。细胞可以是包括表达期望产物的载体的细胞。这些或任何其他类型的细胞可以用于移植或施用于需要治疗的个体。

本揭示內容的任何细胞的细胞系也可以与本揭示內容的方法一起使用。

本揭示內容还提供了将细胞移植到个体中的方法。细胞或组织可以是自体的、单倍型匹配的、转化的细胞，表达所需产物或其组合的同种异体、异种的细胞。所述方法通常包括解冻冷冻保存的细胞，所述冷冻保存的细胞已经冷冻在本文中包含的冷冻保护组合物中并且将解冻的细胞移植到个体体内。该方法可涉及从非移植接受者的供体获得细胞，例如用作同种异体移植物，同系移植物或异种移植物。该方法可涉及从作为移植接受者的个体获得用作自体移植物的细胞。该方法可能涉及在移植前体外扩增细胞。细胞可以在位于组织中时冷冻保存。细胞可以从组织中单离，然后冷冻保存。当细胞位于组织中并且在解冻后与组织单离时，细胞可以冷冻保存。

所得到的冷冻细胞组合物可以在植入个体之前进一步处理。例如，在植入个体之前，细胞可以被洗涤、纯化、提取、扩增或以其他方式处理。

冷冻保存的细胞可以解冻并接种在允许细胞附着并促进工程化组织生产的支架材料中。在一个具体例中，支架由合成或天然聚合物形成，但也可使用其他材料如羟基磷灰石，硅酮，和其他无机材料。支架可以是可生物降解的或不可降解的。代表性的合成不可生物降解聚合物包括乙烯乙酸乙烯酯和聚甲基丙烯酸酯。代表性的生物可降解聚合物包括聚羟基酸如聚乳酸和聚乙醇酸、聚酸酐、聚原酸酯及其共聚物。天然聚合物包括胶原蛋白、透明质酸和白蛋白。水凝胶也适用。其他水凝胶材料包括藻酸钙和某些其他聚合物，其可以形成可延展的离子水凝胶并且可以用于包封细胞。

支架可用于产生新的组织，如血管组织、骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱和韧带。通常用支架接种细胞；培养细胞；然后植入脚手架。应用包括修复和/或替换脏器或组织，如血管、软骨、关节内衬、肌腱或韧带、或创建用作“膨胀剂(bulking agent)”的组织，这些组织通常用于阻止开口或管腔，或转移相邻的组织，如同治疗回流。

除脂肪细胞外，已发现脂肪组织是干细胞的来源(Gimble等人，“脂肪衍生干细胞用于再生医学(Adipose-Derived Stem Cells for Regenerative Medicine)”流通研究(Circulation Research)100:1249-1260，2007；在此引入作为参考)。因此，本文体现的组合物可用于稳定和防止冷冻保存后对脂肪组织来源的干细胞或其他细胞的损伤。在某些具体例中，组合物可用于成人干细胞的移植。在某些具体例中，组合物可用于成纤维细胞的移植。

冷冻保存的细胞可用于任何适当的下游应用，例如研究、组织培养、药物发现、生物制剂生产等。细胞可用于显微镜检查，例如联合组合免疫染色、原位杂交等。这些细胞可用于功能研究，如基因减弱(knockdown)或过表达研究。细胞可以用于研究各种分子途径，例如细胞周期、细胞信号传导、基因调控等。细胞可以通过流式细胞术单离。这些细胞可用于创建细胞系。这些细胞可以用于分馏研究，例如纯化来自不同细胞区室的蛋白质或分子。这些细胞可以用于研究不同的疾病途径，例如癌症。细胞可以被移植到动物模型中，例如研究肿瘤生长。这些细胞可以用于基因，例如mRNA或miRNA，分析研究。细胞的核型或基因型可以被评估。这些细胞可以用于单离各种生物分子、例如抗体、蛋白质、RNA、DNA、配体等。

这些细胞可以用于自动显微镜的高含量筛选，例如用于铅的识别和化合物表征。例如，通过对化合物(例如小分子、siRNA、肽等)进行筛选(例如高通量筛选)以获得期望的活力，例如抑制细胞生长、特定生物化学途径的调节、特定基因表达的调节、与靶标的结合等。

这些细胞可以用于在生物制药领域中用于治疗分子例如抗体、酶等的生产和单离。细胞可以被运送到例如干冰上，在存在聚合物的情况下，例如聚醚，而给顾客、合作者等。细胞可以被评估为污染物，例如细菌、支原体、病毒等。本揭示內容的用途并非旨在是限制性的，并且冷冻保存的细胞的各种其他用途也是可预见的，并且对于本领域技术人员而言是显而易见的。

在其他具体例中，冷冻保存组合物可用于器官的低温保存冷冻保存，或用于在适合维持器官活力的温度运输器官的冷冻保存组合物，用于器官移植和器官供体程序使用。对器官的冷冻保存而言，器官可以用可与冷冻保护组合物一起灌注使用，并在保持器官活力的条件下冷冻。解冻用于移植的器官的解冻程序是本领域技术人员已知的。

本揭示內容还提供了提供的试剂盒，其包括一个或多个填充有适于配制本文所述冷冻保存组合物的试剂的容器，所述容器被封装在单个包装中。例如，试剂盒可以包括其中具有羧化聚氨基酸的第一容器、至少一种有机两性试剂的第二容器、以及其具有多醣的第三容器。这些试剂可以以混合的形式或可以预混，或以浓缩形式使用，由此使用者将浓缩形式稀释至预定的规格。在一些具体例中，羧化聚氨基酸是羧化聚赖氨酸。在一些具体例中，有机两性试剂为四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶。在一些具体例中，有机两性试剂包括四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶衍生物、羟基四氢嘧啶衍生物、类似物、变体或其组合。在一些具体例中，所述多醣是葡聚醣。试剂盒还可以含有一种或多种稀释剂、例如药学上可接受的赋形剂、蒸馏水、盐水、生物介质等。

试剂盒也可能含有稀释剂或混合剂的说明。说明书还可以包括关于生物样本与组合物接触以进行冷冻的信息。说明书还可能包括解冻冻存细胞。这样的说明还可以包括与已经冷冻保存和解冻的细胞、组织等的施用有关的信息。

试剂盒还可以包含通常以政府机构规定的形式的通知，该政府机构规定医疗器械和/或药物的制造、使用或销售，其中该通知反映了组合物的机构对人或兽医在组织移植中的施用的批准。

试剂盒可以包括用于制备组合物的装置或容器。该装置可以是例如测量或混合装置。

试剂盒还可以任选地包括用于施用本揭示內容的组合物的装置。示例性装置包括与各种喉镜设计兼容的专用注射器、针头和导管。

实施例1

适合于-80℃的温度慢速冷冻保存处理的冷冻保存组合物包括7.5％v/v羧化聚赖氨酸和5％w/v葡聚醣-40混合在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中。聚赖氨酸的大约六十(60)％的氨基通过与琥珀酸酐反应而被羧化。在水中作为其溶剂的羧化聚赖氨酸以1:3的比率与葡聚醣-40混合在DMEM中。

实施例2

适合于-80℃的温度慢速冷冻保存处理的冷冻保存组合物包括7.5％v/v羧化聚赖氨酸和5％w/v四氢嘧啶混合在DMEM中。大约六十(60)％的聚赖氨酸的氨基通过与琥珀酸酐反应而被羧化。在水中作为其溶剂的羧化聚赖氨酸以1:3的比率与四氢嘧啶混合在DMEM中。

实施例1和2的冷冻保存组合物的效果进行了分析，并与含有EMEM，FBS和10％二甲基亚砜(DMSO)的标准冷冻保存介质进行比较。结果总结在图1至3中。

如图1所示，通过解冻后(左栏)和1次继代(passage)后(右栏)的台盼蓝测定(Trypan Blue assay)分析胎儿肺成纤维细胞TIG-3-20的细胞恢复率。将成纤维细胞置于对照培养基、实施例1的冷冻保存组合物和实施例2的冷冻保存组合物之一中。

如图1所示，羧化多聚赖氨酸与低浓度的四氢嘧啶(5％)联合使用可以有效地冷冻保存各种细胞类型，包括成纤维细胞，并且与含有DMSO的标准冷冻保存介质相比，可提高细胞恢复率率。

如图2所示，也对胎儿肺成纤维细胞TIG-3-20在对照培养基、实施例1的冷冻保存组合物和实施例2的冷冻保存组合物之一中解冻3天后，通过台盼蓝测定对其细胞活力进行分析。

如图2所示，与含有DMSO的标准冷冻保存介质相比，羧化聚赖氨酸与低浓度的四氢嘧啶结合(5％)或羧化聚赖氨酸与低浓度的的葡聚醣(5％)在冷冻保存各种细胞类型包括成纤维细胞方面，和改善细胞的解冻后活力是有效的。

在对照培养基、实施例1的冷冻保存组合物和实施例2的冷冻保存组合物之一中解冻后，通过酯化钙黄绿素测定分析树突状细胞的细胞活力。

实施例3

适合于温度慢速冷冻保存处理的冷冻保存组合物-80℃包括7.5％v/v羧化聚赖氨酸，5％w/v四氢嘧啶，以及5％w/v葡聚醣-40混合在DMEM中。聚赖氨酸的大约六十(60)％的氨基通过与琥珀酸酐反应而被羧化。在水中作为其溶剂的羧化聚赖氨酸以1:3的比率与葡聚醣-40和四氢嘧啶混合在DMEM中。

解冻后的天然杀伤细胞92(NK-92)的细胞恢复率通过台盼蓝测定进行分析。与实施例1和2的冷冻保存组合物和对照组(5％AB血清、10％DMSO在X-VIVO^TM中)相比，NK-92细胞在实施例3的冷冻保存组合物中表现出改善的解冻后恢复率。

如图4所示，与含有DMSO的标准冷冻保存介质、羧化聚赖氨酸仅与低浓度的四氢嘧啶(小于5％)的结合和羧化多聚赖氨酸仅与低浓度葡聚醣(小于5％)的结合相比，羧化聚赖氨酸与低浓度的四氢嘧啶(小于5％)和低浓度的葡聚醣(小于5％)的结合在包括NK细胞在内的各种细胞类型(包括NK细胞)中是有效的并且提高了细胞恢复率率。

实施例4

适合冷冻保存处理的冷冻保存组合物包括7.5％v/v羧化聚赖氨酸，20％w/v四氢嘧啶，以及20％w/v葡聚醣-40混合在DMEM中。在水中作为其溶剂的羧化聚赖氨酸以1:3的比率与葡聚醣-40和四氢嘧啶混合在DMEM中。

如图5A和5B所示，分析NK-92细胞在对照培养基、实施例3的冷冻保护组合物和实施例4的冷冻保护组合物之一中的解冻后的细胞活力。与实施例4的冷冻保存组合物和实施例3的10％DMSO对照组相比，所述在实施例3的冷冻保存组合物的NK-92细胞表现出改善的解冻后恢复率。

为了获得图5A和5B的数据，将NK-92细胞充分增殖以达到汇合(confluence)，然后通过在实施例3的冷冻保护组合物、实施例4的冷冻保存组合物和对照培养基中的相同浓度的NK-92细胞在-80℃下冷冻24小时而缓慢冷冻保存，随后置于液氮(LN2)中至多7天。

如图5A和5B所示，与含有DMSO的标准冷冻保存介质以及与高浓度四氢嘧啶(20％)和高浓度葡聚醣(20％)两者结合的羧化聚赖氨酸相比，与低浓度四氢嘧啶(小于5％)和低浓度葡聚醣(小于5％)结合的羧化多聚赖氨酸在冷冻保存包括NK细胞的各种细胞类型中并且改善细胞活力是有效的。

进一步如图6A和6B所示，在实施例3的冷冻保存组合物中冷冻保存后解冻的NK-92细胞数量更多且形态更健康，相较于实施例4的冷冻保存组合物中缓慢冷冻保存的NK-92细胞，其在解冻后24小时表现出较弱的扩增(expansion)。

可以想象，与非常适合于慢速冷冻保存过程的实施例1至3的冷冻保存组合物相比，实施例4的冷冻保存组合物更适于快速冷冻保存过程，例如玻璃化。

实施例5

适合包括玻璃化和/或超快速冷冻快速冷冻保存的冷冻保存组合物，于温度小于-100℃下包括52.5％v/v羧化聚赖氨酸，35％w/v四氢嘧啶，以及35％w/v葡聚醣-40混合在DMEM中。大约六十(60)％的聚赖氨酸的氨基通过与琥珀酸酐反应而被羧化。通过加入DMEM将羧化聚赖氨酸在作为其溶剂的水中与葡聚醣-40和四氢嘧啶混合至其最终浓度。

实施例6

适合包括玻璃化和/或超快速冷冻的快速冷冻保存的冷冻保存组合物，于温度小于-100℃包括37.5％v/v羧化聚赖氨酸，25％w/v四氢嘧啶，以及25％w/v葡聚醣-40混合在DMEM中。大约六十(60)％的聚赖氨酸的氨基通过与琥珀酸酐反应而被羧化。通过加入DMEM将羧化聚赖氨酸在作为其溶剂的水中与葡聚醣-40和四氢嘧啶混合至其最终浓度。

虽然以上已经描述了本揭示內容的各种实施例，但应该理解的是，它们仅作为示例呈现，而不是限制。在不脱离本揭示內容的精神或范围的情况下，可以根据本揭示內容对所公开的实施例进行各种改变。因此，本揭示內容的广度和范围不应受到任何上述实施例的限制。

Claims (42)

1.一种冷冻保存组合物，其包括羧化聚氨基酸、有机两性试剂、以及任选地多醣。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述羧化聚氨基酸是羧化聚赖氨酸。

3.如权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚赖氨酸上大于50％的氨基被封闭。

4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚赖氨酸上约50％至约65％的氨基被封闭。

5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚氨基酸的存在量为所述冷冻保存组合物的0.1％至约20％v/v。

6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚氨基酸的存在量为所述冷冻保存组合物的1.0％至约10％v/v。

7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述有机两性试剂是选自四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、以及其组合。

8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中有机两性试剂的存在量为所述冷冻保存组合物的约0.1％至约20％w/v。

9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中有机两性试剂的存在量为所述冷冻保存组合物的约1.0％至约10％w/v。

10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述多醣是葡聚醣。

11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述多醣的存在量为所述冷冻保存组合物的约0.1％至约20％w/v。

12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述多醣的存在量为所述冷冻保存组合物的约1.0％至约10％w/v。

13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述多醣和所述有机两性试剂的相同存在量为自约3.0％w/v至约8％w/v。

14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述冷冻保存组合物包含约7.5％或更少v/v的羧化聚氨基酸，自约5％或更少w/v的有机两性试剂，以及约5％或更少w/v的多醣。

15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚氨基酸包含约7.5％或更少v/v的羧化聚赖氨酸，所述有机两性试剂包含约5％或更少w/v的四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶，以及所述多醣包含约5％或更少w/v的葡聚醣。

16.如权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚氨基酸与所述有机两性试剂存在的比率为自约1.1:1至约3:1。

17.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚氨基酸与所述有机两性试剂存在的比率为约1.3:1至约1.7:1。

18.如权利要求2所述的组合物，其中所述有机两性试剂为四氢嘧啶，并且所述多醣是葡聚醣。

19.如权利要求1至18中任一项所述的组合物，其进一步包括选自由DMEM、EMEM、X-VIVO、盐水、水、以及其组合所组成群组的溶剂。

20.一种冷冻保存生物样本的方法，其包含:获得生物样本；以及将所述生物样本与冷冻保存组合物接触，其中所述冷冻保存组合物包含自约1％至约10％v/v的羧化聚氨基酸，自约1％至约10％w/v的有机两性试剂，以及自约0％至约10％w/v的多醣。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述冷冻保存组合物包含自约1％至约10％v/v的具有大于50％被封闭的氨基的羧化聚赖氨酸，自约1％至约10％w/v四氢嘧啶以及自约1％至约10％w/v的葡聚醣。

22.如权利要求20至21中任一项所述的方法，其中所述羧化聚赖氨酸与所述有机两性试剂和所述多醣存在的比率为自约1.1:1:1至约3:1:1。

23.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述羧化聚赖氨酸与所述有机两性试剂和所述多醣存在的比率为自约1.5:1:1。

24.一种将生物样本储存在可保活力的条件下的方法，其包含:添加冷冻保存组合物至至所述生物样本，并且慢速冷冻保存所述生物样本，其中所述冷冻保存组合物包含自约1％至约10％v/v的具有用羧基封闭的大于50％被封闭的氨基的羧化聚赖氨酸，自约1％至约10％w/v四氢嘧啶，以及自约0％至约10％w/v的葡聚醣。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述羧化聚赖氨酸与所述四氢嘧啶和所述葡聚醣存在的比率为自约1.5:1:1。

26.如权利要求24至25中任一项所述的方法，其进一步包括解冻所述生物样本，其中所述生物样本展现大于50％的解冻后活力。

27.一种用于快速冷冻保存的冷冻保存组合物，其包括约20％至约55％v/v羧化聚赖氨酸，约20％至约55％四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶，以及任选地约20％至约55％的多醣。

28.如权利要求27所述的组合物，其中所述羧化聚赖氨酸上大于50％的氨基被封闭。

29.如权利要求27至28中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚赖氨酸上约60％的氨基被封闭。

30.如权利要求27至29中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚赖氨酸的存在量为所述冷冻保存组合物的约22.5％至约52.5％v/v。

31.如权利要求27至30中任一项所述的组合物，其中所述四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶的存在量为所述冷冻保存组合物的约25％至约35％w/v。

32.如权利要求27至31中任一项所述的组合物，其中所述多醣是葡聚醣。

33.如权利要求27至32中任一项所述的组合物，其中所述葡聚醣的存在量为所述冷冻保存组合物的约25％至约35％w/v。

34.如权利要求27至33中任一项所述的组合物，其中所述多醣和所述有机两性试剂的相同存在量为自约25.0％至约35％w/v。

35.如权利要求27至34中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚赖氨酸与所述四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶存在的比率为自约1.1:1至约3:1。

36.如权利要求27至35中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚赖氨酸与所述四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶存在的比率为约1.3:1至约1.7:1。

37.一种冷冻保存生物样本的方法，其包含:获得生物样本；以及将所述生物样本与冷冻保存组合物接触，其中所述冷冻保存组合物包含自约20％至约55％v/v的羧化聚赖氨酸，自约20％至约55％w/v的有机两性试剂，以及任选地自约20％至约55％w/v的多醣。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述冷冻保存组合物包含自约20％至约55％v/v具有大于50％的被封闭的氨基的羧化聚赖氨酸，自约25％至约35％w/v四氢嘧啶以及自约25％至约35％w/v的葡聚醣。

39.如权利要求37至38中任一项所述的方法，其中所述羧化聚赖氨酸与所述四氢嘧啶和所述葡聚醣存在的比率为自约1.1:1:1至约3:1:1。

40.如权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述羧化聚赖氨酸与所述四氢嘧啶和所述葡聚醣存在的比率为自约1.5:1:1。

41.一种将生物样本在可保活力的条件下储存的方法，其包含:添加冷冻保存组合物至至所述生物样本，玻璃化或超速冷冻所述生物样本，其中所述冷冻保存组合物包含自约20％至约55％v/v的具有大于50％的被封闭的氨基的羧化聚赖氨酸，自约20％至约55％w/v四氢嘧啶以及自约20％至约55％w/v的葡聚醣。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述羧化聚赖氨酸与所述四氢嘧啶和所述葡聚醣存在的比率为自约1.5:1:1。