CN107183012A - 人体干细胞的冷冻液及冷冻储存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人体干细胞的冷冻液及冷冻存储方法，其中每1000ml冷冻液包括以下成份和含量：20‑50mg红景天苷；50～100g羟乙基变性淀粉450Kd；10～50g羧化多聚‑L‑赖氨酸；50～100g蔗糖；20～150g海藻糖；5～20g抗冻蛋白；5～20g糖蛋白；20～50ml DMSO；60～100ml甘油；200～300ml胎牛血清；余量为缓冲液。本发明的人体干细胞冷冻液，二甲基亚砜含量低，对冷冻细胞没有毒副作用，能够有效地保持干细胞活力，避免氧化损伤，细胞复苏率高。
Description
技术领域
本发明属于细胞组织工程领域，特别涉及人体干细胞的冷冻液及冷冻储存方法。
背景技术
在过去十年里，多能干细胞成为多个领域的实用工具，用以帮助人们探索发育生物学、研究疾病病理和开发细胞疗法。
无论干细胞的用途是什么，都离不开低温保存。低温保存即冷冻可以保存珍贵的干细胞资源，但冷冻干细胞并不像冷冻已分化细胞那么简单，其需要恰当的冷冻试剂和方案，否则保存的干细胞发生随机分化，就会失去价值。
通常的冷冻方案为，先用蛋白酶来解离细胞，再进行离心，最后用含有冷冻液的培养基重悬，常用的冷冻液，包括二甲基亚砜(DMSO)、蔗糖及甘油等。DMSO和甘油属于渗透性抗冻剂，蔗糖则为非渗透性抗冻剂。DMSO和甘油均可有效地帮助细胞抵御冷冻带来的有害影响，但经含有大剂量DMSO和甘油的冷冻液冷冻的干细胞并不适合人体，它们极易损伤并且DMSO极可能会有毒副作用。此外，使用普通的冷冻液FBS/DMSO/甘油混合物时，细胞复苏之后的活性往往较差，复苏过程中容易导致干细胞氧化损伤与分化潜能降低。
发明内容
本发明的目的是为解决以上问题，本发明提供一种人体干细胞的冷冻液及冷冻存储方法。本发明的技术方案是通过以下实现的。
根据本发明的一个方面，提供人体干细胞的冷冻液，其中，每1000ml冷冻液包括以下成份及含量：20-50mg红景天苷；50～100g羟乙基变性淀粉450Kd；10～50g羧化多聚-L-赖氨酸；50～100g蔗糖；20～150g海藻糖；5～20g抗冻蛋白；5～20g糖蛋白；20～50ml DMSO；60～100ml甘油；200～300ml胎牛血清；余量为缓冲液。
其中，人体干细胞的冷冻液的PH为7.0～7.4。
其中，人体干细胞包括普通体细胞，自体血液细胞，自体脂肪细胞，脐带血来源细胞。
其中，缓冲液包括PBS缓冲液或HEPES缓冲液中的一种或两种。
根据本发明的另一方面，提供用于人体干细胞的冷冻存储方法，具体包括以下步骤：
(1)将人体干细胞放入以上所述的冷冻液中，在-20℃冷冻1～4小时。
(2)将步骤(1)液体继续在-80℃环境下冷冻8～12小时。
(3)将步骤(2)处理后的液体放入液氮中储存。
该人体干细胞的冷冻液中，羧化多聚-L-赖氨酸(polyamino-acid carboxylatedpoly-l-lysine)，简称CPLL，是一种两性高分子化合物，通过ε-聚-L-赖氨酸水溶液与琥珀酸酐反应后，65mol％胺基基团被转化为羧基集团而合成。羧化多聚-L-赖氨酸具有相近似的防冻功能，经过特定配方混合后制成的冷冻液，能够提升细胞解冻后的存活率和增殖率。
二甲基亚砜(DMSO)，是良好的细胞冷冻剂，在低温冻存时，可以长期保持细胞的活力与功能，但在室温下，有较强的细胞毒副作用，对细胞的存活率、生长增殖能力能够产生影响。
红景天苷，提取自高山红景天，分子式为C14H20O7，通过并抑制胱天蛋白酶-3激活，能够减轻细胞活性的损失和H(2)O(2)刺激诱导的细胞凋亡,可以保细胞和组织免受应激。
胎牛血清，是重要细胞营养成分，同时对细胞在不同温度环境下提供保护。
海藻糖，由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用海藻糖对生物体具有的保护作用，这是因为海藻糖在高温、高寒、等环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。
羟乙基变性淀粉450Kd，为平均分子量为450000的羟乙基变性淀粉，附着于细胞外部，对细胞起到良好的保护作用。
蔗糖，作为细胞保存液基本成分，使细胞有平衡稳定的环境。
抗冻蛋白，为一类提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物的总称，现根据发现包括五种，抗冻糖蛋白、抗冻蛋白Ⅰ、抗冻蛋白Ⅱ、抗冻蛋白Ⅲ、抗冻蛋白Ⅳ，此五种抗冻蛋白均适用于本人体干细胞的冷冻液。
糖蛋白，是分支的寡糖链与多肽链共价相连所构成的复合糖，主链较短。是细胞质膜、细胞间质、血浆粘液等的重要组分。
综上，本发明具有以下有益效果：
1.本发明的人体干细胞冷冻液，能够有效地保持干细胞活力，避免氧化损伤，细胞复苏率高。
2.本发明的人体干细胞冷冻液，通过添加定量的羧化多聚-L-赖氨酸和二甲基亚砜，将二甲基亚砜的含量由10％以上降至2～5％，细胞解冻复苏后，不需去除即可直接进行培养。
具体实施方式
下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然说明书中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
冷冻液X1的配制
取25mlDMSO，85ml甘油，225ml胎牛血清，再加入PBS缓冲液配成1000ml的基础冷冻液，然后再加入20mg红景天苷，60g羟乙基变性淀粉450Kd，45g羧化多聚-L-赖氨酸，50g蔗糖，80g海藻糖，7g抗冻糖蛋白，7g糖蛋白，制成1000ml人体干细胞的冷冻液母液，然后分装10份100ml进行冻存。
人体干细胞的冷冻储存法1：
根据待冻存的干细胞的细胞总量，计算出所需冻存液X1的量，将细胞放入适量的冷冻液X1中，在-20℃冷冻1小时，继续在-80℃环境下冷冻12小时，然后转入液氮中长期储存。
实施例2
冷冻液X2的配制
取20mlDMSO，100ml甘油，200ml胎牛血清，再加入HEPES缓冲液配成1000ml的基础冷冻液，然后再加入20mg红景天苷，100g羟乙基变性淀粉450Kd，10g羧化多聚-L-赖氨酸，100g蔗糖，150g海藻糖，5g抗冻蛋白Ⅰ，5g糖蛋白，制成1000ml人体干细胞的冷冻液母液，然后分装10份100ml进行冻存。
人体干细胞的冷冻存储方法2
根据待冻存的干细胞的细胞总量，计算出所需冻存液X2的量，将细胞放入适量的冷冻液X2中，在-20℃冷冻1小时，继续在-80℃环境下冷冻12小时，然后转入液氮中长期储存。
实施例3
冷冻液X3的配制
取50mlDMSO，60ml甘油，300ml胎牛血清，再加入PBS缓冲液配成1000ml的基础冷冻液，然后再加入50mg红景天苷，50g羟乙基变性淀粉450Kd，50g羧化多聚-L-赖氨酸，50g蔗糖，20g海藻糖，20g抗冻蛋白Ⅳ，20g糖蛋白，制成1000ml人体干细胞的冷冻液母液，然后分装10份100ml进行冻存。
人体干细胞的冷冻存储方法3
根据待冻存的干细胞的细胞总量，计算出所需冻存液X3的量，将细胞放入适量的冷冻液X3中，在-20℃冷冻1小时，继续在-80℃环境下冷冻12小时，然后转入液氮中长期储存。
实验例不同冷冻液的细胞复苏率比较
实验设计：通过以常用冻存液(90％胎牛血清+10％DMSO)作为对照，验证本发明的人体干细胞的冷冻液(X1～X3)对于经4次传代培养的脐血间充质干细胞的冷冻保存性能。
实验方法：
(1)取甲、乙两份来源于北京市海淀区妇幼保健院的脐血标本(2份均获得产妇同意)，以等量的PBS缓冲液混匀，缓慢滴入到等量的淋巴细胞分离液；650g离心15min抽取白膜层细胞，以等量的PBS缓冲液洗涤离心，基础培养液重悬；接种至100mm培养皿，置于37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱内培养；第5天首次全量换液，之后每周2次换液，2周后达60％～80％融合时，用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)常规消化传代至第四代。
(2)将传至第四代的细胞培养物取出，拍打混匀成单细胞悬液，并计算细胞总数，根据计算结果，将同一供者的细胞分装成4份，保证每份细胞含量为1×107。
(3)将分装出的细胞悬液依次以800～1000r/min离心5min，去上清液，振开细胞沉淀，向同一供者的4份细胞沉淀中分别加入适量的冷冻液X1～X3或对照冻存液(90％胎牛血清+10％DMSO)，轻轻吹打混匀并标号。
(4)将共8支冻存管在普通冰箱冻室(-20℃)冻存2小时，然后移至超低温冰箱(-80℃)冻存12小时，转入液氮。
(5)冻存细胞在液氮中保存48h后取出，将冻存管在35℃水域中迅速搅动3分钟，至冻存液完全融化，打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中，加入培养液，1500rp离心5min，弃上清(其中含有X1～X3的冻存管也可不经此除杂步骤，直接培养，经证明实验结果并无明显差异)，加DMEM培养基转入培养瓶中置于37℃下培养，48小时后在显微镜下观察并计算复苏率。
实验结果：
| 冻存管标号 | 冻存细胞数量 | 复苏细胞数量 | 细胞复苏率 |
| 甲-X1 | 1×107 | 0.91×107 | 91％ |
| 甲-X2 | 1×107 | 0.90×107 | 90％ |
| 甲-X3 | 1×107 | 0.92×107 | 92％ |
| 甲-对照 | 1×107 | 0.56×107 | 56％ |
| 乙-X1 | 1×107 | 0.91×107 | 91％ |
| 乙-X2 | 1×107 | 0.94×107 | 94％ |
| 乙-X3 | 1×107 | 0.91×107 | 91％ |
| 乙-对照 | 1×107 | 0.59×107 | 59％ |
结果分析：
通过上表可知，经本发明的人体干细胞的冷冻液X1～X3冻存的甲、乙两份脐血间充质干细胞，其复苏率均在90％以上，要远高于普通冻存液的复苏率。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (5)
1.人体干细胞的冷冻液，其特征在于，每1000ml冷冻液包括以下成份及含量：20-50mg红景天苷；50～100g羟乙基变性淀粉450Kd；10～50g羧化多聚-L-赖氨酸；50～100g蔗糖；20～150g海藻糖；5～20g抗冻蛋白；5～20g糖蛋白；20～50ml DMSO；60～100ml甘油；200～300ml胎牛血清；余量为缓冲液。
2.如权利要求1所述的人体干细胞的冷冻液，其特征在于，
所述冷冻液的PH为7.0～7.4。
3.如权利要求1所述的人体干细胞的冷冻液，其特征在于，
人体干细胞包括普通体细胞，自体血液细胞，自体脂肪细胞，脐带血来源细胞。
4.如权利要求1所述的人体干细胞的冷冻液，其特征在于，
所述缓冲液包括PBS缓冲液或HEPES缓冲液中的一种或两种。
5.一种人体干细胞的冷冻储存方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待冻存的干细胞放入如权利要求1～4任一所述的人体干细胞的冷冻液中，在-20℃冷冻1～4小时；
(2)将步骤(1)的液体转入在-80℃环境下冷冻8～12小时；
(3)将步骤(2)处理后的液体放入液氮中储存。
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