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CN110564694B - 分泌il-23抗体的靶向前列腺癌的car-t细胞药物 - Google Patents

分泌il-23抗体的靶向前列腺癌的car-t细胞药物 Download PDF

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CN110564694B CN201910900676.9A CN201910900676A CN110564694B CN 110564694 B CN110564694 B CN 110564694B CN 201910900676 A CN201910900676 A CN 201910900676A CN 110564694 B CN110564694 B CN 110564694B
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Abstract

本发明公开了分泌IL‑23抗体的靶向前列腺癌的CAR‑T细胞药物，涉及免疫细胞学技术领域。本发明公开的靶向前列腺癌的CAR‑T细胞含有核酸分子，该核酸分子具有编码结合前列腺特异性膜抗原的嵌合抗原受体的第一核酸序列和编码可特异性结合IL‑23的抗体或该抗体的功能性片段的第二核酸序列。该CAR‑T细胞或含该细胞的药物不仅可以靶向前列腺癌的前列腺特异性膜抗原，还可分泌特异性结合IL‑23的抗体或抗体的功能性片段，这些分泌的抗体或抗体的功能性片段以旁分泌方式起作用以逆转前列腺癌的去势抵抗性，增强CAR‑T细胞对抗前列腺癌的活性，提高对前列腺癌细胞杀伤能力。

Description

分泌IL-23抗体的靶向前列腺癌的CAR-T细胞药物
技术领域
本发明涉及免疫细胞学技术领域，具体而言，涉及分泌IL-23抗体的靶向前列腺癌的CAR-T细胞药物。
背景技术
前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的肿瘤之一，全球发病率占男性恶性肿瘤第二位，全球死亡率占恶性肿瘤的第五位。是美国发病率最高的癌症，同时也是第二大致死癌症。数据显示，近10年以来，我国前列腺癌呈现高发趋势，大城市更成为“重灾区”，基于日趋老龄化的人口基数、年龄结构等特点，伴随前列腺癌发病率的升高，中国前列腺癌发病率上升幅度令人堪忧。
传统的前列腺癌治疗方法包括根治性前列腺切除、放疗、化疗和雄激素剥夺疗法(androgen deprivation therapy，ADT)，即采用药物或手术降低体内雄激素水平。
其中雄激素剥夺疗法是不同阶段患者前列腺癌最主要的治疗方法，也叫内分泌治疗，因为雄激素能够促进肿瘤生长，而阻断治疗通过降低雄激素水平从而延缓疾病的进展。该疗法虽然具有一定疗效，但除了对心血管、性功能、代谢、心理和骨骼健康等方面有副作用以外，其对大部分患者的病情缓解仅能维持1至4年，然后患者对雄激素剥夺疗法产生抵抗，从而使癌细胞发展成为更具侵袭性的去势抵抗性前列腺癌(castration-resistantprostate cancer，CRPC)，因为CRPC患者的预后很差，所以这些患者的治疗仍然是未满足的医疗需求。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供分泌IL-23抗体的靶向前列腺癌的CAR-T细胞药物。该CAR-T细胞或含该细胞的药物不仅可以靶向前列腺癌的前列腺特异性膜抗原，还可分泌特异性结合IL-23的抗体或抗体的功能性片段，这些分泌的抗体或抗体的功能性片以旁分泌方式起作用以逆转前列腺癌的去势抵抗性增强CAR-T细胞对抗前列腺癌的活性，提高对前列腺癌细胞杀伤能力。
本发明是这样实现的：
髓源性抑制细胞(MDSCs)产生的IL-23是CRPC的驱动因子。具体机制是MDSCs产生的IL-23通过维持AR信号传导来调节前列腺癌对去势的抵抗力，从而可以激活雄激素受体途径，促进雄激素缺乏条件下的细胞存活和增殖。MDSC通过以非细胞自主方式来促进CRPC。因此，阻断IL-23的治疗可以抵抗MDSC介导的对前列腺癌的去势抵抗性。
免疫治疗是前列腺癌的一种新兴疗法，免疫检查点抑制剂中的程序性死亡受体-1(programmed cell death-1，PD-1)/程序性死亡配体-1(programmed cell death-ligand1，PDL1)抑制剂可以通过激活自身的免疫系统，提高机体抗肿瘤免疫力，达到抑制和杀伤肿瘤细胞的目的，为前列腺癌的免疫治疗提供新的方向，但是其单独治疗时，临床试验中的效果并不容乐观，客观缓解(objective response，OR)率低。
过继性T细胞转移(Adoptive T cell transfer，ACT)是目前最有前景的免疫治疗方法，CD-19特异性的CAR-T细胞在治疗复发难治性急性淋巴细胞白血病可出现完全缓解，治疗流程为：首先分离出患者自己的T细胞(或来自同种异体供者的T细胞)，然后予以活化并进行基因修饰以获得嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)，最后回输至患者体内。嵌合抗原受体由细胞外抗原识别结构域(通常是抗体单链可变片段scFv)与细胞内信号传导结构域(T细胞受体的CD3ζ链或同时引入一种或多种共刺激信号如CD28、4-1BB)相连接而成，其细胞外部分可使T细胞具有识别特异性抗原的能力。能够越过MHC限制性，可与其识别的抗原直接结合后便会通过信号传导结构域刺激T细胞增殖，同时激活T细胞的细胞毒作用并促进细胞因子分泌，最终消除带有该抗原的细胞，具有更好的特异性和持续性。
前列腺特异性膜抗原(prostrate specific membrane antigen，PSMA)在前列腺癌中高表达，是免疫治疗实体瘤的理想靶点，利用靶向PSMA的CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗中具有极大的特异性，靶向性和较少的主要组织相容性复合物限制。临床前研究及临床实验中证明了CAR-T细胞的有效性和安全性，但其应用仍有局限，所以还需要进一步的研究和探索。
基于此，第一方面，本发明实施例提供一种分泌IL-23抗体的靶向前列腺癌的CAR-T细胞，上述CAR-T细胞含有核酸分子；上述核酸分子具有编码嵌合抗原受体的第一核酸序列；
上述嵌合抗原受体具有抗原结合结构域，上述抗原结合结构域所结合的抗原为前列腺特异性膜抗原；
上述核酸分子还具有第二核酸序列，上述第二核酸序列编码可特异性结合IL-23的抗体或该抗体的功能性片段；
上述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
本发明提供的CAR-T细胞不仅具有靶向PSMA的功能且其同时具有分泌表达抗IL-23的抗体或该抗体的功能性片段的特点，该抗体或该抗体的功能性片段可特异性结合IL-23，消除IL-23对CRPC的促进作用。并借助该CAR-T细胞的结合前列腺特异性膜抗原的抗原结合结构域，可使抗IL-23的抗体或该抗体的功能性片段在前列腺癌细胞附近分泌，抗IL-23的抗体或该抗体的功能性片段进而以旁分泌方式起作用以逆转由MDSC介导的去势抵抗性，重新激活肿瘤细胞对激素治疗的敏感性，大大地增强CAR-T细胞对抗前列腺肿瘤的活性。此外，可将本发明提供的CAR-T细胞与雄激素剥夺疗法联合，重新激活肿瘤细胞对激素治疗的敏感性，这将极大的增强对去势抵抗性前列腺癌的疗效。本发明的CAR-T细胞为治疗前列腺癌尤其是去势抵抗性的前列腺癌提高了一种新的治疗药物选择和治疗策略，也为以后前列腺癌CAR-T细胞免疫疗法的临床前实验及临床试验提供一定的基础。
在可选的实施方式中，上述功能性片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2和scFv中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述功能性片段为scFv。
在可选的实施方式中，上述功能性片段的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
在可选的实施方式中，上述功能性片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
在可选的实施方式中，上述功能性片段的轻链可变区与重链可变区之间的铰接区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
需要说明的是，本领域技术人员可以根据需要，不需要付出创造性劳动基础上即可选择合适的铰接区例如包括但不限于上述的SEQ ID NO.5所示铰接区，以连接轻链可变区和重链可变区以实现对IL-23的特异性结合，无论选择何种铰接区均属于本发明的保护范围。在可选的实施方式中，上述抗原结合结构域选自Fab、Fab’、F(ab’)2和scFv中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述抗原结合结构域为scFv。
在可选的实施方式中，上述抗原结合结构域的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
在可选的实施方式中，上述抗原结合结构域的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
在可选的实施方式中，上述抗原结合结构域的重链可变区与轻链可变区之间的铰接区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在可选的实施方式中，上述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区。
在可选的实施方式中，上述跨膜结构域选自如下蛋白分子中的至少一种的跨膜结构域：CD5、CD28、CD137、CD3ε、CD154、CD45、CD4、CD9、CD37、CD16、CD33、CD22、CD134和CD8α。
在可选的实施方式中，上述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域。
在可选的实施方式中，上述共刺激信号传导区包含如下共刺激分子中至少一种的细胞内结构域：OX40、CD3γ、CD3δ、CD134、CD5、CD79a、CD137、ICD3ε、CD154、CD22、CD66d、CD2、CD28、CD4、CD5、CD79b、COS、4-1BB和CD3ζ。
在可选的实施方式中，上述共刺激信号传导区包括4－1BB的胞内共刺激元件和CD3ζ的胞内结构域。
第二方面，本发明实施例提供一种核酸分子，其具有编码嵌合抗原受体的第一核酸序列；
上述嵌合抗原受体具有抗原结合结构域，上述抗原结合结构域所结合的抗原为前列腺特异性膜抗原；
上述核酸分子还具有第二核酸序列，上述第二核酸序列编码可特异性结合IL-23的抗体或该抗体的功能性片段。
本发明提供的核酸分子用于制备出上述靶向前列腺癌的CAR-T细胞，将其导入未经修饰的T细胞中，使其在细胞内行使正常的表达功能，进而可制备出如上所述的CAR-T细胞。
在可选的实施方式中，上述功能性片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2和scFv中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述功能性片段为scFv。
在可选的实施方式中，上述功能性片段的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
在可选的实施方式中，上述功能性片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
在可选的实施方式中，上述功能性片段的轻链可变区与重链可变区之间的铰接区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在可选的实施方式中，上述抗原结合结构域选自Fab、Fab’、F(ab’)2和scFv中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述抗原结合结构域为scFv。
在可选的实施方式中，上述抗原结合结构域的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
在可选的实施方式中，上述抗原结合结构域的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
在可选的实施方式中，上述抗原结合结构域的重链可变区与轻链可变区之间的铰接区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在可选的实施方式中，上述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区。
在可选的实施方式中，上述跨膜结构域选自如下蛋白分子中的至少一种的跨膜结构域：CD5、CD28、CD137、CD3ε、CD154、CD45、CD4、CD9、CD37、CD16、CD33、CD22、CD134和CD8α。
在可选的实施方式中，上述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域。
在可选的实施方式中，上述共刺激信号传导区包含如下共刺激分子中至少一种的细胞内结构域：OX40、CD3γ、CD3δ、CD134、CD5、CD79a、CD137、ICD3ε、CD154、CD22、CD66d、CD2、CD28、CD4、CD5、CD79b、4-1BB和CD3ζ。
在可选的实施方式中，上述共刺激信号传导区包含4-1BB和CD3ζ的胞内结构域。
第三方面，本发明实施例提供一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞药物，其含有前述实施方式任一项所述的CAR-T细胞。
在可选的实施方式中，所述CAR-T细胞药物还包括雄激素剥夺疗法所使用的药物。
在可选的实施方式中，上述雄激素剥夺疗法所使用的药物选自阿比特龙和恩杂鲁胺等雄激素剥夺药物。
在可选的实施方式中，上述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中的表达盒的结构示意图。图中：A：CJ-PSMA-CAR结构；B：CJ-PSMA-IL-23ab-CAR结构。
图2为本发明实施例1中的质粒载体结构示意图。
图3为PSMA-CAR和IL-23ab-CAR病毒滴度CAR阳性率。
图4为PSMA-CART和IL-23ab-CART CAR阳性。
图5为WB和QPCR检测IL-23ScFv的表达。
图6为IL-23ab-CART封闭IL-23与其受体IL-23R的结合，图中：A：K562细胞IL-23R的表达；B：IL-23ab-CART上清降低IL-23与IL-23R的结合。
图7为PSMA-IL-23ab-CART杀伤功能验证。
图8为质粒载体pMD2.G的结构示意图。
图9为质粒载体pSPAX2的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
构建含表达嵌合抗原受体和特异性结合IL-23的单链抗体的表达盒的质粒载体，表达盒上的各元件结构和位置关系参考图1，质粒载体骨架参考图2。
具体步骤如下：
由金斯瑞公司合成表达靶向前列腺特异性膜抗原的嵌合抗原受体的第一表达盒，第一表达盒(PSMA-CAR)包括：CD8α信号肽、PSMA单链抗体重链可变区、Linker1、PSMA单链抗体轻链、CD8铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB的胞内共刺激元件和CD3ζ的胞内结构域(图1中A)，将以上序列依次连接，在最前端引入Kozac序列和相应酶切位点。使用XbaI和SalI双酶切将第一表达盒转移至质粒空载体(Carl June(CJ)团队的慢病毒转移载体)，酶连后得到嵌合抗原受体表达载体CJ-PSMA-CAR。以CJ-PSMA-CAR质粒为初始质粒，添加表达抗IL-23的单链抗体的第二表达盒，第一表达盒与第二表达盒之间用P2A连接，第二表达盒(IL-23-ScFv)依次包括：460sp、抗IL-23单链抗体轻链可变区、Linker2、抗IL-23单链抗体重链可变区和HA-tag(图1中B)。得到的质粒命名为IL-23ab-CAR质粒(结构见图2)。
其中，表达靶向前列腺特异性膜抗原的嵌合抗原受体的第一表达盒的各元件序列如下：
CD8α信号肽(CD8αLeader)的碱基序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG。
PSMA单链抗体轻链可变区(PSMA-ScFv VL)的碱基序列如SEQ ID NO.2所示：
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCTCCCAGGATTGTGGCACCGCCGTGGACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCAGACACACCGGCGTGCCTGACAGATTCACCGGCTCCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCGACTACTTCTGCCAGCAGTACAACTCCTACCCTCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA；
PSMA单链抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDCGTAVDWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFCQQYNSYPLTFGGGTKLEIK。
PSMA-ScFv VL与PSMA-ScFv VH的Linker的碱基序列如SEQ ID NO.4所示：
GGCGGAGGCGGATCAGGTGGTGGCGGATCTGGAGGTGGCGGAAGC；
Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：
GGGGSGGGGSGGGGS。
PSMA单链抗体重链可变区(PSMA-ScFv VH)的碱基序列如SEQ ID NO.6所示：
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCCTGCAAGACCTCCGGCTACACCTTCACCGAGTACACCATCCACTGGGTGAAACAGGCCTCCGGCAAGGGCCTGGAATGGATCGGCAACATCAACCCTAACAACGGCGGCACCACCTACAACCAGAAGTTCGAGGACCGGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCTCCCTGCGGTCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCTGGCTGGAACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTCTCGAGC；
PSMA单链抗体重链可变区(PSMA-ScFv VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEYTIHWVKQASGKGLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSS。
CD8铰链区(CD8 hinge)的碱基序列如SEQ ID NO.8所示：
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT。
CD8α跨膜结构域(CD8a-TM)的碱基序列如SEQ ID NO.9所示：
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC。
4-1BB的胞内共刺激元件的碱基序列如SEQ ID NO.10所示：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG。
CD3ζ的胞内结构域的碱基序列如SEQ ID NO.11所示：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC。
P2A的碱基序列如SEQ ID NO.12所示：
GCCACAAACTTCTCTCTGCTAAAGCAAGCAGGTGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT。
460sp的碱基序列如SEQ ID NO.13所示：
ATGGCCTGGATGATGCTTCTCCTCGGACTCCTTGCTTATGGATCAGGAGTCGACTCT。
抗IL-23单链抗体轻链可变区(IL-23ScFv VL)的碱基序列如SEQ ID NO.14所示：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGAGAGCCTGAAGATCTCCTGCAAGGGCTCTGGCTACTCCTTCTCTAACTATTGGATCGGATGGGTGCGGCAGATGCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGCATCATCGACCCCAGCAATTCCTACACCAGATATTCTCCTAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCATCAGCGCCGATAAGTCCATCTCTACAGCCTACCTGCAGTGGAGCTCCCTGAAGGCCTCCGACACAGCCATGTACTATTGTGCCCGGTGGTACTATAAGCCCTTCGACGTGTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTAGC；
抗IL-23单链抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSNYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIDPSNSYTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARWYYKPFDVWGQGTLVTVSS。
IL-23ScFv VL与IL-23ScFv VH之间的Linker的碱基序列如SEQ ID NO.4所示：
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG。
Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
抗IL-23单链抗体重链可变区(IL-23ScFv VH)的碱基序列如SEQ ID NO.16所示：
CAGTCCGTGCTGACCCAGCCACCTAGCGTGTCCGGAGCACCAGGCCAGCGGGTGACCATCTCTTGCACAGGCAGCTCCTCTAACATCGGCAGCGGCTACGACGTGCACTGGTATCAGCAGCTGCCAGGCACAGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGCAATTCCAAGCGGCCTTCTGGCGTGCCAGATAGATTCTCTGGCAGCAAGTCCGGCACCTCTGCCAGCCTGGCCATCACAGGCCTGCAGTCTGAGGACGAGGCCGATTACTATTGTGCAAGCTGGACCGACGGACTGTCCCTGGTGGTGTTTGGAGGAGGCACCAAGCTGACAGTGCTG。
抗IL-23单链抗体重链可变区(IL-23ScFv VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.-17所示：
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQSEDEADYYCASWTDGLSLVVFGGGTKLTVL。
HA-tag的碱基序列如SEQ ID NO.18所示：TACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT。
HA-tag的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示：YPYDVPDYA。
实施例2
(1)构建表达嵌合抗原受体和抗IL-23scFv的病毒
方法如下：利用大肠杆菌扩增上述IL-23ab-CAR质粒以及慢病毒包装辅助质粒psPAX2(见图8)和pMD2.G(见图9)，抽提质粒以后进行琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定质粒的正确性。选择状态良好代数靠前的293T作为慢病毒包装细胞，利用转染试剂PEI将以上所述三种质粒转染293T细胞。转染在总体系为10mL的10cm培养皿中完成，每皿细胞转染混合物应使用无血清DMEM配制为1mL体系，使psPAX2质粒：pMD2.G质粒：IL-23ab-CAR质粒：PEI＝5μg：3μg：5μg：72μl，室温混合转染混合物，静置20min后缓慢加入到已有9mL培养基的细胞密度达到60-70％的293T中，6-8h后更换新鲜培养基(DMEM+10％FBS+1％P/S)。分别在培养48h和72h时收获培养液上清，经超滤和超离浓缩后得到表达嵌合抗原受体和抗IL-23scFv的病毒，所得病毒命名为IL-23ab-CAR病毒。
(2)病毒滴度检测
方法如下：
选择生长良好的293T进行消化，在24孔板中接种500μl密度为4*10^5/mL的细胞，待细胞贴壁后，添加不同梯度体积的浓缩病毒液，培养48h后将细胞消化，使用CAR可以识别结合的生物素化的PSMA蛋白在4度与细胞共孵育50min后清洗，然后用可以和生物素结合的APC-链霉亲和素SA在4度染30min，染色完毕后清洗装管使用流式仪检测CAR阳性率，选择阳性率恰当的病毒体积计算病毒滴度，滴度计算公式：滴度(TU/mL)＝(2*10^5*CAR阳性率)/病毒体积。
以对照质粒PSMA-CAR质粒(相较于IL-23ab-CAR质粒，PSMA-CAR质粒缺乏表达抗IL-23scFv的第二表达盒)转染的病毒作为对照，该对照质粒转染的方法参考步骤(1)，将其替换IL-23ab-CAR质粒即可，所得病毒即为对照病毒，命名为PSMA-CAR病毒。
滴度检测结果如图3所示，滴度检测按照上述滴度检测方法，细胞接板贴壁以后，对照病毒PSMA-CAR与IL-23ab-CAR病毒分别设置1μl和3μl两个体积梯度，为避免非特异性染色带来的假阳性，需设置CTRL进行CAR阳性圈门，落入APC阳性门内即为CAR阳性细胞，所示比例数值即为CAR阳性率。如图3所示，1μl的PSMA-CAR浓缩病毒感染20万293T可达到72.9％阳性率，3μl对应阳性率为92.9％；1μl的IL-23ab-CAR病毒感染20万293T可达到85.1％的阳性率，3μl对应阳性率为92.9％，因为阳性率过高无法反应病毒真实的滴度，所以均选用1μl的体积计算滴度，对照病毒PSMA-CAR的滴度可达1.5*10^8TU/mL，而IL-23ab-CAR病毒滴度为1.7*10^8TU/mL。
实施例3
(1)构建表达嵌合抗原受体和抗IL-23scFv的T细胞
方法如下：
使用淋巴分离液从人体血液当中分离得到PBMC，然后使用CD4、CD8磁珠分选法分离T细胞，经CD3/CD28复合物激活48h后，即可使用包装好的PSMA-CAR和IL-23ab-CAR病毒按照MOI＝10离心感染2h，24h后更换成新鲜的培养基(XVIVO+10％FBS+IL-2)，两种CART细胞分别命名为PSMA-CART细胞和IL-23ab-CART细胞。
感染换液48h后按照滴度检测同类方法检测以上两种CART的CAR表达水平。
结果见图4显示，IL-23ab-CART和PSMA-CART的CAR阳性率分别为83％和96％。
(2)IL-23-scFv的表达检测：
对于IL-23ab-CART，不仅需要检测其CAR的表达，还需验证是否具有表达抗IL-23scFv的能力，所以收集上述两种在相同培养体系条件下的CART细胞48h的上清及细胞，因为IL-23-scFv末端具有HA-tag，所以可以采用WB的方法从蛋白水平检测IL-23-scFv的表达(30kDa，HA-GFP为阳性对照26kDa)，同时将收集得到的细胞抽提RNA后反转，使用QPCR的方法从mRNA水平验证IL-23ab-CART同时分泌抗IL-23scFv的能力。
结果如图5显示，WB和QPCR的检测结果显示，IL-23ab-CART细胞有抗IL-23scFv的分泌表达，而对照PSMA-CART细胞未见抗IL-23scFv的表达，说明本发明实施例成功构建出分泌表达抗IL-23scFv的CAR-T细胞。
实验例1
IL-23ab-CART对IL-23的封闭功能验证
方法：利用K562细胞高表达IL-23受体(IL-23R)的特征，如图6中A所示为确认K562细胞表面IL-23R表达的流式实验，使用末端带有His标签的IL-23蛋白与K562细胞在4℃冰箱共孵育1h，先使IL-23与K562细胞表面的IL-23R结合，再用PBS清洗一遍，然后用可以结合His标签的流式抗体(PE)与染过IL-23的K562细胞在4℃冰箱共孵育30min，再用PBS清洗、过滤、装管上机。通过流式仪检测His阳性率即可反应IL-23R的表达水平。如图6中A结果所示，K562细胞表面IL-23R阳性率为95％。因此可以用于检测IL-23与IL-23R的结合。
基于以上检测K562表面IL-23R的方法，同时因为抗IL-23的scFv是由CART分泌在胞外的，所以使用CART上清验证IL-23ab-CART的封闭功能，相同培养体系条件下，收集IL-23ab-CART和PSMA-CART两种CART感染细胞48h后的上清，使用超滤管浓缩5倍后与IL-23蛋白(100ng/mL)在4℃冰箱共孵育过夜，然后将此共孵育体系直接与K562在4℃冰箱共孵育1h，用染抗His标签的流式抗体，使用流式仪检测使用上清封闭后IL-23R的变化。实验结果如图6中B所示，IL-23ab-CART浓缩上清预先与IL-23过夜孵育使上清中的抗IL-23scFv与IL-23相互结合，封闭了IL-23和IL-23R的结合，从而导致IL-23与IL-23R结合减少，图6中B流式图IL-23ab-CART浓缩上清(右图)相对PSMA-CART(左图)上清IL-23R阳性减少。从而说明了我们所构建的IL-23ab-CART同时具有对IL-23的封闭功能。
实验例2
检测IL-23ab-CART对前列腺癌细胞的杀伤效果
以阳性率调整一致的IL-23ab-CART和PSMA-CART作为效应细胞，PC3-PSMA(人前列腺癌细胞系，利用慢病毒稳定表达PSMA和荧光素酶)作为靶细胞，首先在低吸附孔板中加入等量的靶细胞，按效靶比(效应细胞：靶细胞)5：1、2.5：1、1.25：1、0.63：1加入相应数量的CART效应细胞，同时做不同梯度只有靶细胞的孔(0.5万、1万、1.5万、2万、2.5万、3万、5万)作为标准曲线。由于靶细胞可以表达荧光素酶，经过24h的共孵育(co-cμlture)，加入底物后，吸光值与靶细胞数量成线性关系，可以做出标曲，计算剩余靶细胞数量，从而计算出杀伤效率Lysis(％)＝(起始靶细胞数-剩余靶细胞数)/起始靶细胞数，以杀伤效率Lysis(％)为纵坐标，不同的效靶比(E：T)为横坐标，得到如图7结果，可知普通CTRL-T细胞对靶细胞基本无杀伤功能，PSMA-CART和IL-23ab-CART对人前列腺癌细胞杀伤效果明显，且随着效靶比的增加，杀伤效果也逐步上升，但IL-23ab-CART对人前列腺癌细胞杀伤效果明显好于PSMA-CART，说明同时表达抗IL-23的ScFv的PSMA-CART有利于提高对前列腺癌细胞的杀伤效果。因此，IL-23ab-CART可以用于治疗前列腺癌，也可以与阿比特龙和恩杂鲁胺等雄激素剥夺药物联合使用，提高治疗前列腺癌的效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学，上海邦耀生物科技有限公司
<120> 分泌IL-23抗体的靶向前列腺癌的CAR-T细胞药物
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 2
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gacatcgtga tgacccagtc cccctcctcc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggcctccca ggattgtggc accgccgtgg actggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggccc ctaagctgct gatctactgg gcctccacca gacacaccgg cgtgcctgac 180
agattcaccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct 240
gaggacttcg ccgactactt ctgccagcag tacaactcct accctctgac cttcggcgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Cys Gly Thr Ala
20 25 30
Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggcggaggcg gatcaggtgg tggcggatct ggaggtggcg gaagc 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaagatc 60
tcctgcaaga cctccggcta caccttcacc gagtacacca tccactgggt gaaacaggcc 120
tccggcaagg gcctggaatg gatcggcaac atcaacccta acaacggcgg caccacctac 180
aaccagaagt tcgaggaccg ggccaccctg accgtggaca agtccacctc caccgcctac 240
atggaactgt cctccctgcg gtctgaggac accgccgtgt actactgcgc cgctggctgg 300
aacttcgact actggggcca gggcaccaca gtgacagtct cgagc 345
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Glu Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 9
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 10
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 11
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gccacaaact tctctctgct aaagcaagca ggtgatgttg aagaaaaccc cgggcct 57
<210> 13
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
atggcctgga tgatgcttct cctcggactc cttgcttatg gatcaggagt cgactct 57
<210> 14
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtgaagaagc caggcgagag cctgaagatc 60
tcctgcaagg gctctggcta ctccttctct aactattgga tcggatgggt gcggcagatg 120
ccaggcaagg gactggagtg gatgggcatc atcgacccca gcaattccta caccagatat 180
tctcctagct ttcagggcca ggtgaccatc agcgccgata agtccatctc tacagcctac 240
ctgcagtgga gctccctgaa ggcctccgac acagccatgt actattgtgc ccggtggtac 300
tataagccct tcgacgtgtg gggacagggc accctggtga cagtgtctag c 351
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr
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Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asn Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
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Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Trp Tyr Tyr Lys Pro Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> DNA
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<400> 16
cagtccgtgc tgacccagcc acctagcgtg tccggagcac caggccagcg ggtgaccatc 60
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ctgccaggca cagcccccaa gctgctgatc tacggcaatt ccaagcggcc ttctggcgtg 180
ccagatagat tctctggcag caagtccggc acctctgcca gcctggccat cacaggcctg 240
cagtctgagg acgaggccga ttactattgt gcaagctgga ccgacggact gtccctggtg 300
gtgtttggag gaggcaccaa gctgacagtg ctg 333
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Thr Asp Gly
85 90 95
Leu Ser Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tacccatacg acgtcccaga ctacgct 27
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5

Claims (11)

1.一种靶向前列腺癌的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞含有核酸分子；所述核酸分子具有编码嵌合抗原受体的第一核酸序列；
所述嵌合抗原受体具有抗原结合结构域，所述抗原结合结构域所结合的抗原为前列腺特异性膜抗原；
所述核酸分子还具有第二核酸序列，所述第二核酸序列编码且分泌表达可特异性结合IL-23的scFv功能性片段；所述第二核酸序列依次包括如下元件：460sp、抗IL-23单链抗体轻链可变区、Linker2、抗IL-23单链抗体重链可变区和HA-tag；其中，460sp的碱基序列如SEQ ID NO.13所示，抗IL-23单链抗体轻链可变区的碱基序列如SEQ ID NO.14所示，Linker2的Linker的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，抗IL-23单链抗体重链可变区的碱基序列如SEQ ID NO.16所示，HA-tag的碱基序列如SEQ ID NO.18所示；所述抗原结合结构域为scFv，所述抗原结合结构域的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述抗原结合结构域的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述抗原结合结构域的重链可变区与轻链可变区之间的铰接区氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
2.根据权利要求1所述的靶向前列腺癌的CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区。
3.根据权利要求2所述的靶向前列腺癌的CAR-T细胞，其特征在于，所述跨膜结构域选自如下蛋白分子中的至少一种的跨膜结构域：CD5、CD28、CD137、CD3ε、CD154、CD45、CD4、CD9、CD37、CD16、CD33、CD22、CD134和CD8α；所述共刺激信号传导区包含如下共刺激分子中至少一种的细胞内结构域：OX40、CD3γ、CD3δ、CD134、CD79a、CD137、ICD3ε、CD154、CD22、CD66d、CD2、CD28、CD4、CD5、CD79b、COS、4－1BB和CD3ζ。
4.根据权利要求3所述的靶向前列腺癌的CAR-T细胞，其特征在于，所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域。
5.根据权利要求3所述的靶向前列腺癌的CAR-T细胞，其特征在于，所述共刺激信号传导区包括4－1BB的胞内共刺激元件和CD3ζ的胞内结构域。
6.一种核酸分子，其特征在于，其具有编码嵌合抗原受体的第一核酸序列；
所述嵌合抗原受体具有抗原结合结构域，所述抗原结合结构域所结合的抗原为前列腺特异性膜抗原；
所述核酸分子还具有第二核酸序列，所述第二核酸序列编码可特异性结合IL-23的scFv功能性片段；所述第二核酸序列依次包括如下元件：460sp、抗IL-23单链抗体轻链可变区、Linker2、抗IL-23单链抗体重链可变区和HA-tag；其中，460sp的碱基序列如SEQ IDNO.13所示，抗IL-23单链抗体轻链可变区的碱基序列如SEQ ID NO.14所示，Linker2的Linker的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，抗IL-23单链抗体重链可变区的碱基序列如SEQ IDNO.16所示，HA-tag的碱基序列如SEQ ID NO.18所示；所述抗原结合结构域为scFv；所述抗原结合结构域的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述抗原结合结构域的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述抗原结合结构域的重链可变区与轻链可变区之间的铰接区氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述跨膜结构域选自如下蛋白分子中的至少一种的跨膜结构域：CD5、CD28、CD137、CD3ε、CD154、CD45、CD4、CD9、CD37、CD16、CD33、CD22、CD134和CD8α；所述共刺激信号传导区包含如下共刺激分子中至少一种的细胞内结构域：OX40、CD3γ、CD3δ、CD134、CD79a、CD137、ICD3ε、CD154、CD22、CD66d、CD2、CD28、CD4、CD5、CD79b、4-1BB和CD3ζ。
9.根据权利要求8所述的核酸分子，其特征在于，所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域。
10.根据权利要求8所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激信号传导区包含4-1BB和CD3ζ的胞内结构域。
11.一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞药物，其特征在于，其含有权利要求1-5任一项所述的CAR-T细胞。
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