CN107982538B

CN107982538B - 一种药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN107982538B
Application number: CN201711432469.2A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Shenzhen In Vivo Biomedicine Technology Ltd
Current assignee: Shenzhen In Vivo Biomedicine Technology Ltd
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: CN107982538A

Abstract

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种药物组合物及其应用，所述药物组合物包括特异性靶向肾肿瘤GPC3的药物，所述特异性靶向肾肿瘤GPC3的药物包括CAR‑T细胞、抗GPC3抗体、靶向GPC3的TCR‑T细胞、靶向GPC3的DC‑CIK或靶向沉默GPC3的siRNA中的任意一种或至少两种的组合。本发明发现了GPC3可以作为肾母细胞瘤的新的靶向抗原，通过制备药物组合物，可以有效杀伤和抑制肾母细胞瘤。

Description

一种药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种药物组合物及其应用。

背景技术

肾母细胞瘤是最常见的儿童原发性泌尿系统恶性肿瘤，具有早期诊断难、预后欠佳、易复发等特点，占15岁以下儿童恶性肿瘤的6％～7％，其中约75％发病于5岁以下儿童，伴先天畸形患者发病年龄常在1岁以前，平均发病年龄约为3.5岁，发病率为万分之一，且肾母细胞瘤在成人少见。

近年来，随着基于手术、化疗及放疗三者相互结合的综合治疗方案的开展，生存率有明显提髙，治疗后5年生存率达到了87％，但是一定数量的病例因肿瘤细胞间变、较晚的临床分期W及肿瘤破溃，表现出较高的复发率和远处病灶转移率，导致了较差的预后，且肾母细胞瘤个体特异的长期治疗方案也带来了较高的预后风险。研究表明肾母细胞瘤复发率接近15％，复发患者的长期生存率仅50％。而肾母细胞瘤的间变型及化疗药物不敏感性均与预后不良相关，并且随着患者生存期的延长，也有继发二次肿瘤的风险。现有研究报道，肾母细胞瘤经过化疗和放疗等治疗后，继发Cusing综合征、男性肾母细胞瘤的长期生存者日常体力活动减少、非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤细胞白血病、中枢神经系统白血病等(“肾母细胞瘤发病机制的研究进展”，曾蕊，常会波，吴建新，《中国肿瘤》，2017)，表明现有的治疗方法对患者身体损耗较大，预后差，治疗后生活质量下降，亟须疗效更好的、低副作用的新治疗方法。

随着肿瘤靶向免疫治疗如单克隆抗体、CAR T细胞、TCR T细胞等的研究进展，肿瘤表面标志物的发现将为肿瘤治疗提供了新途径。而肿瘤靶向免疫治疗相对于现有肿瘤化疗、放疗和手术治疗具有靶向特异性、疗效更显著、低副作用、良好预后以及愈后高生活质量等优势。

另外，由于缺乏有效的肿瘤标志物可能导致低危险度病例过度治疗以及高危险度病例治疗不足带来的严重并发症和不良后果。CN 102633864 A公开了一种GPC3抗原多肽，抗GPC3的多克隆抗体及其应用，通过制备抗GPC3的多克隆抗体，表明该多克隆抗体可特异性识别GPC3蛋白，用于检测肝癌细胞表达的GPC3蛋白，为肝癌诊断提供帮助。CN 104140974A公开了编码表达于人T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸，所述嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别GPC3的C末端表位的单链抗体scFv(GPC3)，所述，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中表达。可见，现有技术中，GPC3主要用于肝癌的检测，并不能检测肾母细胞瘤。

因此，发现新的肾母细胞瘤标志物和生物学指标是细化治疗方案、减少不良反应的重要步骤，也是改善患儿生存率和生活质量的关键。

发明内容

针对目前的问题，本发明提供一种药物组合物及其应用，通过qrt-PCR、Eliza、免疫组化、流式细胞技术等方法检测肾母细胞瘤患者血清和/或CTC细胞和/或肾脏(肿瘤)组织样本中GPC3转录表达、蛋白表达，进行肾母细胞瘤(早期)诊断和预后评估。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括特异性靶向肾肿瘤GPC3的药物。

本发明中，GPC3为发明人发现的肾母细胞瘤的新抗原，发明人发现靶向GPC3抗原的CAR T细胞、抗体等可有效杀伤和抑制肾母细胞瘤细胞，具有靶向特异性、疗效更显著、低副作用、良好预后以及愈后高生活质量等优势。

根据本发明，所述特异性靶向肾肿瘤GPC3的药物包括CAR-T细胞、抗GPC3抗体、靶向GPC3的TCR-T细胞、靶向GPC3的DC-CIK或靶向沉默GPC3的siRNA中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，发明人基于所述肾母细胞瘤的新抗原GPC3构建了CAR T细胞、抗GPC3抗体、靶向GPC3的TCR-T细胞、靶向GPC3的DC-CIK或靶向沉默GPC3的siRNA，都可以杀伤和抑制肾母细胞瘤。

本发明中，所述药物还可以与其他治疗技术联用，包括化疗、放疗、手术切除或抗体治疗等。

根据本发明，所述靶向GPC3的CAR-T细胞为将靶向GPC3的重组病毒转染到T细胞中表达。

根据本发明，所述靶向GPC3的重组病毒为将靶向GPC3的嵌合抗原受体转染到免疫效应细胞中。

根据本发明，所述免疫效应细胞为T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、树突状细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，所述靶向GPC3的嵌合抗原受体包括信号肽、抗GPC3抗体胞外段、跨膜区、胞内共刺激信号传导域和CD3ζ信号传导域。

根据本发明，所述信号肽为人IgM信号肽和/或人CD8α信号肽，优选为人IgM信号肽。

根据本发明，所述的跨膜区为人CD28跨膜区、人CD8跨膜区、人4-1BB跨膜区或胞内共刺激信号分子的跨膜区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人CD28跨膜区和/或人4-1BB跨膜区。

根据本发明，所述胞内共刺激信号传导域还包括CD28、4-1BB、CD27、CD28、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM、SLAMF7、NKp80、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1、SLAMF4、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、Ly9、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、SELPLG、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D或CD83中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD27、OX40、CD40或ICOS中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，所述嵌合抗原受体只要能够靶向GPC3的嵌合抗原受体都是可行的，其可以通过靶向肾母细胞瘤上的GPC3从而实现靶向肾母细胞瘤。

根据本发明，所述靶向GPC3的嵌合抗原受体为IgM-GPC3-CD28-OX40-CD3ξ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAAAACVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR.

根据本发明，所述靶向GPC3的嵌合抗原受体为IgM-GPC3-CD28-ICOS-CD3ξ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列如下：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAAAAKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLKFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR.

根据本发明，所述靶向GPC3的嵌合抗原受体为IgM-GPC3-CD28-CD40-CD3ξ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列如下：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAAAAVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR.

根据本发明，所述靶向GPC3的嵌合抗原受体为IgM-GPC3-41BB-CD27-CD3ξ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列如下：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAAAAARPHPWWLCVLGTLVGLSATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR.

根据本发明，所述抗GPC3抗体为是具有抗体依赖性细胞损伤活性和/或补体依赖性细胞损伤活性的抗体。

根据本发明，所述抗GPC3抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SEQID NO.5所示的氨基酸序列如下：

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSA.

根据本发明，所述抗GPC3抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述SEQID NO.6所示的氨基酸序列如下：

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIK.

根据本发明，所述靶向沉默GPC3的siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-16所示，所述SEQ ID NO.7-16的siRNA的核苷酸序列如下：

序列编码	开始位点	siRNA序列(DNA)	区域	GC％
					SEQ ID NO.7	809	CCTGAAAGTATTTGGGAAT	ORF	36.85
SEQ ID NO.8	890	GGCTCTGAATCTTGGAATT	ORF	42.11
					SEQ ID NO.9	995	GGGACTGATGATGGTTAAA	ORF	42.11
SEQ ID NO.10	1178	CCATGATTCTATCCAGTAT	ORF	36.85
					SEQ ID NO.11	1190	CCAGTATGTCCAGAAGAAT	ORF	42.11
SEQ ID NO.12	1316	CCATTCTCAACAACGCCAA	ORF	47.37
					SEQ ID NO.13	1330	GCCAATATAGATCTGCTTA	ORF	36.85
SEQ ID NO.14	1424	CCGAAGAAGGGAACTAATT	ORF	42.11
					SEQ ID NO.15	1634	GCCAGTGGTCAGTCAAATT	ORF	47.37
SEQ ID NO.16	1832	CCTTGCAGAACTGGCCTAT	ORF	52.64

根据本发明，所述药物组合物与手术、化学药物治疗或放射治疗中的任意一种或至少两种的组合联合使用。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的药物组合物用于制备治疗肾肿瘤细胞药物中的应用。

根据本发明，所述肾肿瘤细胞为肾鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma)、肾素瘤(Juxtaglomerular cell tumor,reninoma)、肾血管肌脂瘤(Angiomyolipoma)、贝里尼导管癌(Bellini duct carcinoma)、肾透明细胞肉瘤(Clear-cell sarcoma of thekidney)、中胚叶肾瘤(Mesoblastic nephroma)、肾母细胞瘤(Wilms'tumor,Nephroblastoma)、混合上皮间质瘤(Mixed epithelial stromal tumor)中的任意一种或至少两种的组合，优选为肾母细胞瘤。

根据本发明，所述肾母细胞瘤为成人肾母细胞瘤和/或儿童肾母细胞瘤。

第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含特异性检测GPC3基因转录或/和蛋白表达水平的检测物。

优选地，所述试剂盒包括qRT-PCR引物和/或RT-PCR引物。

根据本发明，所述qRT-PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17-22所示或与其具有80％同一性，优选为90％同一性的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.17-22所示的核苷酸序列如下：

序列编码	序列(DNA)
		SEQ ID NO.17(上游引物)	CCTTTGAAATTGTTGTTCGCCA
SEQ ID NO.18(下游引物)	CCTGGGTTCATTAGCTGGGTA
		SEQ ID NO.19上游引物)	CAGTAAGGACTGTGGCCGAAT
SEQ ID NO.20(下游引物)	AGCAGTACGTTCTCCATGTCAT
		SEQ ID NO.21上游引物)	ATTGGCAAGTTATGTGCCCAT
SEQ ID NO.22(下游引物)	TTCGGCTGGATAAGGTTTCTTC

根据本发明，所述RT-PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.23-24所示或与其具有80％同一性，优选为90％同一性的核苷酸序列。

序列编码	序列(DNA)
		SEQ ID NO.23(上游引物)	GGTGGTGGCGATGCTGCTCAGCTTGGAC
SEQ ID NO.24(下游引物)	AGCTGGGTATAGATGACTGGAAACAG

第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的试剂盒用于制备检测和/或治疗肾肿瘤细胞药物和/或试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明发现了GPC3可以作为肾母细胞瘤的新的靶向抗原，通过制备药物组合物，可以有效杀伤和抑制肾母细胞瘤；

(2)本发明中，所述药物组合物可以是通过慢病毒、qRT-PCR、Eliza、免疫组化、流式细胞技术等方法构建的药物或试剂，其均是针对肾母细胞瘤的GPC3的新靶点，能够检测GPC3的转录表达，蛋白表达，能够对肾母细胞瘤进行早期诊断和预后评估；

(3)本发明作为一个肾母细胞瘤的新发现，为肾母细胞瘤的诊断和治疗提供了新的思路。

附图说明

图1为本发明GPC3-CAR慢病毒感染T细胞效率图；

图2为本发明通过体外肿瘤细胞杀伤实验检测GPC3-CAR T细胞对肾母细胞瘤细胞的体外免疫杀伤效应；

图3为通过Eliza实验检测CAR T细胞的IL-2免疫细胞因子的分泌情况，其中，Mock-CAR T为空白对照组，GPC3-CAR T为实验组；

图4为通过Eliza实验检测CAR T细胞的IFN-γ免疫细胞因子的分泌情况，其中，Mock-CAR T为空白对照组，GPC3-CAR T为实验组；

图5为CAR GPC3T细胞在体内有效杀伤和抑制肾母细胞瘤结果图，其中，Mock-CART为空白对照组，GPC3-CAR T为实验组；

图6为本发明GPC3抗体抑制肾母细胞瘤的结果图，其中，V22为圆黑点表示，V209为方黑框标书，V1608为正三角，WT为空白对照倒三角；

图7为通过RT-PCR检测并对比肾母细胞瘤组织与正常肾脏组织样本中的GPC3的表达的电泳图，其中，marker为100-500bp，1-肾母细胞瘤组织1，2-肾母细胞瘤组织2，3-肾母细胞瘤组织3，4-肾母细胞瘤组织4，5-肾母细胞瘤组织5，6-正常肾脏。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料

T4DNA连接酶 Invitrogent公司。

实施例1：GPC3-CAR慢病毒载体的构建

(1)通过全基因合成GPC3-CD28-OX40(简称：G28Oζ，即串联的人IgM信号肽、抗GPC3抗体胞外段、人CD28跨膜区、人OX40胞内区和人CD3ζ信号传导域)，GPC3-CD28-ICOS(简称：G28Iζ，即串联的人IgM信号肽、抗GPC3抗体胞外段、人CD28跨膜区、人ICOS胞内区和人CD3ζ信号传导域)，GPC3-CD28-CD40(简称：G2840ζ，即串联的人IgM信号肽、抗GPC3抗体胞外段、人CD28跨膜区、人CD40胞内区和人CD3ζ信号传导域)，GPC3-41BB-CD27(简称：GBB27ζ，即串联的人IgM信号肽、抗GPC3抗体胞外段、人41BB跨膜区、人CD27胞内区和人CD3ζ信号传导域)，再全基因合成CAR-CD19-CD28-CD3ξ(Mock)核酸序列作为阴性对照，合成的基因C端含限制性内切酶Pme1酶切位点及其保护碱基和N端含限制性内切酶Spe1酶切位点及其保护碱基；

(2)分别通过限制性内切酶Pme1和Spe1双酶切，凝胶电泳回收获得含粘性末端的合成DNA片段G28Oζ、G28Iζ、G2840ζ、GBB27ζ和Mock，以及含粘性末端的pWPXLd-eGFP慢病毒载体的线性化DNA；

(3)通过T4DNA连接酶(Invitrogent公司)，将线性化的pWPXLd-2A-EGFP与带粘性末端的合成的DNA片段G28Oζ、G28Iζ、G2840ζ、GBB27ζ和Mock进行连接，获得系列GPC3CAR质粒转化载体pWPXLd-G28Oζ-2A-EGFP、pWPXLd-G28Iζ-2A-EGFP、pWPXLd-G2840ζ-2A-EGFP、pWPXLd-GBB27ζ-2A-EGFP、pWPXLd-Mock-2A-EGFP。

所述IgM-GPC3-CD28-OX40-CD3ξ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示

所述IgM-GPC3-CD28-ICOS-CD3ξ的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述IgM-GPC3-CD28-CD40-CD3ξ的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述IgM-GPC3-41BB-CD27-CD3ξ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例2 GPC3-CAR慢病毒感染T细胞获得GPC3-CAR T细胞

(1)在10cm培养皿中培养293T细胞，培养基为：DMEM高糖培养基+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)；

(2)待150mm培养皿中的293T细胞密度达80-90％时，更换培养基：DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；

(3)更换培养基培养2-6小时后，用PEI分别将pWPXLd-GPC3CAR-EGFP质粒(pWPXLd-G28Oζ-2A-EGFP、pWPXLd-G28Iζ-2A-EGFP、pWPXLd-G2840ζ-2A-EGFP、pWPXLd-GBB27ζ-2A-EGFP、pWPXLd-Mock-2A-EGFP)分别与慢病毒包装辅助质粒pMD2.G、psPAX2共同转导入293T细胞，反应体系如下：

试剂	剂量
		pWPXLd-CAR-EGFP质粒	9μg
pMD2.G辅助质粒	3μg
		psPAX2	12μg
PEI	72μg

(4)分别于转化后24、48和72小时，收集培养基上清，并加入新鲜培养基：DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；

(5)培养基上清收集完毕，将上清2500g离心0.5小时后；

(6)取离心上清，用0.45um过滤器过滤后，利用超高速离心机28000rpm离心1.5小时；

(7)超高速离心后，轻轻去除上清，加入200ul PBS，置于4℃12-16小时溶解，即得CAR慢病毒；

(8)病毒溶解后，收集病毒溶液分装于PCR管，冻存于-80℃待用。

将GPC3-CAR慢病毒感染T细胞，其结果如图1所示，从图1可以看出，GPC3-CAR慢病毒感染效率能够达到56.3％，可见GPC3-CAR慢病毒能够有效的感染T细胞。

实施例3 GPC3-CAR T细胞对肾母细胞瘤体外杀伤检测

将实施例2制备的CAR GPC3T细胞、CAR Mock T细胞以不同比例3:1、1:1、1:3、1:9分别与1×10⁴的G401细胞(肾母细胞瘤细胞系)混合，加入到96孔U型板中，每组设3个复孔，并设单独加肿瘤细胞组作为阳性对照，250g离心5min后，置于37度5％CO2培养箱共培养18h；

荧光素酶(Luciferase)杀伤定量杀伤效率：CAR T细胞与肿瘤细胞共培养或肿瘤细胞单独培养后18小时，在96孔细胞培养板中加入100μl/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间设为1秒；

杀伤比例计算公式：100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图2所示，结果表明，CAR GPC3T细胞相比于对照组，对细胞杀伤能力强，可到70％以上，可见，CAR GPC3T细胞可有效杀伤肾母细胞瘤细胞。

实施例4 GPC3抗原特异性激活的GPC3CAR T细胞分泌细胞因子

通过ELISA检测CAR GPC3T细胞、CAR Mock T细胞分别与肾母细胞瘤细胞共培养18h后上清中的细胞因子IL-2、IFN-γ水平，结果如图3-4所示。

从图3结果可以看出，刺激后细胞因子IL-2的水平可达1000pg/mL，刺激后细胞因子IFN-γ水平可到1400pg/mL，可见，肾母细胞瘤可刺激CAR GPC3T细胞产生免疫效应。

实施例5 GPC3-CAR T细胞对肾母细胞瘤体内杀伤检测

具体方法如下：

(1)将细胞数为1×10⁵的肾母细胞瘤移植入NOD/SCID IL2rg-/-免疫缺陷小鼠体内，构建肾母细胞瘤异种移植小鼠模型，体内评估CAR GPC3T细胞对肾母细胞瘤细胞生长的抑制作用；

(2)肿瘤移植7、14天后，分别在肾母细胞瘤异种移植小鼠模型中静脉注射细胞数为2×10⁶的GPC3CAR T细胞、CAR Mock T细胞，共两个实验组，每组设置5个重复；

(3)于CAR T细胞输注后第7、14、21、28天，用游标卡尺分别量取两个实验组小鼠皮下肿瘤块大小，并记录，绘制肿瘤生长曲线图，结果如图5所示；

从图5结果表明，GPC3CAR T细胞在体内可识别杀伤肾母细胞瘤细胞，通过与对照组对比，GPC3CAR T细胞使得肾母细胞瘤的大小从开始的10mm³到14天后的15mm³，再到28天后的8mm³，可见GPC3CAR T细胞有效抑制肾母细胞瘤生长。

实施例6 GPC3单克隆抗体对肾母细胞瘤的作用

(1)构建表达抗-GPC3抗体和遗传霉素抗性的载体pC-aGPChl，获得pC-aGPChl-anti GPC3，通过电转方式转入CHO细胞；电转后的CHO细胞在37℃、8％CO₂的培养箱中培养；转化质粒稳定表达后，更换筛选培养基：包含400μg/ml遗传霉素的CHO-S-SFMII培养基，筛选的细胞以0.4细胞/100μl/孔的密度接种到96孔板中包含400μg/ml遗传霉素的CHO-S-SFMII培养基中，通过限制稀释法获得单克隆细胞；

所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)如下：

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSA；

所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)如下：

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIK；

(2)将表达GPC3抗体的CHO细胞的培养上清液加样到用包含150Mm NaCl的10mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(PH7.5)平衡的rProtein A Sepharose Fast Flow柱上，用包含1MNaCl的10mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(PH7.5)，然后用10mM的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(PH7.5)洗涤，吸附到柱子上的蛋白质用20mM的乙酸洗脱。向包含GPC3抗体的20mM乙酸级分中加入1M tris-HCl缓冲液(pH 8.5)以将pH从5调节到6，0.22μm滤器过滤，加入等量的去离子水，加样到用20mM乙酸缓冲液(PH6.0)平衡的SP Sepharose Fast Flow柱上，该柱用相同的缓冲液洗涤，然后用包含20mM NaCl的20mM乙酸缓冲液(PH6.0)洗脱吸附于柱子上的蛋白质，以获得纯化的GPC3抗体；

(3)向肾母细胞瘤细胞中加入50μl的制备为不同浓度的GPC3抗体溶液，在室温下反应15分钟；接下来，加入100μl来源于人体外周血的效应细胞悬浮液(5×105细胞/孔)，离心，然后在37℃、5％CO2培养箱中培养4小时，检测肾母细胞瘤细胞的杀伤百分比，制作数据统计图，结果如图6所示。

从图6结果显示，GPC3抗体(V22、V209和V1608克隆)可有效促进免疫效应细胞对肾母细胞瘤的识别杀伤和抑制作用。

实施例7 检测GPC3的逆转录表达对肾母细胞瘤的作用

(1)外周血白细胞/C TC(circulating tumor cell，循环肿瘤细胞)的处理：

获取肾母细胞瘤病人外周血，加入红细胞裂解液(eBioscience)室温裂解红细胞5分钟，加5mL PBS中和红细胞裂解液，300g离心5分钟，获得外周血白细胞，待提取RNA备用；或进一步通过流式细胞分选技术(Beckman Coulter)获得外周血白细胞中CK18+DAPI+细胞(即CTC细胞)，待提取RNA备用；

(2)肾脏/肾母细胞瘤组织样本的处理：

固体肾脏/肾母细胞瘤组织切碎后用DMEM/F12(Lonza)清洗,然后用Accumax 1(Innovative Cell Technologies)37度培养1小时。消化组织通过70-m细胞过滤器过滤变成单细胞悬液，然后轻轻置于Histopaque-1077gradient(Sigma-Aldrich)上，400xg室温离心30分钟后，将管底部的血红细胞、坏死细胞和碎片去除后，收集存活的有核细胞，待提取RNA备用；

(3)RNA提取：

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解；

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟，4℃下12000rpm离心15分钟，离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层，RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％；

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中，加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟，此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块；

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75％乙醇(75％乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀，混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟；

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟；

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，通过分光光度计检测RNA的纯度和浓度，获得的RNA溶液保存于-80℃待用；

(4)RNA样本通过TAKARA逆转录试剂盒步骤进行去DNA后，进行逆转录反应，获得样本cDNA。

设计GPC3的RT-PCR或qRT-PCR引物，所述qRT-PCR引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.17-22所示：

检测样本中GPC3的表达，结果如图7所示。

从图7结果显示，肾母细胞瘤病人样本中显著高表达GPC3mRNA，则可通过RT-PCR/qRT-PCR方法检测病人外周血/肾脏组织样本中GPC3的mRNA表达诊断肾母细胞瘤。

综上所述，本发明中，所述药物组合物可以是通过慢病毒、qRT-PCR、Eliza、免疫组化、流式细胞技术、构建抗体等方法构建的药物或试剂，其均是针对肾母细胞瘤的GPC3的新靶点，能够检测GPC3的转录表达，蛋白表达，能够对肾母细胞瘤进行早期诊断和预后评估。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 深圳市体内生物医药科技有限公司

<120> 一种药物组合物及其应用

<130> 2017

<141> 2017-12-26

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 697

<212> PRT

<213> 人工合成序列()

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser

20 25 30

Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

35 40 45

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50 55 60

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

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Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly

115 120 125

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

145 150 155 160

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

165 170 175

Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His

180 185 190

Gly Leu Lys Trp Ile Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala

195 200 205

Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser

210 215 220

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ala Ala Cys Val Gly Ala Arg

260 265 270

Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gly

275 280 285

Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser

290 295 300

Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser

305 310 315 320

Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly

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Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser

385 390 395 400

Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala

405 410 415

Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys

420 425 430

Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro

435 440 445

Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr

450 455 460

Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala

465 470 475 480

Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro

485 490 495

Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu

500 505 510

Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro

515 520 525

Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Lys

530 535 540

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

545 550 555 560

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

565 570 575

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

580 585 590

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

595 600 605

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

610 615 620

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

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Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

645 650 655

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

660 665 670

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

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Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

690 695

<210> 2

<211> 619

<212> PRT

<213> 人工合成序列()

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser

20 25 30

Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

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Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn

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100 105 110

Tyr Phe Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly

115 120 125

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

145 150 155 160

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

165 170 175

Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His

180 185 190

Gly Leu Lys Trp Ile Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala

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Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser

210 215 220

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Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys Val Leu Thr Gly Glu Ile

275 280 285

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Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gln Gln Phe Lys Met Gln

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Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly

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Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp His Ser

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His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro

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Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe

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Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr

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Leu Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

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Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

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Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

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Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

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<210> 3

<211> 697

<212> PRT

<213> 人工合成序列()

<400> 3

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser

20 25 30

Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

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Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu

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Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

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Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr Ala Val His Pro Glu Pro

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Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp Thr Ile

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405 410 415

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<210> 4

<211> 680

<212> PRT

<213> 人工合成序列()

<400> 4

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

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Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

165 170 175

Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His

180 185 190

Gly Leu Lys Trp Ile Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala

195 200 205

Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser

210 215 220

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

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Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His Leu Pro Tyr Val Ser Glu

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Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met Gln Thr Leu Ala Asp Phe

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Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr His Trp Pro Pro Gln Arg

435 440 445

Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly

450 455 460

Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala Leu Phe Leu His Gln Arg

465 470 475 480

Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu

485 490 495

Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro

500 505 510

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565 570 575

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Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

595 600 605

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610 615 620

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<210> 5

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工合成序列()

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile

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Val Ser Ala

115

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工合成序列()

<400> 6

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

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<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 7

cctgaaagta tttgggaat 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 8

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<210> 9

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<213> 人工合成序列()

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<400> 11

ccagtatgtc cagaagaat 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 12

ccattctcaa caacgccaa 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 13

gccaatatag atctgctta 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 14

ccgaagaagg gaactaatt 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 15

gccagtggtc agtcaaatt 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 16

ccttgcagaa ctggcctat 19

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 17

cctttgaaat tgttgttcgc ca 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 18

cctgggttca ttagctgggt a 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 19

cagtaaggac tgtggccgaa t 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 20

agcagtacgt tctccatgtc at 22

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 21

attggcaagt tatgtgccca t 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 22

ttcggctgga taaggtttct tc 22

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 23

ggtggtggcg atgctgctca gcttggac 28

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 24

agctgggtat agatgactgg aaacag 26

Claims

1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括特异性靶向肾肿瘤GPC3的药物，所述特异性靶向肾肿瘤GPC3的药物包括靶向GPC3的CAR-T细胞；

所述靶向GPC3的CAR-T细胞为将靶向GPC3的重组病毒转染到T细胞中表达；所述靶向GPC3的重组病毒为将靶向GPC3的嵌合抗原受体转染到免疫效应细胞中；

所述靶向GPC3的嵌合抗原受体为IgM-GPC3-CD28-OX40-CD3ξ，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；和/或，

所述靶向GPC3的嵌合抗原受体为IgM-GPC3-CD28-ICOS-CD3ξ，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；和/或，

所述靶向GPC3的嵌合抗原受体为IgM-GPC3-CD28-CD40-CD3ξ，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；和/或，

所述靶向GPC3的嵌合抗原受体为IgM-GPC3-41BB-CD27-CD3ξ，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物与手术、化学药物治疗或放射治疗中的任意一种或至少两种的组合联合使用。

3.一种如权利要求1-2中任一项所述的药物组合物用于制备治疗肾肿瘤细胞药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肾肿瘤细胞为肾鳞状细胞癌、肾素瘤、肾血管肌脂瘤、贝里尼导管癌、肾透明细胞肉瘤、中胚叶肾瘤、肾母细胞瘤或混合上皮间质瘤中的任意一种或至少两种的组合。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肾肿瘤细胞为肾母细胞瘤。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肾母细胞瘤为成人肾母细胞瘤和/或儿童肾母细胞瘤。